INFORME N 1

TTULO: OBSERVACIN DE BACTERIAS

INTRODUCCIN

La microbiologa es la ciencia encargada del estudio de los microorganismos, seres vivos pequeos (del griego mikros "pequeo", bios, "vida" y - -loga, tratado, estudio, ciencia), tambin conocidos como microbios. Se dedica a estudiar los organismos que son slo visibles a travs del microscopio: organismos procariotas y eucariotas simples. Son considerados microbios todos los seres vivos microscpicos, estos pueden estar constituidos por una sola clula (unicelulares), as como pequeos agregados celulares formados por clulas equivalentes (sin diferenciacin celular); estos pueden ser eucariotas (clulas con ncleo) tales como hongos y protistas, procariotas (clulas sin ncleo definido) como las bacterias]. Sin embargo la microbiologa tradicional se ha ocupado especialmente de los microorganismos patgenos entre bacterias, virus y hongos, dejando a otros microorganismos en manos de la parasitologa y otras categoras de la biologa. Las formas bacterianas pueden ser examinadas al microscopio de dos maneras: observando muestras frescas de clulas vivas, y observando clulas muertas teidas con ciertos colorantes. Las bacterias vivas carecen de color en preparaciones acuosas, mientras que en preparaciones teidas, aumentan su contraste con el medio circundante y se hacen ms visibles. El distinguir claramente la estructura bacteriana permite la mejor diferenciacin celular interna y la determinacin de los tipos morfolgicos existentes. En microbiologa resultan de uso frecuente para la observacin de microorganismos las tinciones simples, diferenciales y las tinciones de estructuras.

MARCO TERICO

Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamao de unos pocos micrmetros (entre 0,5 y 5 m, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y hlices (espirilos). Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las clulas eucariotas (de animales, plantas, hongos, etc.), no tienen el ncleo definido ni presentan, en general, orgnulos membranosos internos. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son mviles. Del estudio de las bacterias se encarga la bacteriologa, una rama de la microbiologa. Tincin de bacterias: La mayor cantidad de colorantes constituyen sales en las cuales uno de los iones presenta color. Una sal est formada por un ion positivo y uno negativo. Un colorante simple como el azul de metileno est compuesto por: Azul de metileno(+) + cloruro(-)

Las clulas de las bacterias tienen por lo general una superficie cargada negativamente as que se combina con el in positivo del azul de metileno y resulta teida. La diferencia en la carga produce una afinidad entre el colorante y la clula bacteriana. Los colorantes pueden ser cidos o bsicos.

PARTE EXPERIMENTAL EJERCICIO 01: PREPARACIN DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS PARA TINCIN El objetivo de este experimento es poder fijar las muestras de los microorganismos en la lmina porta objetos para luego pasarlas a la segunda experimentacin. Se necesitarn los siguientes materiales: *Muestras de contenido de bacterias (Bacillus sp, Staphylococcus sp y Escherichia coli) *Asa de Kolle (herramienta) *Lmina porta objeto *Mechero de alcohol *Piseta con agua *Algodn *Pinza de madera Se procede el experimento de la siguiente manera: Para comenzar con el experimento es necesario que el porta objetos sea desengrasado, utilizando alcohol y secarlo con un poco de algodn, cuidadosamente para no volver a ensuciarlo. Una vez limpio el porta objetos, dejaremos caer solo una gota de agua (piseta), hecho esto pasaremos a tomar un poco de la muestra de una bacteria con la ayuda del asa de kolle, el cual ser esterilizado (hasta la incandescencia) previamente en el mechero. Este paso se deber hacer alrededor del mechero para as evitar la aparicin de otros microorganismos en nuestra muestra. Despus de haber utilizado el asa de kolle, este tendr que ser flameado nuevamente para evitar el roce con nuestra piel y surgiendo de esta manera malestares en la persona (por la presencia de las bacterias en la asa) Estando la muestra en la lmina junto a la gota de agua, con la ayuda del asa esparciremos la muestra por toda la lmina, quedando esta como una pelcula delgada. Luego la lmina sostenida por la pinza pasaremos a flamearla sobre el mechero, completando as la fijacin de la muestra sobre la lmina y lista para el siguiente ejercicio.

Ya que tenemos tres muestras contenidas de bacteria, todas ellas pasarn por los mismos pasos.

