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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA Faculdade de Farmcia

ANLISES QUMICAS DE Manihot multifida (L.) CRANTZ (EUPHORBIACEAE)

Ana Patrcia de Oliveira Pereira

Juiz de Fora, Minas Gerais. 2013

Ana Patrcia de Oliveira Pereira

ANLISES QUMICAS DE Manihot multifida (L.) CRANTZ (EUPHORBIACEAE)

Trabalho de concluso de curso apresentado ao corpo docente da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Juiz de Fora como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Farmacutica. Orientadora: Profa. Dra. Luciana Moreira Chedier

Juiz de Fora, Minas Gerais 2013

Ana Patrcia de Oliveira Pereira ANLISES QUMICAS DE Manihot multifida (L.) CRANTZ (EUPHORBIACEAE)

Trabalho de concluso do curso de Farmcia apresentado ao corpo docente da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Juiz de Fora para obteno do ttulo de Farmacutica.

Aprovado em: ___/___/_____ Banca Examinadora:

Profa. Dra. Luciana Moreira Chedier Universidade Federal de Juiz de Fora

Msc. Cristiane Junqueira Ribeiro Universidade Federal de Juiz de Fora

Mestrando Arthur Ladeira Macedo Universidade Federal de Juiz de Fora Suplente:

Prof. Dr. Daniel Sales Pimenta Universidade Federal de Juiz de Fora

Ficha catalogrfica elaborada atravs do Programa de gerao automtica da Biblioteca Universitria da UFJF, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Dedico esse trabalho s minhas queridas: Madrinha Helena, Dindinha Jalila e Tia Zizi.

AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeo a DEUS por me fazer mais forte do que penso. minha me, pelo amor, dedicao e por acreditar que eu poderia ir mais longe. Ao meu irmo, Joo Paulo, por ser meu melhor amigo. s minhas trs prolas, Madrinha Helena, Dindinha Jalila e Tia Zizi, que so tudo na minha vida e que tornaram tudo isso possvel. Ao Fabricio pelo amor, compreenso e por me incentivar ao me mostrar que os problemas no so to grandes e que podem ser resolvidos com um bom trabalho e fora de vontade. todos do Laboratrio de Fitoqumica e Anatomia Vegetal que contriburam, de forma direta e indireta, para a realizao dos meus trabalhos. Em especial: Arthur Macedo, Arthur Avelino, Ana Carolina, Andrea, Wagner Junior, Samara, Lorena, Luiz Fernando e Mathias, por tanto me auxiliarem nas coletas de ltex e produo das colunas cromatogrficas, pela amizade formada e pelo aprendizado proporcionado atravs do convvio. Todos vocs sabem a contribuio que deram e sou muito grata por isso. Obrigada. Agradeo aos funcionrios e amigos do Departamento de Botnica, em especial Flvia. Agradeo tambm a Msc. Cristiane Junqueira, minha companheira de colunas cromatogrficas, pela amizade, ensinamentos e conselhos. Agradeo aos meus grandes amigos: Elzimar, Gilberto, Lara, Thaisa e Tlio e tantos outros por toda a amizade e fora a mim dada durante toda esta caminhada. Ao Prof. Dr. Daniel Sales Pimenta, pelas oportunidades de trabalhos, pela confiana em mim depositada, pela valiosa orientao e pelos ensinamentos, no s de bancada, que me proporcionaram grande crescimento pessoal e profissional. Voc uma pessoa por quem tenho muito respeito, carinho e admirao. Muito obrigada por tudo! Prof. Dr. Luciana Moreira Chedier, que me recebeu e confiou no meu trabalho. Obrigada por ter compartilhado comigo seus conhecimentos e suas experincias, com toda pacincia, carinho e incentivo. Foi muito enriquecedor realizar esse trabalho. Muito obrigada pelos ensinamentos transmitidos. Plataforma Analtica Farmanguinhos/FIOCRUZ pelas anlises cromatogrficas e

espectromtricas realizadas nesse estudo. Universidade Federal de Juiz de Fora e a Faculdade de Farmcia pela oportunidade de me tornar uma Farmacutica.

O essencial invisvel aos olhos. Antoine de Saint-Exupry

RESUMO A utilizao de espcies vegetais com fins medicinais uma prtica muito frequente e antiga. Mesmo sendo os fins teraputicos da espcie validados pelo uso tradicional, estudos da mesma so necessrios para se conhecer os metabolitos ativos e tamb m para prevenir acidentes como intoxicao. Manihot multifida (L.) Crantz (sin. Jatropha multifida L.), Euphorbiaceae, conhecida vulgarmente pelos nomes flor -de-coral, florde-sangue e mertiolate. A etnofarmacologia registra o uso do seu ltex e de suas folhas para o tratamento de candidase, doenas sexualmente transmissveis, alm de cicatrizante de feridas e lceras estomacais. Diversos trabalhos cientficos afirmam a atividade antimicrobiana de seus extratos, principalmente contra C. albicans. Os metablitos especiais isolados de Jatropha incluem diterpenoides, flavonoides e triterpenoides. Este trabalho teve como objetivo o estudo qumico do ltex e do e xtrato hexnico de folhas de M. multifida . O material botnico foi coletado na Estao Experimental de Cultivo no campus da UFJF, Juiz de Fora, MG. As folhas foram secas, modas e extradas sucessivamente em hexano. O ltex foi coletado em metanol e fracionado em hexano e, em seguida, clorofrmio. Aps evaporao do metanol, o ltex foi liofilizado. O extrato hexnico de folhas e a frao em clorofrmio do ltex foram analisados por cromatografia em coluna com gel de slica. O fracionamento da frao em clorofrmio levou ao isolamento de uma substncia amorfa pardacenta, de cor roxa em revelao com vanilina sulfrica na CCD, sugerindo a presena de terpenoide. O ltex liofilizado e a frao em hexano de folhas foram analisados por coluna cromatogrfica com Sephadex LH-20. Fraes do ltex liofilizado, resultantes desta cromatografia, apresentaram odor adocicado e fluorescncia sob luz UV, sugerindo resultado positivo para lignano-cumarina, como relatado na literatura da espcie. O extrato hexnico de folhas e as fraes do ltex foram enviados para anlise por CG/EM. A frao em hexano do ltex apresentou espectros de massas semelhantes ao cido propanoico e ao esteroide estigmasterol, alm de possuir mais uma substncia ainda no identificada. O extrato hexnico de folhas apresentou espectros de massas compatveis com os cidos palmtico, linolnico e esterico, com os terpenos lupenona, isomultiflorenona e taraxasterol, com o sitosterol e com os alcanos tritriacontano e tetratriacontano. A isomultiflorenona e o taraxasterol no haviam sido relatados em M. multifida . Para purificao e isolamento de substncias promissoras, o trabalho deve ser continuado. Palavras-chave: Manihot multifida; Jatropha; Euphorbiaceae; ltex; extrato hexnico de folhas; CG / EM

ABSTRACT Use species plant for therapeutic practice is very common and old. Even though the therapeutic species validated by the traditional use of the same studies are needed to meet the active metabolites and also to prevent accidents such as intoxication. Manihot multifida (L.) Crantz (Syn. Jatropha multifida L.), Euphorbiaceae, is commonly known by the names flor-de-coral , flor-de-sangue e mertiolate . Ethnopharmacology records the use of its latex and their leaves for the treatment of candidiasis, sexually transmitted diseases, as well as healing of wounds and stomach ulcers. Several scientific studies affirm the antimicrobial activity of its extracts, especially against C. albicans. The metabolites isolated in Jatropha species include diterpenoids, flavonoids and triterpenoids. This work aimed to study the chemistry of the latex and the hexane leaf extract of Manihot multifida (L.) Crantz. The plant material was collected at the Estao Experimental de Cultivo on campus UFJF, Juiz de Fora, MG. The leaves were dried, ground and extracted successively in hexane. The latex was collected in methanol and fractionated with hexane and then chloroform. After evaporation of methanol, the latex was lyophilized. The hexane leaf extract and chloroform fraction latex were analyzed by column chromatography on silica gel. Fractions of chloroform fraction afforded the isolation of a substance amorphous grayish, purple with vanillin sulfuric acid revelation in TLC, suggesting the terpenoid presence. The latex lyophilized and the fraction hexane were analyzed by column chromatography using Sephadex LH-20. Latex lyophilized fractions, resulting from this chromatography showed sweetish odor and fluorescence under UV light, suggesting positive results for coumarino-lignan, as previously reported in the literature species. The hexane leaf extract and the fractions latex were analyzed by GC/MS. The hexane fraction latex presented mass spectrum similar to propanoic acid and steroid stigmasterol, besides having an unidentified substance. The hexane leaf extract produced mass spectra consistent with palmitic, stearic and linolenic acids, with lupenona, taraxasterol and isomultiflorenone terpenes, about sitosterol and tritriacontane and tetratriacontane alkanes. The isomultiflorenone and taraxasterol had not been reported in M. multifida. For purification and isolation of promising substances, the work should be continued.

Keywords: Manihot multifida; Jatropha; Euphorbiaceae; latex; hexane leaf extract; CG/MS.

LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Exemplos fotogrficos de espcies de Euphorbiaceae.. ...........................................................18 FIGURA 2. Diterpenoides isolados de Jatropha podagrica Hook. .............................................................20 FIGURA 3. Manihot multifida (L.) Crantz cultivada na Estao Experimental de Cultivo e Manuteno de Plantas no campus da UFJF. ....................................................................................................21 FIGURA 4. Constituintes qumicos encontrados no ltex de Manihot multifida (L.) Crantz. .....................24 FIGURA 5. Diterpenos isolados do caule de Manihot multifida (L.) Crantz...............................................27 FIGURA 6. Esquema da metodologia de extrao lquido-lquido utilizada para o fracionamento do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz coletado em metanol...........................................................33 FIGURA 7. Esquema dos mtodos utilizados para o fracionamento do ltex de M. multifida (L.) Crantz coletado em metanol, apresentando os seus pesos e posteriores destinos. ..............................35 FIGURA 8. Placas de CCD das fraes cromatografadas em coluna com gel de slica da frao em clorofrmio do ltex ................................................................................................................38 FIGURA 9. Cromatograma da frao em hexano do ltex (primeiro lote) fracionada em coluna de Sephadex LH-20. .....................................................................................................................40 FIGURA 10. Cleomiscosin A, uma lignano-cumarina isolada do caule de Manihot multifida (L.) Crantz (DAS et al., 2003). ...................................................................................................................41 FIGURA 11. Espectros de massas do cido propanoico. .............................................................................42 FIGURA 12. Estrutura molecular do cido propanoico.. .............................................................................42 FIGURA 13. Espectros de massas do estigmasterol.. ..................................................................................43 FIGURA 14. Estrutura qumica do estigmasterol. Adaptado de Awad e Fink (2000). ................................44 FIGURA 15. Espectros de massas verificados para a frao em hexano do ltex de M. multifida (MMFH), para substncia-1. ....................................................................................................................45 FIGURA 16. Cromatograma da frao MMLA/F fracionada em coluna de Sephadex LH 20. ...................48

FIGURA 17. Cromatogramas das fraes de MMFH/G do extrato hexnico de folhas. .............................50 FIGURA 18 Cromatograma obtido do extrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz em CG/EM.....................................................................................................................................52 FIGURA 19. Espectro de massa obtido para o estrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz.. .................................................................................................................................................54 FIGURA 20. Fragmentao do derivado TMS -sitosterol, originando o sinal m/z 129. Fonte: adaptado de Silvrio (2008). ........................................................................................................................55 FIGURA 21. Fragmentao do -sitosterol derivatizado com TMS, originando o sinal m/z 129. Fonte: adaptado de Silvrio (2008). ....................................................................................................55 FIGURA 22. Ester trimetilsilil do cido palmtico e suas principais massas geradas pela fragmentao no EM (ERNESTO, 2006)............................................................................................................56 FIGURA 23. Espectros de massas do ster trimetilsilil palmtico. ..............................................................57 FIGURA 24. Espectros de massas do ster trimetilsilil esterico. ...............................................................58 FIGURA 25. Espectros de massas do ster trimetilsilil do cido linolnico.. ..............................................59 FIGURA 26. Anlise por espectrometria de massa da lupenona. ................................................................61 FIGURA 27. Anlise por espectro de massa do taraxasterol, presente no extrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz..................................................................................................63 FIGURA 28. Clivagem do anel C do taraxasterol, com formao dos ons de m/z 207 e m/z 189. Adaptado de Budzikiewicz et al. (1963). .................................................................................................64 FIGURA 29. Espectros de massas da isomultiflorenona. ............................................................................65

LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Constituintes qumicos isolados do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz ...........................24 TABELA 2. Substncias isoladas do caule de Manihot multifida (L.) Crantz.............................................26 TABELA 3. Ltex e material vegetal (folhas e pecolos) de M. multifida (L.) Crantz coletados na Estao Experimental de Cultivo e Manuteno de Plantas no campus da UFJF. ...............................31 TABELA 4. Peso das fraes do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz coletado em metanol e o nmero de gotas coletadas em cada lote. ..............................................................................................37 TABELA 5. Pesos das fraes obtidas da CC com Sephadex LH-20 da frao em hexano do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz (primeiro lote). ........................................................................39 TABELA 6. Fraes obtidas aps cromatografia em coluna com Sephadex LH-20 do resduo aquoso do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz e seus respectivos pesos. ............................................46 TABELA 7. Pesos obtidos aps cromatografia em coluna com Sephadex LH-20 da frao MMLA/F e seus respectivos pesos..............................................................................................................47 TABELA 8. Fraes do extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz cromatografado em coluna com gel de slica e seus pesos. .....................................................................................48 TABELA 9. Sub-fraes da cromatografia em coluna com gel de slica da frao MMFH/G, do extrato hexnico de folhas, e seus respectivos pesos. ..........................................................................50 TABELA 10. Semelhana das substncias identificadas no CG/EM, do extrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz, com a biblioteca do aparelho e os tempos de reteno por elas apresentados.............................................................................................................................53

SUMRIO
1. 2. 2.1. INTRODUO .......................................................................................................................................15 REVISO DE LITERATURA .....................................................................................................................17 Famlia Euphorbiaceae .....................................................................................................................17

2.1.1. Aspectos botnicos da famlia .........................................................................................................17 2.1.2. Aspectos qumicos da famlia ..........................................................................................................18 2.2. 2.3. Gnero Jatropha...............................................................................................................................19 Espcie Manihot multifida (L.) Crantz ..............................................................................................21

2.3.1. Aspectos qumicos da espcie e outras atividades biolgicas ........................................................23 3. 3.1. 3.2. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 5. 5.1. 5.2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................28 Geral .................................................................................................................................................28 Objetivos especficos ........................................................................................................................28 MATERIAIS E MTODOS .......................................................................................................................29 Identificao .....................................................................................................................................29 Coleta e processamento do material vegetal ..................................................................................30 Obteno dos extratos .....................................................................................................................31 Fracionamento do ltex ...................................................................................................................32 Extrao do material vegetal ...........................................................................................................33 Anlises por cromatografias.............................................................................................................33 RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................................................................................37 Rendimento dos extratos .................................................................................................................37 Anlise do fracionamento do ltex ..................................................................................................37

5.2.1. Frao em clorofrmio ....................................................................................................................37 5.2.1.1. Frao em clorofrmio do primeiro lote .........................................................................................37 5.2.1.2. Frao em clorofrmio do segundo e terceiro lotes .......................................................................39 5.2.2. Frao em hexano ...........................................................................................................................39 5.2.3. cido propanoico ............................................................................................................................41 5.2.4. Estigmasterol ...................................................................................................................................42 5.2.5. Substncia-1 ....................................................................................................................................45 5.2.6. Resduo aquoso do ltex .................................................................................................................46 5.2.6.1. Frao MMLA/F do resduo aquoso do ltex de M. multifida (L.) Crantz .......................................47

5.2.7. Extrato Hexnico de Folhas .............................................................................................................48 5.2.7.1. Anlise por cromatografia com fase gasosa acoplada ao espectrmetro de massas do extrato bruto hexnico. ............................................................................................................................................51 5.2.7.2. Derivado trimetilsilil do -sitosterol................................................................................................53 5.2.7.3. cidos Graxos ..................................................................................................................................55 5.2.7.4. Tetratriacontano e Tritriacontano...................................................................................................60 5.2.7.5. Lupenona .........................................................................................................................................60 5.2.7.6. Taraxasterol .....................................................................................................................................63 5.2.7.7. Isomultiflorenona ............................................................................................................................64 6. CONCLUSO .........................................................................................................................................66

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................................................................68

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1. INTRODUO Ao longo dos sculos, os recursos teraputicos para o tratamento de diversas doenas concentraram-se nos recursos da natureza, sendo o uso de produtos de origem vegetal a principal contribuio para o desenvolvimento da teraputica moderna. A arte de curar pelo uso de plantas medicinais uma forma de tratamento muito antiga, relacionada s origens da medicina e fundamentada no acmulo de informaes por sucessivas geraes. Dessa forma, as observaes populares sobre o uso e a eficcia de plantas medicinais contribuem para a divulgao das atividades teraputicas dos vegetais e tornam vlidas informaes teraputicas que foram sendo acumuladas durante sculos (CALIXTO e SIQUEIRA, 2008; BRASIL, 2006; MACIEL et al., 2002). No Brasil, a histria da utilizao de plantas no tratamento de doenas apresenta influncias das culturas indgenas, europeias, africanas e asiticas (ALMEIDA, 2000). Tanto nas regies mais pobres quanto nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais so comercializadas em feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais, sendo muitas vezes o nico recurso teraputico de vrias comunidades e grupos tnicos (MACIEL et al., 2002). Devido facilidade de acesso, a fitoterapia muito utilizada na automedicao e esta prtica pode agravar seus riscos potenciais. Portanto, o conhecimento cientfico sobre o uso seguro de plantas medicinais e medicamentos deve ser transmitido aos mdicos, farmacuticos e aos usurios destes produtos (FARNSWORTH et al., 1985). O Brasil o detentor da maior biodiversidade mundial, com cerca de 20% das espcies vegetais do total existente no mundo. As florestas brasileiras so uma gigantesca farmcia popular espera de serem aproveitadas. Somente em plantas superiores, o Brasil conta com cerca de 60 mil espcies, correspondentes a algo em torno de 22% do total aproximado de 250 mil existentes em todo o planeta, sendo mais de 7% de espcies endmicas (BRASIL, 2006; VALOIS, 1998). As preocupaes globais sobre a biodiversidade e as ideias de desenvolvimento sustentvel trouxeram novos ares aos estudos das plantas medicinais brasileiras que acabaram despertando novamente interesse sobre a fitoterapia (LORENZI e MATOS, 2008). Alm disso, a biodiversidade do Brasil considerada uma grande fonte de substncias biologicamente ativas, sendo um enorme potencial como fonte de novos frmacos e fitofrmacos, ainda pouco explorada com este propsito (BARREIRO e BOLZANI, 2009; BARREIRO e FRAGA, 2002).

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So inmeros os exemplos de medicamentos que so desenvolvidos diretamente ou indiretamente de produtos naturais. A morfina, a pilocarpina, os digitlicos, a emetina, a vincristina, a colchicina e a rutina so exemplos de substncias isoladas de plantas amplamente utilizadas na clnica. Um grande montante de publicaes recentes reafirma a importncia dos produtos naturais como origem de frmacos e a cada momento novas molculas so relatadas, algumas de relevante ao farmacolgica, como a forscolina, o taxol e a artemisinina (BARREIRO e BOLZANI, 2009; CALIXTO e SIGUEIRA, 2008). Os produtos naturais tambm so utilizados como matria prima para sntese de molculas complexas de interesse farmacolgico, aumentando ainda mais o interesse da indstria farmacutica para o desenvolvimento de novos frmacos (YUNES e CECHINEL-FILHO, 2009). Por outro lado, a ao das plantas medicinais pode nunca ser completamente compreendida quando se analisam os seus componentes separadamente. Os defensores do sinergismo qumico afirmam que as propriedades teraputicas se devem s interaes entre os mltiplos constituintes da planta, sendo a ao das substncias juntas maior que a soma aritmtica da ao individual dos componentes (LPEZ, 2010). O entusiasmo em relao ao estudo de plantas medicinais e seus extratos vm crescendo na assistncia sade em funo de sua fcil aceitabilidade, disponibilidade e baixo custo, porm importante que sejam agregadas garantias cientficas para o uso racional e seguro dos vegetais (SIMES, 2004; FARNSWORTH et al., 1985).

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2. REVISO DE LITERATURA 2.1. Famlia Euphorbiaceae 2.1.1. Aspectos botnicos da famlia A famlia Euphorbiaceae, pertencente ordem Malpighiles, apresenta como uma das principais caractersticas botnicas a produo de plantas txicas latescentes. Esta famlia possui cerca de 300 gneros de ampla distribuio geogrfica, ocorrendo principalmente nos trpicos e subtrpicos. No Brasil h cerca de 70 gneros e 1000 espcies, representando uma das maiores famlias da flora brasileira. So plantas com porte arbreo, arbustivo e lianas. Muitas espcies so produtoras de resinas ou ltex (TROPICOS.ORG, 2012; SOUZA e LORENZI, 2005). Os gneros mais expressivos da famlia so Euphorbia, com 1500 espcies, Croton com 700, Acalypha e Phyllanthus com 400 cada, Macaranga com 250 e Antidesma, Drypetes, Tragia, Jatropha e Manihot com 150 espcies cada (CRONQUIST, 1981). Dentre os gneros nativos no Brasil destacam-se, pelo nmero de espcies e/ou pela sua utilidade, os seguintes: Croton (sangue-de-drago, capixingui, marmeleiro do Nordeste e outros), Phyllantus, Euphorbia, Jatropha, conhecidas como pinho-do-Nordeste, com vrias espcies ornamentais (JOLY, 1985). As Euphorbiaceae so de importncia na medicina popular e na economia, de grande relevncia na alimentao humana, como o caso da Manihot esculenta Crantz - chamada de mandioca ou macaxeira, produo de ltex (borrachas), leos utilizados nas indstrias de tintas, plsticos, sabes duros, fibras sintticas, pigmentos para tecidos, perfumes, batons e lubrificantes de motores e turbinas (MACHADO, 2007). Dentre as espcies de interesse econmico destacamse: Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Mll. Arg. (seringueira), nativa da floresta Amaznica, Manihot esculenta Crantz (mandioca) e Ricinus communis L. (mamona), observadas na Figura 1. Vrias espcies so utilizadas como ornamentais, aspecto dado por brcteas e folhagem, visto que suas flores no so vistosas, dentre essas, as mais comuns so Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch (bico-de-papagaio) e Euphorbia milii Des Moul. (coroa de cristo). A espcie Manihot multifida (L.) Crantz tambm cultivada como ornamental (BUCH et al., 2008; SOUZA e LORENZI, 2005). Muitas espcies de Euphorbiaceae apresentam sementes txicas, sendo comuns os acidentes causados por sua ingesto, como as das espcies Aleurites moluccana Willd. (nogueira-

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de-iguape) e Joannesia princeps Vell. (purga de cavalo). O ltex tambm pode causar acidentes, principalmente quando em contato com mucosas e neste contesto encontra-se a avels (Euphorbia tirucalli L.), muito utilizada no nordeste como cerca viva onde recebe o nome de cega-olho (LORENZI e MATOS, 2008; SOUZA e LORENZI, 2005). Segundo Valadares et al. (2007), o Centro de Informaes Toxicolgicas de Gois (CITGO) em levantamento no estado de Gois constatou que, dentre as 18 espcies botnicas relacionadas com intoxicaes no estado, cinco delas (28%) pertenciam famlia Euphorbiaceae.

FIGURA 1. Exemplos fotogrficos de espcies de Euphorbiaceae. A: Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Mll. Arg. (seringueira)*. B: Manihot esculenta Crantz (mandioca)**. C: Ricinus communis L. (mamona)***. Fontes: * IPEF; ** Oregon State University ; *** Nbrega (2008).

