ISSN 1517-1973 Dezembro, 2002

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Aplicao da biologia molecular em programas de conservao de recursos pesqueiros

Repblica Federativa do Brasil

Fernando Henrique Cardoso
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Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Marcus Vinicius Pratini de Moraes
Ministro

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Embrapa

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Gerente da rea de Comunicao e Negcios

ISSN 1517-1981 Dezembro, 2002

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Centro de Pesquisa Agropecuria do Pantanal Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos 36

Aplicao da biologia molecular em programas de conservao de recursos pesqueiros

Dbora Karla Silvestre Marques

Corumb, MS 2002

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Pantanal Rua 21 de Setembro, n1880, Caixa Postal 109 Corumb, MS, CEP 79.320-900 Fone: (67) 233-2430 Fax: (67) 233-1011 Home page: www.cpap.embrapa.br Email: sac@cpap.embrapa.br Comit de Publicaes da Unidade: Presidente: Aiesca Oliveira Pellegrin Secretrio-Executivo: Marco Aurlio Rotta Membros: Balbina Maria Arajo Soriano Evaldo Luis Cardoso Jos Robson Bezerra Sereno Secretria: Regina Clia Rachel dos Santos Supervisor editorial: Marco Aurlio Rotta Revisora de texto: Mirane Santos da Costa Normalizao bibliogrfica: Romero de Amorim Tratamento de ilustraes: Regina Clia Rachel dos Santos Foto da capa: Agostinho Carlos Catella e Dbora Karla S. Marques Editorao eletrnica: Regina Clia Rachel dos Santos 1 edio 1 impresso (2002): formato digital Todos os direitos reservados. A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610). Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) Embrapa Pantanal Marques, Dbora Karla Silvestre. Aplicao da biologia molecular em programas de conservao de recursos pesqueiros / Dbora Karla Silvestre Marques. - Corumb: Embrapa Pantanal, 2002. 22 p. (Embrapa Pantanal. Documentos, 36) 1. Marcadores moleculares. 2. Peixe - Biologia molecular. 3. Recursos pesqueiros Conservao I. Embrapa Pantanal. II. Ttulo. III. Srie CDD: 639.4098172 Embrapa 2002

Autores

Dbora Karla Silvestre Marques Mestre em Cincias Biolgicas Embrapa Pantanal Rua 21 de setembro, 1880, Caixa Postal 109 CEP 79320-900, Corumb, MS Telefone (67) 233-2430 marques@cpap.embrapa.br

Apresentao
Este trabalho fez uma reviso sobre os mtodos moleculares aplicveis a propores de conservao pertinente para uma das maiores reas inundveis de gua doce do mundo. Os recursos pesqueiros do Pantanal so a base da segunda atividade econmica da regio, particularmente relacionada pesca esportiva e aplicao dos mtodos moleculares na caracterizao e identificao das populaes de peixes podem fornecer informaes valiosas para o manejo sustentvel desses recursos para o Pantanal.

Emiko Kawakami de Resende Chefe Geral da Embrapa Pantanal

Sumrio

Aplicao da biologia molecular em programas de conservao de recursos pesqueiros...........................................................................................9 Introduo..........................................................................................9 Estudos genticos em peixes .................................................................10 Marcadores moleculares........................................................................11 Eletroforese de protenas .............................................. ...............................12 Seqncias de DNA como marcadores.....................................................13 Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrio (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) ...................................................14 Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Randomly Aplified polymorphic DNA - RAPD)..............................................................................................15 DNA com seqncias repetitivas: micro-satlites e mini-satlites .......................16 DNA mitocondrial ................................................................................17 Consideraes finais ....................................................................................18 Referncias Bibliogrficas ......................................................................19

Aplicao da biologia molecular em programas de conservao de recursos pesqueiros

Dbora Karla Silvestre Marques

Introduo
As pesquisas em gentica de populaes de peixes tm contribudo grandemente para elucidao de questes relativas estruturao de populaes selvagens ou cultivadas de diversas espcies, de sua origem e caractersticas peculiares, tais como sucesso reprodutivo, taxas de divergncias genticas entre populaes, migrao, tamanho da populao, seleo natural e eventos histricos (Parker et al., 1998; Sunnucks, 2000). Esses estudos so de considervel importncia quando se pensa em elaborao de projetos visando a conservao de recursos naturais, levando ao enfoque no papel desempenhado pelas variaes ao nvel do genoma em resposta s mudanas ambientais, particularmente quelas de origem antropognica. Considerando as caractersticas biolgicas dos peixes, a grande diversidade da ictiofauna neotropical e a importncia da pesca em diversas regies do mundo, a utilizao de marcadores genticos pode auxiliar os programas de conservao de recursos pesqueiros. O monitoramento regular das variaes genticas nos estoques pesqueiros faz-se necessrio nos programas de

