UniverzitetSv Kiril i Metodij Filozofski fakultet Institut za defektologija

Predmet:HUMANA GENETIKA 1

Seminarska rabota:

FISH(FLUORESCENCE IN SITU HIBRIDIZATION)

Mentor: Doc.d-r Vladimir.E.Trajkovski

Student: Ana Serafimovska

Skopje 2006

Sodr`ina 1.Voved,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3 2.Metodi za prou~uvawe na hromozomi,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3,4 3.FISH(Fluorescentna in situ hibridizacija),,,,,,,,,,,,,,,4,5,6 4.Upotreba na FISH tehnika,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.,6 5.Komparativna genomska hibridizacija,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,7 6.SKY,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,7,8 7.Multipleks FISH(M-FISH),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,8 8.Sliki,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,8,9 9.Zaklu~ok,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,9 10.Koristena literatura,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,10

VOVED
Bidej}i mojata seminarska e nameneta za FISH(Fluorescence in situ hibridization) kako metoda za prou~uvaqe na hromozomi prvin ne{to op{to da spomneme za hromozomite. Zborot hromozom poteknuva od dva gr~ki zbora chroma-boja i somatelo.Toa se kon~esti strukturi , a poimot go vovel Waldayer vo 1888 godina.Hromozomite imaat sposobnost za boewe i pretstavuvaat hromatinski materijal na jadroto, koj vo tekot na delba na kletkite se diferencira vo stap~esti tvorbi. Tie se najva`ni strukturni elementi na jadroto, bidej}i se nositeli na genetskata informacija na sekoja kletka Nivnata golemina e 1-5 mikrometri, i doaaat do izraz vo tekot na kleto~nata delba koga se maksimalno spiralizirani . Najzabele`itelni se vo tekot na metafazata, koga se najdobri za prou~uvawe. Pri elektro mikroskopskite istra`uvawe hromozomite izgledaat kako ubava granulirana masa. Sekoj hromozom, zavisnio od fazata vo koja se nao|a se sostoi od edna ili dve hromatidi. Sekoja hromatida e sostavena od edna dolga ni{ka - hromonema koja {to vsu{nost prestavuva nukleoproteid (DNA-svrzana so proteini od tipot histoni). Na oddelni mesta po svojata dol`ina, taa ima jazlovidni zdebeluvawa - hromomeri, ~ii broj , golemina i polo`ba kaj sekoj hromozom se konstantni. Hromonemata vo kleto~niot ciklus pri delbenite procesi se spiralizira i despiralizira . Koga e taa maksimalno spiralizirana hromatidata dobiva opredelena forma i golemina.Pri soodveten tretman so organski boi,hromatidata od hromozomite se bojadisuva vo vid na potemni i posvetli segmenti. Pointezivno bojadisanite segmenti go prestavuvaat hetarohromatinot, a posvetlite euhromatinot. Nivniot raspored kaj sekoj vid hromozom e konstanten.Intenzitetot na bojadisuvaweto zavisi od stepenot na spiralizacijata na hromanemata i od nekoi hemiski svojstva na komponentite {to vleguvaat vo nivnata struktura . Zbirot na site hromozomi vo edna kletka, so opis na nivniot broj i morfologija prestavuva kariotip. Hromozomite podredeni sistematski po golemina i morfologija go pravaat kariogramot. [ematskiot prikaz na kariogramot se ozna~uva kako i diogram . Spored Tijo i Levan ( 1956 ) kariotipot na ~ovekot sodr`i 46 hromozomi so specifi~na struktura i golemina.Vo kariotipot postojat 22 para avtosomni ili somatski hromozomi i eden par polovi hromozomi ( gonosomi ) vrz osnova na relativnata dol`ina na avtosomnite hromozomi i polo`bata na centromerite, tie se podeleni vo sedum grupi : A , B , C , D , E , F , G .

METODI ZA PROU^UVAWE NA HROMOZOMITE

Humanite hromozomi se izu~uvaat so niza citogenetski tehniki -metodi . So niv se prou~uva:hromozomskata konstitucija (strukturen i funkcionalen sostav), se otkrivaat razli~ni aberacii na hromozomite kako strukturni taka i numeri~ki , potoa brojot na inaktivnite hromozomi , odnesuvaweto na hromozomite vo mejoza, analiza na hromozomite na fetus i drugo . Preparati 3

za hromozomi na svetlosen mikroskop mo`at da se dobijat samo od kletki vo delba i toa vo metafazata,takvi kletki koi mo`at da se upotrebat za pravewe na preparati za hromozomi kaj ~ovek se:kletkite od koskenata srcevina , limfocitite od perifernata krv , kultura na kletkite od svrznoto tkivo , bazalnite kletki na epidermisot , korenot na vlaknata , kletkite na gonadite (testisi ili embrionalen ovarium ) i drugi.Za analiza na hromozomite naj~esto se kultiviraat limfocitite od perifernata krvNajednostaven metod za kariotipizacija e klasi~niot metod spored Morhead . Osven klasi~niot metod postojat i drugi citogenetski metodi,.Vo 1975 godina Dutrillaux i Lejeune ja razvile tehnikata na prugawe nare~eno generalna tehnika na prugawe ( banding ) . Paralelno so nea se razvila t.n. specijalna tehnika na prugawe.Naj~esto se upotrebuva tehnikata na G prugi , no isto taka i R -prugi ( reverse ) , C-prugi , Q-prugi . Isto taka kako metoda za prou~uvawe na hromozomi poznata e FISH ( fluorescentana in situ hibridizacija ) na koja najpove}e }e se zadr`ime .