2.1.2. Aspectos qumicos da famlia Euphorbiaceae apresenta-se caracterizada por metabolitos especiais oriundos da via do acetato, sendo os terpenos (di- e triterpenoides) majoritrios (Figura 2). Vrios estudos fitoqumicos da famlia revelaram a presena de outras substncias qumicas biologicamente ativas, sendo estas bem variadas, tais como flavonoides e alcaloides, saponinas, steres, glicosdeos cianognicos, taninos, lignanas, lecitinas e glicoprotenas (AMARAL et al., 2005; GROSSO, 2004; SOUZA et al., 2005; MILANOWSKI et al., 2002; BITTNER et al., 2001). O gnero Phyllanthus, por exemplo, que popularmente utilizado para o tratamento de clculos renais e urinrios, infeces intestinais, diabetes e hepatite, possui constituintes isolados como

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flavonoides, taninos, alcaloides, cumarinas, ligninas e terpenos, aos quais so atribudas as propriedades analgsicas, antinflamatria, antiviral, hipoglicemiante, antiespasmdica e antialrgica do gnero (CALIXTO et al., 1997). O princpio txico das Euphorbiaceae no totalmente identificado, podendo ser uma toxoalbumina, saponina ou outra frao solvel em gua que, quando ingerida provoca intensas irritaes gastrintestinais e complicaes hidroeletrolticas, com clicas, vmitos e diarreias intensas (ALBUQUERQUE et al., 2004). 2.2. Gnero Jatropha Jatropha multifida L. foi recentemente colocada no gnero Manihot, com o nome de Manihot multifida (L.) Crantz. Desta forma, os dois gneros foram abordados ao longo deste trabalho. O gnero Jatropha contm aproximadamente 170 espcies distribudas nas regies tropicais e subtropicais da frica e Amrica, apresentando-se como ervas, arbustos ou rvores. So exemplos de espcies que representam o gnero: Jatropha gossypiifolia, J. curcas, J. podagrica, J. elliptica, e J. glandulifera. As plantas deste gnero possuem grande importncia econmica, devido aos seus usos medicinais e/ou ornamentais. Outra fonte econmica relevante a promissora produo de biodiesel a partir do leo de Jatropha curcas, que j possui vrios produtos do seu leo empregados na indstria, como lubrificante em motores a diesel e na fabricao de sabo e tinta (KRISHNAN e PARAMATHMA, 2009; ACHTEN et al., 2008; SLUSZZ e MACHADO, 2006). Alm disso, trabalhos cientficos descrevem diferentes substncias biologicamente ativas j isoladas de Jatropha L. (Euphorbiaceae), principalmente da presena de diterpenoides macrocclicos nas razes das plantas, que apresentam comprovadas atividades antileucmica, antineoplsica e antitumoral (LORENZI e MATOS, 2008). Em Jatropha gaumeri Greenm., por exemplo, foi encontrada grande concentrao de terpenos (CAN-AK et al., 2004), assim como em Jatropha elliptica (Pohl) Oken, que ainda apresentou cumarinas (GOULART et al., 1993). Em pesquisa realizada com Jatropha unicostata Balf. f. foi relatada a presena de cumarinas e flavonoides (FRANKE et al., 2004). Jatropha maheshwarii Subram. & M.P. Nayar apresentou grande variedade de metablitos especiais, tais como esteroides, flavonoides, alcaloides,

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saponinas e taninos (VISWANATHAN et al., 2004). Em estudo com Jatropha curcas L., foram isolados esteroides, alcaloides e flavonoides (IGBINOSA et al., 2009). Aiyelaagbe et al. (2007) isolaram seis diterpenoides (Figura 2) da raiz de Jatropha podagrica, planta usualmente utilizada na medicina popular para o tratamento de infeces da pele e doenas sexualmente transmissveis, como a gonorreia. Dois peptdeos cclicos, podaciclina A e B, foram isoladas do ltex desta espcie (VAN DEN BERG et al., 1996). O extrato das cascas do caule, onde foram encontrados esteroides e triterpenos, foi ativo contra S. aureus (GMC30) e E. coli (RGBC786), e apresentou atividade moderada contra C. albicans (BRASKARWAR et al., 2008).

FIGURA 2. Diterpenoides isolados de Jatropha podagrica Hook. Fonte: Adaptado de Aiyelaagbe et al. (2007).

Mariz et al. (2010), em um estudo de reviso da literatura sobre Jatropha gossypiifolia, planta conhecida como pio-roxo, discutem os efeitos txicos da espcie que, apesar de conhecidos pela populao, a utilizam para diversos fins na medicina popular. Os autores apresentam estudos experimentais relatados na literatura que corroboram com a

etnofarmacologia, como as atividades antimicrobiana, cicatrizante e hipotensora da espcie, sendo possivelmente explicadas pela presena de substncias como alcaloides, terpenoides, flavonoides, lignanas e taninos.

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As espcies do gnero Jatropha so largamente estudadas e constantemente trabalhos sobre substncias bioativas de suas espcies so publicados, mostrando crescente interesse por parte da comunidade cientfica neste gnero. 2.3. Espcie Manihot multifida (L.) Crantz Manihot multifida (L.) Crantz (sinnimo Jatropha multifida L.) conhecida pelos nomes planta-coral, coral, flor-de-coral, flor-de-sangue, blsamo, mertiolate (Figura 3). Nativa da Amrica do Sul, cultivada como ornamental no Brasil. Suas folhas possuem 20-35 cm de comprimento, 5-11 lbulos estreitos, longos, podendo ter as extremidades lisas ou dentadas. Os pecolos possuem at 20 cm de comprimento, os frutos so amarelos ou verdes, contendo trs sementes, e as flores so vermelhas (KRISHNAN e PARAMATHMA, 2009; BUCH et al., 2008).
A B

FIGURA 3. Manihot multifida (L.) Crantz cultivada na Estao Experimental de Cultivo e Manuteno de Plantas no campus da UFJF. A: Planta inteira. B: Ltex sendo retirado do pecolo por ao de corte do mesmo. C: Flores e frutos comparados o seus tamanhos com uma tesoura de poda. Foto: Luciana Chedier

Informaes etnofarmacolgicas (dados no publicados) mostram que moradores das cidades de Piraba e Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil, utilizam o ltex de M. multifida (L.) Crantz para tratar feridas, e por isto nesta regio a planta recebe, entre outros nomes, o nome mertiolate. Em Serto do Ribeiro, Florianpolis, Santa Catarina, a planta tambm recebe este

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nome (GIRALDI, 2009). Moradores da cidade de Alta Floresta, Mato Grosso, Brasil, a utilizam como cicatrizante (HIROTA et al., 2011). Esta propriedade tambm conhecida nas cidades de Jesutas e Bandeirantes, Paran, Brasil, onde os moradores aplicam o ltex sobre os ferimentos para cicatrizao, ou at mesmo o ingerem para tratar lceras gastrointestinais (BUCH et al., 2008). Manihot multifida (L.) Crantz tambm utilizada na medicina popular em outras partes do mundo, como na frica e na sia, onde as folhas e o ltex so utilizadas para o tratamento de feridas infectadas e para tratar doenas sexualmente transmissveis (HAMZA et al., 2006; KOSASI, 1989a), e na China, onde cascas e folhas so usadas para tratar neurodermatite, coceira na pele e eczema (SHU et al., 2008). Dos seus usos populares, o tratamento contra candidase o mais relevante, sendo muito utilizado tambm na frica, principalmente em portadores de HIV/AIDS, que so paciente susceptveis a microrganismos oportunistas como a Candida sp. A veracidade das atividades biolgicas dessa espcie, de acordo com a etnofarmacologia, foi verificada, e concluiu-se que o extrato metanlico de M. multifida possui forte atividade contra Candida sp. e Cryptococcus neoformans (HAMZA et al., 2006). Fabri et al. (2012) corrobora este estudo demostrando atividade dos extratos metanlico, hexnico e aquoso de folhas e do extrato metanlico de frutos de M. multifida que inibiram significativamente o crescimento de Candida albicans. Em um estudo com crianas com candidase oral, Adesola e Adetunji (2007) na Nigria, trataram um grupo delas com ltex de M. multifida e outro grupo com nistatina. Neste estudo M. multifida mostrou-se eficaz no tratamento de candidase oral, com as vantagens sobre a nistatina de ter ao mais rpida e aplicao nica. Vrios trabalhos publicados corroboram o potencial antimicrobiano de M. multifida. Martins et al. (2005) desenvolveram um estudo com oito espcies de plantas, inclusive Manihot multifida (L.) Crantz e verificaram sua atividade antibacteriana e antifngica. Em outro estudo, realizado por Aiyelaagbe et al. (2008) na Nigria, extratos metanlico e hexnico de folhas e caule de M. multifida apresentaram atividade antimicrobiana, tendo o extrato metanlico maior atividade contra Proteus mirabilis do que a droga controle gentamicina. Este estudo ainda mostrou que quatro dos extratos testados apresentaram atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa resistentes a gentamicina.

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Apesar de possuir comprovada atividade antimicrobiana, casos de intoxicao com M. multifida so relatados na literatura, relacionados principalmente com crianas que ingerem a planta. Vrios destes casos ocorreram em Israel, onde crianas foram admitidas nos servios de emergncia aps a ingerir frutos de M. multifida, e apresentaram sintomas como vmito, dor abdominal, diarreia, desidratao e, em alguns casos, miose (LURIE, 2008; KOLTIN, 2006; LEVIN, 2000). No Sri Lanka tambm h casos de crianas que se intoxicaram aps ingerir M. multifida (GURUGE, 2007; LUCAS, 2006). O interesse da comunidade cientfica nos constituintes qumicos de Manihot multifida no s so em busca dos princpios txicos como tambm dos princpios ativos responsveis pela comprovada atividade antimicrobiana e, de acordo com o conhecimento etnofarmacolgico, pela atividade cicatrizante (HIROTA, 2011). 2.3.1. Aspectos qumicos da espcie e outras atividades biolgicas A literatura traz o registro de alguns constituintes qumicos de M. multifida (L.) Crantz que foram isolados. Os terpenoides, que so a classe de metablitos especiais mais encontradas na famlia Euphorbiaceae, tambm so as substncias mais frequentemente descritas na espcie. Outras substncias qumicas isoladas so peptdeos, lignano-cumarinas, acilfloroglucinis e glicosdeos cianognicos (BARBOSA et al., 2011; PICCHI, 2007; VAN DEN BERG et al., 1995; KOSASI et al., 1989a; 1989b; 1989c). Do ltex de M. multifida foram isolados uma proantocianidina, um decapeptdeo cclico denominado labaditim; e dois acilfloroglucinis denominados de multifidol e glicosdeo de multifidol, tendo todas estas substncias apresentado atividade imunomoduladora (KOSASI et al., 1989a; 1989b; 1989c). O peptdeo labaditim e o seu anlogo de cadeia aberta, chamado de L1, foram sintetizados e avaliados quanto aos seus efeitos antimicrobianos, tendo apenas o labaditim reduzido viabilidade de bactrias Gram-positivas, mas no apresentado efeito sobre as Gram-negativas (BARBOSA et al., 2011). Um cianoglicosdeo derivado da isoleucina, porem no-cianognico porque no libera cido cianognico, denominado multifidina, tambm foi isolado do ltex. Posteriormente a multifidina inibiu moderadamente o crescimento de quatros cepas de fungos, mas mostrou-se inativa nos testes de citotoxidez e nos de inibio da enzima acetilcolinesterase (PICCHI, 2007; VAN DEN BERG et al., 1995).

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Os constituintes qumicos encontrados no ltex de Manihot multifida (L.) Crantz esto na Tabela 1 e na Figura 4.

TABELA 1. Constituintes qumicos isolados do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz


Classe e nome das substncias isoladas Peptdeos Labaditim Proantocianidina No denominada Acilfloroglucinis Multifidol e multifidol glicosdeo Cianoglicosdeo Multifidina Antifngica VAN DEN BERG et al., 1995; PICCHI, 2007. Imunomoduladora KOSASI et al., 1989c. Imunomoduladora KOSASI et al., 1989b. Imunomoduladora, antimicrobiana contra Gram-positivas KOSASI et al., 1989a; BARBOSA et al., 2010. Atividade apresentada Referncias

FIGURA 4. Constituintes qumicos encontrados no ltex de Manihot multifida (L.) Crantz. Fonte: Adaptado de Van Den Berg et al. ( 1995); KOSASI et al. (1989a, 1989c).