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conservao, a fim de evitar o declnio da variabilidade gentica (Ward & Grewe, 1995). Nesse contexto, surgiu a expresso biodiversidade, trazendo desde sua origem a idia do conjunto de variabilidade ecolgica, representada pelo nmero de espcies de uma comunidade e suas interaes, e de variabilidade gentica, onde o enfoque a diversidade de alelos nos vrios locos de uma espcie (Sol-Cava, 2001). Biodiversidade representa, ento, um parmetro necessrio manuteno do equilbrio ambiental e ao desenvolvimento sustentvel daquelas atividades ligadas diretamente aos recursos naturais. A biologia molecular tem sido a ferramenta escolhida para os estudos de gentica de populaes e que tem acumulado avanos importantes, gerando tcnicas cada vez mais precisas para o exame de segmentos de DNA, em adio descoberta de variados marcadores moleculares aplicveis aos mais diversos problemas encontrados no estudo de populaes e s anlises estatsticas que permitem desde a estimativa do grau de variabilidade gentica de uma dada populao construo de rvores filogenticas, relacionando espcies prximas e elucidando questes de parentesco. O objetivo desta reviso de literatura descrever de forma sucinta algumas possibilidades de uso de tcnicas em biologia molecular no estudo de populaes e de conservao de peixes.

Estudos genticos em peixes

A ictiofauna neotropical , em biodiversidade, a mais rica do mundo. Segundo Lowe-MacConnell (1987) os grupos de peixes encontrados nessa regio so em sua maioria Characiformes e Siluriformes, que evidenciam uma notvel radiao adaptativa iniciada durante o isolamento da Amrica do Sul no Tercirio. Entretanto, apesar do muito que se sabe atualmente sobre as relaes evolutivas e histria dos diversos grupos de peixes neotropicais, Britski (1992) ressalta que o conhecimento da taxonomia de grande nmero de peixes neotropicais de gua doce necessita de maiores informaes para permitir uma inferncia segura das relaes filogenticas. Nesse contexto, a citogentica de peixes neotropicais tem contribudo na separao de espcies prximas e, muitas vezes, na elucidao da histria evolutiva de espcies e populaes. A citogentica, portanto, tem auxiliado na compreenso das relaes de parentesco entre ou dentro de diferentes ordens, famlias ou gneros de uma mesma espcie, como em Anostomidae e

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Chilodontidae (Martins et al., 2000), Hemigrammus (Scheel, 1973), Bryconamericus (Wasko & Galetti Jr, 1998). Muitas vezes, entretanto, os estudos citogenticos no so suficientemente eficazes na elucidao de questes evolutivas de espcies e populaes de peixes. Assim, os marcadores moleculares so ferramentas indispensveis onde a identificao de espcies com base em caractersticas morfolgicas e citogenticas impossvel, bem como na separao de populaes prximas geograficamente. Portanto, evidente a utilidade cada vez maior dos estudos com marcadores moleculares acerca dos grupos taxonmicos e populaes de peixes. Sua importncia abrange desde as questes evolutivas at a elaborao de programas de manejo para uso em conservao e auxiliando tambm no planejamento do manejo adequado dos estoques cultivados em piscicultura. Neste ltimo, os marcadores moleculares so ferramentas amplamente utilizadas na seleo de linhagens e programas de melhoramento de caractersticas tais como crescimento e ganho de peso.

Marcadores moleculares
Trabalhar com marcadores genticos significa utilizar caractersticas herdveis em indivduos de uma dada populao, considerando que todos os marcadores refletem diferenas nas seqncias de DNA (Sunnuck, 2000). As principais caractersticas dos marcadores moleculares utilizados em estudos de populaes encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Caractersticas dos diversos marcadores moleculares em aplicaes em estudos de populaes de peixes. Caractersticas Material utilizado Expresso gentica Protenas As diversas formas de uma mesma protena Co-dominante Formas alternativas das protenas estudadas espelhando as variaes genticas RFLP DNA nuclear e DNA de organelas Co-dominante Fragmentos de restrio de DNA detectado por hibridizao com sonda de DNA genmico ou cDNA RAPD DNA nuclear e DNA de organelas Dominante Polimorfismo de tamanho de segmentos de DNA amplificados arbitrariamente VNTRs DNA nuclear Co-dominante

Base tcnica

Aplicao especfica de regio contendo seqncia repetitiva

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Os marcadores unilocus so caracteristicamente co-dominantes, ou seja, em um indivduo diplide, ambos os alelos de um determinado locus so identificados, o que os torna altamente informativos. So marcadores unilocus os RFLP e as seqncias de DNA repetitivo mini-satlites e microsatlites. Os marcadores multilocus permitem a visualizao de muitos genes annimos simultaneamente. Entretanto, sua caracterstica dominante, onde somente um dos alelos identificado, torna-os pouco informativos. No entanto, esses marcadores, tais como RAPD e AFLP, so largamente utilizados em estudos populacionais, pois, com base em eventos recentes, permitem a inferncia de relaes de parentesco entre indivduos de uma dada populao e da histria de divergncia entre populaes de uma mesma espcie (Tabela 2).