EJERCICIO 02: TINCIN SIMPLE CON COLORANTES BSICOS El objetivo de este experimento es poder observar las formas, tamaos y agrupaciones que estos microorganismos presentan, aplicando un simple mtodo de tincin. Se necesitarn los siguientes materiales: *Lminas fijadas previamente de las muestras de bacterias (Bacillus sp, Staphylococcus sp y Escherichia coli) *Aceite de inmersin o aceite de cedro *Colorantes bsicos (Azul de metileno, Cristal violeta y Carbolfucsina) *Piseta con agua *Soporte para tincin *Microscopio *Mechero de alcohol *Jabn carblico Se procede el experimento de la siguiente manera: Teniendo las lminas fijadas con los microorganismos, segn sea el tipo de bacteria, pasaremos a la tincin, eligiendo as: -Bacillus sp -Staphylococcus sp -Escherichia coli Azul de metileno Cristal violeta Carbolfucsina

Estas lminas se colocarn sobre el soporte de tincin, tomando el tiempo segn sea el colorante utilizado. Luego se enjuagar con la piseta (sobre el soporte) con ayuda de pinza se har la limpieza. Luego secaremos esta con un flameo sobre el mechero para luego proceder con el siguiente paso. Colocaremos sobre las muestras fijadas y teidas, el aceite de cedro para ponerlo en el microscopio con un objetivo de inmersin 0 (esta lmina estar relativamente junta al lente).Y as observaremos las formas de los microorganismos.

Terminado el experimento pasaremos hacernos el lavado con el jabn carblico para evitar infecciones en nuestro organismo.

OBSERVACIONES HECHAS

1. Nombre: Bacillus sp Forma: alargada Agrupacin: cadena Colorante: azul metileno

2.

Nombre: Staphylococcus sp Forma: cocos Agrupacin: racimo Colorante: cristal violeta

3. Nombre: Escherichia coli Forma: cocobacilo Agrupacin: ----Colorante: carbolfucsina

Lminas fijadas con tincin de las muestras

DISCUSIONES BACILLUS sp: La muestra de bacteria se ha teido de azul de metileno la reaccin fue en 60 segundos .El azul de metileno, cuyo nombre cientfico es Cloruro de Metiltionina es un un colorante bastante usado en este tipo de experimentos. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas Slo 10% a 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano.

Bacillus sp.

Observada en clase

fotografa de Bacillus sp.

Las bacterias observadas como el bacillus sp siendo una bacteria gran negativa presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano. El espacio entre la membrana externa y la interna se denomina PERIPLASMA, y se encuentran tambin lipoprotenas que unen la membrana externa a la fina capa de peptidoglicano. En la membrana externa adems, existen canales acuosos por donde atraviesan por difusin simple partculas pequeas como el agua o iones, dichos canales son las PORINAS. Es por eso que al contacto con el tinte estas se tien.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Estas bacterias son Cocos Gram Positivos, Agrupados en "Racimos de Uva" y el colorante utilizado fue el cristal violeta y tuvo una reaccin en 10 segundos. LA GRUESA CAPA DE PEPTIDOGLICANO CONFIERE UNA GRAN RESISTENCIA A ESTAS BACTERIAS Y ES LA RESPONSABLE DE RETENER LA COLORACIN DURANTE LA TINCIN.

Staphylococcus aureus

observada en clase

fotografa staphylococcus

. A causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta quede atrapado dentro de la pared celular. Diferencias importantes en la pared de estas bacterias:

Bacteria Gram Positiva

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante molculas de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglucano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin. En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Gram-positivas"

ECHERICHIA COLI Tincin con carbofuscina (rosa intensa) la reaccin fue en 5 segundos E.coli observada en clase fotografa de E.coli

En esta muestra reacciona mucho ms rpido debido a que es un componente muy soluble y favorece a la tincin de esta clula debido a que su pared celular es muy delgada.

CONCLUSIONES En el experimento de laboratorio se pudo apreciar las bacterias, ya mencionadas. Se logr apreciar sus diferentes formas y agrupaciones. Quedaron claros los procedimientos a seguir en la preparacin de muestras fijas con tincin simple. Y se aplicaron correctamente los tintes adecuados, en el tiempo correcto. Se conoce ahora la importancia del objetivo de inmersin y el aceite de inmersin, ya que sin ellos no sera posible la visualizacin de las bacterias. Por el motivo de ser muy pequeas.

RECOMENDACIONES Durante el experimento al hacer el raspado de la muestra si no se tiene el debido cuidado y no se ha tomado las medidas de seguridad correspondiente las muestras pueden: Contaminarse y as aunque se desee ver una muestra determinada se podra estar viendo contaminantes o las mismas bacterias se encontraran destruidas.

As tambin antes, durante y despus de la prctica se tienen que esterilizar los instrumentos a utilizarse. Al momento de usar el mechero de alcohol tener mucha precaucin ya que este se pondr en contacto con la lmina porta objeto la cual se podra sobrecalentar y quebrarse, lo cual arruinara la muestra y se tendra que iniciar nuevamente.

