ESTRUTURA E FUNO DOS CIDOS NUCLEICOS

Lewin, B. Genes VII.Artmed editora, Porto Alegre, 2001.955p Suzuki, et al. Introduo a Gentica. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro , 1992. 633p.

Seres vivos: a) PROCARIOTOS

Bactrias Algas azuis Micoplasmas

b) EUCARIOTOS
Animais Vegetais Protistas : Protozorios Algas Fungos

Ribossomos

Nucleide (DNA compactado) Pili

Tamanho do genoma: E. Coli : 4.600 kb 3.000 protenas Mycoplasma genitalium: 580 kb 470 protenas

Flagelo

Clula procaritica (bactrias): No tem organelas (ncleo, mitocondrias, etc) Material gentico compactado no nucleide (no compartimentalizado) Cromossomo nico, circular fechado (na maioria das bactrias, ex: Escherichia coli) Exceo: Borrelia burgdorferi DNA dupla hlice e linear

Envelope celular (membrana)

Ribossomos

Clula eucaritica: Organelas (ncleo, mitocndrias, cloroplastos, etc) Material gentico compactado no ncleo Cromossomos lineares DNA de fita dupla
Ncleo

Envelope nuclear
Mitocondrias

Ribossomos

Cloroplasto

Breve histria da gentica

1865: os genes so fatores particulados 1884: Primeira publicao dos trabalhos de Mendel 1884: Descoberta dos cromossomos 1869: descoberta do DNA (Friedrich Miescher) 1900 : redescoberta das leis de Mendel 1903: os cromossomos so unidades hereditrias 1910: os genes esto nos cromossomos 1913: os cromossomos contem arranjos lineares de genes 1927: as mutaes so mudanas fsicas nos genes 1931: a recombinao causada pelo crossing-over 1944: o DNA o material gentico 1945: um gene codifica uma protena 1953: o DNA uma dupla hlice 1958: o DNA replica de forma semiconservativa 1960: Descoberta do RNA mensageiro 1961: o cdigo gentico uma trinca

Breve histria da gentica

1977: o DNA pode ser seqenciado 1987: os genomas podem ser seqenciados 1988: Inicio do projeto genoma Humano 2005 : Importncia do DNA lixo Atualmente: Projetos Protemica 2010: sintese in vitro do genoma de uma bactria 2010: Reviso do conceito de gene ( um gene um segmento de DNA que codifica um produto funcional (polipeptdeo ou RNA)

Material gentico est presente nos cromossomos Dvida: DNA RNA Protenas

O DNA o material gentico em todos os organismos exceto em alguns vrus (vrus de RNA)
Comprovado por Griffith 1928 e Avery e colaboradores em 1944

Griffith, 1928 Avery, McLeod & McCarty 1944 Princpio transformante Hershey e Chase,1953 S Fagos marcados com 32P produziam filhos radioativos

Compactao do DNA

Antes da descoberta do DNA pressupunha que o material responsvel pelas caractersticas herdveis deveria ter trs caractersticas principais: 1) Conter toda a informao para a estruturao da clula de um organismo, suas funes, desenvolvimento e reproduo de forma estvel. 2) Se replicar com preciso para que a prognie de clulas tenha a mesma informao gentica que as clulas parentais. 3) Ser capaz de variao (mutao e recombinao), seno no haveria evoluo

FORMAS DE DNA

LINEAR Cromossomo bacteriano Plasmdeo CIRCULAR DNA mitocondrial DNA de cloroplasto DNA de alguns vrus (bacterifagos)

Propriedades das molculas de DNA encontradas em vrios organismos

Fita Simples (FS) ou Fita Dupla (FD) Nmero de bases (b) ou pares de bases (pb)

Fonte SV40 Vrus de macaco Fago M13 Vrus mosaico da couve-flor AD-2 Adenovrus Fago T2 E. coli Drosophila melanogaster (um cromossomo)

Circular ou linear

% (C+G)

FD FS FD FD FD FD FD

Circular Circular Circular Linear Linear Circular Linear

5.243 pb 6.470 b 8.031 pb 35.937 pb 1,7 x 105 pb 4,2 x 106 pb 6,5 x 107 pb

40,80 40,75 40,19 55,20 52 53 40

Componentes dos cidos nuclicos

Nucleosdeos: acar + base nitrogenada (pentose) Nucleotdeos: Nucleosdeo + grupo fosfato

A ligao entre a base nitrogenada e a pentose feita covalentemente atravs de uma ligao N-glicosdica com a hidroxila ligada ao carbono-1 da pentose.