Eletroforese de protenas
Os estudos moleculares acerca das variaes genticas nas diversas espcies tiveram incio com o desenvolvimento da eletroforese, nos anos 50, quando poucas marcas uni-locus foram descobertas (Parker et al., 1998). Sua base est na migrao diferenciada de molculas com cargas diferentes quando submetidas a um campo eltrico. As pesquisas nesse campo fundamentamse nas mltiplas formas moleculares (allicas) da mesma enzima (isoenzimas) que ocorrem em uma espcie e que desempenham, portanto, a mesma atividade cataltica, mas que podem ter diferentes propriedades cinticas (Ferreira & Grattapaglia, 1995). Podendo-se inferir que as diferenas apresentadas entre as isoenzimas so resultados de diferenas ao nvel das seqncias de DNA que as codificam. Para realizar a eletroforese de protenas, o tecido deve ser homogeneizado em tampo especfico para extrao de enzimas, algumas vezes incluindo ingredientes para anular substncias ligantes s protenas (Parkers et al., 1998) e aplicado a um gel, onde as enzimas sero separadas por tamanho, forma e carga ao longo de um gradiente eltrico. Uma das vantagens tcnicas deste marcador a expresso co-dominante das bandas geradas em gel de eletroforese. Para interpretao do padro de bandas necessrio o conhecimento da estrutura quaternria da enzima. Assim, uma enzima monomrica (constituda por uma nica cadeia polipeptdica) apresentar duas bandas no heterozigoto, uma enzima dimrica (formada pela unio de duas cadeias polipeptdicas) apresentar trs bandas

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no heterozigoto e uma enzima tetramrica apresentar cinco (Solferini & Scheepmarker, 2001). As isoenzimas tm sido usadas em pesquisas de biologia evolutiva principalmente atravs do estudo detalhado de um loco e as suas variantes allicas (alozimas) e a utilizao de muitos locos para estudos populacionais, lembrando, entretanto, que mutaes no material gentico nem sempre levam a alteraes na estrutura protica e nem toda alterao na seqncia de aminocidos provoca diferenas na mobilidade eletrofortica, os nveis de variabilidade podem ser subestimados (Solferini & Scheepmarker, 2001). Toledo Filho et al. (1992) consideram que a eletroforese de protenas a mais aconselhada para o monitoramento de estoques de peixes em projetos de repovoamento por ainda constituir uma das tcnicas mais eficientes para a anlise gentica de populaes de peixes. As protenas tambm tm sido utilizadas em estudos de filogenia (Tringali et al. (1999) e variabilidade de populaes de peixes (Calcagnotto & Toledo-Filho (2000). Entretanto, Sunnucks (2000) considera que este marcador molecular revela pequenas variaes e gera informaes genealgicas limitadas. O autor ressalta, portanto, as vantagens do uso de DNA para estudos em populaes.

Seqncias de DNA como marcadores

Ao contrrio de marcadores enzimticos, o DNA pode ser extrado de tecidos fixados por tempo ilimitado e permite a visualizao direta das variaes ocorridas no genoma individual. Outra vantagem surgiu com o uso da reao em cadeia da enzima polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR) permitindo a amplificao in vitro de cidos nuclicos, resolvendo os problemas relacionados quantidade de DNA a ser utilizado nas reaes em laboratrio. A concepo inicial da tcnica da PCR foi de Kary Mullis, um bioqumico que trabalhava com sntese qumica de oligonucleotdeos em uma firma biotecnolgica da Califrnia, a Cetus Corporation (Matioli & Passos-Bueno, 2001) e consiste, basicamente, na repetio in vitro dos ciclos de duplicao da fita de DNA, j conhecidos atravs dos estudos de biologia molecular. A reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR) possibilita a amplificao exponencial de segmentos de DNA flanqueados por

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seqncias iniciadoras (primers). A tcnica consiste em submeter um mix de primers, tampes, nucleotdeos, enzima polimerase e o DNA de interesse a uma seqncia de cerca de 35 ciclos de variaes de temperatura tima para o pareamento dos primers (variando conforme a seqncia e o tamanho do primer utilizado) e para a extenso do segmento a ser amplificado. Os produtos da amplificao podem ser visualizados diretamente em gel de agarose ou poliacrilamida.

Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrio (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP)

Nesta tcnica, as variaes (polimorfismos) apresentadas so baseadas na aceitao de que o stio de corte de uma mesma enzima encontra-se em diferentes pontos do DNA de indivduos diferentes. Assim, no necessrio o conhecimento prvio das seqncias de DNA a serem utilizadas e isto constitui uma das vantagens observadas neste mtodo. As variaes so explicadas pela diferena entre os tamanhos dos fragmentos gerados pela digesto com enzimas escolhidas pela especifidade dos seus stios de corte (chamadas enzimas de restrio). Se h a segregao Mendeliana de tais fragmentos, conclui-se que elas representam um loco de RFLP e, portanto, podem ser utilizadas como marcador gentico (Ferreira & Grattapaglia, 1995). Resumidamente, a tcnica consiste em submeter o DNA de interesse ao de enzimas de restrio, gerando fragmentos de diversos tamanhos que so separados em gel de agarose por eletroforese. Os fragmentos separados so transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose - Southern Blot (Southern, 1975), onde realizada a hibridizao de sondas radioativas e exposio em filme de raio X para visualizao do padro de distribuio das bandas geradas pela complementariedade entre as sondas e determinadas seqncias do DNA digerido. Uma caracterstica importante do marcador RFLP sua expresso codominante, que o torna vantajoso para estudos de segregao allica, estimativa da variabilidade gentica populacional e gerao de rvores filogenticas. O uso mais amplo das enzimas de restrio nos estudos de populao tem sido o estudo da diversidade allica e diferenciao de populaes em DNA mitocondrial, onde a freqncia allica pode ser quantificada pela presena ou ausncia de stios de restrio entre os indivduos (Parker et al., 1998). Os

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autores explicam que grandes molculas como DNA nuclear no podem ser analisadas pelo uso direto de enzimas de restrio devido grande quantidade de stios de clivagem enzimtica, gerando padres de bandas de difcil interpretao. Este problema solucionado com o uso da tcnica de hibridizao em membrana, aps eletroforese, com sondas que consistem de seqncias complementares aos segmentos de interesse. RFLP tem sido aplicado com sucesso em estudos de populaes de peixes, na determinao de variaes genticas (OConnell et al., 1995; Wolf te al., 2000), avaliao de impacto da introduo de indivduos de cativeiro em populaes selvagens (Ferguson et al., 1995; Clifford et al., 1998) e filogenia (Michael & Phillips, 1995). Como desvantagem do uso do RFLP pode-se citar: (1) a necessidade de grandes quantidades de DNA, uma vez que esta tcnica no utiliza a PCR; (2) os gastos em termos de tempo e dinheiro no procedimento de hibridizao em membrana (Southern Blot Hybridization).

Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Randomly Aplified polymorphic DNA - RAPD)

No uso da tcnica RAPD desnecessrio o conhecimento prvio da seqncia do DNA, uma vez que as variaes genmicas detectadas por este mtodo baseia-se na diferena entre indivduos da distribuio dos stios complementares a um primer curto (10 bases), de seqncia aleatria. Utilizando-se um nico primer por reao, observa-se a gerao de numerosos segmentos amplificados, cujas seqncias so desconhecidas e os tamanhos so variados. Assim, assume-se que diferentes indivduos produzem distintos padres de fragmentos amplificados com base nas diferentes localizaes dos stios de anelamento dos primers ao longo da fita de DNA. As amplificaes resultantes so visualizadas diretamente em gel de agarose ou poliacrilamida, com uso direto de corantes como brometo de etdeo, e cada banda tem carter dominante. Portanto, no possvel detectar alelos. As anlises so feitas considerando a distribuio presena/ausncia das bandas geradas pela reao de amplificao. Este marcador aplicvel em estudos de populaes de peixes para estimativa de variabilidade e similaridade entre populaes, possibilitando a inferncia da histria recente de determinadas populaes.

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Os marcadores RAPD so eficientes na discriminao de espcies onde a identificao por caractersticas morfolgicas tem se mostrado limitada, como por exemplo em peixes do gnero Barbus (Callejas & Ochando, 1998). Alm do uso clssico na estimativa de similaridade gentica entre populaes, os marcadores RAPD foram utilizados com sucesso em grande nmero de pesquisas na obteno de padres espcie especficos em peixes (Dinesh et al., 1993, Takagi & Taniguchi, 1995 e Callejas & Ochando, 1998) e na estimativa de relaes filogenticas entre espcies e subespcies ( Bardakci & Skibinski, 1994, Callejas & Ochando, 1998). De uma forma geral, entre as vantagens da RAPD est a possibilidade de deteco de polimorfismos sem a necessidade de conhecimento prvio das seqncias utilizadas, a visualizao direta em gel e a utilizao de quantidades pequenas de DNA. A principal limitao dos marcadores de RAPD o baixo contedo de informao gentica por loco, pelo fato de ser dominante e, portanto, permitir a deteco de gentipos heterozigotos (Ferreira & Grattapaglia, 1995).

