Amerika trule pelinjih zajednica - razliiti sojevi bakterije Penibacillus larvae i njihov uticaj na ispoljavanje bolesti

Jevrosima Stevanovi, Zoran Stanimirovi

Katedra za biologiju Fakultet veterinarske medicine Univerzitet u Beogradu SRBIJA

Amerika trule (AFB)

AFB veoma opasna bakterijska bolest pelinjeg legla, letalna za inficirane larve, ali potencijalno letalna i po itavo pelinje drutvo. irenje bolesti meu drutvima unutar pelinjaka i izmeu razliitih pelinjaka, ali i izmeu drava, olakavaju nepravilni pelarski postupci, kao to su: razmena materijala meu konicama, seoba slabih drutava na pau, globalna trgovina pela i meda, pozajmljivanje pribora, uvanje veeg broja drutava u zatvorenom prostoru, samostalna izrada satnih osnova od nesterilisanog voska. AFB je rasprostranjena irom sveta. U mnogim dravama, jedina mera kontrole AFB jeste spaljivanje obolelih drutava i kontaminirane pelarske opreme. Samim tim, AFB dovodi do velikih ekonomskih gubitaka u pelarstvu irom sveta.

U nekim zemljama, koriste se antibiotici (npr. oxytetracycline) za suzbijanje klinikih simptoma, odnosno pojavu AFB. Nedostaci ove metode su: (i) antibiotici nisu efikasni protiv spora. Stoga, tretmani antibioticima samo maskiraju bolest. (ii) razvoj oxytetracycline-rezistentnih sojeva P. larvae koji zahtevaju da se stalno traga za novim, efikasnijim antibioticima.

Miyagi et al. (2000); Mussen (2000); Kochansky et al., (2001); Elzen et al., (2002); Wu et al., (2005)

REKLASIFIKACIJA BAKTERIJE UZRONIKA AFB Bacillus larvae (White, 1906) Bacillus pulvifaciens (Katznelson, 1950) Nakon uvoenja molekularnih metoda u taksonomska istraivanja bakterija, ove vrste, Bacillus larvae i Bacillus pulvifaciens, determinisane su kao pripadnici novog roda Paenibacillus, odnosno preimenovane: Naredna istraivanja* Heyndrickx et al. (1996) pokazala su da je ipak re Bacillus larvae Paenibacillus larvae o jednoj vrsti: Bacillus pulvifaciens Paenibacillus pulvifaciens (Ash et al., 1993).

Paenibacillus larvae
*pre svega analiza rDNK koja je pokazala tako veliku slinost koja ne opravdava klasifikaciju u dve vrste

REKLASIFIKACIJA BAKTERIJE UZRONIKA AFB Meutim, na osnovu razlika u patogenosti i fenotipskim karakteristikama izmeu dve bive vrste, Heyndrickx et al. (1996) predloili su podelu Paenibacillus larvae u dve podvrste: P. larvae larvae i P. larvae pulvifaciens (koje se razlikuju po:
- patogenosti (Katznelson, 1950)

- narandasto-obojene kolonije kod P. l. pulvifaciens (Heyndrickx et al., 1996), - spoljanjem izgledu spore (Ludvik et al., 1993) - proizvodnji koseline iz manitola, ali ne iz salicina kod P. l. pulvifaciens)
(Heyndrickx et al., 1996).

Dobbelaere et al., 2001 . Neuendorf et al., 2004 .. Kilwinski et al., 2004 Alippi et al., 2004

Konano, opsena taksonomska prouavanja koja su pored klasinih, ukljuila i molekularne aspekte, omoguila su reklasifikaciju dve podvrste P. l. larvae i P. l. pulvifaciens U JEDNU JEDINU VRSTU:

P. larvae
(Genersch et al., 2006)

GENOTIPOVANJE P. larvae putem rep-PCR fingerprint metode korienjem ERIC prajmera ukazalo na postojanje razlika u okviru vrste P. larvae. Do sada je opisano 4 razliita genotipa
(Ashiralieva and Genersch, 2006).

ERIC I ERIC II ERIC III ERIC IV

pripadaju ex-podvrsti P. l. larvae

pripadaju ex-podvrsti P. l. pulvifaciens

ERIC I

ERIC II

ERIC III ERIC IV

3000 2000 1500 1000

GENOTIPOVANJE P. larvae putem rep-PCR fingerprint metode korienjem ERIC prajmera

(uzorci iz eke, Kanade, Argentine, vedske, Finske, Nemake, Makedonije i Srbije).

500

3000 2000 1500 1000

500

ERIC III

ERIC I

ERIC II

ERIC IV

Nai rezultati
Detekcija amerike trulei (izolovana DNK)

Rezultati analiza Amerike trulei

na uzorcima iz Srbije

Identifikacija genotipova amerike trulei (primenom rep-PCR)

Znaaj detekcije genotipa P. larvae je u tome to izmeu genotipova postoje razlike u virulenciji, odnosno sposobnosti da izazove bolest. Tok bolesti je potpuno razliit u zavisnosti od genotipa izazivaa, pa se samim tim razlikuje i verovatnoa njihove detekcije tradicionalnim metodama. Zbog toga je neophodna molekularna dijagnostika koja omoguava ne samo sigurnu detekciju, nego i identifikaciju genotipa P. larvae, a samim tim i procenu patogenosti soja i prognozu toka bolesti.

Genotipovi koji su visoko virulenti na nivou larve (ERIC III i ERIC IV) su manje virulentni na nivou drutva i NE DOVODE do izbijanja bolesti, tj. do pojave klasinih klinikih znaka. Zato? Zato to u tim situacijama VEINA LARVI UGINE PRE ZATVARANJA SATNE ELIJE, ime je omogueno pelama higijeniarkama da to lako osete i oiste uginulo leglo.