A ligao entre o grupo fosfato e a pentose feita atravs de uma ligao fosfoster com a hidroxila ligada ao carbono-5 da pentose.

Bases Nitrogenadas

Composio dos cidos nuclicos

Composio dos cidos nuclicos

Uracila Timina Ribose

Citosina

2desoxirribose

Adenina

Guanina

cido fosfrico

RNA

Ribonucleotdeo

DNA

POLINUCLEOTDEOS: dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 2- Desoxiadenosina 5-trifosfato 2- Desoxiguanosina 5-trifosfato 2- Desoxicitidina 5-trifosfato 2- Desoxitimidina 5-trifosfato

Desoxirribonucleotdeos

cidos nuclicos so polmeros lineares de nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister 5 3. Cadeia polinucleotdica Sequencias de cidos nuclicos, por conveno, so escritas na 5- 3 Sequencia de bases: como a informao gentica carregada

Os nucleotdeos esto ligados covalentemente por ligaes fosfodister. A posio 3 da molcula de acar liga-se ao grupamento fosfato que se liga a posio 5da molcula de acar subseqente

O alongamento da fita de DNA ocorre SEMPRE na direo 5' para 3'

Estrutura da Molcula de DNA

1953 Watson e Crick propuseram um modelo de estrutura tridimensional do DNA a) Estudos de difrao do raio X (Franklin e Wilkins) b) Estudos qumicos da molcula ( Chargaff)

DAMA SOMBRIA ROSALIND FRANKLIN: A DAMA SOMBRIA

DO DNA (1920 1958) R. Franklin e M. Wilkins (1953): Difrao de raios-X Molculas de DNA assumem estrutura helicoidal, com 2 periodicidades (3.4 e 34A ) ao longo do eixo da hlice. Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA. Brenda Maddox Erwin Chargaff (1950) Regras de Chargaff As quantidades relativas de A, T, G e C so caractersticas de cada organismo, no variando entre diferentes tecidos ou em diferentes condies fisiolgicas. Em qualquer DNA celular, a quantidade de resduos A=T e G=C. The Double Helix - James D. Watson (leitura adicional)

J. Watson e F. Crick (1953):

Modlo tri-dimensional para a estrutura do DNA: Duas cadeias de DNA complementares (pareamento de bases) So anti-paralelas (direes opostas), Formam uma dupla-hlice com rotao no sentido anti-horrio (right-handed). Fitas enrolam para a direita Arcabouo acar-fosfato do lado externo (cargas negativas) As bases ficam no interior da cadeia (degraus) A toro das fitas gera dupla hlice com sulco maior e sulco menor Duas cadeias esto associadas por pontes de Hidrognio entre as bases.

DNA fita dupla: cadeias antiparalelas

Bases no meio

Ligaes glicosdicas no DNA, entre as desoxirriboses e as bases nitrogenadas, no esto diretamente opostas na dupla-hlice, gerando 2 cavidades desiguais em seu contorno.

PONTES DE HIDROGNIO Estrutura Qumica e Tamanho das bases nitrogenadas

CETO ( C=O ) GRUPOS AMINO ( C-NH2 ) Permitem a formao de PONTES DE HIDROGNIO entre as bases.

TeU A CeG

grupo CETO grupo AMINO grupos CETO e AMINO

TeU A CeG

grupo CETO grupo AMINO grupos CETO e AMINO

1 ponte de hidrognio 2 pontes de hidrognio

1 ponte de hidrognio adicional entre os nitrognios dos anis aromticos em todos os pares de bases
OUTROS PAREAMENTOS PAREAMENTO DE HOOGSTEEN

Ocorre em fitas triplas dos anis aromticos de RNA e DNA : GA , CA e TG.

Com base na estrutura de dupla hlice do DNA e nas caractersticas de hidrofobicidade das molculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma: O grupo fosfato e o acar (parte hidroflica) - esto localizados na parte externa da molcula. As bases nitrogenadas (parte hidrofbica) - esto localizadas na parte interna da molcula.

Pontes de hidrognio entre bases C-G e A-T em fitas de DNA complementares estabilizam e conferem especificidade a dupla-fita de DNA

FORAS QUE ESTABILIZAM A ESTRUTURA DA DUPLA-HLICE

a) fortes para manter a integridade do DNA FORAS b) permitir uma flexibilidade conformacional, essencial para suas atividades

Ligaes covalentes: une os tomos nas molculas (pontes de hidrognio) Fora de Van der Walls: ligaes moleculares (fracas) entre os anis aromticos de bases adjacentes que so fracas, mas aditivas na manuteno da estrutura.

Efeitos hidrofbicos nitrogenadas adjacentes

interaes hidrofbicas entre bases

os anis purnicos e pirimidnicos das bases so forados para o interior da dupla-hlice. Efeitos hidroflicos as cadeias de acar-fosfato (carregados negativamente) interagem com ctions (principalmente Mg2+) em soluo, neutraliza a repulso entre as duas cadeias estabiliza a dupla-hlice.

Estrutura da Molcula de DNA

Dupla hlice Antiparalelas

DNA

Acar, Grupo fosfato e Bases nitrogenadas Anis aromticos das bases nitrogenadas (hidrofbicos) Bases pareadas entre as duas fitas

DUPLA-HLICE DO DNA PROPOSTA POR WATSON E CRICK

A) Modelo simplificado

B) Modelo molecular mostrando as cavidades

Cm CM Cm Cm CM

Tipos de DNA mais comuns encontradas em condies fisiolgicas. CM= cavidade maior; Cm= cavidade menor.

Caractersticas das diferentes formas de hlice dupla de DNA

Forma A
Sentido helicoidal Dimetro Pares de base por giro da hlice (n) Giro helicoidal por pb (=360/n) Subida da hlice por pb (h) Espaamento na hlice (=nh) Inclinao da base em relao ao eixo da hlice Sulco maior Sulco menor Ligao glicosdica 20 Largo/raso anti 6 Estreito/profundo anti 7 Achatado Estreito/profundo anti (pir) sin (pur) Estreito/profundo Largo/profundo ~2,6 nm 11 33 0,26 nm 2,8 nm

Forma B
~2,0 nm 10 36 0,34 nm 3,4 nm

Forma Z
Giro para a esquerda ~1,8 nm 12 (6 dmeros) 60(por dmero) 0,37 nm 4,5 nm

Giro para a direita Giro para a direita

CONSEQNCIAS DA DUPLA HLICE 1. Molcula pode ser duplicada ou replicada (especificidade entre as bases) 2. Seqncia de pares de nucleotdeos dita a seqncia de aminocidos na protena 3. Os cidos nuclicos pareamento de bases hibridizam por

PROPRIEDADES DO DNA
Propriedade crucial: capacidade da dupla hlice separar em duas fitas simples sem romper as ligaes covalentes

A dupla hlice de DNA pode ser desnaturada reversivelmente: Agentes desnaturantes: Aquecimento Extremos de pH

Desnaturao e Renaturao da fita dupla de DNA Fuso ( melting) Reanelamento

Fundamentais para os processos de: REPLICAO TRANSCRIO RECOMBINAO

Tm= Temperatura de fuso(melting) Tm uma funo do contedo de G + C da amostra de DNA, varia de 80C a 100C. 40% de GC (mamferos): DNA desnatura com uma Tm em torno de 87C.

Cada molcula de DNA Apresenta uma Tm diferente

Rompimento de pares de bases: GC ( trs pontes de hidrognio) so necessrias temperaturas mais elevadas, pH mais altos ou maiores concentraes de agentes desnaturantes do que para a separao de um par AT (duas pontes de hidrognio).

Quanto maior a porcentagem de CG, maior ser a temperatura necessria para a desnaturao, > valor daTm

Relao entre a composio de bases e a Tm

RENATURAO DO DNA
a) Resfriamento Temperatura 25 C abaixo da Tm Resfriamento abrupto b) Sedimentao por centrifugao c)Tratamento com enzimas especficas para fita simples (nuclease S1) lentamente fitas de DNA colapsam

UTILIZAO: Caracterizao de genomas Identificao de sequncias de interesse Hibridizao

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA

Replicao

cido Desoxirribonucleico

Transcrio
cido Ribonucleico

Traduo

Protena

Replicao do DNA

Replicao do DNA:
Processo que precede a diviso celular e atravs do qual so geradas cpias idnticas das molculas de DNA presentes na clula-me, a seguir herdadas pelas duas clulas-filhas Diviso celular (fase S da intrfase)