CUESTIONARIO

1. Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias? Se destacan 3 tipos de asociaciones entre las ms frecuentes: comensalismo, mutualismo y parasitismo a. Comensalismo: Debido a su pequeo tamao, las bacterias comensales son ubicuas y crecen sobre animales y plantas exactamente igual a como creceran sobre cualquier otra superficie. As, por ejemplo, grandes poblaciones de estos organismos son las causantes del mal olor corporal y su crecimiento puede verse aumentado con el calor y el sudor. b. Mutualismo: Se da cuando ambas partes participantes reciben beneficios. Un ejemplo claro se da entre los rumiantes y las bacterias que poseen en el rumen de estos animales. Los rumiantes reciben cidos grasos y vitaminas producidos por estas bacterias, mientras que estas ltimas tienen hbitat, proteccin y alimento garantizado. Tambin existen bacterias que habitan la rizsfera del suelo (zona de races) y se benefician de los compuestos orgnicos excretados por las races de las plantas. Estas bacterias son importantes ya que realizan la fijacin de nitrgeno, generando compuestos nitrogenados que las plantas pueden aprovechar. c. Parasitismo: Cuando perjudica al hospedador. En el ser humano se les conoce a estas bacterias como patgenos y son las que causan enfermedades. Cada especie de patgeno tiene un espectro caracterstico de interacciones con sus huspedes humanos. Algunos organismos, tales como Staphylococcus o Streptococcus, pueden causar infecciones de la piel, pulmona e incluso meningitis y sepsis, una respuesta inflamatoria sistmica que produce shock, vasodilatacin masiva y muerte.

Sin embargo, estos organismos son tambin parte de la flora humana normal y se encuentran generalmente en la piel o en la nariz sin causar ninguna enfermedad. 2. En qu rango de tamaos se definen las bacterias?

El tamao se mide en micrmetros, m, para microorganismos ms pequeos se usa el nanmetro, nm. Las bacterias esfricas se miden por el dimetro, y la gran mayora tienen un dimetro que vara entre 0,2 y 2 m. Las bacterias alargadas se miden por el largo y el ancho y la mayora de ellas tienen un ancho de 0,2 a 2 m por 1 a 15 m de largo. Las bacterias espiraladas se miden por la longitud total, la amplitud de la espira y la profundidad de la misma. Existen bacterias cuyo tamao est en el extremo inferior de la escala, son las rickettsias, clamidias y micoplasmas, su tamao es similar al de los virus ms grandes, los poxvirus. En el otro extremo de la escala, hay algunas bacterias alargadas que tienen una longitud semejante al dimetro de una clula eucariota, por ejemplo, los lactobacilos tienen un largo que puede superar al dimetro de un eritrocito. 3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes? A. Cocos: forma regularmente esfrica. Se dividen en: a. Diplococos: conjunto de bacterias por ser cocos asociados en parejas b. Estreptococos: son un gnero de bacterias Gram Positivas que se asocian en cadenas. c. Estafilococos: asociaciones en forma de racimo. d. Ttradas: agrupacin de 4 cocos por divisin en planos perpendiculares. e. Sarcinas: forman paquetes regularmente cbicos

B. Bacilos: Con forma de barra o vara, y pueden encontrarse en muchos grupos taxonmicos diferentes tipos de bacterias. Se dividen en: a. Diplobacilo: en pares b. Empalizada: agrupacin de bacilos bsicamente. c. Estreptobacilo: formacin en cadena

C. Vibriones: forma de bastones

D. Espiroquetas: alargadas y enrolladas helicoidalmente

E. Espirilos: de forma helicoidal o de espiral. Se desplazan en medios viscosos avanzando en tornillo

4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa? Es tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo. En cambio la tincin negativa es una tcnica suave que no destruye a los microorganismos, permitiendo por lo tanto un recultivo posterior para el estudio de patgenos y contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). Se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta tcnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro. En caso de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero atmico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Tpicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al electrnico, esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de reducido tamao. 5. Qu importancia se le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados en la prctica? Los colorantes difieren en el grado de reactividad. Por ejemplo, el cristal violeta es muy reactivo y demora 10 segundos, lo cual se puede aplicar a material orgnico escaso en la muestra. En cambio el azul de metileno reacciona con clulas de carga negativa lo cual implica que demore ms su tiempo de tincin (30 segundos e incluso ms). Finalmente, la carbofucsina requiere slo de 5 segundos, aclarando que esta, por ser de reactividad muy alta, dificulta una tincin ms precisa. 6. Funcin del aceite de cedro o de inmersin: La funcin del aceite de inmersin es restringir el movimiento de la muestra, adems de evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza cuando vamos a observar con el objetivo 100x.

Otra funcin del aceite de inmersin es evitar que la luz se desve; lo que se pretende es que la luz llegue concentrada hacia la muestra. 7. Funcin del lente objetivo de inmersin: En este tipo de lente, el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Puede usarse agua destilada, pero el ms usado es el aceite de cedro por poseer un ndice de refraccin casi idntico al del vidrio. La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada. El empleo de la inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados

BIBLIOGRAFIA Brock, Biologa de Microorganismos, Madigan, Parker .J. 1998 octava edicin Prentice Hall. Referencias Bibliogrficas e Imgenes: Murray et al. Medical Microbiology, 6th Edition by Mosby http://repositorio.utn.edu.ec/bitstream/123456789/631/4/capitulo4.pdf http://bipesbiporus.blogspot.com http://www.ferato.com/wiki/index.php