DNA com seqncias repetitivas: micro-satlites e minisatlites

No genoma de diversas espcies ocorrem seqncias repetitivas organizadas em tandem cujos tamanhos podem variar. So chamados VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) e representam loci individuais onde alelos so compostos por repeties em tandem que variam no nmero de unidades do cerne (Nakamura et al., 1987). O DNA satlite foi primeiro identificado na dcada de 60, quando DNA centrifugado sob certas condies foi separado em duas ou mais camadas: uma banda mdia contendo genes e bandas secundrias que tornaram-se conhecidas como bandas satlites, onde foram encontradas as seqncias de DNA repetitivo (Moxon & Wills, 1999). Quando os blocos de DNA repetitivo so compostos por 10 a 64 pares de bases, cujo tamanho total varia de 0,1 a 7,0 Kb, estas seqncias so denominadas mini-satlites (Jeffreys et al., 1985). As seqncias denominadas DNA micro-satlite tm unidades de repetio de 1 a 5 nucleotdeos (Schltterer & Pemberton, 1998). Estes marcadores, tambm chamados sinple sequence repeats (SSRs), so hipervariveis, co-dominantes e revelam variaes de comprimento entre os alelos (Parker et al., 1998; Sunnucks, 2000).

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Sondas baseadas em VNTRs podem detectar simultaneamente grande quantidade de loci hipervariveis, fornecendo um padro fingerprint utilizvel para identificao de indivduos, testes de paternidade e mapeamento gentico (Jeffreys et al., 1985; Nakamura et al., 1987). Em estudos de populaes, o uso de VNTRs considerado um dos mtodos mais efetivos para avaliar o nvel de variabilidade gentica em casos de redues do nmero de alelos e de heterozigosidade (Fergunson et al., 1995). A metodologia de utilizao de micro-satlites baseia-se na amplificao (por PCR) das seqncias simples repetidas utilizando-se um par de primers de seqncias complementares quelas que as flanqueiam. Tendo em vista a expresso co-dominante e o multialelismo, os marcadores micro-satlites so os que possuem o mais elevado contedo de informao de polimorfismo, ideais para mapeamento gentico e fsico de genomas, identificao e discriminao de gentipos e estudos de gentica de populaes (Ferreira & Grattapaglia, 1995). O fator limitante para o emprego de micro-satlites a disponibilidade de informaes em termos das seqncias de nucleotdeos das regies de repeties no genoma do organismo que se deseja estudar, sendo necessria a construo de uma biblioteca genmica do organismo em questo (Matioli & Passos-Bueno, 2001). Os mini-satlites tm sido marcadores muito eficientes na identificao dos estoques pesqueiros (Beacham et al., 1996; Angers et al., 1995; Galvin et al., 1995; Tessier et al., 1995) e vrios micro-satlites tm sido isolados e caracterizados a partir de DNA de algumas espcies de peixes, principalmente em salmondeos (Estoup et al., 1993; Pfeiffer et al., 1997; Banks et al., 1999).

DNA mitocondrial
Clulas de eucariotos apresentam DNA nuclear e DNA de organelas, tais como mitocndrias em animais e cloroplastos em plantas denominados genomas extranucleares (Zaha et al., 1996). O DNA de organelas apresenta fita dupla circular. O DNA de cloroplastos e mitocondrial so moleculas pequenas, apresentando cerca de 120-220 kb e 15-17 kb, respectivamente (Brown et al., 1979; Palmer, 1985 e 1987, Parker et al., 1998). O DNA mitocondrial animal codifica aproximadamente 5% de toda maquinaria necessria para o funcionamento da mitocndria, onde so

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descritos 37 genes, dos quais 13 codificam RNAs mensageiros para protenas envolvidas diretamente no processo de transporte de eltrons e fosforilao oxidativa, dois para subunidades ribossmicas e 22 para RNAs transportadores e h uma regio no codificadora conhecida como A+T nos invertebrados e como D-loop nos vertebrados, que contm o controle da replicao e transcrio desse genoma (Arias & Infante-Malachias, 2001). Ao contrrio do DNA nuclear de herana biparental, o DNA de organelas encontra-se no citoplasma e, portanto, apresenta herana uniparental. Suas seqncias so extremamente conservadas. Assim, comparaes de gentipos nucleares e mitocondriais podem ajudar a reconhecer indivduos hbridos, acasalamentos preferenciais e efeitos estocsticos sobre variantes para as quais o taxa ancestral foi polimrfico, podendo-se gerar rvores filogenticas (Sunnukcs, 2000). Segundo Pereira (2000), o DNA mitocondrial de vrios vertebrados tem sido amplamente utilizado para estudos de populao. O autor tambm explica que a regio controle do genoma mitocondrial freqentemente usada em estudos de populaes devido alta variabilidade em suas seqncias de nucleotdeos, cujos genes codificantes de protenas tais como citocromo b (Cyt b), so geralmente usados para anlises filogenticas. Regies de DNA mitocondrial animal podem exibir considervel variao intra e entre populaes (Parker et al., 1998). Assim, o DNA mitocondrial foi usado com sucesso nos estudos realizados em diversas espcies de peixes, tais como no gnero Salmo (Fergunson et al., 1995), em estudos de filogenia de peixes (Morita, 1999; Harris & Mayden, 2001; Nagl et al., 2001; Perdices et al., 2002; Obermiller & Pfeiler, 2003), assim como em estudos de estrutura de populao (Chenoweth & Hughes, 1997) e de impacto da introduo de indivduos cultivados em populaes selvagens (Clifford et al., 1998).