Do extrato metanlico das folhas de M. multifida foram identificados trs bisflavonas diC-glicosdicas, denominadas de jatrofenol I, jatrofenol II e jatrofenol III, e sete substncias fenlicas identificadas como apigenina-7-O--D-neohespredosida, cido ferlico, quercetina, vicenina-II, isoorientina, vitexina, e luteolina (MOHARRAM et al., 2007). Os terpenoides representam a famlia mais extensa e estruturalmente diferente dentre os produtos naturais, derivados de unidades de isopreno (C5) formados geralmente da juno cabea-cauda, com mais de 55.000 membros j isolados. Os terpenos ou terpenoides podem ser

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classificados de acordo com o nmero de isoprenos que constituem: hemiterpenos, monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) e politerpenos. Os diterpenos, constitudos por quatro unidades de isoprenos, compreendem um grande grupo de substncias no volteis, de baixo peso molecular e insolveis em gua. A literatura relaciona os diterpenos com vrias atividades biolgicas (COSTA, 2012). A literatura descreve vrios diterpenoides que foram isolados do caule de M. multifida (Tabela 5). Alguns destes diterpenos possuem estrutura bastante interessante, como o diterpeno denominado multifidona (14), cuja estrutura peculiar porque um dos seus anis possui seis carbonos enquanto a maioria dos diterpenos encontrados em espcies de Jatropha possuem anel ciclopentano. Com este diterpeno, foram realizados ensaios de citotoxidez in vitro contra quatro diferentes linhagens de clulas cancerosas, e o decrscimo da viabilidade celular em todas as linhagens testadas de forma dose-dependente foi afirmado. Outro diterpenoide peculiar tambm isolado do caule a multidiona (17), que possui um anel fenlico e uma longa cadeia lateral (DAS et al., 2009a; 2009b). Em continuidade aos seus trabalhos de investigao qumica do caule de M. multifida Das et al. (2008; 2009c) isolaram novos diterpenos: multifolona (8); (4E)-jatrogrossidentadiona (9); um derivado acetil do japodagrona, o acetato de 15-O-acetil japodagrona (3); e acetato de 15-epi(4E)-jatrogrossidentadiona. Estes autores tambm isolaram vrios outros metabolitos do caule: jatrofona (1); japodagrona (2); jatrofolona-A (4); jatrofolona-B (5); jatrofenona (6); 15-epi-(4E)jatrogrossidentadiona (7); (4E)-jatrogrossidentadiona (10); citlalitriona (11); 3,12-dihidroxi-13etil-podocarpane-8,10,13-trieno (12); 3-acetoxi-12-metoxi-13-metil-podocarpa-8,11,13-trien-7ona (13); 4-butil-2-cloro-5-formil-1H-imidazol; uma flavona (pictonarigenina) e uma lignanocumarina (cleomiscosina A). Kanth et al. (2011) tambm isolaram dois novos diterpenoides macrocclicos do caule de M. multifida, multifidanol (15) e multifidenol (16), juntamente com vrios metabolitos conhecidos (Tabela 2). Multifidanol e multifidenol apresentaram atividade citotxica significativa contra cinco diferentes linhas de clulas cancerosas. A atividade antimicrobiana dos metabolitos novos foi avaliada contra sete microrganismos: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, S. aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella planticola e Pseudomonas aeruginosa. Multifidanol mostrou relevante atividade contra B. subtilis e contra E. coli, enquanto multifidenol apresentou atividade seletiva contra S. aureus. A presena de uma ligao dupla em

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C-1-C-2 em multifidenol pode ser responsvel por esta atividade antimicrobiana seletiva (KANTH et al., 2011). A Tabela 2 e a Figura 5 trazem as substncias encontradas em M. multifida (L.) Crantz. TABELA 2. Substncias isoladas do caule de Manihot multifida (L.) Crantz.
Figura n Substncia Frmula condensada C20H24O4 C20H28O4 C22H30O5 C20H24O2 C20H24O2 C22H30O4 C20H30O5 C22H30O5 C20H30O4 C22H30O5 C20H28O4 C20H26O4 C18H26O2 Referncias

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Jatrofona Japodagrona 15-O-acetil Japodagrona Jatrofolona-A Jatrofolona-B Jatrofenona 15-epi-(4E)-jatrogrossidentadiona Acetato de 15-epi-(4E)-jatrogrossidentadiona

DAS et al., 2008. DAS et al., 2009c. DAS et al., 2009c. DAS et al., 2009c. DAS et al., 2009c. DAS et al., 2009c. DAS et al., 2008, 2009c. DAS et al., 2009c. DAS et al., 2008. DAS et al., 2008. DAS et al., 2008, 2009c. DAS et al, 2008. DAS et al., 2009c.

(8) (9) (10) (11) (12)

Multifolona Acetato de (4E)-jatrogrossidentadiona (4E)-jatrogrossidentadiona Citlalitriona 3,12-dihidroxi-13-metil-podocarpano-8,10,13trieno 3 -acetoxi-12-metoxi-13-metil-podocarpa8,11,13-trien-7-ona Multifidona Multifidanol Multifidenol Multidiona 4-butil-2-cloro-5-formil-1H-imidazol

(13)

C21H28O4

DAS et al., 2008, 2009c.

(14) (15) (16) (17)

C20H26O3 C20H32O4 C20H30O4 C20H28O3 C8H11ClN2O

DAS et al., 2009a. KANTH et al., 2011. KANTH et al., 2011 DAS et al., 2009b. DAS et al., 2009c.

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FIGURA 5. Diterpenos isolados do caule de Manihot multifida (L.) Crantz. Fonte: Adaptado de Devappa et al. (2010) e Kanth et al. (2011).

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3. OBJETIVOS 3.1. Geral Esse trabalho teve como objetivo o estudo qumico de extratos vegetais obtidos de Manihot multifida (L.) Crantz (Jatropha multifida L.) ampliando o conhecimento da espcie em estudo. 3.2. Objetivos especficos Coleta e identificao da espcie estudada; Obteno de extrato hexnico de folhas da espcie selecionada; Obteno de fraes aquosa, em hexano e em clorofrmio do ltex coletado da espcie; Identificao de substncias presentes na espcie em estudo por meio de anlises cromatogrficas e espectromtricas.

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4. MATERIAIS E MTODOS Os solventes utilizados para as extraes, cromatografias e reaes foram todos grau P.A. da Merck S/A Indstrias Qumicas e Vetec S/A. Para o estudo, foram utilizados os seguintes equipamentos: liofilizador Terroni modelo Enterprise I, balana semi-analtica Marte AY220, cmara escura Biothec 254/365 NM, placa de aquecimento Biomixer DB-IVAC modelo XMTD-71, evaporador rotatrio Fisatom modelo 802. Para o fracionamento cromatogrfico dos extratos foram utilizados gel de slica 60 (0;0630,2 mm / 70-230 mesh ASTM, Macherey Nagel) e Sephadex LH 20. As anlises de cromatografia com fase gasosa acoplada ao espectrmetro de massas (CG/EM) foram realizadas na Plataforma Analtica de Farmanguinhos, Fiocruz, utilizando-se um cromatgrafo com fase gasosa Hewlett Packard 6890 e MS HP5972, munido de um banco de dados WILEY 7n.1. Foi usada uma coluna capilar do tipo HP5MS com 0,25m de espessura do filme, de 30m de comprimento e 250m de dimetro interno. O gs de arraste foi hlio (1mL/min) e as separaes foram realizadas com injetor a 250 C, detector a 280 C e a seguinte programao de temperatura: 70 C aumentando 2 C por minuto at 290 C. Os parmetros da operao de EM foram 70eV, fonte inica 250 C, impacto de eltrons. As anlises cromatogrficas em camada delgada foram realizadas em cromatoplacas em gel de slica 60 G F254 Merck. Os reveladores para cromatografia em camada delgada (CCD) utilizados foram vanilina/cido sulfrico, hidrxido de potssio (KOH) e luz UV (254/365nm). Para a realizao de anlises cromatogrficas e espectromtricas o projeto contou com a colaborao da Plataforma Analtica de Farmanguinhos, Fundao Oswaldo Cruz, estando o grupo de pesquisas cadastrado na Rede de Plataformas da Fiocruz. 4.1. Identificao Exemplares frteis foram coletados e herborizados para identificao taxonmica e depositados no Herbrio da Universidade Federal de Juiz de Fora (MG), com o nmero 54865. A identificao botnica foi realizada pela Msc. Ana Claudia Gioseffi Ramos (Museu Nacional/UFRJ).

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4.2. Coleta e processamento do material vegetal O ltex de M. multifida (L.) Crantz foi coletado na Estao Experimental de Cultivo e Manuteno de Plantas no campus da UFJF, em Juiz de Fora, MG (2145'51"S - 4321'1"O). A coleta do ltex produziu trs lotes que foram obtidos de acordo com as datas da coleta, apenas para ter maior rendimento, no tendo interesse em anlises ecolgicas. O primeiro lote foi coletado em janeiro de 2011, o segundo lote em maio de 2011 e o terceiro lote em janeiro de 2012. O primeiro lote foi obtido nos dias 07; 12 e 17 de janeiro de 2011 nos horrios de 10h13h; 13h-14h e 9h-11h; respectivamente. O ltex coletado no dia 4 de maio de 2011 no horrio de 8h s 10h se refere ao segundo lote. O terceiro lote foi produzido pela coleta do ltex nos dias 04; 06; 10; 11; 12 e 20 de janeiro de 2012 nos horrios de 10h-12h; 9h-12h; 11h-13h; 10h-12h; 11h12h e 9h-11h, respectivamente. O ltex foi coletado em metanol utilizando-se para tanto ao mecnica lesiva aos tecidos vegetais. O material foi recolhido em beckers contendo 100 mL de metanol, identificados por etiqueta contendo: nome da espcie, data da coleta e nome do coletor. Para mensurar a quantidade de ltex coletado, os nmeros de gotas recolhidas foram contados. As folhas e os pecolos originados dos cortes foram recolhidos, obteve-se o peso fresco e o peso seco deste material que posteriormente foram utilizadas para produo do extrato hexnico. A Tabela 3 resume este processo.

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TABELA 3. Ltex e material vegetal (folhas e pecolos) de M. multifida (L.) Crantz coletados na Estao Experimental de Cultivo e Manuteno de Plantas no campus da UFJF.
Peso do Dia da coleta Hora da coleta N de Gotas coletadas Nmero de coletores Metanol utilizado (mL) material vegetal fresco (g) Lote 1 07/01/11 12/01/11 17/01/11 10h - 13h 13h - 14h 9h - 11h * 190 320 2 1 2 Lote 2 04/05/11 8h - 10h 860 3 Lote 3 04/01/12 06/01/12 10/01/12 11/01/12 12/01/12 20/01/12 10h - 12h 9h - 12h 11h - 13h 10h - 12h 11h - 12h 9h - 11h 470 670 425 878 450 900 1 1 3 3 2 4 100 100 150 150 100 200 401 160 285 557 260 420 111 46 76 141 78 88 300 884 180 100 100 100 513 150 221 109 36 50 Peso do material vegetal seco (g)

* Nmero de gotas coletadas no mensurado.

4.3. Obteno dos extratos O ltex coletado foi transferido para recipientes de cor mbar com tampa e aps serem devidamente identificados foram mantidos sob refrigerao e protegidos da luz. Para a extrao lquido-lquido, o ltex em metanol ficou decantando (para remoo de polmeros que se formaram), posteriormente foi filtrado. O filtrado foi colocado em contado com os solventes hexano e, em sequencia, clorofrmio. Folhas e pecolos foram pesados para obteno do peso de material vegetal fresco e posteriormente reduzidos a pequenos fragmentos que foram secos em estufa a 40C. Aps a secagem, o material foi novamente pesado obtendo-se assim o peso do material vegetal seco. Para a produo do extrato hexnico, 433g de folhas e pecolos secos coletados em janeiro de

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2012 (lote 3) foram colocados em contato com o solvente orgnico, procedendo macerao esttica. 4.4. Fracionamento do ltex O ltex em metanol foi retirado do refrigerador e filtrado em papel de filtro. O filtrado foi transferido para funil de separao a fim de realizar a extrao lquido-lquido. Para cada dia coletado foi realizada a extrao liquido-lquido separadamente, porm ao final destas, as fraes foram reunidas obtendo-se cada lote. Primeiramente foi utilizado hexano, em quantidade equivalente a 50% do volume do metanol-ltex, sucessivas vezes. O solvente aps ser adicionado ao funil de separao foi agitado para maior contato entre os solventes e deixado em repouso para a separao das fazes. Cada frao em hexano foi retirada e reduzida em evaporador rotatrio. As sucessivas trocas de hexano ocorreram at que no houvesse mais resduos no balo em que as fraes foram reduzidas. Posteriormente, para a extrao lquido-lquido em clorofrmio, o metanol-ltex foi reduzido em evaporador rotatrio obtendo-se a metade de seu volume inicial e acrescentado o mesmo volume, obtido aps reduo, de gua destilada. Seguiu-se a extrao com clorofrmio, em quantidade equivalente a 50% do volume da frao residual, sucessivas vezes, at que no houvesse mais resduos no balo utilizado para reduzir as fraes. A Figura 6 esquematiza esta metodologia adotada. Aps a realizao da extrao lquido-lquido, a frao residual do primeiro lote foi levada a evaporador rotatrio sob presso reduzida para evaporao do metanol, obtendo-se uma mistura de gua-ltex que foi acondicionada em freezer e, posteriormente, submetida ao processo de liofilizao.