FISH ( FLUORESCENTNA IN STU HIBRIDIZACIJA)

Fluorescentena in situ hibridizacija(FISH)prestavuva kombinacija pome|u dve prethodno razvieni tehniki:konvencionalna citogenetika i molekularna biologija.FIHS e {iroko upotrebuvana tehnika vo dijagnostika na klini~ka citogenetika kako i vo gensko mapirawe. Voobi~aen tip na proba za FISH singl genopska sekvenca.FISH ovozmo`uva vizuelizacija, iidentifikacija na specifi~nite DNA I RNA sekvenci( delovi na genot , hromozomski regii i celi hromozomi ) so upotreba na fluorescentni boi i fluorescenten mikroskop . Senzitivnosta na FISH e mnogu povisoka od rutinskata hromozomska analiza . So nea mo`at da se detektiraat promeni do veli~ina od 10 Kb , {to e mnogu pomalku odkolku {to e dol`inata na edna lenta na hromozomot. Zatoa ovaa tehnika dava mo`nost za ispituvawe na hromozomi na submikroskopsko nivo. Isto taka FISH (fluorescentna in situ hibridizacija)morfolo{ka demonstracija na genite i hromozomite na kletki koi ne se vo delba . Osnovata na metodata se dol`i na mo`nosta na vrzuvawe na specifi~niot ,ispituvaniot del od hromozomot (golema nukleotidna sekvenca ), so odnapred poznata proba odbele`ana so fluorescentna boja.Otsustvoto na florescentnoto obojuvawe na hromozomot mo`e da zboruva za delecija na toj del. Ovaa metoda mo`e da go prepoznae baraniot del ( ili cel hromozom ) ne samo vo metafaza , tuku i vo interfazno jadro ( jadro koe ne e vo delba), so {to e mo`na analiza na mnogu pogolem broj na kletki bidej}i ne mora da se vo delba. So toa e ovozmo`eno otkrivawe na mozai~ni kleto~ni linii koi bi bile propu{teni so konvencionalnata tehnika . Zaradi toa ovaa tehnika ima pogolema senzitivnost od konvencionalnoto kariotipizirawe . Preparatite se analiziraat na fluorescenten mikroskop .

Vo minatoto . probite bile oboeni so radioizotopi koi ~esto davale visoka rezolucija , no razvojot na hromozomskata FISH nudi zna~ajno zgolemuvawe na ~uvstvitelnosta i rezolucijata . Pri ovoj metod DNA probata e oboena neposredno od soedinenie na fluorescentni oboeni nukleotidni prekusori, ili indirektno od soedinenie na nukleotidna sodr`ina na molekuli koi po soedinuvaweto vo DNA se pricvrsteni od fluorescentni boi.FISH ima korist od snabduvawe na brzi rezultati koi mo`at da bidat postignati samo so pomo{ na fluorescenten mikroskop. Hromozomskata FISH upotrebena vo metafaza (metafazen FISH),i pozitiven hibridizaciski signal,~esto se poka`uva kako dvojna damka. Maksimalna rezolucija na metafazen FISH e nekolku megabajti . Upotreba na pove}e prodol`eni prometafazi na hromozomi mo`e da dozvoli 1MB rezolucija . Od neodamna novite varijacii bile razvieni kako Fiber FISH koja soedinuva ve{ta~ki rasteglivi od DNA ili hromatinski fibrili dozvoluvaj}i mnogu visoka rezolucija. FISH metoda na hromozomite od interfazni jadro ( interphase FISH )obezbeduva visoka rezolucija , bidej}i hromozomite po svojata priroda se mnogu poprodol`eni vo sporedba metafazni i interfazni hromozomi .

Two-color metaphase and interphase FISH rearrangement in chronic myeloid leukemia

to

detected

BCR-ABL

Upotreba na FISH tehnika

FISH tehnikata se koristi ~esto vo klini~kata praksa . Od osobena polza e pri : A) Potreba od to~no diferencirawe na seks hromozomite kaj pacienti so nesoodvetna seksualna diferencijacija; B) Pri tragawe po mozai~ni linii vo kariotipot; C) Pri potreba na analiza na golem broj kletki zaradi otkrivawe na mozaicizam (nisko procentni mozaicizmi); D) Pri ispituvawe na hromozomskite promeni kaj malignite neoplazmi; E) Se pove}e se koristi za prenatalno otkrivawe na aneuploidii kaj plodot; Poznati se pove}e probi za odbele`uvawe na hromozomite : -Alfa satelitni probi-za odbele`uvwe na centromeri na hromozomi.Sekoj hromozom ima svoja specifi~na proba. -Lokus specifi~ni probi- slu`at za obojuvwe na specifi~en del na hromozomot.Vakvi probi ima mnogu, prakti~ni za sekoj del od genomot, i slu`at za doka`uvawe na mali delecii, duplikacii kako i iznao|awe na mestoto na iskr{uvawe na hromozomot pri translokaciite. -Probi za obojuvawe na cel hromozom- ( whole chromosome painting ) pri {to sekoj hromozom mo`e da se odbele`i so specifi~na proba. So ovie probi se detektira potekloto na marker hromozomite kako i postoeweto na ekstra materijal koj ne mo`e da se objasni od koj hromozom poteknuva so analiza na roditelskiot kariotip . Ovie probi se koristat i za analiza na materijalot od malignite kletki. Otkrieni se tri mo{ne silni FISH tehniki i toa: komparativna genomska hibridizacija , SKY, multipleks FISH ( M-FISH ).

KOMPARATIVNA GENOMSKA HIBRIDIZACIJA Ovaa tehnika se upotrebuva za merewe na razlikite vo kopiraniot broj od poseben hromozomski segment me|u dve razli~ni DNA primeroci . Celosna DNA od eden primerok e oboena so crvena fluorescentna boja, a drugiot primerok so zelena boja . Dvata oboeni DNA primeroci se me{aat vo ednakva koli~ina i se upotrebuvaat kako probna slika za FISH so normalna metafaza na hromozomi . Soodnosot od crveno-zelelena fluorescencija se ispu{ta od probata niz sekoj hromozom vo odredena koli~ina . Ako DNA od posebniot region od hromozomot e pretstavena ednakvo vo dvata primeroci od koi e napravena probata, odnosot na crvena-zelena fluorescencija }e bide 1:1 . Dokolku DNA oboena so zelena i DNA oboena so crveno se od kletki taka da bilo koja od dvete ima nedostatok na materijal ( monosomija ) ili vi{ok na materijal ( trisomija ) , od celiot del na hromozomot , odnosot pome|u crvenozelena fluorescenicija }e bide 1:1 pri {to bilo koja od ovie dvete ima pomalku eden vo kletkata od monosomija i pove}e eden vo kletkata od trisomija . Za primer e prika`ano na slikava:

DNA oboeno so crveno od tkivo na individuaa so parcijalna trisomija od tip na hromozom 18 P, pri {tyo rezultati vo soodnosot me|u crveno - zelena fluorescencija niz 18 P }e bidat 0,5:1 . Ovaa tehnika e otkriena pri studii na hromozomski . aberacii na kancerogeni kletki . SKY Za SKY e va`no da postojat 24 razli~ni hromozomski probi po edna za bilo od 24 humani hromozomi.Ovie hromozomski specifi~ni probi se dobivaat od bilo koi hromozomi i bending tehniki,a se upotrebuvaat i fluorescentni aktivni hromozomski vidovi.Site hromozomski specifi~ni DNA primeroci se oboeni vo razli~ni od fluorescentni boi {to se emitiraat vo razli~ni branovi dol`ini.Vo toj pravec,sekoj human hromozom e prestaven od proba so svoj karakteristi~en spektar na branova dol`ina na fluorescencija.Site 24 probi na humanite hromozomi se kombinirani i upotrebeni za FISH na metafazni hromozomi .

MULTIPLEKS FISH M-FISH Vo multipleks FISH se upotrebuvaat digitalni sliki, posebni za sekoja od pette razli~ni fluorescentni boi nabquduvani so CCD kamera. Slikata se analizira so softverski paket koj sostavuva slika vo koja sekoj hromozom e obele`an so razli~na psevdo boja vo zavisnost od sostavot na fluorescetnite boi.Metodite kako {to e ovaa se posebni za analiza za primerok na tumor. . -So nekolku sliki }e ja prika`am FISH (fluorescentna hibridizacija ). in situ

Zaklu~ok
Fluorescentna in situ hibridizacija u~evstvuva vo razvoj na citogenetika,klini~ka genetika i onkogenetika.So pomo{ na FISH metoda se ovozmo`uva mapirawe na genite,se prou~uva genska ekspresija,se ispituva evolucija na genom.Se primenuva vo ispituvawata povrzani so razvojna biologija,biologija na tumorite,ja istra`uva dinamika na kleto~en ciklus,topografija na jadroto,vr{i analiza na kleto~ni somatski hibridi.

Koristena literatura

1.Strachan.T.,Andres.P.,Human Molekular Genetics3,Third Education,London and New York,2003 2.Ko~ova.M,E.[ukarova-Angelkovska,V.Anastasovska,S.Ko~eva,

Prira~nik po Humana Genetika II 3. Vladimir E. Trajkovski,Humana Genetika,Filozofski fakultet,Institut za defektologija,bul.Krste Misirkov b.b.,1000 Ckopje,Republika Makedonija 4.I Thompson &Thompson,Genetics in Medicine.

5.internet resursi
www.google.com

10