Consideraes finais
Os estudos voltados para conservao de populaes ou espcies de importncia econmica ou em risco de extino fornecem dados que constituem uma base essencial na tomada de medidas de manejo de populaes selvagens ou cultivadas. A concatenao das diversas reas de estudos populacionais, tais como biologia, ecologia e gentica uma tendncia atual. Nesta ltima, o desenvolvimento de tcnicas que possibilitam a deteco da evoluo de diferentes gentipos enriqueceu a gama de ferramentas utilizveis no suprimento de necessidades tais como

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identificao de indivduos e estimativa do grau de parentesco entre eles, a delimitao de populaes de interesse, estimativa do grau de variabilidade das mesmas, bem como de sua histria recente, e estimativa do grau de similaridade entre populaes e espcies, com a construo de rvores filogenticas. Todos estes parmetros compem a biodiversidade, que assumida ser essencial para o equilbrio ambiental e que tem sido objeto de extensas discusses e debates em mbito internacional. No que diz respeito aos recursos pesqueiros, a preocupao em adquirir conhecimentos das caractersticas populacionais acessveis pelos mtodos de estudos genticos est ligada tanto s necessidades ecolgicas de conservao ambiental quanto ao aumento da demanda de alimentos como resultado do crescimento populacional humano. As alteraes ambientais causadas pela presena humana e a explorao excessiva dos estoques pesqueiros tm levado a respostas como modificaes nos padres populacionais de vrias espcies de peixes. Essas respostas so espelhadas em caractersticas essenciais como tamanho da populao, reproduo, crescimento, alimentao e migrao. Com os conhecimentos adquiridos a partir das pesquisas acerca dos diversos aspectos genticos dos estoques pesqueiros, espera-se poder embasar com segurana as normas de explorao dos mesmos, nos permitindo levantar propostas de manejo para manuteno ou recuperao de diversas espcies na natureza, avaliar impactos de atividades antrpicas tais como a explorao excessiva de recursos naturais e a introduo de espcies exticas ou a existncia de hbridos dentro de espcies protegidas.

Referncias Bibliogrficas
ANGERS, B. ; BERNATCHEZ, L. ; ANGERS, A. ; DESGROSEILLERS, L. Specific microsatellite loci for brook charr reveal strong population subdivision on a microgeographic scale. Journal of Fish Biology, London, v.47. p.177-185, 1995. AVISE, J.C. Molecular markers, natural history and evolution. New York: Chapman & Hall, 1994. 511 p. ARIAS, M.C.; INFANTE-MALACHIAS, M.E. RFLP: O emprego de enzimas de restrio para deteco de polimorfismos no DNA. In: MATIOLI, S.R. Biologia molecular e evoluo. Ribeiro Preto: Holos, 2001. 202 p. BANKS, M.A.; BLOUIN, M.S.; BALDWIN, B.A.; RASHBROOK, V.K.; FITZGERALD, H.A.; BLANKENSHIP, S.M.; HEDGECOCK, D. Isolation and

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iheritance of novel microsatellites in chinook salmon (Oncorhynchus tschawytscha). Journal of Heredity, Washington, v.90, n.2, p.281-288, 1999. BARDAKCI, F.; SKIBINSKI, D.O. Application of the RAPD technique in tilapia fish: species and subespecies identification. Heredity, Edinburg, v.73, p.117123, 1994. BEACHAM, T.D.; MILLER, K.M.; WITHLER, R.E. Minisatellite DNA variation and stock identification of coho salmon. Journal of Fish Biology, London, v.49, n.3, p.411-429. 1996. BRITSKI, H. Conhecimento atual das relaes filogenticas de peixes neotropicais. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ICTIOLOGIA, 9., 1992, Maring. Documentos... Maring: UEM, 1992. p.42-57. CALCAGNOTTO, D.; TOLEDO-FILHO, S. de A. Loss of genetic variability at the transferrin locus in five hatchery stocks of tambaqui (Colossoma macropomum). Genetics and Molecular Biology, Ribeiro Preto, v.23, n.1, p.127-130, 2000. CALLEJAS, C.; OCHANDO, M.D. Identification of Spanish barbel species using the RAPD technique. Journal of Fish Biology, London, v.53. p.208215, 1998. CHENOWETH, S.F.; HUGHES, J.M. Genetic poppulation structure of the catadromous Perciform: Macquaria novemaculeata (Percichthyidae). Journal of Fish Biology, London, v.50, n.4, p.721-733, 1997. CLIFFORD, S.L.; McGINNITY, P.; FERGUSON, A. Genetic changes in na Atlantic salmon population resulting from escaped juvenile farm salmon. Journal of Fish Biology, London, v.52, n.1, p.118-127, 1998. DINESH, K.R.; LIM, T.M.; CHUA, W.K.; PHANG, P.E. RAPD analysis: an eficient method of DNA figerprint in fishes. Zoological Science, Tokyo, v.10, p.849-954, 1993. ESTOUP, A.; PRESA, P. ; KRIEG, F.; VAIMAN, D.; GUYOMARD, R. (CT)n and (GT)n microstellite: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout). Heredity, Edinburg, v.71, p.488-496, 1993.

