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UFRGS

INSTITUTO DE CINCIAS BSICAS DA SADE

Parasitologia Humana

Professora Marilise Brittes Rott

Chrla Correa Bica, Jssica Pich Abella, Tase de Mello Goulart.

Protozorios parasitas de veiculao hdrica: deteco e remoo

Porto Alegre, 13 de maio de 2013

Importncia das doenas causadas pelos protozorios de veiculao hdrica As doenas de veiculao hdrica, sobretudo aquelas causadas por protozorios intestinais, emergiram como um dos principais problemas de Sade Pblica nos ltimos 25 anos. Neste trabalho sero abordados os principais protozorios de transmisso hdrica (Cryptosporidium spp. e Giardia spp.) que, por sua elevada persistncia ambiental e resistncia clorao, constituem uma preocupao constante para os sistemas produtores de gua e indstria de alimentos. As guas de recreao tambm constituem um risco de aquisio destes agentes parasitrios. As fontes de gua doce utilizadas pelo ser humano, na forma de poos, rios, riachos e lagos, hoje sofrem um contnuo e crescente processo de degradao em funo do despejo de esgotos in natura ou tratados, de fezes de animais (silvestres e de produo), alm dos efluentes resultantes das atividades industriais. Antes da dcada de 80, disenteria e febre tifide eram as principais doenas associadas gua, mas com a melhoria nos processos de tratamento de gua, especialmente clorao (adio de cloro), foi altamente efetiva em reduzir os patgenos entricos bacterianos. Aps 1980, os protozorios parasitas Cryptosporidium spp. e Giardia spp. emergiram como os principais contaminantes associados veiculao hdrica. Estas duas espcies so as que mais causam surtos epidmicos por veiculao hdrica. No Brasil, os surtos descritos at o momento, em sua maioria, referem-se a episdios que aconteceram entre crianas que freqentam creches, com via de transmisso por contato interpessoal. Vrios fatores contribuem para a ampla disperso dos cistos de Giardia e dos oocistos de Cryptosporidium no ambiente: as formas de resistncia destes protozorios so capazes de sobreviver aos processos de clorao da gua e apresentam elevada resistncia s condies adversas ambientais. A dimenso aproximada dos cistos e oocistos de 8-15 micrometros, e 3 a 7 micrometros, respectivamente. Apesar de ambos possurem caractersticas similares de sedimentao e filtrao, a remoo de oocistos de Cryptosporidium por filtrao inferior dos cistos de Giardi. Atualmente, mais ateno dada remoo de Cryptosporidium porque seus oocistos tm tamanho menor do que aqueles de Giardia. Os oocistos de Cryptosporidium oferecem tambm maior resistncia a desinfetantes e tm maior potencial para contaminar a gua atravs de fezes de animais. Alm disso, Cryptosporidium tem uma maior taxa de infeco sobre a populao exposta (40% para o Cryptosporidium, contra 1% a 10% de Giardia). Estes fatores, juntamente com outras caractersticas que determinam a sua transmisso, isto , oocistos resistentes s condies ambientais, a transmisso de humano-humano, a transmisso atravs da gua, sua alta resistncia aos desinfetantes e a capacidade para provocar a auto-infeco, conferem alto potencial epidemiolgico. Via veiculao hdrica, o risco de contrair uma doena causada por estes parasitas maior do que para o caso de infeces causadas por bactrias. A ingesto de poucos cistos e oocistos pode causar infeco; experimentos com voluntrios humanos demonstraram que a dose mdia infectante ao redor de 9-1.042 oocistos, dependendo da cepa de Cryptosporidium e, para Giardia, a ingesto de apenas 10-25 cistos suficiente para causar doena. Outro agravante o grande potencial para a contaminao ambiental, pois um nico bezerro infectado pode eliminar cerca de 1 bilho a 10 bilhes de oocistos nas fezes durante uma semana. Agora, descreveremos melhor as caractersticas dos parasitas de veiculao hdrica e as respectivas doenas causadas por eles. Giardia duodenalis

