Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar E também para manter o pH mais ou menos constante.

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5 to 2%.Gel: composto de agarose ou poliacrilamida Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. Fácil de preparar. Usada em concentrações de 0. . via eletroforese.000 bp. Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50. Não-tóxico.

A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3.Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Para DNA a poliacrilamida é usada para separar fragmentos de menos de 500 bp. Também usados para separação de proteínas. . Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó.5 a 20%). Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro. São mais difíceis de preparar.

•Tampão de amostra material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp) •Brometo de Etídeo. As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese •Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas •Tampão de eletroforese (corrida). em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV. Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE). usado para visualizar o DNA corado com EtBr Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV) . corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos.Equipamento e reagentes para gel de agarose: •Uma cuba de eletroforese e um fonte de força •Bandejas de Gel. Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico •Transiluminador (caixa de luz UV).

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stolaf.http://www.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg .

Tampão de amostra .

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Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA (ou RNA) Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.wikipedia.VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE O corante mais comum para géis de agarose é o brometo de etídio (EtBr).org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis . http://en.

Consegue-se ver picogramas de DNA. .Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese.É muito menos mutagênico. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: . .SYBR Green > Molecular Probes 1995 > Revolucionou a detecção de DNA em géis A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100X quando se liga ao DNA.

Eletroforese Vertical .

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VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE Coomassie Blue Coomassie Brilliant Blue R250. É menos sensível que corar com a prata mas efetivo também. http://www.theses.ca/2005/22772/22772049.ulaval. se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. além de ser fácil de corar.jpg .

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A prata pode detectar também ácidos nucléicos. glicoproteínas e lipoproteínas. . Sensibilidade maior oferece vantagens como menos amostra no gel e análise de amostra diluída. Tipicamente 50X maior que com Coomassie* Brilliant Blue R-250.Método da Prata A maior vantagem é a sensibilidade sobre os outros métodos.

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