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Ltex em Metanol Hexano Frao metanlica Rotaevaporado metade de seu volume Adicionado gua Hexano Ltex em Metanol e gua Clorofrmio Resduo hidrometanlico Rotaevaporado para a remoo do metanol Resduo aquoso Liofilizao Resduo aquoso FIGURA 6. Esquema da metodologia de extrao lquido-lquido utilizada para o fracionamento do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz coletado em metanol. Frao em clorofrmio Frao em hexano

4.5. Extrao do material vegetal Folhas e pecolos foram submetidos extrao por macerao esttica utilizando como solvente orgnico hexano. Foram realizadas trocas sucessivas de solvente at a exaustiva extrao do material. O solvente foi reduzido em evaporador rotatrio sob presso reduzida, a 45 C, resultando no extrato bruto hexnico. 4.6. Anlises por cromatografias Da frao em clorofrmio do primeiro lote, 77,4 mg foram fracionados em coluna cromatogrfica com gel de slica. Utilizou-se gradiente de polaridades crescentes com hexano, hexano / acetato de etila, acetato de etila, acetato de etila/metanol e metanol. Foram obtidas 19 fraes que foram acompanhadas por CCD, utilizando-se como reveladores luz UV (254/365nm) e vanilina sulfrica. Desta mesma forma, as fraes em clorofrmios do segundo e terceiro lotes

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foram reunidas, e 0,436g foram fracionados em cromatografia de adsoro em coluna com gel de slica, resultando em 71 fraes. Devida a baixa solubilidade apresentada pela frao em hexano do primeiro lote em solventes orgnicos, 58 mg desta foram fracionados por cromatografia por excluso de tamanho, em coluna com Sephadex LH-20, eludos em metanol. As fraes, de aproximadamente 1 mL, foram coletadas na vazo de uma gota a cada 40 segundos. As 74 fraes obtidas foram acompanhadas por CCD, reveladas com luz UV (254/365nm) e vanilina sulfrica. Aps anlise das CCDs realizadas, estas fraes foram reunidas em um total de 11 fraes. Uma poro da frao em hexano do segundo lote, denominada de MMLH/2, foi enviada para anlise por CG/EM. O resduo aquoso do ltex do primeiro lote (2,5 g) foi cromatografado em coluna com Sephadex LH-20, eluda em metanol e tendo as fraes de 2 ml coletadas na vazo de duas gotas por minuto. As 536 fraes obtidas foram acompanhadas por CCD, utilizando-se luz UV (254/365nm) e revelao com vanilina sulfrica para visualizao das substncias. Aps anlise das CCDs, as fraes foram reunidas resultando em 12 fraes. A frao codificada como MMLA/F (85,1 mg) foi novamente cromatografada em coluna com Sephadex LH-20 eluda em metanol e tendo fraes de 1mL coletadas na vazo de 2 gotas por minuto. Foram recolhidas 48 fraes que foram reunidas segundo anlise de CCD, resultando em um total de 7 fraes. A Figura 7 esquematiza este processo.

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Lote 1

Hexano Ltex-Metanol M M

59,3mg M

Sephadex L20

11 fraes Codificadas como MMLH

Ltex-Metanol- gua Clorofrmio M M 77,8mg M


2,5g resduo aquoso do ltex

Slica gel

19 fraes Codificadas como MMLC

Evaporao do metanol Ltex-Metanol-gua

Sephadex LH-20

Ltex-gua
12 fraes, sendo uma delas recromatografada em Sephadex LH-20

Lote 2

Lote 3

SA!!

Hexano Ltex-Metanol M M

27,4mg

CG/MS

Hexano Ltex-Metanol M

173,3mg M

Ltex-Metanol-gua Clorofrmio M M 221,1mg M CG/MS

Ltex-Metanol-gua Clorofrmio M M 435,9mg M

FIGURA 7. Esquema dos mtodos utilizados para o fracionamento do ltex de M. multifida (L.) Crantz coletado em metanol, apresentando os seus pesos e posteriores destinos.

Amostras do extrato bruto hexnico, codificadas como MMFH, foram enviadas para anlises em CG/ EM. Visando o isolamento de substncias puras, 7 g do mesmo foram fracionadas em cromatografia de adsoro em coluna com gel de slica, eluda com solventes em gradiente crescente de polaridade: hexano, hexano / acetato de etila, acetato de etila / metanol e metanol. Fraes de aproximadamente 300 mL foram coletadas, obtendo-se um total de 235 fraes que foram reunidas de acordo com anlise de CCD, utilizou-se vanilina sulfrica e luz UV (254/365 nm) como reveladores, resultando em 21 fraes. A frao obtida no processo

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cromatogrfico codificada como MMFH/G (554,6 mg) foi novamente cromatografada em coluna com gel de slica e analisada por cromatografia em camada delgada, reveladas com vanilina sulfrica e luz UV.

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5. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1. Rendimento dos extratos Os lotes 1, 2 e 3 das fraes em hexano do ltex resultaram em uma massa de 59,3 mg, 27,4 mg e 173,3 mg, respectivamente. As fraes em clorofrmios produziram 77,8 mg, 221,1 mg e 435,9 mg, respectivamente. A Tabela 4 apresenta os rendimentos das fraes. TABELA 4. Peso das fraes do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz coletado em metanol e o nmero de gotas coletadas em cada lote.
N de Gotas coletadas Frao em hexano (mg) Lote 1 Lote 2 Lote 3 > 510 860 2893 59,3 27,4 173,3 Frao em clorofrmio (mg) 77,8 221,1 435,9

A frao residual do primeiro lote foi levada a evaporador rotatrio para evaporao do metanol e posteriormente acondicionado em freezer para ser submetida a processo de liofilizao, que produziu 4,8 g. O extrato hexnico foi obtido por macerao esttica de 433 g de folhas secas de M. multifida, produzindo 9,71 g de extrato bruto, o que corresponde a um rendimento de 2,24% em relao planta seca. 5.2. Anlise do fracionamento do ltex 5.2.1. Frao em clorofrmio 5.2.1.1. Frao em clorofrmio do primeiro lote O ltex foi submetido a extrao lquido-lquido com hexano e clorofrmio. A frao em clorofrmio do primeiro lote (77,4 mg) foi cromatografada em coluna com gel de slica, fornecendo 19 fraes. A frao codificada como MMLC/15 (peso de 50,3 mg), eluda em acetato de etila / metanol (1:1) apresentou uma substncia amorfa pardacenta aps evaporao do solvente e uma nica mancha na anlise por CCD, tanto na revelao com luz UV, quanto na revelao com vanilina sulfrica. Esta frao foi submetida a teste de ponto de fuso, no entanto

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no se fundiu, comeando a carbonizar a partir de 222 C. Devido ao baixo peso desta frao, novos lotes de ltex foram coletados, em maior quantidade, visando produzir nova cromatografia em coluna (CC) de adsoro com gel de slica para que, com maior peso desta frao, a substncia em questo fosse identificada. A anlise da frao em clorofrmio por CCD e revelao com vanilina sulfrica mostrou manchas de cor roxa nas aplicaes 14, 15 e 16, que correspondem respectivamente s fraes denominadas de MMLC/14 ( peso de 0,5 mg), MMLC/15 (peso de 50,3 mg) e MMLC/16 (peso de 0,3 mg), conforme Figura 8.

FIGURA 8. Placas de CCD das fraes cromatografadas em coluna com gel de slica da frao em clorofrmio do ltex, utilizou-se vanilina sulfrica como revelador (CC codificada como MMLC1). Sistema eluente composto por acetato de etila nas placas das aplicaes de 1 a 11 e Acetato de etila / metanol (1:1) nas aplicaes de 12 a 19.

O clorofrmio possui polaridade intermediria, carreando substncias como flavonoides metoxilados, lignanas, triterpenos, lactonas e cumarinas (HIROTA, 2011). Segundo Wagner e Bladt (1995) a revelao com vanilina sulfrica til para a deteco de terpenoides e arilpropanoides. A colorao roxa destas fraes evidencia terpenoides, no entanto, como a frao MMLC/15 se tornou praticamente insolvel em solventes, a mesma no pode ser enviada para anlises espectromtricas. Alm disso, a frao em questo no se fundiu, carbonizando a 222 C e a cromatografia com fase gasosa aplicvel para separao e anlise de misturas cujos

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constituintes tenham pontos de ebulio de at 300 C e que sejam termicamente estveis, e para que as substncias possam ser eludas pelo gs de arraste estas devem se dissolver, pelo menos parcialmente, nesse gs (GRANDE, 2008). 5.2.1.2. Frao em clorofrmio do segundo e terceiro lotes

A frao em clorofrmio do segundo e terceiro lotes (436 mg) foram reunidas e cromatografada em coluna com gel de slica, fornecendo 71 fraes. A sub-frao MMLC/2-G (2,6 mg) mostrou-se interessante nas anlises das CCDs, apresentando uma manchas azul e outra amarela em revelao com luz UV. Desta forma, esta frao foi encaminhada para anlise por CG/EM e apresentou nove sinais no cromatograma e espectros de massas que ainda no foram estudados. A sub-frao MMLC/2-M (300,8 mg) apresentou uma substncia amorfa pardacenta de aspecto idntico MMLC/15. 5.2.2. Frao em hexano A frao em hexano do ltex do primeiro lote, codificada como MMLH-1 (58 mg), foi cromatografada em coluna com Sephadex LH-20, devido sua baixa solubilidade no prprio hexano e no acetato de etila, e eluda em metanol puro. As 74 fraes obtidas foram reunidas aps anlise das CCDs resultando em 11 fraes, de acordo com a Tabela 5. TABELA 5. Pesos das fraes obtidas da CC com Sephadex LH-20 da frao em hexano do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz (primeiro lote).
Fraes 01-07 08-09 10-12 13 14-15 16-17 18-21 22-23 24-32 33 34-74 Codificadas por MMLH/A MMLH/B MMLH/C MMLH/13 MMLH/D MMLH/E MMLH/F MMLH/G MMLH/H MMLH/33 MMLH/I Peso (mg) 1,2 0,9 0,4 0,3 3,3 2,7 2,2 2,7 1,4 0,1 2,8

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As anlises destas CCDs revelaram a presena de 5 substncias, que tornaram-se visveis aps revelao com vanilina sulfrica, tendo duas delas apresentando fluorescncia em presena de luz ultra violeta a 365 nm (Figura 9). A utilizao de KOH intensificou a fluorescncia j existente.
A B

FIGURA 9. Cromatograma da frao em hexano do ltex (primeiro lote) fracionada em coluna de Sephadex LH-20. A: Observao sob luz UV 365nm. B: revelao com vanilina sulfrica. Sistema eluente composto por acetato de etila / metanol (2:3).

Dentre estas substncias pode haver um terpenoide, devido a colorao roxa apresentada aps revelao com vanilina sulfrica. Segundo Wagner e Bladt (1995) a revelao com vanilina sulfrica til para a deteco de terpenoides que podem apresentar colorao vermelhaarroxeada aps a utilizao do reagente. Utilizando-se de um mtodo de frao do ltex semelhante ao utilizado neste estudo, Dias et al. (2007) aglutinaram os ltices de Euphorbia tirucalli e E. milii, plantas que so da mesma famlia de M. multifida, com n-BuOH e submeteram o sobrenadante a frao com metanol: gua/hexano, metanol: gua/diclorometano. Desta forma os autores apresentaram maior rendimento de triterpenos nas fraes em hexanos, de ambas as espcies, do que nas fraes em diclorometano. Estes autores conseguiram mostrar atravs de CG/EM que os triterpenos se encontravam majoritrios nas fraes orgnicas. Segundo Wagner e Bland (1995), o reagente KOH til na revelao de cumarinas que aps aplicao visto a 365 nm como manchas em azul. Este mesmo reagente detecta antraquinonas, que aparecem em vermelho na luz visvel e antronas, que aparecem em amarelo em UV a 365 nm.

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Das et al. (2008) isolaram, entre vrios outras substncias, uma lignano-cumarina do caule de M. multifida. Para tanto, os autores submeteram 4 Kg de planta seca a macerao esttica com clorofrmio / metanol (1:1), obtendo 102,5 g de extrato. Deste extrato foi isolado 16 mg de cleomiscosina A (Figura 10). Como pode ser observado, o rendimento desta lignano-cumarina foi muito baixo. A cleomiscosin A foi primeiramente isolada de Cleome viscosa e posteriormente de J. gossypifolia. Lignano-cumarinas so frequentemente encontradas em espcies de Jatropha (DAS et al., 2003).

FIGURA 10. Cleomiscosin A, uma lignano-cumarina isolada do caule de Manihot multifida (L.) Crantz (DAS et al., 2003).

Em investigao fitoqumica Aiyelaagbe et al. (2009) isolaram uma cumarina de M. multifida, a 8-hidroxi-6,7-dimetoxi cumarina. No mesmo estudo os autores testaram extratos da espcie que apresentaram potente atividade antimicrobiana contra Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorreia e Candida albicans. Devido ao baixo peso das fraes de MMLH-1, um novo lote de ltex foi coletado e, desta forma, a frao em hexano do segundo lote, codificada como MMLH-2, foi enviada para CG/EM. As anlises apresentaram 3 substncias que foram identificadas com base na biblioteca do aparelho como sendo o cido propanoico, o estigmasterol e uma substncia fenlica. 5.2.3. cido propanoico A provvel presena do cido propanoico, com tempo de reteno de 4,905 min, apresentou semelhana com a biblioteca do CG/EM de 56%, m/z do on molecular de 446, sinal base de m/z 71 e sinais de fragmentao de maiores intensidades de m/z 83 (14%), 56 (9,62%), 55 (9%) e 69 (8%), conforme Figura 11.

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FIGURA 11. Espectros de massas do cido propanoico. A: Espectro verificado para a frao em hexano do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz (MMFH). B: Espectro disponibilizado pela biblioteca do aparelho.

O cido propanoico, tambm chamado de cido propinico ou cido proplico (Figura 12), cuja frmula molecular condensada C3H6O2, um cido orgnico voltil aliftico monocarboxlico de cadeia curta e baixo peso molecular, tal como os cidos frmico, actico e butrico (CAMARGO, 2001). cidos orgnicos so encontrados em todos os rgos das plantas e seu acmulo nestes rgos depende do tipo do cido e da planta. Assim, na polpa da ma acumula-se cido mlico, no suco do limo encontra-se cido ctrico, na folha de espinafre acumula-se cido oxlico e em hipoctilo de girassol, os cidos fumrico e mlico (GUTIERREZ et al., 1989).

FIGURA 12. Estrutura molecular do cido propanoico. Fonte: MassBank (2013).

5.2.4. Estigmasterol O estigmasterol, com tempo de reteno de 17,556 min, apresentou semelhana com a biblioteca do CG/EM de 43%, m/z do on molecular de 415, sinal base de m/z 105 e sinais de fragmentao de maiores intensidades de m/z 93 (58%), 206,9 (57%), 119 (55%) e 144,9 (54%), conforme Figura 13.

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FIGURA 13. Espectros de massas do estigmasterol. A: Espectro verificado para a frao em hexano do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz (MMFH). B: Espectro disponibilizado pela biblioteca do CG/EM. C: Espectro de massas do estigmasterol disponvel em dado de base eletrnica, MassBank (2013).

O estigmasterol um fitosterol, substncia qumica de natureza esteroidal, considerado um dos mais difundidos entre as espcies vegetais superiores, assim como o -sitosterol e o campesterol. Os esterides caractersticos de espcies vegetais superiores apresentam semelhana estrutura do colesterol animal, porm com a ligao de cadeias laterais adicionais estrutura ciclopentanoperidrofenantrnica em C-24. Especificamente, o estigmasterol apresenta a ligao de um grupamento etila na referida posio, aliado a ligao dupla trans em 22. O estigmasterol apresenta-se como uma substncia amorfa branca, insolvel em gua e solvel em solventes orgnicos, com ponto de fuso a 170C, frmula molecular C29H48O e peso molecular 412,67 g/mol (OLIVEIRA, 2007). A sua estrutura qumica est representada na Figura 14.

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FIGURA 14. Estrutura qumica do estigmasterol. Adaptado de Awad e Fink (2000).

Os fitosterois possuem vrias aes de interesse farmacolgico, dentre elas a ao hipocolesterolmica. Matvienko et al. (2002) em um estudo com 36 homens voluntrios com hipercolesterolemia, utilizaram uma mistura de fitoesteris contendo 48% de -sitosterol e 21% de estigmasterol, inserida na dieta por 4 semanas e comprovaram a reduo do colesterol total e do LDL-colesterol sem alterao dos nveis sricos de HDL-colesterol e triglicrides, o que vantajoso para evitar a aterosclerose. Os autores atribuem a inibio da absoro intestinal do colesterol biliar e da dieta saturao dos entercitos pela prolongada presena dos fitoesterides dentro das clulas e da inibio da esterificao deste colesterol. Assim, fitoesteris podem ser uma parte importante de uma estratgia global da dieta para controlar os nveis de colesterol, particularmente para pacientes que no podem tolerar drogas redutoras de colesterol (CARR et al., 2010). A literatura cita outros estudos envolvendo fitosterois, como ao antinflamatria, anticancergena e efeitos imunomoduladores. Em um artigo de reviso, Awad e Fink (2000) trazem estudos epidemiolgicos e experimentais que sugerem que os fitosterois na dieta podem oferecer proteo contra os cnceres mais comuns em sociedades ocidentais, tais como cncer de mama, clon e prstata. Alm disso, estes autores discutem os possveis mecanismos dos fitosterois, tais como o efeito sobre a estrutura e funo da membrana de tumor e tecido hospedeiro, sobre as vias de transduo de sinais que regulam o crescimento de tumores e apoptose, sobre a funo imune do hospedeiro e sobre o metabolismo do colesterol. No foi encontrado na literatura pesquisada relatos de fitosterois isolados de M. multifida. Porm estas substncias so bem distribudas no gnero Jatropha, como por exemplo o sitosterol e -sitosterol-3- -d-glucopianosideo isolados de J. maheshwarii, o 5-stigmasta-3,6dieno que est presente em J. curcas e o campesterol e o estigmasterol isolados das folhas de J. unicostata (ZHANG et al., 2009).

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5.2.5. Substncia-1 A substncia no identificada-1, provavelmente uma substncia fenlica, com tempo de reteno de 19,688 min, apresentou on molecular de m/z 394, sinal base de m/z 207 e sinais de fragmentao de maiores intensidades de m/z 394 (74%), 83 (60%), 143 (59%), 128 (51%), conforme Figura 15.

FIGURA 15. Espectros de massas verificados para a frao em hexano do ltex de M. multifida (MMFH), para substncia-1.

No foi possvel identificar a substncia encontrada na anlise do CG/EM da frao em hexano do segundo lote, sendo provavelmente uma substncia fenlica. Fenis so um grupo estruturalmente diverso de metablitos secundrios, mais de 8000 substncias fenlicas j foram detectados em plantas, que inclui os metablitos originados de vias mistas, alm de flavonoides, isoflavonoides e taninos. Dentre os fenis esto os polifenois, tambm chamados de taninos e os flavonoides. Os taninos solveis em gua com massa molecular em torno de 500 e 3000 Daltons, apresentam habilidade de formar complexos insolveis em gua com alcaloides, gelatina e outras protenas (JACOBSON, 2007). J os flavonoides esto amplamente distribudos nas frutas e nos vegetais, apresentando-se sob muitas variaes como flavonois, flavonas, flavanonas, catequinas, antocianinas, isoflavonas e chalconas. Os fenis possuem atividade antioxidante, assim como possvel efeito na preveno de diversas enfermidades cardiovasculares, cancergenas e neurolgicas. De maneira geral, a ao benfica das substncias fenlicas a sade relacionam se a sua atividade antinflamatria, a ao antiplaquetria e a inibio de radicais livres no organismo. Uma vez que protegem molculas como o DNA, podem vir a abortar alguns processos carcinognicos (SILVA, 2010). Em uma pesquisa acerca das propriedades hemostticas de M. multifida, Dougnon et al. (2012) atribui esta propriedade a presena de taninos e flavonoides na seiva da espcie. Neste

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estudo, ratos Wistar foram submetidos a cortes e o tempo de sangramento foi avaliado aps a aplicao de seiva de M. multifida ou gua destilada. A seiva reduziu significativamente o tempo e o volume de sangramento. Desta forma, Dougnon et al. (2012) justifica um dos usos da medicina popular da espcie. Em pesquisa fitoqumica realizada com extratos de razes de espcies de Jatropha, Aiyelaagbe et al. (2000) tambm encontrou taninos. Fabri et al. (2009) ao pesquisar os metabolitos presentes nas folhas e nos frutos de M. multifida, tambm encontrou metablitos especiais fenlicos como flavonides e steres. Apesar da substncia fenlica ter sido encontrada na frao em hexano (MMLH-2), e geralmente fenis so solveis em gua, deve-se lembrar que esta frao no foi solvel no prprio hexano, sendo cromatografada em coluna de Sephadex LH-20 e eluda com metanol. 5.2.6. Resduo aquoso do ltex O resduo aquoso do ltex do primeiro lote foi liofilizado produzindo um peso de 4,8 g, sendo 2,5 g cromatografados em coluna com Sephadex LH-20 e eludos em metanol puro. As 536 fraes obtidas foram reunidas aps anlise de CCDs, resultando em 12 fraes. Os pesos destas fraes so encontrados na Tabela 6. TABELA 6. Fraes obtidas aps cromatografia em coluna com Sephadex LH-20 do resduo aquoso do ltex de Manihot multifida (L.) Crantz e seus respectivos pesos.
Fraes 1-10 11 12-20 21-30 31-40 41-50 51-63 64 65-80 81-90 91-250 251-536 Codificadas por MMLA/A MMLA/11 MMLA/B MMLA/C MMLA/D MMLA/E MMLA/F MMLA/64 MMLA/G MMLA/H MMLA/I MMLA/J Peso (mg) 5,50 6,60 61,80 124,50 206,00 170,20 85,10 130,30 64,50 25,70 700,02 361,30

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As fraes codificadas como MMLA/B (61,8 mg); MMLA/C (124,5 mg); MMLA/D (206 mg), MMLA/E (170,2 mg) e MMLA/F (85,1 mg), que possuem aspecto gelatinoso, cor esverdeada e odor adocicado, apresentaram duas manchas nas anlises das CCDs, uma com fluorescncia esverdeada a 365 nm e outra avermelhada em 254 nm, ambas de cor vermelho carmim aps revelao com vanilina sulfrica. Por ser esta uma frao muito polar, as placas de CCD apresentaram rastro e difcil eluio. Sendo assim, estas fraes, embora pareceram se tratar das mesmas substncias, no foram reunidas. Estas fraes, juntamente com a frao MMLA/64, possuem odor adocicado, que remete a figo. Segundo Lake (1999), o odor adocicado sugere resultado positivo para cumarinas. 5.2.6.1. Frao MMLA/F do resduo aquoso do ltex de M. multifida (L.)

Crantz A frao MMLA/F, com peso de 85,1 mg, aspecto gelatinoso e cor esverdeada, tambm possui odor adocicado e apresentou o mesmo padro de manchas em CCD que MMLA/B; MMLA/C; MMLA/D e MMLA/E, sendo novamente cromatografada em coluna com Sephadex LH-20. As fraes obtidas foram reunidas em um total de 7, de acordo com a anlise das CCDs. A Tabela 7 traz os pesos apresentados pelas fraes. TABELA 7. Pesos obtidos aps cromatografia em coluna com Sephadex LH-20 da frao MMLA/F e seus respectivos pesos.
Fraes 1-20 21-23 24-25 26-30 31-33 34-36 37 38-48 Codificadas por MMLA/F-A MMLA/F-B MMLA/F-C MMLA/F-D MMLA/F-E MMLA/F-F MMLA/F-G MMLA/F-H Peso (mg) 4,8 1,7 2,3 33,4 5,0 3,1 2,0 8,5

As sub-fraes reunidas denominadas como MMLA/F-C, MMLA/F-D, e MMLA/F-E apresentaram em CCD duas manchas em diferentes comprimentos de luz UV, como mostra a

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Figura 16. Estas manchas seguem o mesmo padro de manchas das placas das fraes MMLA/B; MMLA/C; MMLA/D e MMLA/E.
A B C

FIGURA 16. Cromatograma da frao MMLA/F fracionada em coluna de Sephadex LH 20. A: Observao sob luz a 254 nm. B: Observao sob luz a 365nm. C: revelao com vanilina sulfrica. Sistema eluente acetato de etila / metanol (3:7).

5.2.7. Extrato Hexnico de Folhas O extrato hexnico de folhas de M. multifida (L.) Crantz foi cromatografado em coluna com gel de slica. Em todas as 21 fraes resultantes foi possvel observar, atravs de CCD, inmeras substncias, tendo cada frao em torno de 5 ou mais substncias. A Tabela 8 traz os pesos das fraes. TABELA 8. Fraes do extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz cromatografado em coluna com gel de slica e seus pesos.
Fraes 1-6 7-16 17-18 19-25 26-28 29-31 32-46 47-52 53-62 63-80 Codificadas por MMFH/A MMFH/B MMFH/C MMFH/D MMFH/E MMFH/F MMFH/G MMFH/H MMFH/I MMFH/J Peso (mg) 243,3 22,9 3,8 248,3 349,6 1851,2 554,6 904,0 759,5 587,4

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81-91 92-112 113-142 142-156 157-181 182-194 195-203 204-209 210-220 221-225 226-235

MMFH/L MMFH/M MMFH/N MMFH/O MMFH/P MMFH/Q MMFH/R MMFH/S MMFH/T MMFH/U MMFH/V

375,0 386,5 437,8 67,0 189,7 189,7 64,7 94,0 78,8 219,6 376,7

Vrias fraes apresentaram-se interessantes na anlise por CCD, devido a manchas fluorescentes em 365 nm. Substncias que absorvem luz ultravioleta, chamadas cromforas, possuem sistemas insaturados em sua estrutura e so indicativos de substncias ativas (VACONDIO et al., 2009). Uma delas foi a frao MMFH/G, com peso de 554,6 mg, de cor amarela e aspecto gelatinoso, obtida na coluna com a eluio de hexano/ acetato de etila (49:1). Desta forma, na tentativa de se isolar alguma substncia promissora, a frao codificada como MMFH/G foi novamente cromatografada em coluna com gel de slica. A coluna foi eluda com solventes em gradiente crescente de polaridade, sendo utilizado hexano, hexano / acetato de etila, acetato de etila e metanol. Foram aplicados 461,7 mg desta frao na coluna e recolhidas 73 fraes, que foram acompanhadas por CCD. Estas fraes foram reunidas, segundo anlise das CCDs obtidas resultando em 17 fraes. Estas anlises mostraram que no foi possvel isolar as substncias. A sub-frao que possui a substncia fluorescente que despertou interesse para recromatografia foi a MMFH/G-G. A Tabela 9 apresenta os pesos das sub-fraes. A Figura 17 apresenta as CCDs para a frao MMFH/G do extrato hexnico de folhas.

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FIGURA 17. Cromatogramas das fraes de MMFH/G do extrato hexnico de folhas, fracionada em coluna com gel de slica, reveladas com vanilina sulfrica. Sistema eluente composto por hexano/ acetato de etila (9:1) nas aplicaes de A L e hexano/ acetato de etila (17:3) nas aplicaes de M Q.

TABELA 9. Sub-fraes da cromatografia em coluna com gel de slica da frao MMFH/G, do extrato hexnico de folhas, e seus respectivos pesos.
Sub-fraes 1-11 12 13-16 17-23 24-26 27-29 30-31 32-40 41-43 44-47 48-49 50-54 55-60 61-65 66-68 69-71 72-73 Codificadas por MMFH/G - A MMFH/G - 12 MMFH/G - B MMFH/G -C MMFH/G -D MMFH/G -E MMFH/G -F MMFH/G -G MMFH/G -H MMFH/G -I MMFH/G -J MMFH/G -L MMFH/G -M MMFH/G -N MMFH/ G -O MMFH/G -P MMFH/G -Q Peso (mg) 3,5 20,7 119,6 14,7 5,1 7,3 9,9 19,8 3,7 4,2 2,2 3,4 5,3 2,0 2,1 3,0 19,5

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5.2.7.1.

Anlise por cromatografia com fase gasosa acoplada ao espectrmetro

de massas do extrato bruto hexnico. Uma amostra do extrato bruto hexnico foi enviada para anlise por CG/EM. O cromatograma se encontra na Figura 18. As substncias foram identificadas com base na biblioteca do CG/EM como sendo os cidos graxos hexadecanico, cido linolnico e cido octadecanico, todos estes cidos na forma de ster trimetilsilil; os alcanos tritriacontano e tetratriacontano; os triterpenos lupenona (lup-20(29)-en-3-ona), isomultiflorenona (D:CFriedoolean-8-en-3-ona) e taraxasterol. Estas substncias apresentaram tempos de reteno de 9,362; 10,929; 11,159; 16,239; 17,599; 20,142; 19,975 e 20,469 min, respectivamente. Alm desses metablitos, uma substncia, que no foi identificada pela biblioteca do aparelho mas que possui espectro de massa disponvel na literatura compatvel com o do -sitosterol, possui tempo de reteno de 19,604 min. A Tabela 10 relaciona a semelhana das substncias com a biblioteca do aparelho e os tempos de reteno por elas apresentados.

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FIGURA 18 Cromatograma obtido do extrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz em CG/EM. Os sinais cromatogrficos representam o (9,362 min), ster trimetilsilil linolnico (10,929 min), ster trimetilsilil esterico (11,159 min), tritriacontano (16,239 min), tetratriacontano (17,599 min), isomultiflorenona (D:C-Friedoolean-8-en-3-ona) (20,142 min), -sitosterol (19,604 min), lupenona (sinal de maior intensidade) (19,975 min)e taraxasterol (20,469 min ).

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TABELA 10. Semelhana das substncias identificadas no CG/EM, do extrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz, com a biblioteca do aparelho e os tempos de reteno por elas apresentados.
Substncia cidos graxos ster trimetilsilil palmtico cido linolnico ster trimetilsilil esterico Alcano Tetratriacontano Tritriacontano Triterpenos Lupenona (lup-20(29)-en-3-ona) Isomultiflorenona (D:C-Friedoolean-8-en-3-ona) Taraxasterol Derivado trimetilsilil do 20,142 19,975 20,469 91% 90% 83% 16,239 17,599 91% 91% 9,362 10,929 11,159 50% 64% 53% Tempo de reteno (min.) Semelhana

-sitosterol

19,604

5.2.7.2.

Derivado trimetilsilil do -sitosterol

A substncia que possui tempo de reteno de 19,604 min apresentou espectro de massas com on molecular (M+) de m/z 486, sinal base de m/z 357 e sinais de fragmentao de maiores intensidades de m/z 129 (99%), 396 (86%), 73 (64%) e 206 (54%). O -sitosterol, na forma trimetilsilil, apresenta M+ 486, m/z 129, m/z 357, m/z 381, m/z 396, m/z 471 (HANSEL et al., 2008). Desta forma, o espectro de massas da substncia compatvel com o do -sitosterol, na forma trimetilsilil (TMS), conforme o espectro de massas disponvel na base de dados eletrnica MassBank (2013) e conforme o espectro de massas encontrado por Silvrio (2008), presentes na Figura 19.

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FIGURA 19. Espectro de massa obtido para o estrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz. A: Espectro de massa da substncia do extrato hexnico de folhas, cujo tempo de reteno 19,604 min. B: Espectro de massas do derivado trimetilsilil do -sitosterol disponvel em dado de base eletrnica (MassBank, 2013), com a estrutura molecular da substncia. C: Espectro de massas do derivado trimetilsilil do -sitosterol encontrado por Silvrio (2008).

O sinal em m/z 73 caracterstico do on trimetilsilil [(CH3)3Si]+ (SILVRIO, 2008). O fragmento de m/z 129 caracterstico da fragmentao de derivados de TMS de esterides com hidroxilas na posio 3 (AMO et al., 2010; SILVRIO, 2008). A formao deste fragmento mostrado na Figura 20, em que os sinais dos ons m/z 129 e [M-129]+ correspondem eliminao de um fragmento contendo o grupo TMS e de trs carbonos C1, C2 e C3. Esta fragmentao favorecida, pois o rearranjo do hidrognio ocorre atravs de um anel de seis membros e a clivagem acontece na posio allica. Estudos com marcao com deutrio comprovaram que o carbono C4 no participa do on m/z 129 (SILVRIO, 2008).

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FIGURA 20. Fragmentao do derivado TMS -sitosterol, originando o sinal m/z 129. Fonte: adaptado de Silvrio (2008).

O on [M-129]+ formado via anel de seis membros, aps clivagem da ligao na posio allica. O H do C2 migra para o C6, como representado na Figura 21.

FIGURA 21. Fragmentao do -sitosterol derivatizado com TMS, originando o sinal m/z 129. Fonte: adaptado de Silvrio (2008).

Como mencionado no item 5.2.4, fitosterois so bem distribudos em espcies do gnero Jatropha. 5.2.7.3. cidos Graxos

Os lipdios nos vegetais podem ser agrupados em dois tipos: de reserva, que so encontrados nos frutos e nas sementes na forma de leo, e estruturais, que compem as membranas biolgicas e as superfcies de proteo e so compostos principalmente por glicolipdios e fosfolipdios. Os cidos graxos mais comuns so o mirstico (C14:0), palmtico (C16:0), esterico (C18:0), linolico (C18:2) e linolnico (C18:3), que totalizam

aproximadamente 90% da frao lipdica. J os cidos graxos com 20 e 22 tomos de carbono encontram-se em baixos teores (HARWOOD, 1997). No CG/EM de MFH esto presentes trs

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destes lipdios que so mais frequentes em plantas: palmtico, esterico e linolnico, todos na forma de ster trimetilsilil. O ster trimetilsilil palmtico apresentou espectro de massas com on molecular de m/z 328, sinal base de m/z 313 e sinais de fragmentao de maiores intensidades de m/z 117 (69%), 73 (49%), 75 (38%) e 129 (34%). Estes resultados corroboram Christie (2012), que afirma que o sinal base (m/z 313) representa a perda de um grupo metil a partir do grupo ster do trimetilsilil, enquanto que o sinal m/z 132 formado a partir de rearranjo de McLafferty. De acordo com Ernesto (2006), o sinal de m/z 285 corresponde perda do etileno e um radical metil [M-43]+, o sinal de m/z 269 resultante da eliminao de CO2 e um radical metil [M-59]+ e o de m/z 201 do ster de TMS derivado da ciso de cadeia aliftica [M-127]+. J os sinais de m/z 73 ([CH3Si]+), 75 ([CH2SiOH]+) e [M -15]+ (que neste caso o sinal de m/z 313, que se forma devido a perda de um grupo metila do TMS), so tpicos de todos os derivados de trimetilsilil (ERNESTO, 2006). A fragmentao deste ster de cido graxo representada na Figura 22 e seus espectros esto representados na e Figura 23.

FIGURA 22. Ester trimetilsilil do cido palmtico e suas principais massas geradas pela fragmentao no EM (ERNESTO, 2006).

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FIGURA 23. Espectros de massas do ster trimetilsilil palmtico. A: Espectro verificado para o extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz (MMFH). B: Espectro de massa do ster trimetilsilil palmtico segundo a biblioteca WILEY 7n.1 do CG/EM. C: Espectro do ster trimetilsilil palmtico segundo Christie (2012).

O cido esterico (cido octadecanico), na forma de ster trimetilsilil esterico, apresentou espectro de massas com sinal base de m/z 341, correspondente ao sinal [M -15]+, e sinais de fragmentao de maiores intensidades em m/z 117 (73%), 73 (52%), 75 (40%), 129 (35%), conforme a Figura 24.

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FIGURA 24. Espectros de massas do ster trimetilsilil esterico. A: Espectro verificado para o extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz (MMFH). B: Espectro de massa do ster trimetilsilil esterico segundo a biblioteca WILEY 7n.1 do CG/EM. C: Espectro do ster trimetilsilil esterico segundo Christie (2012), com a estrutura molecular da substncia.

O cido linolnico, na forma de ster trimetilsilil, apresentou espectro de massas com on molecular em aproximadamente m/z 337, sinal base de m/z 75 e sinais de fragmentao de maiores intensidades de m/z 73 (86%), 79 (65%), 129 (45%) e 67 (42%), conforme Figura 25.

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FIGURA 25. Espectros de massas do ster trimetilsilil do cido linolnico. A: Espectro verificado para o extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz (MMFH). B: Espectro de massa do cido linolnico segundo a biblioteca WILEY 7n.1 do CG/EM. C: Espectro de massa do cido linolnico segundo base de dados eletrnica (MASSBANK, 2013).

Os leos provenientes das sementes e frutos de Jatropha so de grande interesse para a pesquisa e produo de biodiesel (BANERJI et al., 1995). Esses autores pesquisaram o contedo, as propriedades fsico-qumicas, a composio de cidos graxos e os valores de energia dos leos das sementes de quatro espcies de Jatropha: J. curcas, J. glandulifera, J. gossypifolia e M. multifida. Neste estudo, os autores verificaram que o maior valor de energia dos leos foi o de sementes de M. multifida (13,647 kcal / g). Os cidos graxos encontrados em todas as quatro espcies foram o palmtico, o esterico, o oleico e o linoleico, sendo o cido linoleico majoritrio nos quatro leos. No extrato hexnico de folha (MMFH) analisado por CG/EM, os dois cidos graxos encontrados, cidos palmtico e esterico, corroboram os estudos de Banerji et al. (1995). Estes

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autores apresentam o cido linoleico como majoritrio no leo de sementes de M. multifida, enquanto que o cromatograma de MMFH mostra que nas folhas da espcie o cido graxo encontrado com maior rea de sinal, de 12,11, foi o palmtico. Banerji et al. (1995) encontraram o cido linoleico no leo das sementes. Este cido no foi encontrado no extrato das folhas. J o cido linolnico apresentou sinal cromatogrfico com rea de 5,17 no cromatograma de MMFH, enquanto que o cido esterico apresentou sinal cromatogrfico com rea 1,9. 5.2.7.4. Tetratriacontano e Tritriacontano

O n-tetratriacontano (C34H70) e o n-tritriacontano (C33H68) so alcanos de cadeia linear longa. Os alcanos so hidrocarbonetos saturados alifticos, os de cadeia longa so altamente indigestveis, sendo utilizados para estimar o consumo em animais sob pastejo. So encontrados na cera cuticular, a qual geralmente uma mistura complexa de lipdios alifticos sintetizados pela planta. O prefixo n (normal) para os diversos alcanos significa que os tomos de carbono se encontram em cadeia contnua, sem ramificaes. Cada planta, teoricamente, possui um perfil nico de n-alcanos, imprimindo uma impresso digital para cada indivduo. Por ser constituinte da cera cuticular, normal t-los encontrados no extrato hexnico de folhas (CRTES, 2005). O tetratriacontano apresentou tempo de reteno 17,599 min e espectro de massas com sinal base em m/z 57 e sinais de fragmentao de maiores intensidades em m/z 71 (74%) e 85 (63%), que corrobora os fragmentos do tetratriacontano descritos por RO (2009). Outro sinal de alta intensidade foi o de m/z 99. J o tritriacontano, que representa o tetratriacontano subtrado de uma metila, apresentou tempo de reteno 16,239 min e espectro de massas com sinal base tambm de 57 e sinais de fragmentao de maiores intensidades em m/z 71 (85%), 85 (66%) e 69 (23%). 5.2.7.5. Lupenona

Lupenona, um triterpeno do tipo lupano, apresentou espectro de massas com on molecular de m/z 424, sinal base de m/z 205 e sinais de fragmentao de maiores intensidades em m/z 109 (61%), 95 (58%), 93 (50%) e 121 (50%). Estes resultados corroboram o espectro de massas encontrado por Modugno et al. (2006), conforme Figura 26. A formao do on molecular de m/z 424 e o sinal base de m/z 205 caracterstico da lupenona (BUDZIKIEWICZ et al, 1963). O sinal em m/z 189 pode ser formado pela clivagem do anel C dos triterpenos, com transferncia

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de um tomo de hidrognio, seguindo-se a perda de gua. O mesmo ocorre com o taraxasterol, conforme representado na Figura 28, com a diferena de que na posio 3 o taraxasterol possui um grupo hidroxila enquanto a lupenona possui uma cetona (BUDZIKIEWICZ et al, 1963).

FIGURA 26. Anlise por espectrometria de massa da lupenona. A: espectrometria de massa da lupenona encontrado no extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz. B: espectro de massa da lupenona segundo a biblioteca WILEY 7n.1 do CG/EM. C: espectro de massa da lupenona obtido por Modugno et al. (2006). D: Estrutura qumica da lupenona (C30H48O), adaptado de Prakash e Prakash (2012).

A ocorrncia de lupenona no extrato de folhas indica que pode coexistir o triterpeno lupeol. Fato este verificado por Hirota (2011), que isolou da frao em hexano do extrato bruto etanlico de cascas e folhas de M. multifida, um slido branco em forma de agulhas, que posteriormente identificou como sendo o lupeol. O lupeol possui um grupo lcool na posio 3

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enquanto a lupenona possui um grupo cetona. O lupeol frequentemente encontrado em diversos vegetais e frutas. Estudos de quantificao mostram que a lupeol est presente no fruto da azeitona (3 g / g), frutos de manga (1,80 g / g de polpa), na folha de babosa (280 g / g de folha seca), pera japonesa (175 mg / g de galho e casca) e leo de ginseng (15,2 mg/100 g de leo) (SIDDIQUE e SALEEM, 2011). A literatura cita que este triterpeno pentacclico possui ampla atividade farmacolgica, como para o tratamento de inflamao, artrite, diabetes, doenas cardiovasculares, distrbios renais, toxidez heptica, infeces microbianas, cncer, atividade quimiopreventiva e antiprotozoria (SIDDIQUE e SALEEM, 2011; GALLO e SARACHINE, 2009). A literatura sugere que lupeol um agente atxico, no provoca qualquer toxidez sistmica em animais em doses que variam de 30 a 2000 mg / kg (SIDDIQUE e SALEEM, 2011). A atividade reparadora da pele de lupeol, isolado do ltex de Leptadenia hastata, foi verificada utilizando modelo in vitro de clulas epiteliais humanas. O lupeol promoveu significativa reparao da pele, formando um adequado extrato crneo (NIKIMA, 2001). Harish et al. (2008) demonstraram que a aplicao tpica de lupeol (8 mg / ml de gel de alginato de sdio a 0,2%), em modelo animal, aumenta a cicatrizao de feridas de modo significativo, sendo esta atividade maior do que a da nitrofurazona, medicamento comumente usado para este fim. Aps a verificao da manuteno da textura da pele e sua integridade pelo lupeol, vrios cremes antienvelhecimento da pele e anti-fungos esto em desenvolvimento (SIDDIQUE e SALEEM, 2011). Lupeol um triterpeno que ganhou a ateno dos profissionais de sade, pesquisadores e da indstria farmacutica por sua ampla atividade farmacolgica (SIDDIQUE e SALEEM, 2011). A lupenona foi o constituinte do extrato hexnico de folhas com maior rea do sinal cromatogrfico, 34,49, da cromatografia com fase gasosa. Popularmente utilizada como cicatrizante e em outras afeces da pele, M. multifida possui atividade antimicrobiana e cicatrizante comprovadas (HIROTA et al., 2011; AIYELAAGBE et al., 2008; BUCH et al., 2008; SHU et al., 2008; ADESOLA e ADETUNJI, 2007; HAMZA et al., 2006; MARTINS et al., 2005; KOSASI, 1989a). Desta forma, o lupeol e a lupenona podem ser alguns dos constituintes da planta responsveis por estas atividades.

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5.2.7.6.

Taraxasterol

O taraxasterol tambm foi comparado com base na biblioteca do CG/EM (com semelhana de 83%) e por dados encontrados na literatura (Figura 27). Para este triterpeno no h relatos, na literatura pesquisada, de ocorrncia em M. multifida (L.) Crantz porm, em outras espcies de Jatropha este triterpeno est presente, sendo encontrado nas folhas de J. gaumeri (CAN-AK, 2004) e no leo de sementes de J. curcas (ADEBOWALE e ADEDIRE, 2006). O espectro de massas do taraxasterol exibiu on molecular de m/z 426 e sinais de fragmentao de maiores intensidades em m/z 207 (87,15%) e sinal base de m/z 189 (100%), que podem ser formados pela clivagem do anel C, conforme representado na Figura 28 (BUDZIKIEWICZ et al, 1963). Outros sinais de alta intensidade foram os em m/z 95 (78%); 81 (73%) e 135 (72%).

FIGURA 27. Anlise por espectro de massa do taraxasterol, presente no extrato hexnico de folha de Manihot multifida (L.) Crantz. A: Estrutura qumica do taraxasterol, adaptado de Sasaki (2008). B: Espectro de massa do taraxasterol encontrado no extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz. C: Espectro de massa do taraxasterol segundo a biblioteca WILEY 7n.1 do CG/EM.

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FIGURA 28. Clivagem do anel C do taraxasterol, com formao dos ons de m/z 207 e m/z 189. Adaptado de Budzikiewicz et al. (1963).

5.2.7.7.

Isomultiflorenona

Outro terpeno do extrato hexnico de folhas (MMFH) identificado com base na biblioteca do CG/EM e em dados encontrados na literatura foi a isomultiflorenona (D:C friedoolean-8-en-3one), uma cetona triterpenoide. Em estudo da composio qumica de extrato lipoflico de fibra de Corchorus capsularis, Ro (2009) identificou duas cetonas triterpnicas, sendo uma delas a isomultiflorenona, que possui espectro de massa semelhante ao descrito na literatura (TALAPATRA et al, 1968; BUDZIKIEWICZ et al, 1963). O espectro de massas da isomultiflorenona identificada por Ro (2009) possui fragmentos semelhantes ao presente no espectro de massas de MMFH. Em ambos os espectros, o sinal do on molecular de m/z 424 a e os sinais de fragmentao de maiores intensidades so de m/z 205 (100%); 245 (49,45%) e m/z 257 (68,68%) u.m.a. No h relatos na literatura pesquisada da presena desta cetona triterpnica em M. multifida (L.) Crantz. A Figura 29 apresenta os espectros de massas da isomultiflorenona, segundo Ro (2009) e o espectro verificado para o extrato hexnico de folhas de M. multifida (MMFH).

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FIGURA 29. Espectros de massas da isomultiflorenona. A: retirado de Ro (2009), com a estrutura molecular da cetona triterpnica. B: Espectro verificado para o extrato hexnico de folhas de Manihot multifida (L.) Crantz (MMFH).

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6. CONCLUSO

A literatura comprova a forte atividade antimicrobiana da espcie e corrobora o uso popular contra C. albicans e o tratamento de feridas. Da frao em clorofrmio do ltex foi isolada uma substncia no identificada, amorfa de cor parda, que no se fundiu, carbonizando a 222C. A colorao roxa em revelao com vanilina sulfrica em CCD evidencia terpenoides, no entanto, como a amostra se tornou praticamente insolvel nos solventes testados, a mesma no pode ser enviada para anlises espectromtricas. Na frao em hexano foram encontradas cinco manchas nas CCDs. A frao foi enviada para CG/EM e, de acordo com a biblioteca do aparelho, na amostra h cido propanoico, a substncia fenlica no identificada e o estigmasterol. Fraes do resduo aquoso do ltex obtidas por cromatografia por excluso em Sephadex LH-20 possuem odor adocicado e fluorescncia esverdeada, sugerindo resultado positivo para cumarina, ou lignano-cumarina, como j relatada na espcie. O ltex, embora seja a parte mais utilizada descrita na etnofarmacologia, por ser muito polar foi de difcil trabalho, dificultando as anlises por cromatogrfias em curto perodo de tempo. O extrato hexnico de folhas foi cromatografado em coluna com gel de slica resultando em fraes com inmeras substncias. Desta forma, para isolamento das substncias, novas anlises cromatogrficas devero ser realizadas. Este mesmo extrato foi enviado para anlise por CG/EM para obteno do perfil cromatogrfico. Os espectros foram compatveis com os steres trimetilsilil dos cidos palmtico, esterico e linolnico, que apesar de possurem baixa semelhana com a biblioteca do aparelho, possuem dados plausveis com os da literatura. J o alcano tetratriacontano, os terpenos lupenona, isomultiflorenona e taraxasterol apresentaram alta semelhana com a biblioteca do aparelho. Uma substncia no identificada pela biblioteca do aparelho possui espectro semelhante ao do sitosterol, encontrado na literatura. A lupenona, encontrada neste trabalho, e o lupeol presentes na folha de M. multifida podem ser alguns dos constituintes da planta responsveis por suas atividade antimicrobiana e cicatrizante.

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O taraxasterol est presente em outras espcies de Jatropha mas no havia sido relatado anteriormente, na literatura pesquisada, na espcie estudada. Assim como no h relatos da ocorrncia na espcie do terpenoide isomultiflorenona. O extrato hexnico de folhas possui inmeras substncias promissoras, devendo ser este trabalho continuado para isolamento e identificao das mesmas.

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