Giardia duodenalis um protozorio flagelado de distribuio cosmopolita e atualmente o parasito mais frequentemente identificado nos exames fecais. Possui duas fases no seu ciclo de vida, a de trofozoto e a de cisto. encontrado no intestino delgado de vrios animais, inclusive no ser humado. A aquisio desta protozoose ocorre pela via fecal-oral, mediante a ingesto de gua ou alimentos contaminados. Os protozorios so transmitidos pela ingesto dos cistos oriundos das fezes de indivduo contaminado, podendo estar presentes na gua, alimento, pelo contato pessoaa-pessoa (comum em ambientes de creches, escolas maternais e berrios) ou indiretamente, por contato com objetos ou superfcies contaminadas , e at mesmo durante sexo oral-anal. Moscas e baratas tambm podem transport-los. As crianas em creches e pessoas imunodeprimidas esto entre os grupos com maior risco de infeco. Aps um perodo de incubao de 1-2 semanas, sintomas como nuseas, vmitos, diarria, flatulncia, clicas abdominais, mal-estar, esteatorria e perda de peso podem ocorrer e persistirem durante 2-4 semanas. comum que cerca de 60% dos indivduos infectados sejam assintomticos ou apresentem sintomas inespecficos. Contudo, alguns indivduos apresentam a forma crnica da parasitose, com perda de peso e m absoro de nutrientes (carboidratos, lipdios, acares e vitaminas). Em geral, somente os indivduos sintomticos so submetidos ao tratamento, e assim os pacientes assintomticos acabam atuando como fonte de cistos ara contaminao. O diagnstico feito via exame de fezes ou, em casos raros, bipsia de material duodenal. Cryptosporidium spp. Geralmente, este parasita encontrado no trato digestrio. Ao multiplicar-se no interior da clula intestinal, leva m absoro dos alimentos. Causa diarria no hospedeiro, alm de atrofia das vilosidades e perda de enzimas digestivas. A criptosporidase uma zoonose que tem sua fonte de infeco no gado, nos animais domsticos e nos de laboratrio. A fonte primordial de infeco so as fezes contaminadas, que so adquiridos por meio da ingesto de alimentos e gua potvel contaminados. Outra forma de infeco a direta, quando h contato de um indivduo infectado com outro no infectado, podendo ser de pessoa para pessoa ou de animal para pessoa (ou vice-versa). O oocisto a forma infectante, e esfrico ou ligeiramente ovalado. Possui estrutura interna obscura, ao microscpio ptico. Apresentam uma elevada resistncia variao das condies ambientais como temperatura, pH e salinidade. No so afetados pelo cloro nas concentraes normalmente utilizadas no tratamento da gua e so resistentes maior parte dos desinfetantes. Sob determinadas condies atmosfricas, tais como, chuvas torrenciais, derretimentos de neve e enchentes, os oocistos so veiculados em quantidades anormais das reas constituintes das bacias hidrogrficas para os reservatrios das guas superficiais elevando a sua turvao e contaminao. O aumento dos cursos de gua superficiais naturais, dos esgotos, das escorrncias urbanas e dos terrenos agrcolas resultam na elevao da contaminao da gua pelos oocistos. A criptosporidiose mais grave em imunodeprimidos: enquanto os indivduos imunocomprometidos desenvolvem um quadro de diarria aquosa severa e prolongada, visto que as evacuaes provocadas pelo parasito tornam-se freqentes e volumosas, causando considervel perda de peso, em pessoas saudveis a patogenia provoca enterocolite aguda espordica e de durao limitada.

Os repetidos episdios de diarria causados por Cryptosporidium nos primeiros anos de vida podem afetar o crescimento e desenvolvimento cognitivo infantil; alm disso, no existe um tratamento eficaz contra a parasitose, uma vez que os medicamentos testados at hoje no apresentam resultados homogneos para todos os pacientes e no promovem a cura parasitolgica. Com a introduo da terapia antiretroviral ativa e potente, em 1997, os casos graves de criptosporidiose tornaram-se menos freqentes entre os indivduos portadores de HIV, mas outras categorias populacionais, com sade mais debilitada, como os transplantados, os idosos, os diabticos, os desnutridos e as pessoas que fazem hemodilise ou quimioterapia, alm dos usurios de corticosterides, exibem grande risco de aquisio de criptosporidiose e de desenvolverem um quadro de diarria severa e debilitante, que pode levar esses indivduos morte devido desidratao causada pela diarria. Atualmente, so aceitas 16 espcies de Cryptosporidium, das quais sete tem a capacidade de infectar o ser humano. Cosmopolitanamente, Cryptosporidium parvum e C. hominis so as principais espcies infectando tanto os hospedeiros imunocompetentes como os imunocomprometidos. C. parvum infecta bovinos e outros ruminantes, alm do homem; apresenta, portanto, um ciclo zoontico. C. hominis naturalmente infectante para seres humanos e macacos Rhesus, embora j tenha sido encontrado em peixe-boi marinho e, por infeco experimental, em ovinos. Assim, C. hominis tem um ciclo predominantemente antropontico. As espcies C. parvum e C. hominis so as principais espcies incriminadas nos surtos de veiculao hdrica. O diagnstico feito atravs da visualizao do oocisto nas fezes, atravs de colorao por lcool-cido resistncia, ou imunofluorescncia. Pode-se realizar oncomitantemente sorologia por mtodos imunoenzimticos. Outros protozorios em que foi observada veiculao hdrica: Cyclospora cayetanensis e Toxoplasma gondii Cyclospora cayetanensis foi descrito como uma nova espcie pela primeira vez em 1994. Os oocistos deste protozorio so eliminados em estado no-esporulado nas fezes dos hospedeiros infectados e necessitam de um tempo de maturao de aproximadamente 15 dias no ambiente para tornarem-se infectantes. Como estes oocistos apresentam dimenses um pouco maiores (8-10 micrometros) que os de Cryptosporidium (3-7 micrometros), e tambm exibem as mesmas propriedades de colorao quando so empregados os procedimentos lcoolcido-resistentes, h dificuldades em relao ao diagnstico laboratorial, j que este requer o emprego da micrometria dos oocistos e comprovao por autofluorescncia (propriedade esta apresentada somente pelos oocistos de Cy. cayetanensis de forma duradoura). Na ciclosporore, o perodo de incubao de 7 dias, similar ao da criptosporidiose. A infeco por Cy. cayetanensis provoca diarria aquosa, profusa, de 43 a 57 dias de durao, alternando perodos de constipao. Entre outros sintomas esto a anorexia, perda de peso, nusea, vmitos, mialgia, febre baixa e fadiga. No Brasil, os episdios de surtos relacionados a Cy. Cayetanensis foram relacionados ingesto de gua contaminada pelo parasita, enquanto na Amrica do Norte ocorram surtos causados pela ingesto de frutas contaminadas. Os sintomas relatados pelos infectados incluam diarria aquosa, clica e dor abdominal, nuseas, vmitos, febre baixa e cefalia. O primeiro surto de ciclosporose ocorreu no Brasil no ano de 2000.

Toxoplasma gondii um parasita intracelular obrigatrio coccdeo e tem como hospedeiros intermedirios vrios mamferos, sendo o principal o homem. Os gatos so o hospesdeiro definitivo do protozorio, cujo ciclo sexuado culmina com a produo de oocistos, eliminados nas fezes destes animais. Visto que este um animal domstico, frequentemente a Toxoplasmose transmitida ao homem atravs das fezes dos gatos, geralmente por meio de alimentos contaminados (em carnes cruas ou mal passadas). No entanto, j foram relatados casos no Brasil por intoxicao hdrica com gua contaminada com as fezes de felinos. Na cidade de Santa Isabel do Iva, no Estado do Paran, cerca de 294 pessoas foram atingidas; a gua de uma pequena estao de tratamento ocasionou o surto ao ser contaminada acidentalmente com as fezes de uma gata. Nesse caso, o tratamento da gua inclua apenas a clorao e o seu precrio tratamento contribuiu para a contaminao da mesma. A toxoplasmose pode se manifestar de forma assintomtica na maioria dos casos, at mesmo sem causar nenhum dano, caso o hospedeiro no esteja com seu sistema imunitrio comprometido. Nos pacientes sintomticos, os principais sintomas apresentados so dores musculares e articulares, comprometimento da viso, dor de cabea e garganta e manchas pequenas e vermelhas pelo corpo, fadiga, linfadenopatia (nguas espalhadas pelo corpo), inflamao da retina (coriorretinite), apresentando conjuntivite, hemorragias oculares, embaamento da viso. Pode tambm provocar quadros graves no miocrdio e fgado. A toxoplasmose pode ser transmitida congenitamente, ou seja, da me para o feto, mas no se transmite de uma pessoa para outra. Apesar da maioria dos casos serem assintomticos, quando uma gestante no-imune infectada, a toxoplasmose pode ser muito grave. Nesse caso, o feto mais susceptvel infeco, podendo desenvolver leses oculares e no SNC. Outro caso grave a infeco em imunodeprimidos ou imunodeficientes. Na maioria dos casos o diagnstico faz-se atravs de sorologia (mtodos imunoenzimticos e de aglutinao). A identificao do parasito tambm pode ser feita em lquidos orgnicos, como lquor e lavado brnquico. Outras tcnicas menos usuais so a bipsia, o PCR e o isolamento em animais de laboratrio. Remoo dos protozorios da veiculao hdrica Como Cryptosporidium altamente resistente a desinfetantes qumicos tipicamente usados em gua potvel, a remoo fsica do parasita por filtrao um importante componente no processo de tratamento da gua municipal. Os nveis de cloro que seriam necessrios para a remoo destes parasitas so impraticveis para a indstria de tratamento de gua. Para ser efetiva a remoo de oocistos, a filtrao rpida granular deve ser precedida por coagulao qumica e o tratamento otimizado para remover partculas. Mesmo quando feita adequadamente, a filtrao rpida no pode garantir remoo de todos os oocistos. A filtrao lenta em areia considerada mais efetiva que a filtrao rpida granular, por causa do menor fluxo hidrulico e porque partculas menores podem ser removidas. Para eliminar os cistos e oocitos, o ideal adotar juntamente o uso de outros desinfetantes. Desinfetantes como oznio ou dixido de cloro so mais efeitos que apenas o cloro, e possvel que a indstria considerar estas alternativas mais cuidadosamente para combater os protozorios de veiculao hdrica. Entretanto, a eficcia e os subprodutos destes meios alternativos ainda devem ser analisados com maior cautela, antes de serem adotados em escala industrial. importante tambm reforar o conceito de que, sistemas com barreiras mltiplas (por exemplo, desinfeco

qumica aliada a coagulao e filtrao efetivas) so provavelmente os que oferecero melhor proteo contra infeco de protozorios de veiculao hdrica. Comparando-se a filtrao em que se utiliza o filtro de areia, a filtrao dupla ou a filtrao mista, observou-se que o nmero de amostras positivas para os oocistos de Cryptosporidium spp. maior quando se emprega o tratamento com o filtro de areia, e que o problema com a filtrao est associado ao tamanho dos oocistos de Cryptosporidium spp., que varia de 3 a 6 m, de forma que atravessa facilmente as barreiras no processo de filtrao, principalmente quando encontra-se em grande nmero na gua no-tratada. As plantas de filtrao com carvo ativado so freqentemente usadas quando a qualidade da gua muito precria, e demonstrou-se que mais de 60% dos efluentes filtrados por essa planta apresentaram oocistos de Cryptosporidium spp., superior s plantas de tratamento em que se usa o filtro de areia, nas quais as amostras positivas dos efluentes filtrados superaram o valor de 36%. Assim verifica-se que pode haver reduo do nmero de oocistos nas guas superficiais com o tratamento pelo processo de filtrao, porm h influncia quanto ao tipo de tratamento simples, duplo ou misto, e quanto ao tipo de filtro utilizado. Os tratamentos da gua para consumo humano removem em diferentes graus estes dois protozorios, sendo que a filtrao lenta em areia capaz de remover entre 93% e 100% de Giardia. Com Cryptosporidium, a remoo chega a 99,99% (4 log) e 99,997% (5 log). Em sistemas convencionais e filtrao direta, se tem obtido remoes entre 25% e 86%. H discusses com base na evidncia epidemiolgica que os nveis de Giargia que persistem em gua potvel (0,11/L) mesmo depois de todos os processos de filtrao no so capazes de provocar infeces. Mtodos de Deteco dos Protozorios Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em guas Os mtodos de deteco de oocistos e cistos em amostras de gua so fundamentados em trs etapas: a coleta e a concentrao da amostra, seguidas de etapa de purificao e, finalmente, a visualizao e enumerao dos protozorios. Inicialmente, as diferentes metodologias foram delineadas para o monitoramento da ocorrncia de Cryptosporidium e Giardia em guas superficiais brutas e em gua tratada distribuda populao. Entretanto, com a crescente importncia do conhecimento sobre a veiculao hdrica dos oocistos de Toxoplasma gondii e de Cyclospora cayetanensis, modificaes vm sendo introduzidas com o objetivo de contemplar a deteco ambiental destes protozorios. importante ressaltar que a deteco de cistos e oocistos em suprimentos de guas naturais difcil, e as tcnicas atuais ainda esto sujeitas grande variabilidade e baixa reprodutibilidade, que proporcional ao aumento da turbidez, e representam um alto custo se comparadas aos mtodos usados para medir outros parmetros de qualidade de gua. Os procedimentos iniciais para deteco de Cryptosporidium e Giardia incluam a filtrao de grande volume de gua obteno de concentrados mediante a filtrao em cartuchos do tipo cartridge (filtros de polipropileno com 1 m de porosidade nominal), seguindo-se sucessivas lavagens do filtro com solues contendo surfactante (Tween 80 - 0,01%) para desprender os oocistos capturados da matriz de filtrao. Em seguida, o lquido de eluio resultante era centrfugo-concentrado a 1.100 1.500 x g, com a finalidade de obter um pellet 5 ml, o qual era purificado mediante

gradiente de Percoll- sacarose, com gravidade especfica de 1,1. Aps a retirada dos resduos da suspenso de purificao, a deteco dos oocistos era realizada com o emprego de anticorpos monoclonais em reao de imunofluorescncia indireta, em pequenas membranas (de 0,22m de porosidade nominal e dimetro de 25 mm), clarificadas antes do exame microscpico com soluo seriada contendo etanol e glicerol. Os resultados eram relatados por volumes de 100 litros e a performance e sensibilidade do mtodo dependia da presena ou concentrao de determinados fatores interferentes tais como turbidez, presena de microalgas, argila, polmeros e coagulantes usados nos processos de tratamento, como resduos de ferro e alumnio. Em um estudo, a eficincia de recuperao do mtodo foi de 28,411,0% para cistos de Giardia e 9,33,3% para oocistos de Cryptosporidium, quando analisadas amostras de 40 litros de gua bruta; para gua tratada, o desempenho foi de 30,0 11,7% para cistos e 9,84,5% para oocistos. Outro mtodo, a precipitao qumica ou floculao em carbonato de clcio foi desenvolvida para concentrar Cryptosporidium em amostras com volume de 10 litros de gua. Neste procedimento, a amostra de gua submetida agitao rpida com a adio de 100 ml das solues de cloreto de clcio (1M) e bicarbonato de sdio (1M). A seguir, o pH elevado (10) com soluo de hidrxido de sdio (1M). Aps um tempo de sedimentao, o sobrenadante descartado e o precipitado formado dissolvido empregando-se 200mL da soluo de cido sulfmico a 10% e, posteriormente, concentrado por sucessivas centrifugaes (3.000 x g; 10 min) at a obteno de um pellet que aliquotado e examinado por microscopia de fluorescncia. Uma das limitaes apresentadas por essa metodologia a possibilidade de ocorrncia de resultados falso-positivos ou negativos, j que a precipitao qumica acontece em pH elevado e perodo prolongado e a dissoluo do sedimento com o emprego de cido sulfmico pode produzir deformaes nos cistos e oocistos, o que acarreta maior dificuldade no reconhecimento dos parasitos no exame em microscpio. Alm disso, a manipulao de reagentes cidos e de bases fortes requer maior cuidado laboratorial e procedimentos de biossegurana. O emprego de outros agentes floculantes e/ou cidos para dissoluo do precipitado acarreta reduo da fluorescncia dos cistos e oocistos ou aumento da fluorescncia residual. Este mtodo tambm no se aplica s amostras com baixa turbidez (menos que 1 UT), como a gua tratada. Entretanto, a floculao com sulfato de alumnio ou sulfato frrico uma metodologia bastante utilizada para a deteco de oocistos de Toxoplasma gondii em amostras de gua. Experimentos com inculo variando entre 104 e 105 oocistos esporulados resultaram em elevada eficincia: 41,5% (9,0) a 96,5% ( 21,7) e 35,9% (12,3) a 93,1% (8,1) para as solues de sulfato de alumnio e sulfato frrico, respectivamente. Outra limitao do mtodo de floculao com carbonato de clcio consiste na necessidade de se trabalhar com um pH mais elevado para efetuar a reao de precipitao qumica. Outro mtodo alternativo proposto para a deteco de oocistos e cistos em amostras hdricas a tcnica de filtrao em membranas. Neste mtodo, a amostra de gua filtrada utilizando-se bomba de vcuo (fluxo de 4 L/min.) e sistema porta-filtro; aps a filtrao, o material eludo a partir da superfcie da membrana mediante extrao mecnica com soluo de Tween 80 a 0,01%. O material resultante concentrado por dupla centrifugao. A eluio dos organismos capturados na membrana filtrante pode ser realizada mediante lavagem e raspagem da superfcie da membrana, ou por sua dissoluo em acetona. A eficincia de recuperao mdia para oocistos relatada na literatura varia de 25,5% a 70,5% . No Brasil, essa metodologia tem sido empregada em diversos estudos que tratam da ocorrncia de Cryptosporidium e

Giardia em amostras ambientais diversas, tais como gua bruta superficial, esgoto e crregos, efluentes de esgoto, gua mineral em gales de 20 litros, bem como em estudos moleculares. A maior limitao da tcnica de filtrao em membranas o efeito da turbidez da gua, pois quanto maior a turbidez mais rapidamente ocorre a obstruo dos poros da membrana, o que gera a necessidade de trocar as membranas para filtrar todo o volume estipulado para a amostra. Caractersticas da amostra de gua, tais como, slica, presena de cidos hmicos, bactrias, algas, metais, matria orgnica em decomposio, bem como variaes do pH e da turbidez, so fatores crticos que podem acarretar grande variabilidade de recuperao, afetando negativamente a sensibilidade das diversas metodologias. Na dcada de 1990, foi criado o mtodo 1622. Este mtodo foi criado devido a necessidade da deteco de Cryptosporidium e Giardia nos Estados Unidos devido a ocorrncia das patologias causadas por estes parasitas no pas. O Mtodo 1622 representou um avano em relao s metodologias j existentes por incluir uma etapa de purificao que emprega a separao imunomagntica (IMS) ao invs dos procedimentos convencionais de purificao. Por ser o mtodo mais sofisticado, vamos explicar ele com maiores detalhes, enfatizando o uso do mtodo em Cryptosporidium, j que o que h mais dificuldades de deteco e identificao. A metodologia para deteco e identificao tem basicamente cinco etapas: I. colheita da amostra; II. concentrao; III. purificao; IV. colorao; V. exame. Colheita da amostra hdrica A sua deteco e identificao implica a necessidade de colher e concentrar amostras de grandes volumes visto que os oocistos de Cryptosporidium ocorrem geralmente em baixa concentrao em guas ambientais. Se o que se pretende analisar um meio aquoso com elevada turvao como, por exemplo, a gua residual de um esgoto, o volume das amostras poder variar de cerca de 200 mL a 1 litro se a origem da amostra afluente, isto , a montante da ET AR (estao de tratamento de guas residuais); se a amostra provm da gua efluente, isto , a jusante da ETAR, o volume poder ser de cerca de 15 litros. Quando o volume desejado para anlise menor, as amostras podem ser tomadas no local de colheita e transportadas para o laboratrio, onde continuado o processo analtico. Quando o volume das amostras a analisar grande, so, no local de colheita, passadas atravs de um filtro e este conduzido ao laboratrio para continuao do processo analtico. Concentrao dos oocistos A concentrao dos oocistos das amostras aquticas , basicamente, obtida pela filtrao ou pela floculao. Usualmente, a concentrao das amostras de grandes volumes (superiores a 100 litros) obtida por passagem de um fluxo da gua a analisar, a presso controlada, durante um tempo determinado, atravs de um filtro em cartucho de polipropileno. Em amostras de volumes menores usado o filtro em membrana plana de base celulsica ou de policarbonato e tambm usada a floculao por carbonato de clcio. Modernamente, referida a concentrao por centrifugao de fluxo contnuo e filtrao de fluxo contnuo.

A centrifugao de fluxo contnuo tem maior eficincia na deteco de oocistos comparativamente filtrao por filtro em cartucho. A filtrao por fluxo contnuo seletiva do tamanho, baseia-se na passagem de um volume de gua em duas filtraes consecutivas, por dois filtros de tamanhos diferentes. O tamanho de poro do filtro da primeira filtrao de modo a suster as partculas de maiores dimenses, indesejveis e que dificultam a deteco dos oocistos. O tamanho de poro do filtro da segunda filtrao o conveniente para reter os oocistos mas deixar passar as partculas de menores dimenses, indesejveis que dificultam a visualizao dos oocistos. O mtodo de concentrao por filtrao de fluxo contnuo seletivo de tamanho, aplicado na recuperao de oocistos em gua potvel, apresenta uma eficincia que varia entre os 77,2% e os 85,0%, quando o par de filtros de 8 um e 3 um e um enriquecimento da amostra de apenas 110 oocistos por 20 litros de gua. Purificao dos oocistos necessrio um mtodo de purificao que separe os oocistos de partculas na maior parte das amostras. A metodologia usada para a purificao tem sido a flutuao dos oocistos numa soluo de gravidade especfica mais elevada (1,1-1,2), atravs da qual passam as partculas mais densas que vo sedimentar no fundo do tubo. As solues usadas incluem a sacarose, citrato de potssio e a sacarose de Percoll. Aps centrifugao, a camada superior e uma poro abaixo da interface, cerca de 25% da suspenso, so colhidas, diludas com um fludo de diluio e centrifugadas. O sobrenadante aspirado e rejeitado at um determinado volume restante. O sedimento ressuspendido e alquotas desta ltima suspenso so posteriormente submetidas a colorao. Abordagens metodolgicas baseadas em princpios imunolgicos, visando a separao dos oocistos de partculas contaminantes, incluem a citometria de fluxo e a separao imunomagntica. Princpios imunolgicos: A aplicao da citometria de fluxo, na separao dos oocistos das partculas contaminantes numa amostra de gua, baseia-se na reao dos epitopos expostos na superfcie dos oocistos, suspensos num concentrado duma amostra, com um anticorpo monoclonal gnero-especfico marcado pelo isotiocianato de fluorescena. As partculas fluorescentes, de tamanho, forma e intensidade fluorescente definidos, so separadas das partculas contaminantes, passando o concentrado por um dispositivo separador de clulas activadas pela fluorescncia (FACS - fluorescence activated cell sorting). As partculas separadas so depositadas em lminas de microscopia para serem visualizadas em epifluorescncia, para confirmar a presena de oocistos.A citometria de fluxo com separao celular por activao fluorescente consideravelmente mais fivel que o mtodo de purificao baseado na gravidade especfica mas mais moroso, requer operadores altamente habilitados e equipamento dispendioso. Separao imunomagntica: (IMS - immunomagnetic separation) tambm assenta na reao dos epitopos, expostos na superfcie dos oocistos, com paratopos de anticorpos monoclonais gnero-especfcos. Os anticorpos esto ligados covalentemente superfcie de partculas esfricas magnetizveis. Os complexos esferas-anticorpos-oocistos so separados dos restantes materiais estranhos contaminantes em suspenso pela aplicao de um campo magntico no lado exterior do tubo contentor da suspenso Os complexos, assim magnetizados, so atrados e fixados na zona interior do tubo adjacente ao magnete. Esta tcnica permite, por aspirao ou por decantao descartar o contedo sobrenadante e reter os complexos. O tratamento com cido clordrico gera a quebra das ligaes anticorpo/oocisto, conduz dissociao dos complexos e liberta os oocistos das esferas paramagnticas.

Para retirar as esferas paramagnticas, a suspenso amostra submetida novamente a um campo magntico, permanecendo os oocistos na suspenso para sequente colorao. Colorao dos oocistos A colorao dos oocistos de origem aqutica feita com anticorpos monoclonais gnero especficos marcados pelo isotiocianato de fluorescena (FITC) e pelo corante fluorognico 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Exame da amostra A visualizao dos oocistos feita em microscopia de epifluorescncia e de contraste de fase. A colorao pelo isotiocianato de fluorescena (FITC) visualizada com filtro de excitao de 450 a 490 nm, espelho dicrico divisor do feixe de 510 nm e filtro de barreira ou de supresso de 515 a 520 nm. A colorao pelo DAPI visualizada com filtro de excitao UV de 340 a 380 nm, espelho dicrico divisor do feixe de 400 nm e filtro de barreira ou de supresso de 420 nm. Os oocistos corados pelo FITC apresentam-se como objetos esfricos ou ligeiramente ovides com um dimetro de 4 a 6 um com uma fluorescncia verde ma brilhando mais intensamente na periferia. Entre outras metodologias de deteco dos oocistos em amostras de gua contam-se as tcnicas moleculares mediadas pela PCR (polymerase chain reaction). A PCR assenta na ao catalisadora da polimerase na elongao de cadeias ou de segmentos catenrios polidesoxirribonucleotdicos ou polirribonucleotdicos no caso da PCR-RT (reverse transcription - transcrio inversa) especficos, na presena de primers (iniciadores) especficos. A PCR uma tcnica analtica muito potente e sensvel, com aplicao em campos muito diversos, incluindo a biologia molecular, o diagnstico clnico, a anlise forense e a gentica populacional. Devido a que, geralmente, baixos nmeros de oocistos so encontrados em amostras ambientais, a sua deteco requer um teste com alta sensibilidade e alta especificidade como a PCR. O Mtodo 1623 Como o Mtodo 1622 era direcionado apenas deteco dos oocistos de Cryptosporidium, foi logo substitudo pelo Mtodo 1623, que permanece como mtodo de referncia e tambm contempla os cistos de Giardia. As modificaes introduzidas pelo Mtodo 1623 foram o menor volume de amostra (10 L) e a filtrao por meio de cpsulas contendo filtros de polisulfona. Aps a filtrao, a cpsula preenchida com soluo de eluio e submetida agitao em shaker durante cinco minutos, sendo recolhido o lquido resultante. Essa etapa repetida novamente e o eluato final concentrado por centrifugao a 1.050 x g, sendo o volume final reconstitudo a para procedimento de separao imunomagntica. O Mtodo 1623 foi delineado para a pesquisa de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia em amostras de gua superficial bruta e gua tratada, porm seu desempenho afetado pelo aumento da turbidez da gua, pelo teor de ferro dissolvido presente na amostra de gua e por variaes do pH ou do tempo de rotao durante a incubao das microesferas e a amostra.

A concentrao da amostra durante a filtrao resulta no acmulo de partculas de tamanho similar aos oocistos. Esta presena de sujidades na amostra concentrada um dos principais fatores que limitam a eficincia de recuperao das metodologias. Comparao entre os diferentes mtodos de deteco Por fim, segue abaixo uma tabela comparativa entre os mtodos de deteco citados neste trabalho, demonstrando as vantagens e desvantagens de cada mtodo:

importante comentar tambm que, em situao de surto epidmico, essas metodologias no permitem a identificao da espcie de protozorio - o que pode seria til para determinar a fonte da contaminao.

Concluso: Visto que a gua um recurso necessrio para a sobrevivncia do homem, sendo essencial vida desde os primeiros instantes desta, primordial para a sade que este recurso esteja em condies adequadas para consumo humano. Entretanto, as fontes de gua doce utilizadas pelo ser humano atualmente sofrem com contnuos despejos de esgoto, de influentes de indstrias, alm da contaminao por fezes de animais. Isso interfere na qualidade da gua, que pode, ento, estar contaminada com diversos parasitas. Dessa forma, as doenas causadas por protozorios de veiculao hdrica tornaram-se um problema de sade mundial. Dados globais da Organizao Mundial da Sade estimam que 3,4 milhes de pessoas, principalmente crianas, morrem anualmente devido a enfermidades relacionadas gua. Porm, mesmo com esses nmeros alarmantes, de desconhecimento de muitos pases, inclusive do Brasil, os riscos da presena de protozorios, principalmente de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. na gua que consumimos. As doenas causadas por estes parasitas geralmente atingem o trato gastro-intestinal, causando diarria e desidratao. Se considerarmos que a dose de infeco, tanto da criptosporidiose quanto da giardiose, baixa, e que estes parasitas apresentam maior resistncia aos mtodos convencionais de tratamento da gua, torna-se evidente a necessidade de deteco e remoo destes atravs de tcnicas especficas. Quanto aos mtodos de remoo, estes so fundamentais para garantir a qualidade da gua. A filtrao adequada da gua considerada uma das melhores profilaxias para evitarmos a presena de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em meios hdricos, mas deve-se lembrar que para obtermos xito na retirada destes microorganismos devemos adotar mtodos que vo alm da filtrao comum, e de preferncia utilizar vrias barreiras em conjunto para garantir a remoo dos parasitas em quantidades que garantam a sade da populao. Para deteco dos parasitas, foram desenvolvidos vrios mtodos diferentes, cada um com usas vantagens e desvantagens. So eles: filtrao em cartuchos, filtrao em membrana, floculao em carbonato de clcio, mtodo 1622 e seu precursor, o mtodo 1623, sendo este ltimo o mais avanado mtodo, mas tambm o que apresenta maior custo. Alm dos gastos com os reagentes dos mtodos, que em sua maioria so importados, h tambm o gasto com recursos humanos especializados, uma vez que so mtodos especializados, e estes ainda no so considerados to importantes, justamente devido ao desconhecimento da nao brasileira em geral das consequencias que os parasitas podem trazer sade da populao quando presentes em quantidades infectantes nos meios hdricos de consumo. A verdade que existem poucos registros no pas de casos documentados e tratados clinicamente, e isso que contribui para a ignorncia quanto aos riscos eminentes dos protozorios patognicos na gua. necessria maior pesquisa destes protozorios por parte das Estaes de Tratamento de gua e tambm maior fiscalizao por parte da ANVISA, j que pouco se sabe sobre a extenso desde problema no pas. As Estaes de Tratamento devem se mostrar abertas a modificaes em seus mtodos de anlise de gua, j que a descoberta de novos organismos patgenos freqente e, por isso, os conceitos em que a indstria se baseia para entregar aos usurios um produto de qualidade so falveis e devem se adaptar as novas descobertas.

Alm disso, importante que os pesquisadores tenham maior interesse nesse assunto, considerando que os mtodos de remoo e deteco ainda devem ser aprimorados. Por fim, gostaramos de considerar alguns aspectos da realizao do trabalho em si. Durante o desenvolvimento deste, descobrimos muito alm do que pensvamos sobre os protozorios de veiculao hdrica, em vrios aspetos como por exemplo que existem mtodos de deteco especias para estes parasitas e estes mtodos so recentes e poderiam ser melhorados, que existem poucas pesquisas relacionadas ocorrncia de doenas causadas pelos protozorios de veiculao hdrica, e que no existe ainda um consenso sobre O acesso as informaes e artigos sobre o assunto foram de fcil acesso, com diferentes abordagens de texto, e encontramos documentos em diversas lnguas, incluindo artigos em portugus e provenientes de pesquisadores brasileiros. Ns escolhermos abordar os protozorios de veiculao hdrica justamente pelo pouco conhecimento que tnhamos sobre o assunto, alm de que uma via importante de disseminao de doenas, considerando que todos ns necessitamos da gua para beber e isso nos despertou um interesse maior em pesquisar sobre qual seriam as solues definitivas para acabar com a prevalncia destes organismos em meio hdrico. importante buscarmos informaes sobre a qualidade da gua e os riscos que o consumo dela contaminada pode trazer para a sade. Levando em conta que, como j mencionado, os mtodos de tratamento podem falhar, importante orientar a populao sobre os riscos que ela corre ao ingerir gua diretamente de fontes no confiveis, e, mesmo em fontes confiveis, aconselhvel prestar ateno caso qualquer sintoma de contaminao ocorra, relatando estes s autoridades responsveis para que as medidas de controle adequadas sejam tomadas.

Bibliografia: Artigos consultados: FRANCO, Regina Maura Bueno. Protozorios de veiculao hdrica: relevncia em sade pblica. Artigo de reviso. Revista Panam. Infectol 2007. LOPES, Jos Ribeiro. Deteco, Identificao e Quantificao de Oocistos de Cryptosporidium parvum na Agua: Mtodos Convencionais e Imunofluorescncia ps-Separao Imunomagntica. Tese. Universidade do Porto, 2002. SOLARTE Yezid, PEA Miguel, MADERA Carla. Transmisin de protozoarios patgenos a travs del agua para consumo humano. Revista Colomb. Med. vol.37, 2006. FRANCO, Regina Maura Bueno et al. Avaliao da performance de metodologias de deteco de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em gua destinada ao consumo humano, para o atendimento s demandas da Vigilncia em Sade Ambiental no Brasil. Revista de Epidemiol. Serv. Sade v.21 n.2. Braslia, 2012. FRANCO, Regina Maura Bueno; BRANCO, Nilson & LEAL, Diego Averaldo Guiguet. Parasitologia Ambiental: mtodos de concentrao e deteco de Cryptosporidium spp. E Giardia spp.em amostras de gua. Revista de Parasitologia Tropical, 2012. SMITH, Huw V. & SMITH, Paul G. Parasitic protozoa in drinking water. Endeavour, New Series, Volume 14, No. 2. 1990.

Website consultado somente para maiores dados sobre as doenas dos parasitos em estudo: http://www.ufrgs.br/parasito/index.shtml (site do Setor de Parasitologia da UFRGS)

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