Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar E também para manter o pH mais ou menos constante.

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5 to 2%. . Não-tóxico.Gel: composto de agarose ou poliacrilamida Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.000 bp. via eletroforese. Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50. Fácil de preparar. Usada em concentrações de 0.

A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro. São mais difíceis de preparar.Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Para DNA a poliacrilamida é usada para separar fragmentos de menos de 500 bp.5 a 20%). Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3. Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. Também usados para separação de proteínas. . Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença.

•Tampão de amostra material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp) •Brometo de Etídeo. Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico •Transiluminador (caixa de luz UV). em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV. As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese •Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas •Tampão de eletroforese (corrida). usado para visualizar o DNA corado com EtBr Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV) . corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos.Equipamento e reagentes para gel de agarose: •Uma cuba de eletroforese e um fonte de força •Bandejas de Gel. Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE).

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edu/people/muth/7-16-04%20007.stolaf.http://www.jpg .

Tampão de amostra .

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VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE O corante mais comum para géis de agarose é o brometo de etídio (EtBr).org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis . Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA (ou RNA) Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA. http://en.wikipedia.

SYBR Green > Molecular Probes 1995 > Revolucionou a detecção de DNA em géis A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100X quando se liga ao DNA. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: . . Consegue-se ver picogramas de DNA. .É muito menos mutagênico.Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese.

Eletroforese Vertical .

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se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. http://www. É menos sensível que corar com a prata mas efetivo também.jpg .VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE Coomassie Blue Coomassie Brilliant Blue R250.theses.ulaval. além de ser fácil de corar.ca/2005/22772/22772049.

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glicoproteínas e lipoproteínas. Sensibilidade maior oferece vantagens como menos amostra no gel e análise de amostra diluída. Tipicamente 50X maior que com Coomassie* Brilliant Blue R-250. A prata pode detectar também ácidos nucléicos. .Método da Prata A maior vantagem é a sensibilidade sobre os outros métodos.

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