21

Mtodos moleculares aplicveis em programas de conservao de recursos pesqueiros

FERGUSON, A.; TAGGART, J.B.; PRODOHL, P.A.; MCMEEL, O.; THOMPSON, C.; STONE, C.; MCGINNITY, P.; HYNES, R.A. The application of molecular markers to the study and conservation of fish populations, with special reference to Salmo. Journal of Fish Biology, London, v.47, suppl. A, p.103-126, 1995. FERGUSON, A.; McGINNITY, P.; STONE, C.; CLIFFORD, S.; TAGGART, J.; CROSS, T.; COOKE, D.; BOURKE, E. The genetic impact of escaped farm atlantic salmon on natural populations. Aquaculture, Amsterdam, v.137, n.1-4, p.55-56, 1995. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. Brasilia: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. 220 p. (EMBRAPA-CENARGEN. Documento 20). GALVIN, P.; MCKINNELL, S.; TAGGART, J.B.; FERGUNSON, A.; OFARRELL, M.; CROSS, T.F. Genetic stock identification of Atlantic salmon using single locus minisatellite DNA profiles. Journal of Fish Biology, London, v.47, p.186-199, 1995. HARRIS, P.M.; MAYDEN, R.L. Phylogenetics relationships of major clades of Catostomidae (Teleostei: Cypriniformes) as inferred from mitochondrial SSU and LSU rDNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, San Diego, v.20, n.2, p.225-237, 2001. JEFFREYS, A.J.; WILSON, V.; THEIN, S.L. Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature, London, v.314, p.67-73, 1985. LOWE-MACCONNELL, R.H. Ecological studies in tropical fish communities. Cambridge: Cambridge University press. 382 p. 1987. MARTINS, C.; VENERE, P.C.; MESTRINER, C.A.; CESTARI, M.M. ; FERREIRA, R.; GALETTI JUNIOR, P.M. Chromosome relationships between Anostomidae and Chilodontidae fish (Characiformes). Cytologia, San Francisco, v.65, p.153-160, 2000. MATIOLI, S.R.; PASSOS-BUENO, M.R. dos S. Mtodos baseados em PCR para anlise de poplimorfismos de cidos nuclicos. In: MATIOLI, S.R. Biologia molecular e evoluo. Ribeirao Preto: Holos, 2001. p.153-161. MICHAEL, D.; PHILLIPS, R. B. Phylogenetic analysis of Pacific salmon (Genus Oncorhynchus) based on mitochondrial DNA sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution, San Diego, v.4, n.4, p.366-371, 1995. MORITA, T. Molecular phylogenetic relationships of the deep-sea fish genus Coryphaenoides (Gadiformes: Macrouridae) based on mitochondrial DNA.

Mtodos moleculares aplicveis em programas de conservao de recursos pesqueiros

22

Molecular Phylogenetics and Evolution, San Diego, v.13, n.3, p.447-54, 1999. MOXON, E.R.; WILLS, C. DNA microsatellites: agents of evolution? Scientific American, New York, v.280-1 , p.72-77. 1999. NAKAMURA, Y.; LAPPERT, M.; OCONNELL, N.; WOLFF, R.; HOLM, M.; CULVER, M.; MARTIN, C.; FUJIMOTO, E.; HOFF, M.; KUMLIM, E.; WHITE, R. Variable number of tendem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science, Washington, v.235, p.1616-1622, 1987. NAGL, S.; TICHY, H.; MAYER, W.E.; SAMONTE, I.E.; McANDREW, B.J.; KLEIN, J. Classification and phylogenetic relatiuonships of african tilapiinae fishes inferred from mitochondrial DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, San Diego, v.20, n.3, p.361-374, 2001. OBERMILLER, L.E.; PFEILER, E. Phylogenetic relationships of elopomorph fishes inferred from mitochondrial ribosomal DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, San Diego, v.26, n.2, p.202-214, 2003. OCONNELL, M.O.; SKIBINSKI, D.O.F.; BEARDMORE, J.A. Genetic variation in stocked populations of Atlantic salmon. Aquaculture, Amsterdam, v.137, n.1-4, p.54-55, 1995. PALMER, J.D. Evolution of chloroplast and mitochondrial DNA in plants and algae. In: MCINTYRE, R.J. Molecular evolutionary genetics. New York: Plenum Press, 1985. p.131-240. PALMER, J.D. Chloroplast DNA evolution and biosystematic uses of chloroplast DNA varaition. American Naturalist, Chicago, v.130, p.6-29, 1987. PARKER, P.G.; SNOW, A.A.; SCHUG, M.D.; BOOTON, G.C.; FUERST, P.A. What molecules can tell us about populations: choosing and using a molecular marker. Ecology, Durham, v.79, n.2, p.361-382, 1998. PERDICES, A.; BERMINGHAM, E.; MONTILLA, A.; DOADRIO, I. Evolutionary history of the genus Rhamdia (Teleotei: Pimelodidae) in Central America. Molecular Phylogenetics and Evolution, v.25, n.1, p.172-189, 2002. PEREIRA, S. Mitochondrial genome organization and vertebrate phylogenetics. Genetics and Molecular Biology, Ribeiro Preto, v.23, n.4, p.745-752, 2000. PFIFFER, A.; OLIVIERI, A.M.; MORGANTE, M. Identification and characterization of microsatellites in Norway sprece (Picea abies K.). Genome, Ottawa, v.40, p.411-419, 1997.