Nasuprot njima, genotipovi ERIC I i ERIC II dovode do klasinog izbijanja bolesti i klinike slike AFB. Razlog: Ti genotipovi su manje virulentni na nivou jedinke, tj. ZNATNO VEI BROJ LARVI UGINE NAKON ZATVARANJA satne elije, odnosno tek nakon ulutkavanja, ime se u velikoj meri umanjuje ansa da to uginulo leglo unite higijeniarke.

Razlike u infektivnosti izmeu ERIC genotipova P. larvae

ERIC IV

Kumulativni mortalitet %

ERIC III ERIC II ERIC I

Dani nakon infekcije

Genersch et al. (2006)

Forsgren et al. (2008)

Osim toga, prilikom laboratorijske dijagnostike treba imati u vidu da izmeu genotipova P. larvae postoje signifikantne razlike: - u stopi klijavosti na vrstoj podlozi (MYPGP, 5% CO2) Slika 1 - u otpornosti spora na temperaturne tretmane - Slike 2a i 2b - u dugovenosti uskladitenih spora - Slike 3a i 3b

Zato se u laboratoriji uvek moraju ukljuiti razliiti genotipovi prilikom procene protokola za kultivaciju P. larvae.

Razlike u klijavosti na vrstim podlogama (MYPGP, 5% CO2)

Slika 1.

Prosena stopa klijavosti (%, broj kolonija naspram broja spora pod mikroskopom) razliitih genotipova P. larvae
CCUG48979 (ERIC I) CCUG48978 (ERIC I) 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Field isolates Reference strains CCUG48972 (ERIC II) CCUG48973 (ERIC II) ATCC9545 (ERIC I) Germination rate LMG16252 (ERIC III) LMG14427 (ERIC IV) LMG16247 (ERIC IV) Figure 1

Razlike u otpornosti na temperaturu spora izmeu razliitih genotipova P. larvae

Figure 2a 70% 60% 50% Germination rate 40% 30% 20% 10% 0% Untreated 80C 85C 90C 95C 100C CCUG 48979, (ERIC I) CCUG 48978, (ERIC I) CCUG 48972, (ERIC II) CCUG 48973, (ERIC II)

Slika 2a. Prosena stopa klijavosti (%) terenskih sojeva nakon tretmana temperaturom

Figure 2b ATCC9545 (ERIC I) 80% 70% LMG16252 (ERIC III) LMG14427 (ERIC IV) LMG16247 (ERIC IV)

Germination rate

Slika 2b. Prosena stopa klijavosti (%) referentnih sojeva nakon tretmana temperaturom

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Untreated 80C 85C 90C 95C 100C

Razlike u dugovenosti uskladitenih spora izmeu razliitih genotipova P. larvae

Figure 3a 100% 90% 80% Germination rate 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% <1month 6 months 12 months 18 months CCUG 48979 (ERIC I) CCUG 48978 (ERIC I) CCUG 48972 (ERIC II) CCUG 48973 (ERIC II)

Slika 3a. Prosena stopa klijavosti (%) terenskih sojeva nakon 6, 12 i 18 meseci skladitenja.

Figure 3b 100%

Slika 3b.
Germination rate

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% <1month 6 months

ATCC9545 (ERIC I) LMG16252 (ERIC III) LMG 16247 (ERIC IV)

Prosena stopa klijavosti (%) referentnih sojeva nakon 6, 12 i 18 meseci skladitenja.

12 months

18 months

Istraivanja u Srbiji obavljena su na Katedri za biologiju Fakulteta veterinarske medicine u okviru projekta: EKOFIZIOLOKA I GENETIKA ISTRAIVANJA DOMAIH IVOTINJA
I PELA U FUNKCIJI POVEANJA REPRODUKTIVNIH SVOJSTAVA I OTPORNOSTI NA BOLESTI, kojim rukovodi prof. dr Zoran Stanimirovi:
(Projekat Ev. br. 143022, finansiran od strane Ministarstva za nauku i tehnoloki razvoj Republike Srbije, u periodu 2006-2010).

Neki od eksperimenata obavljeni su u Upsali (vedska), na vedskom Univerzitetu poljoprivrednih nauka (Swedish University of Agricultural Sciences - SLU), tokom istraivakog boravka Jevrosime Stevanovi na toj instituciji, pod rukovodstvom prof. dr Ingemara Fries-a. Istraivaki boravak Jevrosime Stevanovi u periodu 01. 09. 2006 30. 06. 2007 u vedskoj finansirala je vedska vladina institucija Swedish Institute (Si.)

Zajedniko istraivanje
Izmeu Katedra za biologiju, Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu, Bul. JNA 18, 11000 Beorad, Serbia i Department of Ecology, Swedish University of Agricultural Sciences, Ulls vg 16, Box 7044, 75007 Uppsala, Sweden Prof. dr Zoran Stanimirovi Dr Jevrosima Stevanovi Prof. dr Ingemar Fries

Ciljevi zajednikog istraivanja su:

i) Ispitati u Srbiji distribuciju poznatih genotipova P. larvae putem repPCR fingerprint metode korienjem ERIC prajmera ii) Ispitati osobine i virulenciju novih ERIC genotipa P. larvae koji se otkriju u Srbiji.

GENOTIPOVANJE P. larvae putem rep-PCR fingerprint metode korienjem ERIC prajmera

3000 2000 1500 1000 500

ERIC I

ERIC II

ERIC III

ERIC IV

Laboratorija za genetiku ivotinja Katedre za biologiju