Duplicaao dos cromossomos Separaao dos cromossomos

Divisao celular

Meselson e Sthal, 1958

A replicao semi-conservativa foi provada em experimentos nos quais o DNA de Eschericchia coli foi inicialmente marcado com 15N, mais pesado.Nas geraes sucessoras, cultivadas sem 15N, formaram-se DNAs hbridos, que no se formariam se a replicao no fosse semiconservativa

Replicao envolve vrias atividades enzimticas nas seguintes fases: Iniciao : reconhecimento de uma origem por um complexo protico. Nas Forquilhas de replicao Alongamento ou extenso: replissomo )outro complexo protico.. Terminao: reaes de juno e/ou terminao. Sntese de nova fita: DNAs polimerases Envolvidas em reparo (DNA polimeraseI e II), Envolvida na replicao : DNA polimerase III Estendem a fita pela adio de um nucleotdeo por vez a uma rxtremidade 3-OH

DNA sintetizado por DNA polimerases DNA polimerase I foi isolada a partir de E.coli em 1955 por A. Kornberg As DNA polimerases necessitam sempre de um DNA molde e de uma seqncia iniciadora (Primer). O substrato da sntese o desoxiribonucleosdeo 5-trifosfato. A sntese de DNA ocorre pela adio de nucleotdeos a extremidade 3OH da cadeia em crescimento. Sentido da sntese sempre 5 3.

Forquilha de Replicao:
Regio do DNA onde ocorre a transio do DNA me fita dupla, para as novas fitas filhas duplas

Fragmentos de Okasaki: Bactria: 1.000 a 2.000 pb Eucariotos: 150 a 200 pb

Todas as DNA polimerases conhecidas so capazes de estender fitas de DNA apenas na direo 5' 3' Como, ento, se d a sntese na direo 3' 5' da forquilha de replicao?

O que ocorre uma replicao descontnua numa direo e contnua na outra; os fragmentos (de Okasaki) so unidos mais tarde por uma ligase

Todas as DNA polimerases precisam de um grupo 3'-OH para estender a cadeia de DNA Como, ento, se inicia a sntese de DNA? Uma enzima chamada primase sintetiza um PRIMER de RNA tanto na fita lider como nos fragmentos de Okasaki

Elongao da cadeia

Atividade revisora (atividade exonuclease 3 5) garante a fidelidade da replicao

Replicon: Unidade do DNA onde est ocorrendo um evento de replicao Origem + Trmino Ativados apenas uma nica vez em cada ciclo celular O genoma de uma clula procaritica possui um nico replicon Cada cromossomo eucaritico possui vrios replicons e todos so ativados uma nica vez no ciclo celular ainda que no simultaneamente

O genoma bacteriano circular possui um nico replicon

A velocidade da forquilha de replicao bacteriana 50.000 pb/min Uma nica origem de replicao em E.coli (OriC, 245 pb) Bidirecional

O genoma eucaritico possui vrios replicons

A velocidade da forquilha de replicao eucaritica 2.000 pb/min

Os replicons eucariticos tem 40-100 kb e so iniciados em tempos diferentes Fase S do ciclo celular demora ~ 6hrs em uma clula somtica

Replicao: Sntese

Replicao em E. coli
Iniciao - 1 estgio da replicao em E.coli
Estrutura da origem de replicao bacteriana oriC

A origem de replicao OriC extremamente conservada. sequncias repetidas com 9 e 13 bases, ricas em A-T so reconhecidas por > 9 enzimas diferentes..

Protenas presentes na origem de Replicao de E.coli DNA A : Reconhece a origem oriC e abre a dupla fita em stios especficos DNA B (helicase) : Desenrola o DNA DNA C : Auxilia a ligao de DNAB na origem HU : Protena do tipo histona que estimula a iniciao Primase (DNAG): Sintetiza os iniciadores de RNA Single strand binding (SSB): Liga a fita simples de DNA RNA polimerase: Facilita a ao da DNAA DNA girase: (topoisomerase): Alivia a tenso torsional gerada pela abertura da dupla-fita Dam Metilase: Metila as sequncias GATC na OriC

Elongao - 2 estgio da replicao

Aplicaes na PCR:

Sentido da sntese 5

3 da cadeia

Capacidade do DNA de desnaturar e renaturar Temperatura de melting Necessidade de iniciadores (primer) Propriedades das DNAs polimerases