23

Mtodos moleculares aplicveis em programas de conservao de recursos pesqueiros

SOL-CAVA, A.M. Biodiversidade molecular e gentica da conservao. In: MATIOLI, S. R. Biologia molecular e evoluo. Ribeiro Preto: Holos, 2001. 202 p. SCHLTTERE, C.; PEMBERTON, J. The use of microsatellites for genetic analysis of natural populations a critical review. In: DESALLE, R.; SCHIERWATER, B. Molecular approaches to ecology and evolution. Basel: Birkhuser Verlag, 1998. p. 71-86. SCHEEL, J.J. Fish chromosome and their evolution. Charlottenlund, Denmark: Internal Report of Denmarks Akvarium, 1973. 22 p. SOUTHERN, M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology, London, v.98, p.503, [197-]. SOLFERINI, V.N.; SCHEEPMAKER, D.S. Polimorfismos de isozimas. In: MATIOLI, S.R. Biologia molecular e evoluo. Ribeiro Preto: Holos, 2001. p.137-142. SUNNUCKS, P. Efficient genetic markers for population biology. Tree, London, v.15, p.199-203, 2000. TAKAGI, M.; TANIGUSHI, N. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) for identification of three species of Anguilla, A. japonica, A. australis and A. bicolor. Fisheries Science, v.61, n.5, p.884-885, 1995. TESSIER, N.; BERNATCHEZ, L.; PRESA, P.; ANGERSS, B. Gene diversity analysis of mitochondrial DNA, microsatellites and allozimes in landlocked Atllantic salmon. Journal of Fish Biology, London, v.47, p.156-163, 1995. TOLEDO FILHO, S. de A.; ALMEIDA-TOLEDO, L.F. de; FORESTI, F.; GALHARDO, E.; DONOLA, E. Conservao gentica de peixes em projetos de repovoamento de reservatrios. So Paulo: USP, 1992. 39 p. (USP. Cadernos de Ictiogentica, 1). TRINGALI, M.D.; BERT, T.M.; SEYOUM, S.; BERMINGHAM, E.; BARTOLACCI, D. Molecular phylogenetics and ecological diversification of the Transisthmian fish genus Centropomus (Perciformes: Centropomidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, San Diego, v.13, n.1, p.193-207, 1999. WARD, R.D.; GREWE, P.M. Apraisal of molecular genetic techniques in fisheries. In: CARVALHO, G.R.; PITCHER, T.J. Molecular geneticis in fisheries. London: Chapman & Hall, 1995. p.29-54.

Mtodos moleculares aplicveis em programas de conservao de recursos pesqueiros

24

WASKO, A.P.; GALETTI JUNIOR, P.M. Karyotype diversity in the neotropical fish Bryconamericus (Characidae, Tetragonopterinae). Cytobios, Cambridge, v.94, p.185-193, 1998. WOLF, C.; BURGENER, M.; HBNER, P.; LTHY, J. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: differentiation of fish species. LebensmittelWissenschaft und Technologie, London, v.33, p.144-150, 2000. ZAHA, A.; SCHRANK, A.; FERREIRA, H.B.; SCHRANK, I.S.; RODRIGUES, J.J. S.; REGNER, L.P.; PASSAGLIA, L.M.P.; ROSSETTI, M.L.R.; RAUPP, R.M.; SILVA, S.C. da; GAIESKY, V.L.V. Biologia molecular bsica. Porto Alegre: Mercado Aberto, 1996. 336 p.

25

Mtodos moleculares aplicveis em programas de conservao de recursos pesqueiros

Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento