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Bioenergia

Eliana G. dE M. lEMos
nElson R. stRadiotto
(oRGs.)
dEsEnvolvi MEnto, pEsqui sa
E i novao
f r o n t e i r a s
BIOENERGIA
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CONSELHO EDITORIAL ACADMICO
Responsvel pela publicao desta obra
Maria Jos Soares Mendes Giannini
Erivaldo Antnio da Silva
Kleber Toms de Resende
Maria Valnice Boldrin
Maysa Furlan
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ELIANA G. M. LEMOS
NELSON R. STRADIOTTO
(ORGS.)
BIOENERGIA
DESENVOLVIMENTO, PESQUISA
E INOVAO
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2012 Editora UNESP
Cultura Acadmica
Praa da S, 108
01001-900 So Paulo SP
Tel.: (0xx11) 3242-7171
Fax: (0xx11) 3242-7172
www.editoraunesp.com.br
feu@editora.unesp.br
CIP BRASIL. Catalogao na fonte
Sindicato Nacional dos Editores de Livros, RJ
B512
Bioenergia: desenvolvimento, pesquisa e inovao / Eliana G. M. Lemos e Nelson
R. Stradiotto (orgs.). So Paulo: Cultura Acadmica, 2012.
il.
Inclui bibliograa
ISBN 978-85-7983-256-7
1. Biocombustveis. 2. Combustveis. 3. Energia Fontes alternativas Brasil.
4. Desenvolvimento sustentvel. 5. Inovaes tecnolgicas. I. Lemos, Eliana G. M.
II. Stradiotto, Nelson R.
12-4488. CDD: 662.88
CDU: 662.6
Este livro publicado pelo Programa de Publicaes Digitais da Pr-Reitoria de Pesquisa
da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho (UNESP)
Editora afiliada:
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SUMRIO
Apresentao 9
Parte I
Biomassa para bioenergia 13
1 Metabolmica de cana-de-acar e sua relao com
a produo de biomassa vegetal para bioenergia 15
2 Estudos da dormncia e do condicionamento fisiolgico
de sementes: possveis contribuies propagao de
espcies vegetais com potencial energtico 35
3 Tecnologia de aplicao e inovaes voltadas ao uso
racional de defensivos agrcolas em culturas destinadas
produo de bioenergia 53
4 Metagenoma e a desconstruo da biomassa 83
5 Modificaes genticas em plantas de cana-de-acar visando
aumento de produtividade e a utilizao de genes de Bacillus
thuringiensis para o controle biolgico de insetos praga 113
6 Eucalipto adensado: manejo para florestas energticas 125
Parte II
Produo de biocombustveis 163
7 A complexidade da produo do bioetanol em fermentaes
abertas de matrias-primas industriais 165
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6 SUMRIO
8 Produo de etanol por Zymomonas mobilis CCT 4494
utilizando substratos no convencionais como alternativa
produo convencional 195
9 Hidrlise enzimtica na cadeia produtiva do bioetanol e uso
de enzimas para diagnsticos de produtos da fermentao 251
10 Resduos agrcolas e agroindustriais: potencialidades
de uso na produo de etanol 271
11 Utilizao de enzimas lipolticas na produo de biodiesel 319
12 Estressores biticos em cana-de-acar:
reflexos quali-quantitativos na matria-prima
e no processamento industrial 341
13 Produo, caracterizao e utilizao do biodiesel
de tucum originrio da regio amaznica 409
14 Contaminao microbiana na fermentao alcolica
para produo de etanol carburante 447
Parte III
Utilizao de bioenergia 489
15 Combustvel renovvel em trator agrcola:
experincias na utilizao de biodiesel 491
16 Efeitos da utilizao do biodiesel em motores
de combusto interna 521
17 Uso de etanol para a produo de hidrognio
e acionamento de motor aeronutico flex 547
18 Uso de biogs para produo de gua gelada e eletricidade 595
19 Biodiesel e gs de gaseificao em motor
de combusto interna 633
20 Aspectos do incremento da cogerao no setor
sucroalcooleiro com o uso de novos equipamentos
e tecnologias para melhor aproveitamento energtico 657
Parte IV
Biorrenarias, alcoolqumica e oleoqumica 751
21 Da biotecnologia biorrefinaria 753
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BIOENERGIA 7
Parte V
Sustentabilidade dos biocombustveis 833
22 Mudanas recentes na ocupao sucroalcooleira em
decorrncia da mecanizao do corte de cana-de-acar
no estado de So Paulo 835
23 Potenciais riscos ambientais do biodiesel 855
24 Impactos do uso de concentrado de vinhaa biodigerida
e outras fontes de nutrientes nos agroecossistemas
de cultivo da cana-de-acar 865
25 Avanos brasileiros no desenvolvimento de normas
tcnicas analticas para certificao e controle
da qualidade de biodiesel 889
26 Novos mtodos analticos para avaliao da qualidade
do bioetanol combustvel 945
27 Aspectos relacionados produo de biodiesel com
aproveitamento de resduos, caracterizao e testes
de misturas em motores de combusto interna 981
Lista de autores 1043
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APRESENTAO
A bioenergia constitui atualmente um importante segmento das deno-
minadas energias renovveis, frao cada vez mais representativa entre as
matrizes energticas de vrios pases do mundo. No Brasil, a pesquisa so-
bre bioenergia tem se desenvolvido consideravelmente, e seu uso, apontado
como exemplo a ser seguido na evoluo tecnolgica energtica da socieda-
de contempornea.
Nesse contexto, a edio deste livro, intitulado Bioenergia: desenvolvi-
mento, pesquisa e inovao, tem por objetivo proporcionar uma viso abran-
gente sobre as diversas reas que compem este segmento, com o intuito de
contribuir para melhor compreenso dessa importante energia renovvel
fundamental para o desenvolvimento do pas.
Este livro apresenta uma coletnea de trabalhos realizados por vrios
pesquisadores do Instituto de Pesquisa em Bioenergia (Bioen) da Universi-
dade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho (Unesp). Essas pesquisas
foram agrupadas em cinco partes distintas, perfazendo um total de vinte e
sete captulos.
Na primeira parte so mostradas as vrias formas de biomassa utiliza-
das na obteno de bioenergia; na segunda, os diversos processos usados na
produo de biocombustveis; na terceira, as aplicaes dos bicombustveis
em motores; na quarta, os aspectos concernentes s biorrefinaria, alcool-
qumica e oleoqumica; e na ltima, os impactos ambientais, sociais e eco-
nmicos da sustentabilidade dos bicombustveis.
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10 APRESENTAO
Na primeira parte intitulada Biomassa para bioenergia so aportados,
em seis captulos, temas da maior relevncia acadmica, tais como: a me-
tabolmica de cana-de-acar e sua relao com a produo de biomassa
vegetal para bioenergia; os estudos da dormncia e do condicionamento fi-
siolgico de sementes e as possveis contribuies propagao de espcies
vegetais com potencial energtico; a tecnologia de aplicao e as inovaes
voltadas ao uso racional de defensivos agrcolas em culturas destinadas
produo de bioenergia; o metagenoma e a desconstruo da biomassa; as
modificaes genticas em plantas de cana-de-acar visando ao aumento
de produtividade e utilizao de genes de Bacillus thuringiensis para o con-
trole biolgico de insetos praga; e o uso do eucalipto adensado no manejo de
florestas energticas.
Na segunda parte intitulada Produo de biocombustveis so descri-
tos em oito captulos tpicos da maior envergadura cientfica, como: a pro-
duo de etanol por Zymomonas mobilis CCT 4494, utilizando substratos
no convencionais como alternativa produo convencional; a hidrlise
enzimtica na cadeia produtiva do bioetanol e o uso de enzimas para diag-
nsticos de produtos da fermentao; a utilizao de enzimas lipolticas na
produo de biodiesel; os resduos agrcolas e agroindustriais e as potencia-
lidades de uso na produo de etanol; a complexidade da produo do bioe-
tanol em fermentaes abertas de matrias-primas industriais; os estressores
biticos em cana-de-acar e seus reflexos quali-quantitativos na matria-
-prima e no processamento industrial; a produo, caracterizao e utiliza-
o do biodiesel de tucum originrio da regio amaznica; e a contaminao
microbiana na fermentao alcolica para produo de etanol carburante.
Na terceira parte intitulada Utilizao de bioenergia so relatados em
seis captulos temas da mais alta importncia tecnolgica, tais como: o uso
de combustvel renovvel em trator agrcola e as experincias na utilizao
de biodiesel; os efeitos da utilizao do biodiesel em motores de combus-
to interna; o uso de etanol para a produo de hidrognio e acionamento
de motor aeronutico flex; o uso de biogs para produo de gua gelada
e eletricidade; o biodiesel e o gs de gaseificao em motor de combusto
interna; e os aspectos do incremento da cogerao no setor sucroalcooleiro
com o uso de novos equipamentos e tecnologias para melhor aproveitamen-
to energtico.
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BIOENERGIA 11
Na quarta parte intitulada Biorrefinarias, alcoolqumica e oleoqumi-
ca so discutidos dentro de um nico captulo tpicos altamente relevantes
para o desenvolvimento industrial, tais como: a evoluo da biotecnologia
biorrefinaria, em que so relatadas importantes aplicaes em biotecno-
logia e recentes desenvolvimentos de tecnologias de bioprocesso para utili-
zao de biomassa com foco principal na bioconverso industrial das fontes
renovveis em qumicos de interesse.
Na quinta parte intitulada Sustentabilidade dos biocombustveis
so aportados em seis captulos temas extremamente vitais para a sociedade,
como: as mudanas recentes na ocupao sucroalcooleira em decorrncia da
mecanizao do corte de cana-de-acar no estado de So Paulo; os potenciais
riscos ambientais do biodiesel; os impactos do uso de concentrado de vinhaa
biodigerida e outras fontes de nutrientes nos agroecossistemas de cultivo da
cana-de-acar; os avanos brasileiros no desenvolvimento de normas tcni-
cas analticas para certificao e controle da qualidade de biodiesel; os novos
mtodos analticos para avaliao da qualidade do bioetanol combustvel; e
os aspectos relacionados produo de biodiesel com aproveitamento de re-
sduos, caracterizao e testes de misturas em motores de combusto interna.
Concluindo, gostaramos de agradecer imensamente aos autores dos ca-
ptulos pela inestimvel contribuio; professora Maria Jos Soares Men-
des Giannini pelo convite para organizarmos a edio deste livro; aos revi-
sores dos captulos pelas correes altamente qualificadas; Neusa Maria
Luiz pelos excelentes servios de secretaria; Pr-Reitoria de Pesquisa da
Unesp pela oportunidade proporcionada pelo Programa de Publicaes Di-
gitais; e Editora da Unesp pela esmerada produo desta obra.
Eliana G. M. Lemos
Nelson R. Stradiotto
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Parte I
Biomassa para bioenergia
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1
Metabolmica de cana-de-acar
e sua relao com a produo
de biomassa vegetal para bioenergia
Alberto J. Cavalheiro, Isabel Duarte Coutinho,
Gabriel Mazzi Leme, Alexander Alves da Silva,
Ana Paula Dias da Silva
A produo de biocombustveis tem recebido ateno crescente, vis-
lumbrados como fontes biodegradveis e no poluentes de energia. Me-
recem nfase o diesel e o etanol obtidos de fontes vegetais, com destaque
para este ltimo, j produzido em vrios pases a partir da fermentao da
sacarose obtida, em ordem de importncia, de cana-de-acar, milho, sor-
go e beterraba. A produo a partir da cana-de-acar desenvolveu-se de
forma impressionante no Brasil, a ponto de se tornar uma cultura agrcola
de importncia estratgica para a economia nacional.
A cana-de-acar pertence famlia Poaceae, tribo Andropogoneae e
ao gnero Saccharum, destacando-se a espcie Saccharum officinarum, ori-
ginria do sudeste asitico, onde cultivada desde tempos remotos. Cru-
zamentos dessa espcie com outras quatro do mesmo gnero permitiram o
desenvolvimento de diversas variedades, com o objetivo de obter plantas
com caractersticas agronmicas melhoradas, incluindo resistncia a doen-
as. Variedades modernas de cana-de-acar so derivadas principalmente
de cruzamento interespecfico entre a cana nobre S. officinarum e a espcie
selvagem S. spontaneum. Como resultado disso, as variedades atuais de cana
possuem um genoma interespecfico complexo, aneupoliploide (n 12), com
o nmero de cromossomos variando de 100 a 130 (Hoarau et al., 2001). Essa
complexidade genmica e a natureza multiallica e multignica da maioria
das variedades agronmicas torna o melhoramento da cana-de-acar uma
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16 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
tarefa muito difcil (Casu et al., 2004). Os gneros Saccharum, Erianthus,
Miscanthus, Narenga e Sclerostachya so considerados muito similares e for-
mam o complexo Saccharum (Mukherjee, 1957), cujas espcies so pass-
veis de intercruzamento forado em programas de melhoramento gentico.
Por que estudar metabolmica de cana-de-acar?
O crescimento e ciclo de vida das plantas envolvem sequncias comple-
xas de expresso gnica altamente controladas, alm de respostas e adapta-
es ao meio ambiente, no qual esto sujeitas a vrias situaes de estresses
biticos e abiticos que podem modificar essa expresso. A maior parte
dos progressos no entendimento desses processos em vegetais foi obtido
a partir de estudos em espcies modelo, principalmente com Arabidopsis e
arroz. Embora o impacto da poliploidia sobre a expresso gnica tenha sido
estudado em vrias espcies alopoliploides (algodo e Arabidopsis tetra-
ploides, trigo e Sencio hexaploides), com relatos de efeitos aditivos e no
aditivos sobre subconjuntos de genes, observados juntamente com a po-
liploidizao (Jackson; Chen, 2010), estudos micos com cana-de-acar
podem proporcionar descobertas importantes acerca da regulao gnica
em genomas complexos (Manners; Casu, 2011).
Metabolmica estuda os processos ecofisiolgicos no nvel micromole-
cular, monitorando o maior nmero possvel de metablitos primrios e se-
cundrios de clulas, rgos e tecidos de um organismo por meio de tcnicas
analticas de alto desempenho como cromatografia gasosa acoplada a es-
pectrmetro de massas (CG-EM), cromatografia lquida acoplada a espec-
trmetro de ultravioleta e visvel com arranjo de diodos e/ou espectrmetro
de massas (CLAE-DAD-EM) e espectrmetro de ressonncia magntica
nuclear (RMN) acoplado ou no a um cromatgrafo lquido. Resulta, por-
tanto, na caracterizao de fentipos micromoleculares de organismos sob
condies especficas (fatores ambientais, genticos e patolgicos), visando
a associao dessas substncias ao gentipo e funo gnica (Villas-Bas;
Rasmussen; Lane, 2005).
Ao conjunto de dados gerados, aplica-se tratamento quimiomtrico
visando correlacionar as informaes qumicas s caractersticas vegetais
observadas no experimento para, a seguir, proceder-se formulao de hi-
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 17
pteses. Trata-se de abordagem complementar genmica e protemica,
no sentido do entendimento dinmico e funcional de organismos no nvel
micromolecular. Esse conhecimento detalhado de espcies teis para a pro-
duo de bioenergia tem aplicao potencial no melhoramento do rendi-
mento de biomassa, teor de molculas diretamente relacionadas produo
de energia e manipulao molecular da maquinaria bioqumica para esta-
belecimento de cultivares mais resistentes a situaes de estresses biticos e
abiticos, e tambm mais produtivos.
Constituio micromolecular de cana-de-acar
Apesar da produo de sacarose a partir da cana-de-acar remontar
poca do Imprio Gupta, por volta do ano 350, na ndia, sua estrutura mo-
lecular s foi elucidada em 1927 (Avery; Haworth; Hirst, 1927), aps estu-
dos intensivos de vrios cientistas por cerca de trs dcadas. Relatos sobre
outros constituintes qumicos micromoleculares desse vegetal s aparecem
na literatura cientfica a partir da dcada de 1930. Burr e colaboradores pu-
blicaram, em 1957, uma reviso interessante sobre vrios aspectos da cana-
de-acar, incluindo o que era conhecido poca sobre sua constituio
qumica. Em relao s micromolculas, so citados, nessa reviso, estudos
que relataram a ocorrncia de pirogalol, cido protocatecuico e vanilina na
frao lignnica; vitamina A, inositol, fitina e os cidos acontico, ctrico,
fumrico, gliclico, mlico, mesacnico, oxlico, succnico, sirngico e as-
crbico na garapa; tiamina, riboflavina, cido pantotnico, niacina e biotina
nos colmos; cido flico no melao; piridoxina e cido ascrbico nas folhas.
Da graxa exterior dos colmos foram obtidos lcool miriclico e hidro-
carbonetos. cidos palmtico e linoleico, estigmasterol, sitostetol, glicerol,
clorofila e caroteno foram obtidos de extratos da planta. Entre os compos-
tos fosforados, at 1957 j haviam sido identificados em cana-de-acar
frutose difosfato, glicose-1-P, glicose-6-P, adenosina trifosfato, cido fos-
fomlico e cido glicrico-3-P. Entre os aminocidos, asparagina era fre-
quentemente encontrada em grande quantidade no melao, mas tambm j
haviam sido relatadas as ocorrncias de cido asprtico e glutmico, lisina,
alanina, valina, cido -aminobutrico, leucina, isoleucina, glicina, serina,
glutamina, fenilalanina, norleucina, tirosina, cisteina, metionina, norvali-
na, cido o-amino isobutrico, prolina e treonina.
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18 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Investigaes preliminares sobre a ocorrncia de substncias fenlicas
em cana-de-acar foram feitas por Stevens (1959), que no conseguiu con-
firmar as presenas de cidos ferlico e cafeico na garapa, mas verificou na
cutcula do vegetal (B 37-161) a presena de pigmento cuja aglicona apre-
sentou caractersticas similares cianidina. A ocorrncia de antocininas em
cana j havia sido proposta por Sakuma e Momose, em 1935.
No bagao de cana foram determinados vrios compostos fenlicos:
cido p-coumrico, cido ferulico, p-hidroxibenzaldeido, vanilina e cido
vanlico (Leal et al., 1994). Um estudo amplo sobre a composio qumica
no complexo Saccharum envolveu a investigao de 120 plantas dos gne-
ros Saccharum, Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Narenga, Sclerostachya,
Imperata, incluindo hbridos interespecficos e intergenricos e variedades
comerciais de cana (Williams; Harborne; Smith, 1974). Como principal re-
sultado, o estudo indica as flavonas de folhas como potenciais marcadores
sistemticos, acrescentando que Saccharum officinarum, S. edule, S. robus-
tum e Erianthus maximus podem ser facilmente distinguidos de S. spon-
taneum, Narenga, Miscanthus, Imperata, Scleostachya, Ripidium e outras
espcies de Erianthus pela presena de bissulfatos de tricina-7-O-glicosideo
e tricina-7-O-neohesperidosideo e tricina-7-O-diglicosideo.
Tambm foi observado nesse estudo que as espcies de Erianthus, todas
africanas, podem ser distinguidas de Ripidium, que ocorrem nas Amricas,
pela presena de uma luteolina di-C-glicosdeo apenas neste ltimo gnero.
Embora com a identificao incompleta de vrias substncias, outras flavo-
nas C- e O-glicosdeos foram encontradas em todos os gneros estudados:
iso-orientina, iso-vitexina, iso-orientina-O-raminosilglicosdeo, iso-orien-
tina 7-O-glicosdeo, uma possvel iso-orientina O-triglicosdeo e trs luteo-
lina di-C-glicosdeos. Os autores observaram tambm que alguns hbridos
F1 de Saccharum officinarum x S. spontaneum apresentaram alterao no
padro de hidroxilao do anel B das flavonas, principalmente em relao
aos derivados de iso-orientina, alm de vitexinas C-glicosdeos. Os hbri-
dos apresentaram maior teor de vitexina C-glicosdeos (uma hidroxila),
enquanto as matrizes apresentaram principalmente luteolina C-glicosdeos
(duas hidroxilas no anel B).
A partir de 2005, surgiram novos trabalhos de caracterizao de flavonas
de folhas de plantas hbridas, transgnicas e em garapa a partir de cultivares
brasileiros de cana-de-acar, porm, empregando tcnicas mais refinadas,
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 19
como CLAE-DAD-EM. Nesses estudos, vrias flavonas O e C-glicosiladas
foram descritas, incluindo diosmetina-8-C-glicosil-arabinosdeo, dios-
metina-8-C-glicosdeo, tricina-7-O-ramnosilgalacturondeo, tricina-4-
-O-(eritro ou treo-guaiacilgliceril) ter e tricina-4-O-(eritro ou treo-guaia-
cilgliceril) ter-7-O-glicopiranosdeo, tricina-7-O-ramnosil-galacturo-
ndeo, tricina-7-O-neohesperosdeo, tricina-7-O-neohesperosdeo-4-O-
-ramnosdeo, tricina-7-O-metilglicurondeo, orientina, vitexina, luteo lina-
8-C-ramnosil-glicosdeo, 4,5-dimetil-luteolina-8-C-glicosdeo, luteoli -
na-8-C-glicosil-7-O-glicurondeo, escaftosideo, iso-escaftosdeo e 7-O-
-metilapigenina-6-C-glicosdeo (Colombo et al., 2005; Colombo et al.,
2006; Colombo; Yariwake; McCullaghb, 2008; Vila et al., 2008; Colombo
et al., 2009).
A ao antiproliferativa e antioxidante observada por Duarte-Almeida
e colaboradores (2006 e 2007) na garapa obtida de cana-de-acar (cultivar
SP813250) foi atribuda aos constituintes fenlicos apigenina, luteolina,
cido cafeico, cido hidroxicinmico e cido sinpico, alm de tricina-7-O-
|-(6-metoxicinmil)-glicosdeo.
As flavonas luteolina-8-C-ramnosil-glicosdeo, tricina-7-O-ramnosil-
galacturondeo, diosmina e as antocianinas petunidina-3-O-(6-succinil)-
-raminosdeo e cianidina-3-O-glicosdeo foram identificadas e quantifica-
das nas folhas, colmos e razes de Saccharum sinensis Roxb (Li et al., 2010).
A composio qumica de kokuto, um tipo de acar bruto similar ra-
padura e preparado no Japo e regio a partir da cana-de-acar, foi estu-
dada, resultando na descrio de vrios compostos fenlicos, muitos com
propriedades antioxidantes. Vrias lignanas esto entre eles (Nakasone et
al., 1996; Takara et al., 2002 e 2003). Nas figuras 1.2 e 1.3 esto ilustradas
vrias dessas substncias.
Arundona (fernenol metil ter) e taraxerol metil ter (savamiletina)
foram os primeiros triterpenos a serem relatados nas folhas de Saccha-
rum officinarum L. (Bryce et al., 1967). Posteriormente, foram caracteri-
zados |-sitosterol, estigmasterol e os compostos minoritrios taraxerol,
|-amirina, betulina, |-amirina metil ter (iso-savamiletina), fernenol, cilin-
drina, 24-metil-lofenol, 24-etil-lofenol, estigmasten-5-en-3|-diol (ikshus-
terol), estigmasten-5-en-3|-diol (epi-ikshusterol) e estigmastan-3|, 5o,
6|-triol (Deshmane; Dev, 1971). Os triterpenos e esteroides campeste-
rol; |-sitosterol; estigmasterol; 24-metilcolesta-3,6-diona; 24-etilcolesta-
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20 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Figura 1.1 Flavonas e antocianinas j identificadas em estudos qumicos com Saccharum
spp. Ara = arabnose, Fuc = fucose, Gal = galactose, Glc = glicose, Glr = cido glicurnico,
MeGlr = metil ster do cido glicurnico e Rha = ramnose, Ru = rutinosdeo.
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 21
Figura 1.2 Compostos fenlicos e estilbenos j identificados em amostras de Saccharum
spp. ou em produtos obtidos a partir da planta.
Figura 1.3 Lignanas j identificadas como constituintes de kokuto, alimento preparado
no Japo a partir de caldo de cana.
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22 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
-3,6-diona; 24-etilcolest-22-en-3,6-diona; 6-hidroxi-campest-4-en-3-ona;
6-hidroxiestigmast-4,22-dien-3-ona; colesta-4-en-3-ona; 24-metilcolest-
-4-en-3-ona; 24-metilcolesta-4,22-dien-3-ona; 24-etilcolest-4-en-3-ona
e 24-etilcolesta-4,22-dien-3-ona foram isolados da torta de filtro da cana-
-de-acar (Georges et al., 2006). A torta de filtro um resduo obtido na
fabricao do acar, depois que as borras resultantes da clarificao tm
a sacarose residual extrada, e tem sido empregada como adubao orgnica
(Pereira et al., 2005). As estruturas dessas substncias esto representadas
nas figuras 1.4 e 1.5.
Figura 1.4 Esteroides identificados em estudos qumicos de Saccharum spp.
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 23
Figura 1.5 Triterpenos identificados em estudos qumicos de Saccharum spp.
Constituio micromolecular associada a eventos
ecofisiolgicos
Os trabalhos citados acima descrevem apenas o isolamento e caracteri-
zao estrutural desses compostos obtidos de diferentes partes e hbridos de
Saccharum spp., e tambm de produtos e subprodutos oriundos do proces-
samento do vegetal. Nesses casos, importante ressaltar que muitas dessas
substncias podem ser resultado de hidrlise, rearranjos e isomerizaes
causadas pelos processos trmicos e alcalinos envolvidos na preparao de
melao, rapadura e kokuto, principalmente.
A seguir esto revisados alguns estudos que relacionam metablitos de
cana-de-acar a processos ecofisiolgicos. Nesses estudos, so avaliados
grupos especficos de metablitos (em alguns casos uma substncia ape-
nas) e que podem ser considerados estudos preliminares abordagem me-
tabolmica.
Os primeiros trabalhos relacionando alteraes na constituio qu-
mica de cana-de-acar com situaes de estresse associaram florogluci-
nol (1,3,5-triidroxibenzeno) ao cultivo sob deficincia de potssio (Hartt,
1934) e o aumento expressivo do teor de aminocidos quando cana foi sub-
metida seca (Wiggins; Williams, 1955).
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24 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
O cido hidroxmico 2,4-diidroxi-1,4-benzoxazin-3-ona (DIBOA),
obtido de folhas de cana-de-acar, e seu produto de degradao 2-ben-
zoxazolinona (BOA) possuem efeitos alelopticos (Singh; Suman; Shrivas-
tava, 2003). A aplicao dessa substncia em concentraes maiores que
0,3 mM inibiu o crescimento da cana-de-acar e, em concentraes supe-
riores, mostrou ao aleloptica no desenvolvimento do trigo, mostarda e
feijo (Pushpa et al., 2009). Ensaios de alelopatia tambm foram realizados
com extratos da palha de cana-de-acar. A partir do fracionamento do ex-
trato, foram isolados e quantificados os cidos trans-ferulico, cis-ferulico,
vanilico e siringico (Sampietro; Vattuone; Isla, 2006), que inibiram o cres-
cimento de ervas daninhas (Amaranthus quitensis L., Bidens subalternans L.,
Brassica campestris L., Sida rhombifolia L.) e de Lactuca sativa L. (alface).
Piceatanol (Figura 1.3) foi isolado e caracterizado a partir do extrato clo-
rofrmico dos colmos de Saccharum sp. (cvs. CP807, C 33-324, e CP36-13).
Esse estilbeno foi biossintetizadao pela planta quando inoculada com o fun-
go Colletotrichum falcatum, conhecido como podrido vermelha (Brinker;
Seigler, 1991), sendo caracterizado como fitoalexina. Estilbenos como o
piceatanol, resveratrol e pinosilvina foram tambm identificados em ou-
tras espcies de Poaceae quando infectadas com fungos endofticos (Powell
et al., 1994). As fitoalexinas so substncias produzidas pelo vegetal como
resposta a presena de patgenos invasores.
Frana et al. (2001) usaram um conjunto de genes relacionados ao me-
tabolismo secundrio, extrado do banco de sequncias tag expressas pela
cana (SUCEST). O objetivo desse estudo foi investigar tanto o padro de
expresso gnica de enzimas chaves reguladoras das vias do metabolismo
secundrio e das classes principais de metablitos envolvidos na reposta da
cana-de-acar a desafios ambientais e durante seu desenvolvimento. Os
resultados mostraram que cDNAs de cana-de-acar codificam sesqui-
terpeno ciclases (SC) induzidos por luz UV, assim como chalcona sintase
(CHS), a primeira enzima na ramificao metablica que leva a flavonoi-
des, isoflavona sintase (IFS), que est envolvida na defesa da planta e no-
dulao da raiz, isoflavona redutase (IFR), uma enzima chave na biossn-
tese de fitoalexinas fenilpropanodicas e cido cafeico-O-metiltransferase,
enzima chave na biossntese de lignina e precursores de parede celular.
Metablitos secundrios so sintetizados a partir de intermedirios do
metabolismo primrio do carbono. Considera-se que a sntese aumentada
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 25
desses metablitos sob condies de estresse esto relacionadas proteo
das estruturas celulares de danos oxidativos (Chalker-Scott; Fuchigami,
1989; Close; McArthor, 2002; Winkel-Shirley, 2002; Wahid; Ghazanfar,
2006). Carotenoides (carotenos e xantofilas) atuam como pigmentos aces-
srios na captao de luz e tambm como antioxidantes (Havaux, 1998; de
Pascale et al., 2001). Os compostos fenlicos so antioxidantes poderosos,
importantes na proteo de tecidos sob estresse (Dixon; Paiva, 1995; Sgherri,
Stevanovic; Navari-izzo, 2004). Eles so quimicamente heterogneos, in-
cluindo flavonoides, ligninas e taninos. Desempenham ampla variedade de
funes, incluindo defesa contra herbvoros e patogenos, suporte mecni-
co, atrao de polinizadores, absoro de luz e ao inibitria sobre plantas
vizinhas competidoras (Harborne; Williams, 2000; Taiz; Zeiger; 2002).
Recentemente, o papel dos fenlicos foi revisado devido s evidncias
de seu maior envolvimento na tolerncia ao estresse oxidativo do que na de-
fesa contra herbivoria (Close; McArthor, 2002; Wahid; Ghazanfar, 2006).
Antocianinas so solveis em gua e produzidas sob vrias condies de es-
tresse, incluindo UV-B (Mendez; Jones; Manetas, 1999), seca (Balakumar
et al., 1993), baixa temperatura (Krol et al., 1995), deficincia de nutrientes
(Rajendran et al., 1992), oznio (Foot et al., 1996) e salinidade (Wahid;
Ghazanfar, 2006). O acmulo desses metablitos sob condies de estresse
merece estudos avanados.
Kumar e Narayanaswamy (2006) tentaram relacionar nveis de cidos
carboxlicos, o-hidroxi cidos e amino cidos com o desenvolvimento da
podrido vermelha. Poliamidas foram identificadas em garapa (Rodrguez
et al., 2000). Ropenack e colaboradores (1998) relacionaram o aumento nos
nveis de poliaminas e cidos fenlicos em tecidos vegetais com a diminui-
o na eficincia da infestao fngica e viral, incluindo inibio da germi-
nao de esporos de fungos e reforo da parede celular vegetal, tornando-as
mais resistentes ao de enzimas hidrolticas.
A maioria dos cidos fenlicos, como os derivados do cido cinmico,
esto amplamente distribudos no reino vegetal e so reconhecidos como
participantes constitutivos (antecipinas) nas interaes planta-patgeno.
No entanto, h relatos do aumento da atividade de fenilalanina amnia
liase (PAL) aps a infeco do vegetal por patgenos e a caracterizao de
hidroxicinamoilamidas como fitoalexinas, biossintetizadas em resposta ao
ataque de patgenos (Matern; Grimmig; Kneusel, 1995).
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Fontaniella et al. (2003) avaliaram os teores das poliaminas putresce-
na, cadaverina, espermidina e espermina e dos cidos p-hidroxibenzoico,
clorognico, cafeico, sirngico, p-coumrico e ferlico em dois cultivares
de cana-de-acar (L55-5 e C439-52) com susceptibilidades diferentes em
relao escaldadura das folhas, uma doena causada pela bactria Xan-
thomonas albilineans. Foram avaliados os sucos obtidos de dois cultivares
infectados, que apresentaram nveis significativamente aumentados de ati-
vidade de putrescena e ornitina descarboxilase. No entanto, os patgenos
induziram mudanas diferentes nos dois cultivares, em etapas metablicas
subsequentes. Enquanto espermidina desapareceu completamente no cul-
tivar altamente susceptvel C 439-52, um aumento no teor dessa substncia
foi observado no cultivar moderadamente susceptvel L 55-5. O metabolis-
mo de cidos fenlicos tambm foi diferente nos dois cultivares. Em resu-
mo, esse estudo demonstrou que a composio de poliaminas e cidos fen-
licos no suco da cana foi alterada de forma diferenciada pela infeco por X.
albilineans, sendo que essas alteraes tambm so cultivar dependentes.
Dimetilsulfoniopropionato (DMSP), glicina betana e prolina betana
j foram encontradas e quantificadas em cana (Colmer et al., 2000). Essas
substncias possuem propriedades osmoprotetoras geralmente relaciona-
das a situaes de estresse salino e hdrico (seca), fundamentais na estabili-
zao conformacional de protenas e membranas.
Glassop e colaboradores (2007) observaram mudanas metablicas du-
rante o desenvolvimento da planta (cultivar Q-117) atravs de anlises do
perfil metablico de internodos em vrios estgios de desenvolvimento,
ao longo dos colmos, por CG-EM. Verificaram que os teores de trealose
e de sacarose foram positivamente correlacionados, embora desconheam
mecanismo para explicar essa correlao. No entanto, existem relatos que
indicam modulao por trealose da atividade hexoquinase, enzima associa-
da ao desenvolvimento vegetal (Rolland; Baena-Gonzalez; Sheen, 2006;
Zhang; Yang; Feng, 2006). Existem tambm relatos que associam o ac-
mulo de trealose em plantas submetidas a estresses hdrico, salino e trmico
(Mller; Boller; Wiemken, 1995). Poliis, como manitol, xilitol e sorbitol,
so considerados osmoreguladores e associados a estresse osmtico causado
por temperatura, seca, sal e altos teores de acar (Bieleski, 1982; Pommer-
renig; Papini-Terzi; Sauer, 2007).
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 27
De forma mais ampla, vrias associaes entre nveis de acares e ex-
presso gnica j foram relatadas. Mais especificamente, os acares pa-
latinose, turanose, celobiose, gentiobiose, lactilose e leucrose foram rela-
cionados supresso de sinalizao de giberelinas em embries de cevada
(Loreti; Alpi; Perata, 2000). Alm de sacarose, o mais abundante em cana-
de-acar, glicose e frutose esto sempre presentes em baixas concentra-
es. Adicionalmente, outros 32 acares solveis foram detectados em
concentraes mnimas em vrias espcies e hbridos do complexo Saccha-
rum (Glassop et al. 2010). O eventual papel dessas substncias na modula-
o de sinais fisiolgicos, incluindo crescimento vegetal e resposta a estres-
ses, ainda no entendido.
Wahid e Ghazanfar (2006) encontram fortes evidncias para a hiptese
de que os metablitos secundrios desempenham papel fisiolgico na to-
lerncia salinidade pela cana-de-acar, particularmente em relao aos
danos oxidativos. A funo de tais metablitos pode ficar restrita aos com-
partimentos em que so acumulados, como carotenoides em cloroplastos e
fenlicos, antocianinas e flavonas no citosol.
O aumento na temperatura ambiente global outro fator crtico para o
crescimento vegetal. Para estudar alteraes no crescimento vegetal e nos
nveis de metablitos primrios e secundrios, e suas relaes com termo-
tolerncia, mudas de cana-de-acar (NCO-310) de um ms de idade fo-
ram cultivadas sob condies controle (28C) e sob estresse trmico (40C)
e avaliadas em intervalos de doze horas. Inicialmente, o estresse trmico
reduziu significativamente a matria seca e a rea foliar das plntulas, mas
esse efeito foi posteriormente reduzido. Alteraes nas taxas de crescimen-
to relativo e na assimilao lquida de gua foram maiores que a expanso
foliar relativa, indicando um efeito adverso do calor sobre a assimilao de
nutrientes e de CO
2
na produo de matria seca.
Embora a reduo no potencial hdrico foliar tenha sido uma resposta
imediata ao calor, esse efeito foi compensando pela sntese prematura de
prolina livre, glicina betana e acares solveis. Entre os metablitos se-
cundrios, a sntese de antocianinas foi similar de metablitos primrios;
carotenoides e fenlicos solveis acumularam posteriormente, enquanto o
teor de clorofila no sofreu alterao. As relaes entre nveis de atributos
de crescimento e nveis metablicos, no observados nos controles, foram
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28 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
evidentes nas condies de estresse trmico, indicando sua importncia na
tolerncia da cana-de-acar ao calor (Wahid, 2007).
Alm dos metablitos destacados nos estudos citados acima, os com-
postos orgnicos volteis biognicos (BVOCs) liberados por plantas e que
incluem terpenoides, hidrocarbonetos no oxigenados e oxigenados (l-
coois, aldedos, cetonas, steres) desempenham funo importante na si-
nalizao vegetal, incluindo atrao de polinizadores espcie-especficos,
defesa a herbvoros e patgenos (por exemplo, atravs da atrao de seus
inimigos naturais), regulao celular no desenvolvimento vegetal e, de uma
maneira geral, tambm podem ser indicadores da condio fisiolgica do
vegetal em condies de estresse (Farmer, 2001; Pechersky. Gershenzon;
2002; Penuela; llusia, 2003). Outro fato significativo que BVOCs desem-
penham tambm papel importante na qualidade do ar, na formao do ae-
rosol orgnico secundrio (SOA), no sequestro de carbono e nas interaes
biosfricas (Atkinson; Arey, 2003).
Quase nada de BVOCs de cana-de-acar conhecido. Uma exceo
foi a caracterizao dos componentes volteis (Figura 1.6) responsveis
pelo aroma do suco fresco de cana-de-acar (variedade NCO 376), entre
os quais foram identificados os cidos hexanoico, heptanoico e nonanoico,
os lcoois benzlico, 2-feniletanol, 3-fenil-1-propanol e 3-fenil-2-propanol,
os fenis 2-metoxifenol, fenol, 4-hidroxi-3-metoxiestireno, 4-vinilfenol e
4-hidroxi-2-metxi-benzaldedo e a lactona 4-nonanolido (Tokitomo; Ko-
bayashi; Yamanishi, 1984). As substncias volteis 3-hidroxi-4,5-dimetil-
-2(5H)-furanona (sotolona), 3-hidrxi-2-metil-4-piranona e 2-hidrxi-3-
-metil-2-ciclopentenona, relacionadas ao aroma do melao, no foram
detectadas no suco fresco, o que indicativo de que so produzidas durante
o processamento do suco, em condies alcalinas e sob alta temperatura.
Figura 1.6 Substncias volteis identificadas como responsveis pelo aroma de suco de
cana (garapa) e do melao.
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METABOLMICA DE CANA-DE-ACAR 29
Estudo da composio molecular da graxa epicuticular de cana exem-
plo recente de como a anlise multicomponente pode ser usada juntamente
como mtodos quimiomtricos para revelar caractersticas fenoqumicas
indicadoras de resistncia do vegetal a situaes especficas (Purcell et al.,
2005). Foram utilizados como caractersticas qumicas os catorze compo-
nentes principais da graxa epicuticular dos colmos, entre os quais sete al-
dedos, cinco lcoois e dois alcanos, todos de cadeia carbnica longa (C24
a C33), cujos teores foram avaliados em 122 clones de cana-de-acar com
diferentes nveis de resistncia broca da cana. As diferenas encontradas
nos diversos clones analisados so fundamentalmente quantitativas, cada
um possuindo uma proporo caracterstica entre os vrios componentes
da graxa epicuticular.
Utilizando anlise de componentes principais (PCA) foi possvel clas-
sificar arbitrariamente as amostras em trs grupos e relacion-los com os
constituintes da graxa. Atravs dessa anlise foi possvel relacionar os al-
dedos triacontanal (C30), dotriacontanal (C32), tetratriacontanal (C34)
e hexatriacontanal (C36) e o alcano heptacosano (C27) e o lcool triacon-
tanol (C30) com os clones mais resistentes, enquanto os lcoois tetracosa-
nol (C24), hexacosanol (C26) e octacosanol (C28) e o aldedo hexacosanal
(C26) foram relacionados aos clones mais susceptveis. Modelagem dessas
informaes atravs de quadrados mnimos parciais (PLS) confirmou a
possibilidade de prever a susceptibilidade de clones a partir da composio
qumica da graxa cuticular. Em outras palavras, esse mtodo pode reduzir
sensivelmente o tempo de desenvolvimento de novas variedades, uma vez
que o melhorista poder classificar novas plantas sem necessidade de expe-
rimentao biolgica.
Consideraes finais
Os relatos apresentados acima indicam a necessidade de sistematizao
e complementao do conhecimento das alteraes metablicas associadas
aos vrios cultivares de cana-de-acar, visando o entendimento de suas
funes nas variedades genticas resistentes a doenas e a estresses am-
bientais. O estudo metabolmico detalhado de cana-de-acar durante os
estgios de crescimento vegetal e sob condies diversas e severas de culti-
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30 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
vo podem suportar essa proposta. Objetivos adicionais devem considerar a
avaliao de alteraes metablicas durante a infeco/infestao da planta
por patgenos e desenvolvimento de doenas, com intuito de identificar
marcadores qumicos de sade vegetal e fatores de resistncia a situaes de
estresse abitico ou bitico.
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2
Estudos da dormncia e
do condicionamento fisiolgico de sementes:
possveis contribuies
propagao de espcies vegetais
com potencial energtico
Edvaldo Aparecido Amaral da Silva,
Cludio Cavariani, Simoni Anese, Sue Ellen Ester Queiroz,
Ana Carla Resende Fraiz
Introduo
O Brasil, pas com expressiva biodiversidade, tambm o local de ori-
gem de vrias espcies vegetais de importncia econmica mundial, desta-
cando-se a castanha do Par, a seringueira, o mogno, a mandioca e outras.
Alm dessas espcies, j mundialmente conhecidas e utilizadas, as espcies
com potencial energtico podem diversificar a matriz energtica brasileira
e, desse modo, reduzir a dependncia de fontes no renovveis de energia.
Atualmente no Brasil, iniciativas governamentais tm criado incentivos
produo de matrias-primas para suprir a demanda por biodiesel. To-
davia, vrias dessas espcies carecem de estudos que possam favorecer a
propagao com o desenvolvimento de mtodos e protocolos de propagao
mais eficiente.
Nesse sentido, estudos sobre os mecanismos de dormncia e germi-
nao, apoiados em tcnicas de pr-semeadura, como o condicionamento
fisiolgico, ampliaro as perspectivas quanto a utilizao das espcies de
potencial energtico por contribuir na sua propagao.
Existe, na literatura brasileira, elevado nmero de trabalhos cientfi-
cos que contemplam mtodos para a superao da dormncia de semen-
tes de vrias espcies vegetais. Entretanto, poucos deles visaram ampliar
os conhecimentos sobre os mecanismos da germinao e da dormncia em
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36 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
associao com as condies ambientais. Tais conhecimentos, quando ge-
rados, podem, por exemplo, possibilitar o entendimento da influncia do
ambiente (temperatura, luz e precipitao) na superao da dormncia e na
germinao das sementes.
Adicionalmente, o uso da tcnica de condicionamento fisiolgico (pri-
ming) constitui uma ferramenta importante no apenas por proporcionar
germinao mais rpida e uniforme, mas, tambm, por induzir tolerncia s
sementes durante a geminao e o desenvolvime nto de plntulas e plantas
em condies adversas de ambiente.
Assim, estudos fisiolgicos e tratamentos de pr-semeadura, juntamen-
te com os avanos alcanados na rea da genmica, transcriptoma, proteo-
ma e metaboloma, podem proporcionar a identificao de genes, protenas
e metablitos envolvidos com os referidos processos biolgicos e, tambm,
com a qualidade das sementes. O conjunto dessas iniciativas deve resultar
no desenvolvimento de marcadores moleculares para auxiliar no monitora-
mento da qualidade das sementes, para predizer seu desempenho, alm de
ter sua aplicao no melhoramento vegetal pela seleo assistida por mar-
cadores. Finalmente, transformaes genticas, objetivando a melhoria da
qualidade de sementes, podem tambm ser aplicadas.
Atualmente, existe um grande nmero de espcies vegetais cujos ge-
nomas ou ESTs (Expressed sequence tags) foram realizados e, para muitas
delas, as informaes encontramse disponveis para acesso. (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov). Entre as espcies com potencial para utilizao na pro-
duo de biodiesel, cita-se a Jatropha curcas L. (pinho-manso). Nessa es-
pcie 13.249 ESTs foram obtidas durante o desenvolvimento e a germina-
o das sementes (Costa et al., 2010).
Definio de dormncia
De acordo com Bewley (1997), a dormncia pode ser interpretada como
uma falha de uma semente intacta e vivel em germinar sob condies apa-
rentemente favorveis germinao. Para Laboriau (1983), a dormncia
de sementes definida como uma condio negativa, ou seja, mesmo sob
condies ambientais favorveis ou normalmente adequadas, a germinao
no ocorre.
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ESTUDOS DA DORMNCIA E DO CONDICIONAMENTO FISIOLGICO DE SEMENTES 37
Em um conceito mais amplo, a dormncia de sementes pode ser enten-
dida como um fenmeno que determina a ausncia momentnea ou a lenta
germinao de sementes viveis, apesar da existncia de condies ambien-
tais favorveis ao processo.
Tipos de dormncia
A classificao de dormncia segundo a sua origem contempla dois tipos
de dormncia: a primria ou inata, e a secundria, ou induzida.
Dormncia primria
A dormncia primria instala-se durante a fase de desenvolvimento
e/ou maturao, de modo que a semente dispersa j em estado dormente,
exigindo tratamentos ou condies especficas para tornar-se quiescente.
As sementes, durante seu desenvolvimento, podem adquirir capacidade
de germinar logo aps a maturao, mas existem, na maioria das espcies,
mecanismos controladores do crescimento do embrio que impedem a
germinao na planta me. A persistncia dos fatores restritivos germi-
nao, aps a maturidade e disperso da semente, caracteriza a dormncia
primria.
O cido abscsico (ABA), entre outros fatores, responsvel pela indu-
o da dormncia. A dormncia primria no depende s do gentipo, mas
tambm das condies ambientais durante a maturao. Fatores como a po-
sio da flor ou inflorescncia na planta, posio da semente na inflorescn-
cia ou no fruto e idade da planta me durante a induo floral ou maturao
da semente tambm influenciam, diretamente, o grau de dormncia de
uma semente, alterando sua capacidade de germinao.
A dormncia primria possui duas funes bsicas: a primeira impe-
dir a germinao precoce das sementes durante a fase de maturao; a se-
gunda funo distribuir a germinao das sementes no tempo, ou seja,
evitar que todas tenham germinao sincronizada. A estratgia amplia as
possibilidades de sobrevivncia da espcie, mas interfere negativamente na
sua propagao comercial.
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38 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Dormncia secundria
A dormncia secundria de sementes ainda no foi completa e suficiente-
mente elucidada na literatura pertinente. reconhecido que as sementes com
dormncia secundria so as que germinam normalmente, mas quando ex-
postas a fatores ambientais desfavorveis, so induzidas ao estado de dormn-
cia. Portanto, a dormncia secundria pode ocorrer em sementes anterior-
mente no dormentes ou com dormncia primria superada. De acordo com
Hilhorst (1995), as sementes podem passar por ciclos de dormncia, pela
ocorrncia sucessiva de induo e superao da dormncia secundria aps o
declnio da dormncia primria (no dormente), dependente das variaes de
fatores ambientais, at que as condies se tornem favorveis germinao.
Causas da dormncia
Bewley e Black (1982) reconheceram basicamente as seguintes causas de
dormncia: dormncia do embrio, includos os casos de inibio metabli-
ca e imaturidade do embrio, e dormncia imposta pelo envoltrio (ou teci-
do de cobertura), relacionada aos casos de impermeabilidade do tegumento,
presena de inibidores e restrio mecnica. Um sistema mais abrangente
dividiu a dormncia do embrio (dormncia endgena) em fisiolgica,
morfolgica e morfofisiolgica, e a dormncia imposta pelo envoltrio (ou
exgena) em fsica, qumica e mecnica (Baskin e Baskin, 1998).
Considerando uma abordagem mais clssica, as causas de dormncia em
sementes so: impermeabilidade do tegumento gua; impermeabilidade
da cobertura protetora a trocas gasosas; resistncia mecnica imposta pelo
tegumento, pericarpo ou tecidos de reserva; ao de substncias inibidoras
da germinao e imaturidade do embrio.
Impermeabilidade do tegumento gua
As sementes com tegumento impermevel gua so conhecidas por se-
mentes duras, dureza que confere atraso na germinao das sementes. Esse
mecanismo de dormncia induzido durante o processo de maturao, no
perodo de acmulo de matria seca. No tegumento, ou envoltrio, dessas
sementes so depositadas substncias de natureza orgnica e hidrofbica
(lipdios, suberinas, cutinas e ligninas) em uma ou mais camadas de clula
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ESTUDOS DA DORMNCIA E DO CONDICIONAMENTO FISIOLGICO DE SEMENTES 39
que impedem a entrada de gua na semente. A hidratao e a consequente
superao da dormncia esto relacionadas, em muitos casos, formao de
aberturas em estruturas anatmicas especializadas, como o hilo, por exem-
plo, localizado na superfcie da semente, em que ocorre a reduo da resis-
tncia entrada de gua (Baskin e Baskin, 2004).
A impermeabilidade do tegumento gua considerada uma das causas
mais comuns de dormncia em sementes de espcies tropicais e verificadas
com frequncia nas seguintes famlias: Fabaceae (leguminosas, principal
grupo), Cannaceae, Chenopodiaceae, Convallariaceae, Convolvulaceae,
Gramineaceae, Malvaceae, Solanaceae, Anacardiaceae e Rhamnaceae.
Alm dessas, diversas espcies de palmeiras possuem dormncia, princi-
palmente relacionada impermeabilidade penetrao de gua para o em-
brio e o endosperma.
As sementes podem ser dispersas com diferentes graus de impermeabi-
lidade gua ou dureza, por influncia do gentipo, da desuniformidade de
maturao e das alteraes das condies climticas durante a fase de ma-
turao. Devido a essas diferenas de profundidade de dormncia das se-
mentes, esse mecanismo possui importante papel ecolgico de distribuio
na germinao no tempo. A superao da dormncia devido a impermeabi-
lidade entrada de gua ocorre na natureza, por processos que envolvem a
participao e a interao de microrganismos e temperaturas alternadas, e,
tambm, devido a ingesto das sementes por animais.
Impermeabilidade do tecido de cobertura a trocas gasosas
Neste caso de dormncia, os tecidos impermeveis que circundam o em-
brio limitam sua capacidade de trocas gasosas de modo a impedir o aces-
so necessrio ao oxignio obrigatrio germinao, mantendo a semente
dormente. sugerido por alguns autores que o tegumento ou envoltrio
das sementes possam oferecer resistncia entrada de oxignio ou sada
de gs carbnico durante a embebio. Entre outros fatores, a composio
qumica e a estrutura do tegumento podem controlar as trocas gasosas da
semente e o meio.
Resistncia mecnica
A ocorrncia de sementes com dormncia mecnica causada por te-
cidos que impedem expanso do embrio e protruso da radcula. Nesse
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40 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
caso, a absoro de gua e oxignio ocorrem normalmente pelas sementes,
sendo que, o crescimento do embrio limitado pela rigidez dos tecidos que
o envolvem. Essa dormncia, muitas vezes, relacionada ao endosperma
que muito rgido, como o endosperma micropilar (endosperma localizado
na frente da radcula).
Endosperma micropilar rgido, que precisa ser enfraquecido para ocor-
rer a protruso da radcula, j foi constatado em diversas espcies, tais como
tomate (Solanum esculentum) (Groot; Karssen, 1987; Toorop; Bewley;
van Aelst; Hillhorst, 1996; Toorop; van Aelst; Hillhorst, 2000), pimenta
(Capsicum annum) (Watkins; Cantliffe, 1983), tabaco (Nicotiana taba-
cum) (Leubner-Metzger et al., 1995); melo (Cucumis melo) (Welbaum et
al., 1995), Datura ferox (Sanchez et al., 1986); caf (Coffea arabica) (Silva
et al., 2004); lobeira (Solanum lycocarpum) (Pinto et al., 2007); e jenipapo
(Genipa americana) (Queiroz, 2009). A superao desse mecanismo de dor-
mncia ocorre devido a ao de vrias enzimas, entre elas, o-galactose (EC
3.2.1.22), |-manosidase (EC 3.2.1.25) e endo-|-mananase (EC 3.2.1.78),
no enfraquecimento do endosperma micropilar por hidrlise de mananas e
galactomananas, presentes nas paredes celulares do endosperma micropilar
das sementes.
Substncias inibidoras
A dormncia causada por substncias inibidoras est relacionada
substncias produzidas tanto fora como dentro das sementes, que, quando
translocadas para o embrio, podem inibir a germinao. Portanto, inibido-
res, presentes tanto na semente quanto no fruto, podem inibir a germinao
em situaes em que o embrio no se encontra dormente.
Imaturidade do embrio
As sementes de algumas espcies vegetais podem ser dispersas com
embrio fisiologicamente imaturo, que necessita ter o desenvolvimento
completado para que a germinao ocorra. No primeiro caso, as sementes
so dispersas da planta me com embrio no diferenciado, ou seja, no
possvel identificar as partes principais do embrio, como os cotildones,
hipoctilo e radcula. Nesse caso, o embrio teria que finalizar o seu desen-
volvimento aps a disperso. Algumas sementes de orqudeas so dispersas
com o embrio formado por uma massa de clulas na qual no possvel
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ESTUDOS DA DORMNCIA E DO CONDICIONAMENTO FISIOLGICO DE SEMENTES 41
identificar as partes do embrio. Alguns autores classificam esse tipo de
dor mncia como dormncia morfolgica.
Outras espcies vegetais tm suas sementes dispersas com embrio pou-
co desenvolvido, embora diferenciado em cotildones e em eixo hipoctilo-
-radcula, mas com barreiras fisiolgicas. Nesse caso, a germinao prece-
dida por uma fase de crescimento desencadeada por condies ambientais
apropriadas. A combinao de dormncia morfolgica e fisiolgica cha-
mada de dormncia morfofisiolgica. Sementes de Annona crassiflora, tam-
bm conhecida como marolo ou araticum, um exemplo de espcie que
tem dormncia morfofisiolgica.
Do ponto de vista prtico, a dormncia presente em sementes de Annona
crassiflora compromete a produo de mudas da espcie. Exemplo de que
a pesquisa tem auxiliado nesse aspecto com relao ao entendimento das
condies ambientais necessrias para a superao da dormncia dessa es-
pcie. Hoje conhecido que as oscilaes de temperaturas, bem como tem-
peratura baixa do solo, prximas a 10C durante os meses de junho e julho,
so necessrias para a superao da dormncia.
Condicionamento fisiolgico de sementes
Condicionamento fisiolgico, ou priming, de sementes uma impor-
tante tecnologia pr-semeadura usada comercialmente para aprimorar
a qualidade de sementes, traduzido por elevao da taxa de germinao,
uniformidade de emergncia de plntulas e, em alguns casos, liberao de
dormncia, em diferentes espcies. A tcnica envolve a hidratao controla-
da das sementes suficiente para promover atividades pr-metablicas nas
fases iniciais da germinao (fases I e II), sem, contudo, ocorrer a protruso
da radcula (fase III) e secagem posterior para grau de umidade anterior
aplicao do tratamento (Heydecker; Higgins; Gulliver; 1973; Karssen et
al., 1989; McDonald, 1998; Powel et al., 2000). Os benefcios do priming
so constatados depois da reidratao. Em geral, ocorre aps o tratamento a
reduo da fase II, porque parte da preparao para entrada na fase III no
precisa ser repetida, de modo que a germinao subsequente mais rpida
e sincronizada (Powel et al., 2000; Karssen et al., 1989).
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42 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Solues osmticas, com agentes inorgnicos, como o NaCl, KNO
3
e
MgSO
4
, e orgnicos, como polietilenoglicol (PEG), tm sido usadas e refe-
rem-se ao osmopriming. J o hidropriming envolve o uso de gua, com o con-
trole da embebio realizado em funo do perodo de tempo que as semen-
tes se mantm em contato com a gua e pela temperatura. A eficincia do
osmopriming sobre vigor, uniformidade de germinao, estabelecimento de
diferentes espcies e tolerncia a condies de estresse relatada em muitos
estudos (Ella; Dionisio-Sese; Ismail, 2011; Kissmann et al., 2010; Butler et
al., 2009; Kausar et al., 2009; Nascimento, 2005; Liu et al., 1996).
Contudo, o hidropriming tem vantagens por ser mais simples, econmi-
co e de fcil aplicao, porque somente gua utilizada durante a embebi-
o (Farooq et al., 2006a). Hidropriming tem sido usado com sucesso em
sementes de cereais (Farroq; Barsa; Wahid, 2006b; Moradi Dezfuli; Sharif-
-Zadeh; Janmohammadi, 2008), em hortalias (Caseiro; Bennett; Marcos
Filho, 2004; Venkatasubramanian; Umarani, 2007; Marcos Filho; Kikuti,
2008) e em sementes de espcies florestais (Pinedo; Ferraz, 2008; Anese et
al., 2011).
Os benefcios proporcionados pelo priming so influenciados por muitos
fatores. Inicialmente, para definir as melhores situaes de condicionamen-
to, necessrio conhecer o comportamento da embebio e da fase inicial
da germinao da espcie de interesse. Aps isso, necessrio determinar a
melhor combinao de potencial osmtico, agente condicionador, perodo
de tempo e temperatura em que as sementes ficaro expostas ao tratamento
e o efeito da secagem aps o tratamento (Badek; van Duijn; Grzesik, 2006).
Portanto, no h um procedimento nico para o condicionamento de se-
mentes de diferentes espcies, o que torna necessrio o desenvolvimento de
pesquisas para estabelecer um protocolo eficiente para a espcie, ou mesmo
cultivar.
Quando o condicionamento das sementes for favorvel, diversos eventos
metablicos podem ser ativados e contribuem com a melhoria da germina-
o subsequente. Os benefcios tm sido associados ativao de mecanis-
mos de reparos macromoleculares e do sistema de membranas, incremento
nas atividades enzimticas e mobilizao de acares e protenas (Sriniva-
san; Saxena; Singh, 1999; McDonald, 1998). Em reviso recente, Varier e
colaboradores (2010) sumarizaram os principais processos, em nvel subce-
lular, resultantes da aplicao do priming. Foi destacado, mediante estudos
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ESTUDOS DA DORMNCIA E DO CONDICIONAMENTO FISIOLGICO DE SEMENTES 43
envolvendo anlise protemica, que enzimas associadas com a mobilizao
de reservas so ativadas ou sintetizadas durante o condicionamento. Alm
disso, foi possvel detectar o acmulo de protenas com a funo de mini-
mizar danos celulares.
Da mesma forma, estudos de expresso gnica revelaram a presena de
genes que codificam protenas envolvidas na produo de energia e defesas
qumicas. O condicionamento tambm proporciona a pr-ativao do ciclo
celular, pelo preparo das clulas do embrio para a diviso, por aumentar a
sntese de |-tubulina, que um componente dos microtbulos, mostran-
do-se, assim, como um dos mecanismos que propicia desempenho superior
da germinao de sementes submetidas ao tratamento.
O condicionamento fisiolgico, para algumas espcies, tambm est en-
volvido no mecanismo de superao de dormncia. O enfraquecimento do
endosperma micropilar tem sido proposto como o evento que controla a
germinao de diferentes espcies, tais como alface (Lactuca sativa) (Nas-
cimento; Cantliffe; Huber, 2004), tomate (Groot et al., 1988) e Solanum
lycocarpum (Pinto et al., 2007). Endo-|-mananase (EBM) uma enzima
relacionada com o enfraquecimento do endosperma micropilar de tomate
(Still; Bradford, 1997; Toorop, 1998). Foi demonstrado em sementes de to-
mate durante o priming aumento da atividade de EBM e reduo da fora de
ruptura do endosperma micropilar (Still; Bradford, 1997; Toorop, 1998).
Do mesmo modo, em sementes de alface, EBM uma enzima chave na
regulao do enfraquecimento do endosperma e exige a ao do etileno para
ser ativada. Altas temperaturas durante a embebio das sementes podem
inibir a germinao atravs da supresso da sntese de etileno que, por sua
vez, reduz a atividade de EBM (Nascimento; Cantliffe; Huber, 2004). O
condicionamento das sementes em PEG (-1,2 MPa), 15C, mostrou-se
eficiente para superar os efeitos inibitrios da alta temperatura em sementes
de alface, melhorando a germinao e a atividade de EBM, o que sugere a ca-
pacidade do osmocondicionamento proporcionar a superao da termodor-
mncia, mesmo em condies de supresso da sntese de etileno (ibidem).
Para ocorrer a germinao de sementes dormentes de S. lycocarpum,
uma espcie nativa do bioma Cerrado e importante colonizadora de re-
as degradadas, necessrio o enfraquecimento do endosperma micropilar,
processo coincidente com a elevao da atividade de EBM nessa regio do
endosperma (Pinto et al., 2007). Anese e colaboradores (2011) constataram
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ambos os fenmenos durante o condicionamento em gua (hidropriming) de
sementes de S. lycocarpum, por quinze dias, 15C.
Assim, o enfraquecimento do endosperma micropilar, e consequente re-
duo da fora de resistncia ao alongamento do embrio e da protruso ra-
dicular na germinao subsequente das sementes, resultou em diminuio
do tempo necessrio para 50% de germinao (T50), elevao da uniformi-
dade de germinao e melhor desempenho das mudas em condies de vi-
veiro, traduzidos por incrementos em emergncia, em altura, em dimetro
e em massa da matria seca das plantas jovens. Foi sugerido a possibilidade
do emprego da tcnica de priming para beneficiar a produo de mudas na
restaurao de reas degradadas in situ, por exemplo.
Em espcies agrcolas, como a soja, Bejandi e colaboradores (2009) ve-
rificaram efeito positivo da imerso das sementes em gua durante doze
horas, 25C, seguida de secagem, assim como da imerso com a adio
de auxina e giberelina taxa mdia de emergncia, aos contedos relativos
de gua das folhas e de clorofila, ao comprimento da parte area e pro-
dutividade de gros em condies salnicas. Rouhi e colaboradores (2011)
avaliaram o efeito do osmoprimig e do hidropriming na melhoria qualitativa
de lotes de sementes de soja. O osmopriming em PEG (-1,2 MPa), por doze
horas, foi o tratamento que resultou em valores superiores de germinao,
de velocidade de germinao e de comprimento das plntulas, com a con-
cluso de constituir excelente tcnica para aprimorar o desempenho fisiol-
gico das sementes, inclusive das de vigor inferior, traduzido por emergncia
uniforme de plntulas no campo.
O condicionamento fisiolgico pode favorecer a germinao e o cresci-
mento de plntulas sob condies de dficit hdrico em sementes de olea-
ginosas, como o girassol (Kaya et al., 2006). Em condies de campo, a
imerso de sementes de girassol em gua durante 24 horas a 27C, seguida
de secagem, promoveu aumento na velocidade de emergncia das plntulas
(Hussain et al., 2006). Barros e Rossetto (2009) demonstraram que o osmo-
condicionamento dos aqunios de girassol em KNO
3
foi eficiente em pro-
mover a superao da dormncia e/ou o reparo metablico do lote de aqu-
nios envelhecido artificialmente. Em sementes de canola, outra cultura com
potencial para produo de biodiesel, Basra e colaboradores (2003) relata-
ram que o priming afetou significativamente os parmetros de crescimento
e registrou um aumento no ndice de rea foliar e acmulo de matria seca.
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ESTUDOS DA DORMNCIA E DO CONDICIONAMENTO FISIOLGICO DE SEMENTES 45
Sementes de linhagens hbridas de milho submetidas ao hidropriming
por 36 horas, tiveram elevada germinao e maior comprimento radicular
das plntulas em comparao ao controle (Moradi Dezfuli; Sharif-Zadeh;
Janmohammadi, 2008). Do mesmo modo, o condicionamento osmtico
realizado por trs dias com polietilenoglicol, sob potenciais de -1,0 MPa e
-1,2 MPa, proporcionou aumento da germinao de sementes de milho doce
armazenadas por seis meses, e pode constituir uma alternativa para superar
a queda de germinao durante o armazenamento (Oliveira et al., 2007).
Apesar dos estudos realizados e tendo em vista a diversidade de espcies
da flora brasileira com potencial energtico, so necessrias, ainda, mais in-
formaes a respeito do condicionamento fisiolgico das sementes para esse
grupo vegetal. Assim, investigaes mais detalhadas para desvendar as ba-
ses fisilogicas, bioqumicas e os aspectos da biologia molecular das semen-
tes, durante e aps a aplicao do condicionamento fisiolgico (osmopriming
e ou hidropriming), poderiam indicar os aprimoramentos necessrios da
tcnica e, consequentemente, o desenvolvimento dos protocolos adequados
para o alcance de benefcios reais que contribuam expanso da produo.
Mecanismos fisiolgicos e moleculares associados
s sementes submetidas ao condicionamento fisiolgico
Embora os efeitos da tcnica de priming sejam conhecidos, conferindo
tolerncia s situaes de estresse, ainda no existem trabalhos suficientes
para desvendar os mecanismos moleculares associados a essa tolerncia.
Assim, atualmente, uma linha de pesquisa que se destaca so os estudos
voltados para promover no apenas rpida e uniforme germinao s se-
mentes, mas, tambm, para conhecer em nvel molecular quais protenas
so induzidas durante os tratamentos que favorecem a emergncia das
plntulas e o desenvolvimento das plantas em situaes de estresse.
Os estresses ambientais podem provocar perdas na planta, porm, em
contrapartida, acarretar respostas de preveno e de reparo (Kranner et al.,
2010) que so controladas em nvel molecular mediante mudanas na ex-
presso gnica. As plantas so capazes de expressar um tipo de memria,
tambm chamada de impresso do estresse. Essa impresso, comumente
traduzida por modificaes genticas e bioqumicas induzidas por uma
primeira exposio ao estresse, aumenta a resistncia a uma condio ad-
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46 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
versa subsequente (Bruce et al., 2007), mediante a induo de respostas de
tolerncia. A tolerncia pode estar relacionada a um arranjo de respostas
morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e moleculares que diminuem as
perdas causadas pela exposio ao estresse, ou facilitam o reparo de perdas
do sistema (Potters et al., 2007).
Alguns trabalhos indicam que o efeito benfico do condicionamento
fisiolgico diante do estresse tem sido associado ao acmulo de mRNA e de
protenas inativas produzidas durante o condicionamento osmtico (Bray
et al., 1989; Gallardo et al., 2001; Ozbingol et al., 1999), ao reparo e sntese
de novas molculas de DNA e RNA (Kausar et al., 2009) e ao aumento da
sntese de antioxidantes (Chen; Arora, 2011; Srivastava et al., 2010). Es-
ses so alguns exemplos de eventos que contribuem para a preservao da
integridade do genoma e para a qualidade de sementes. Soeda e colabora-
dores (2005) identificaram expresso de genes relacionados tolerncia a
estresse durante o condicionamento de sementes de Brassica oleracea, como
SOD (superoxido dismutase), HSP (protenas de choque trmico) e LEA
(protenas abundantes do final da embriognese).
Alm de mudanas na sntese de macromolculas, outro modo das plan-
tas superarem condies adversas evitar o estresse. Esse mecanismo
conhecido como escape (Larcher, 2000) e tambm pode ser desencadeado
pelo condicionamento osmtico. ndices superiores de velocidade de ger-
minao (IVG) de sementes condicionadas, em relao as no condiciona-
das, foram observados em trabalhos de pesquisa e significam reduo do
tempo entre a semeadura e a protruso da radcula, ou seja, maiores chances
de escape a possveis intempries ambientais.
A maior eficincia na absoro de gua do meio, o incio antecipado das
atividades metablicas do processo de germinao (Hassanpouraghdam,
et al., 2009) e a menor aderncia do tegumento durante a emergncia das
plntulas (Nascimento; West, 1998) so justificativas ao menor tempo para
a protruso da radcula, como demonstrados em Cucumis melo e Brassica
napus. O reduzido espao de tempo para a protruso da radcula e emer-
gncia das plntulas, a partir da semeadura, considerado a caracterstica
que proporciona possvel vantagem ecolgica no estabelecimento da planta
em reas com condies subtimas (Bewley; Black, 1994), como baixas e
altas temperaturas (Wahid; Shabbir, 2005), baixas umidades no solo (Du;
Tuong, 2002) e salinidade (Wahid et al., 2007).
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ESTUDOS DA DORMNCIA E DO CONDICIONAMENTO FISIOLGICO DE SEMENTES 47
Outras caractersticas encontradas foram maior capacidade de ajusta-
mento osmtico das clulas e a maior quantidade de acar e cidos org-
nicos em plantas de tomate originrias de sementes condicionadas em solu-
es salinas. Nesse caso, as plantas de tomate mostraram maior tolerncia
salinidade do solo (Cayuela et al., 1996).
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3
Tecnologia de aplicao e inovaes voltadas
ao uso racional de defensivos agrcolas em
culturas destinadas produo de bioenergia
Caio Antonio Carbonari,
Edivaldo Domingues Velini,
Ulisses Rocha Antuniassi
Introduo
A produo de energia a partir da biomassa vegetal , luz do conheci-
mento atual, a alternativa mais vivel para a substituio dos combustveis
fsseis. Nesse contexto, o Brasil apresenta destaque no cenrio mundial
com ampla produo de energia por fontes renovveis, com vasto uso de
biomassas vegetais. Entre as fontes de energia primria no Brasil, destacam-
-se os produtos provenientes da cana-de-acar e a lenha, respectivamente
responsveis por 18,8% e 10,2% da energia primria brasileira (Empresa
de Pesquisa Energtica, 2010). Assim, as culturas da cana-de-acar e do
eucalipto, que a principal espcie florestal plantada no Brasil, destacam-
-se no pas como culturas de grande importncia quanto produo de bio-
energia.
A cana-de-acar sobressai como uma das culturas mais notveis do
pas, produzindo matria-prima para a indstria sucroalcooleira e cogera-
o de energia eltrica. O Brasil o maior produtor mundial de cana-de-
-acar, com uma rea plantada de aproximadamente 8 milhes de ha, sen-
do 4,35 milhes de ha somente no estado de So Paulo (Companhia Nacio-
nal de Abastecimento Conab, 2011). Essa rea representa um aumento
de 8,4% do obtido na safra passada, ou seja, uma quantidade de 674 mil
hectares adicionais da cultura.
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54 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
A agroindstria canavieira est plenamente implantada e em expanso
no Brasil. Nas ltimas dcadas, a indstria canavieira tem demonstrado
grande capacidade de agregar valor a coprodutos do lcool e do acar,
como a vinhaa (como fertilizante), a torta de filtro, o bagao (matria-
-prima industrial, alimentao animal e gerao de energia) e a palhada (ge-
rao de energia). A tendncia para os prximos anos que cada unidade
industrial destinada transformao da cana produza, alm do acar e do
lcool, energia, crditos de carbono e um grande nmero de matrias-pri-
mas industriais.
A palhada o coproduto mais recente da cultura e a sua acumulao no
campo foi desencadeada pela alterao do mtodo de colheita. A colheita
mecanizada da cana sem queima da palha deu origem a um novo sistema
de produo denominado de cana crua. A colheita tradicional com queima
da palha dever estar extinta em futuro prximo, em funo de presses
ambientais e trabalhistas. O sistema de cana crua j utilizado de maneira
predominante nos canaviais do estado de So. As bases para o uso da pa-
lhada para a produo de energia ou para fins industriais ainda esto sendo
criadas. Esse resduo normalmente supera 10t ha
-1
de biomassa no campo,
justificando os esforos para o seu uso.
Do mesmo modo, o plantio de eucalipto assume grande importncia na-
cional pela gerao de matria-prima para a indstria e gerao de energia.
De acordo com ABRAF (2010), 56% (2.534.240 ha) das reas com florestas
plantadas de eucalipto no Brasil se localizam na regio Sudeste, com des-
taque para o estado de Minas Gerais (1.300.000 ha) seguido por So Paulo
(1.029.670 ha), respectivamente, com participaes de 29% e 23% do total
do pas. A expanso de ambas as culturas ocorre em reas ocupadas ante-
riormente por outras culturas, menos rentveis, particularmente em peque-
nas propriedades, assim como em reas recm-desmatadas.
Outras duas culturas de grande destaque em termos de produo de bio-
energia so a soja e o milho. O leo de soja utilizado na produo de 86%
do biodiesel consumido no Brasil (ANP, 2011). Desde o incio de 2010, o
biodiesel adicionado ao leo diesel na proporo de 5% em todo o terri-
trio nacional. O milho constitui a base para o programa de produo de
etanol nos EUA, o maior produtor mundial desse combustvel.
As quatro culturas citadas, cana, eucalipto, soja e milho so as de maior
relevncia para a produo de bioenergia no Brasil (as trs primeiras) e no
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 55
mundo. Culturas como beterraba aucareira, mamona, dend, girassol,
pinho-manso, canola so tambm importantes em termos de Brasil e de
mundo, mas em um nvel inferior s quatro destacadas neste texto.
Algumas crticas produo de bioenergia so recorrentes. A primei-
ra delas refere-se ao fato das culturas produtoras de energia, competirem
em rea e recursos com cultivos produtores de alimentos. Esse risco de fato
existe, mas minimizado quando a cultura em questo permite o uso com
mais de uma finalidade como o caso da soja e do milho. No caso dessas
duas culturas, apenas parte dos gros utilizada na produo de combust-
veis, sendo que o restante destinado produo de alimentos destinados
a animais, principalmente. Na medida em que o cultivo de ambas para a
produo de energia estimulado, a produo de alimentos , na mesma
medida, beneficiada.
Quanto cana-de-acar, praticamente toda a biomassa destinada
produo de energia havendo as seguintes possibilidades principais: 1) ener-
gia metablica a partir da sacarose; 2) etanol a partir da sacarose; 3) etanol
de segunda gerao produzido a partir do bagao e de outros resduos como
a palhada; 4) gerao de energia eltrica a partir do bagao e da palhada.
Quando da renovao da cultura (da ordem de 15% ao ano), comum a ro-
tao da cana com culturas anuais como amendoim e soja, havendo a possi-
bilidade de produzir alimentos em reas tradicionalmente cultivadas com a
espcie.
No caso do eucalipto, os sistemas de integrao pastagem, lavoura e
pecuria so alternativas promissoras para a produo de madeira de modo
harmonioso com a produo de alimentos, mas so sistemas cujo desen-
volvimento ainda demanda intensa atividade de pesquisa para otimiz-los.
O eucalipto a alternativa mais eficiente para a produo de lenha, que j
corresponde a 10,2% da matriz energtica brasileira (Empresa de Pesquisa
Energtica, 2010) e cresce a sua utilizao na produo de energia eltri-
ca. Nesse ltimo caso, o maior desafio corresponde ao desenvolvimento de
sistemas de cultivo e de colheita voltados a essa nova utilizao da cultura.
Outra crtica frequente produo de bioenergia refere-se elevada de-
manda de insumos e outros recursos necessrios produo da biomassa
com esse fim. O primeiro fator de produo sempre mencionado a gua.
De fato, a preocupao se justifica quando se considera que mais de dois
teros de toda a gua consumida pela humanidade utilizada para abastecer
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56 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
sistemas de irrigao. Nesse aspecto, os sistemas de produo de soja, mi-
lho, cana e eucalipto, desenvolvidos no Brasil so bastante eficientes, pois
a grande maioria das reas cultivadas so reas de sequeiro, ou seja, sem
irrigao. Em outros pases, o uso de irrigao em soja e milho, principal-
mente, bastante frequente, justificando a preocupao apresentada.
O aumento do uso de fertilizantes para produzir bioenergia tambm
uma grande preocupao em funo da possibilidade da exausto das ro-
chas e fontes de energia utilizadas na sua produo . Nesse aspecto, os sis-
temas de produo em uso no Brasil tambm so modelos de eficincia.
Praticamente todos os produtores de soja lanam mo de fixadores simbi-
ticos de nitrognio inoculados nas sementes das culturas e que praticamen-
te dispensam o uso desses fertilizantes na cultura. Em cana, o uso de ferti-
lizantes tem sido minimizado pelo retorno da grande maioria dos resduos
como vinhaa e torta, ao campo, reduzindo a necessidade de adubao
da cultura.
Em eucalipto, vem sendo muito bem-sucedido o melhoramento ge-
ntico da cultura, associado clonagem dos melhores gentipos, que tem
permitido a obteno de clones mais produtivos, rsticos e com menor de-
manda de nutrientes por tonelada de madeira produzida. Apesar do grande
esforo feito pelas instituies de pesquisa, pelas indstrias de fertilizantes
e pelos produtores, o Brasil ainda importa cerca de 25%, 50% e 90% de todo
o nitrognio, fsforo e potssio consumidos para fins agrcolas. Talvez seja
esse o ponto de maior vulnerabilidade de nossa produo agropecuria; no
h como mant-la sem a importao de fertilizantes.
Outra crtica recorrente ao uso dessas quatro culturas agrcolas na pro-
duo de bioenergia refere-se ao uso de defensivos agrcolas com possveis
efeitos negativos sobre a qualidade dos produtos obtidos e, principalmente,
sobre o meio ambiente. sobre esse tema que versar este texto.
Os defensivos agrcolas desempenham um papel de grande importncia
na agricultura, contribuindo para reduo dos agentes nocivos e aumen-
to na produo e qualidade dos produtos agrcolas, desde que aplicados de
maneira racional, evitando-se a contaminao do solo e da gua, os danos
sade humana e animal e o surgimento de pragas, plantas e patgenos
resistentes (Cunha et al., 2003). Em termos de valores despendidos com
defensivos agrcolas, as informaes podem sofrer alteraes a cada safra,
mas as participaes das trs principais classes de produtos (herbicidas, in-
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 57
seticidas e fungicidas) tm se mantido prximas a 40%, 30% e 15% respecti-
vamente. Em termos de culturas, as participaes da soja, milho e cana tm
sido prximas a 45%, 12% e 8% respectivamente. Uma quarta cultura de
grande destaque a do algodo com participao no mercado similar da
cana-de-acar. No foram encontradas informaes sobre o mercado total
de defensivos agrcolas na cultura do eucalipto.
As culturas da soja e milho tm se mantido em posio de destaque no
uso de defensivos agrcolas em funo dos seguintes fatores: 1) da rea total
de cultivo; 2) da extenso das reas cultivadas na maioria dos pases, em
regies do Brasil e em sistemas de produo, dificultando o uso do contro-
le manual, por exemplo; 3) amplo uso do plantio-direto (predominante no
Brasil), inviabilizando o uso do cultivo mecnico; 4) aumento do nmero
de aplicaes de herbicidas em funo da elevada utilizao de linhagens
transgnicas que so resistentes a herbicidas de ps-emergncia sem efei-
to residual (exemplos: glyphosate e glufosinate); 5) presena de plantas
daninhas resistentes a herbicidas. Especificamente para a soja, destaca-se
a recente introduo no Brasil da ferrugem asitica, causada pelo fungo
Phakopsora pachyrhizi, que pode reduzir drasticamente a produtividade da
cultura se no forem adotadas medidas de controle.
Em cana-de-acar, h amplo predomnio dos herbicidas na composi-
o do mercado total de defensivos agrcolas, mas tambm so comuns as
aplicaes de inseticidas no combate de pragas e de maturadores. No caso
dos maturadores, a aplicao tem sido feita com o emprego de aeronaves e
vrios dos compostos utilizados tm tambm ao como herbicida (exem-
plos: glyphosate; sulfometuron-metil e fluazifop-p-butil). Especificamen-
te quanto aos herbicidas, predominam os produtos aplicados em pr-emer-
gncia ou ps-emergncia com efeito residual no solo para que o controle
de plantas daninhas possa ser feito por perodos que podem ultrapassar 180
dias. Em ps-emergncia, alm da aplicao dos maturadores, h as aplica-
es localizadas (catao qumica) e as aplicaes de glyphosate direciona-
das s folhas da cana para eliminao das soqueiras quando da renovao
ou substituio da cultura.
Quando so aplicados herbicidas com ao de pr-emergncia, o alvo
preferencial pode ser o solo ou a palhada. As aplicaes sobre a palhada tm
predominado em funo das restries queimada da cultura antes da co-
lheita e do uso crescente do sistema de colheita mecanizada. Em reas de
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58 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
cana colhida crua, sem queima das folhas, a quantidade de palha que per-
manece sobre o solo pode ultrapassar a 10 t ha
-1
, e esta camada de resduo in-
terfere de modo decisivo na dinmica e persistncia de herbicidas, de outros
defensivos e de fertilizantes nas reas de produo. Segundo as informaes
referentes a 2009, o mercado de defensivos agrcolas em cana-de-acar
movimentou US$ 768,4 milhes (9,5% das vendas no pas), sendo que, des-
se total, 73,5% foram gastos com herbicidas, 22,8% com inseticidas e 3,7%
com fungicidas (Souza; Macedo, 2009).
Em eucalipto, tambm predomina amplamente o uso de herbicidas,
com destaque para o glyphosate, que tem como principal modalidade de
uso, a aplicao direcionada s plantas daninhas para que no intoxique a
cultura. O glyphosate tambm pode ser aplicado previamente colheita
para melhorar as condies de trabalho para os envolvidos nessa operao,
na desinfestao inicial das reas antes do plantio da cultura e na prpria
eliminao da cultura (aplicado s rebrotas ou diretamente ao toco). Outros
exemplos de herbicidas de amplo uso na cultura so: sulfentrazone, isoxa-
flutole e flumioxazin. Nos ltimos anos, a ocorrncia de pragas e doenas
tambm tem levado necessidade de uso de inseticidas e fungicidas nas
reas de produo da cultura, alm dos viveiros de produo de mudas.
Processos envolvidos nas perdas de defensivos agrcolas
Depois da aplicao de um defensivo agrcola, vrios processos fsi-
cos, qumicos e biolgicos determinam seu comportamento. O destino de
herbicidas no ambiente governado por processos de reteno (adsoro,
absoro), de transformao (decomposio, degradao) e de transporte
(deriva, volatilizao, lixiviao, escoamento superficial), e por interaes
desses processos. Alm da variedade de processos envolvidos na deter-
minao do destino ambiental de herbicidas, diferenas nas estruturas e
propriedades das substncias qumicas e, nas caractersticas e condies
ambientais, podem afetar esses processos. Condies meteorolgicas, com-
posio das populaes de microrganismos no solo, presena ou ausncia
de plantas, localizao do solo na topografia e prticas de manejo dos solos
podem tambm afetar o destino de defensivos agrcolas no ambiente (Spa-
dotto, 2002).
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 59
Deriva e uniformidade nas aplicaes de defensivos agrcolas
Quando se realiza a aplicao de determinado defensivo agrcola, geral-
mente, busca-se colocar a quantidade certa de ingrediente ativo no alvo de-
sejado, com mxima eficincia e de maneira mais econmica possvel, sem
afetar o meio ambiente (Durigan, 1989). A deriva definida como parte da
pulverizao agrcola que carregada para fora da rea-alvo, pela ao do
vento (Miller, 1993) ou pela volatilizao do produto. Entre os fatores que
interferem na ocorrncia da deriva, podem ser mencionadas as caracters-
ticas do herbicida, o tipo de equipamento, a calibrao, o tipo de pontas de
pulverizao, as tcnicas de aplicao, as condies meteorolgicas e a ha-
bilidade do operador (Costa et al., 2007; Cunha et al., 2003; Ozkan, 2011;
Penckowski; Podolan; Lpezovejero, 2003; Viana et al., 2007).
A deriva em aplicaes de defensivos agrcolas pode ser considera-
da como um dos maiores problemas da agricultura atualmente, tendo em
vista o grande aumento no consumo e dependncia desses produtos para a
proteo das culturas agrcolas. Dessa forma, altos nveis de perdas duran-
te a aplicao de um defensivo agrcola implicam em uma menor eficcia
biolgica e um maior risco ambiental. Segundo Friedrich (2004), estima-
-se que cerca de 50% dos defensivos agrcolas so desperdiados devido s
ms condies de aplicao. Carbonari e colaboradores (2011) observaram
perdas entre 2% e 62 % do volume total da calda de herbicidas aplicados em
reas de cana-de-acar, em funo de falhas operacionais e/ou condies
climticas inadequadas no momento da aplicao.
Dessa forma, alm dos prejuzos diretos para o produtor que realiza a
pulverizao, causados pela menor deposio do produto aplicado sobre o
alvo, existem outros motivos que tornam a deriva indesejvel, como o pa-
gamento de indenizaes por perdas em reas vizinhas, a contaminao de
alimentos, a contaminao do ar e da gua, efeitos prejudiciais sade e
segurana do ser humano e animais, entre outros.
A Tabela 3.1 apresenta resultados de pesquisa cujo objetivo foi a deter-
minao do ndice de deriva de aplicaes areas e terrestres em condies
consideradas prximas dos limites operacionais quanto s condies clim-
ticas. Nessas aplicaes, possvel observar que o uso de gotas finas em
condies limites pode resultar em nveis elevados de deriva, com potencial
tanto para redues significativas das doses reais dos produtos a campo
como para o risco de deriva direta de produtos em reas vizinhas, o que
pode efetivamente causar danos econmicos e ambientais.
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60 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Tabela 3.1 ndices de perdas em aplicaes areas e terrestres de acordo com as condies clim-
ticas no momento das aplicaes
Sistema
Volume
(L/ha)
Adjuvante Gotas
Temperatura
(C)
Umidade
(%)
Vento
(km/h)
Perdas
(%)
Areo 12 OV 10% Finas 25,4 76,0 7,7 11,9 28,8
Areo 30 Finas 29,5 74,5 13,0 24,0 40,1
Terrestre 30 OV 5% Finas 27,6 73,7 11,0 14,0 39,8
Terrestre 50 Finas 29,5 62,5 8,5 24,1 42,5
Fonte: Antuniassi et al., 2009
A classificao de valores de deriva como aceitveis ou inaceitveis
uma prtica difcil, pois a variabilidade de condies de trabalho a campo
muito grande, dificultando a determinao de parmetros de comparao.
Em tese, o ideal que a deriva fosse nula, mas o cotidiano das aplicaes
mostra que extremamente frequente em uma situao normal de campo
que algum nvel de deriva sempre ocorra.
Cada sistema produtivo apresenta peculiaridades, as quais induzem a
diferentes nveis de perdas nas aplicaes. A prtica agronmica tem mos-
trado que ndices totais de perdas acima de 50% podem ser aceitveis para
alguns tipos de aplicaes em fruticultura (turboatomizadores de fluxo di-
vergente, por exemplo), enquanto nveis prximos a estes seriam inacei-
tveis numa aplicao com pulverizador de barras na cultura da soja, por
exemplo. Mesmo dentro de um nico mercado, o ndice total de perdas
considerado aceitvel apresenta variaes prticas. Aplicaes de desse-
cantes como glyphosate e 2,4-D so usualmente realizadas com extremo
cuidado, frequentemente utilizando pontas com induo de ar de gotas
grossas ou muito grossas, e por isso o nvel de deriva total muito baixo, em
geral inferior a 10%. J em uma aplicao de fungicidas ou inseticidas com
gotas finas, visando maximizar a cobertura das folhas em soja, um nvel de
perdas totais da ordem de 20% a 25% poderia ser considerado normal, dada
a grande suscetibilidade dessas gotas finas, no que se refere aos fatores que
causam a deriva.
Assim, de acordo com os dados de pesquisa apresentados na Tabela 3.1,
observa-se que a aplicao area a 12 L ha
-1
foi realizada em condies cli-
mticas prximas da normalidade, dentro das recomendaes usuais, e o
resultado de 28,8% de perdas totais poderia ser considerado um pouco
acima do aceitvel. Por outro lado, as demais aplicaes apresentadas na
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 61
Tabela 3.1 foram todas realizadas com excesso de vento e/ou temperaturas
prximas dos limites operacionais, elevando os valores de deriva a patama-
res que podem ser considerados inaceitveis (prximos ou acima de 40%
de perdas).
A deteco da deriva tem grande importncia, pois, enquanto as perdas
ocasionadas por esse fator no forem facilmente identificadas, produtores
de culturas sensveis em reas adjacentes podem ter substanciais redues
na produo sem identificar a verdadeira causa (Schroeder; Cole; Dexter,
1983). Matthews (1999) ressalta a preocupao mundial com os efeitos que
a deriva pode provocar fora das reas tratadas, cujo resultado tem sido a
necessidade de instalao de reas de proteo (buffer zones) para cursos
dgua e outras reas sensveis.
Eliminar completamente a deriva bastante improvvel, no entanto,
esta pode ser minimizada usando-se tcnicas e mtodos de aplicao cor-
retos, tamanho de gotas adequados, limpeza e regulagem do equipamen-
to, aplicao em condies climticas adequadas e/ou uso de formulao
apropriada. No entanto, o que se observa no campo a falta de informao
a respeito da tecnologia de aplicao (Costa et al., 2007).
Alm da deriva, em aplicaes com barra de pulverizao, a deposio
do produto extremamente varivel devido a movimentos verticais e hori-
zontais dessa barra. Para alcanar um melhor desempenho na pulverizao
com barras longas no campo, onde a superfcie do solo ondulada, Nation
(1977) sugere mudanas nos modelos das barras e no seu acoplamento vi-
sando diminuio dos movimentos verticais e horizontais. Speelman e
Jansen (1974) estudaram os efeitos da movimentao da barra na distribui-
o da calda de pulverizadores e concluram que as suas vibraes afetam
de maneira negativa a distribuio da calda, principalmente nas pontas
da barra.
Porskamp e Van Zuydam (1992) verificaram que as movimentaes
verticais e horizontais de 20 cm aumentam o coeficiente de variao em
48% a mais no centro e 78% na ponta da barra. Verificaram, tambm, que
o movimento horizontal da barra de pulverizao mais prejudicial que o
movimento vertical. Essa variao nos depsitos pontuais dentro da rea de
aplicao contribui de forma bastante significativa para reduo de eficcia
da maioria dos defensivos agrcolas disponveis, o que acaba implicando na
necessidade de aumento nas doses desses produtos para uma ao efetiva.
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62 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Perdas por volatilizao e fotodegradao
A presso de vapor a presso exercida por um vapor em equilbrio com
um lquido, a uma determinada temperatura. Essa caracterstica indica o
grau de volatilizao do defensivo agrcola, ou sua tendncia em se perder
na forma de gs na atmosfera. Quanto maior a presso de vapor do defen-
sivo agrcola, maior o seu grau de volatilizao e maiores so as chances de
perdas para a atmosfera (Oliveira, 2001; Monaco; Weller; Ashton, 2002).
Em condies de alta temperatura e baixa umidade relativa do ar, o po-
tencial de volatilizao maior, sendo essas condies inapropriadas para a
aplicao de defensivos agrcolas classificados como volteis. Quanto maior
a presso de vapor (Tabela 3.2), maior seu potencial de volatilizao.
Tabela 3.2 Classificao da volatilidade em funo da presso de vapor
Classificao Presso de vapor (mm Hg)
No voltil < 10
-8
Pouco voltil 10
-7
a 10
-5
Medianamente voltil 10
-4
a 10
-3
Muito voltil >10
-2
Outro mecanismo importante quanto s perdas de defensivos agrcolas
aps a aplicao a fotodegradao ou fotodecomposio, desencadeada
quando a molcula do defensivo agrcola absorve a energia da radiao so-
lar excitando os seus eltrons, o que acarretar na ruptura de ligaes (Mo-
naco; Weller; Ashton, 2002). Esse fenmeno pode causar a desativao das
molculas dos defensivos agrcolas, resultando em perdas significativas dos
produtos. Cada molcula sensvel a comprimentos de ondas especficos,
em geral, na faixa do ultravioleta. Na prtica, a fotodegradao um fen-
meno que ocorre para produtos que apresentam picos de absoro de com-
primentos de onda entre 295nm e 400 nm (Christoffoleti; Ovejero, 2005).
Para muitos herbicidas so conhecidos os efeitos da fotodegradao
quando aplicados diretamente sobre o solo, sendo estes agravados em con-
dies de solo seco, conforme Velini (1992). Por sua vez, nota-se um cres-
cente aumento de reas cultivadas sobre algum tipo de cobertura morta
(palhada), como plantio direto de culturas anuais, cultivo mnimo em reflo-
restamentos e cana crua, sendo, atualmente, o herbicida aplicado sobre es-
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 63
ses restos vegetais. Vale ressaltar que em cana-de-acar, por exemplo, uma
prtica comum a aplicao de herbicidas pr-emergentes imediatamente
aps a colheita que realizada com frequncia em perodos do ano de maior
restrio hdrica (junho a setembro).
A aplicao de herbicidas de ao residual sobre palhadas altera signifi-
cativamente sua dinmica no ambiente, pois sua chegada ao solo depen-
dente da ocorrncia de chuvas. Assim, a permanncia dos herbicidas sobre
a palhada potencializa os efeitos da fotodegradao pela maior exposio
dos produtos radiao solar. Segundo Locke e Bryson, (1997), um her-
bicida aplicado sobre a palhada interceptado pela superfcie da palha ali
depositada e torna-se vulnervel degradao causada pela volatilizao
e/ou fotodecomposio, at que seja lixiviado para o solo. Por conseguinte,
a fotodegradao de herbicidas conhecidos por serem foto estveis no solo,
pode ser alterada e potencializada quando da aplicao sobre a palhada,
consequncia da maior exposio aos raios solares.
Perdas por lixiviao no solo
Na maioria das situaes, uma parcela muito significativa dos defensi-
vos agrcolas aplicados, tem como destino final o solo. No solo, os defen-
sivos agrcolas em geral e particularmente os herbicidas com ao residual
podem sofrer processos de soro, lixiviao e/ou degradao por efeitos f-
sicos, qumicos e biolgicos, alm de ser absorvidos pelas plantas daninhas
e/ou plantas cultivadas (Velini, 1992). Os defensivos agrcolas apresentam
algumas caractersticas fsico-qumicas que, juntamente com as condies
ambientais e atributos fsicos, qumicos e biolgicos do solo, regem sua
dinmica no solo. Essas caractersticas so especficas para cada produto,
mesmo para aqueles pertencentes ao mesmo grupo qumico, e seu conheci-
mento de fundamental importncia para o sucesso na sua utilizao.
Dentre as caractersticas que determinam o comportamento dos herbi-
cidas no solo, as mais importantes so: constante de equilbrio de ioniza-
o de um cido ou base fraca (pKa); coeficiente de partio octanol-gua
(Kow); solubilidade em gua; presso de vapor e meia-vida do herbicida
no solo. As constantes de ionizao cido/base (pKa ou pKb) de molculas
que possuem carter cido fraco ou base fraca, respectivamente, represen-
tam a sua tendncia de ionizao numa determinada faixa de valores de pH.
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64 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Sendo assim, o pKa o pH no qual metade das molculas esto ionizadas
e metade no ionizadas. Esse parmetro mostra o valor de pH em que as
formas ionizadas e no-ionizadas do herbicida ocorrem em iguais concen-
traes, respondendo, cada uma das formas, por 50% da concentrao total
do composto (Procpio et al., 2003). Conforme a constante de equilbrio
de ionizao, os herbicidas inicos podem ser classificados em herbicidas
cidos ou herbicidas bsicos (Oliveira, 2001; Regitano et al., 2002).
O coeficiente de partio (Kow) representa a proporo entre as quanti-
dades de um determinado herbicida que migram para um solvente orgni-
co apolar (geralmente o octanol) ou para a gua (polar), quando adicionado
e agitado em frascos em que se encontram quantidades determinadas des-
sas substncias utilizadas como solventes, ou seja, os valores de Kow refe-
rem-se medida da intensidade da afinidade da molcula pela fase polar
e apolar.
A solubilidade em gua de uma molcula de herbicida caracterizada
pela quantidade do herbicida dissolvida em gua pura, ou seja, indica a pro-
poro de herbicida que poder estar disponvel na soluo do solo, poden-
do ser absorvida por razes e sementes em germinao, a uma determinada
temperatura. A quantidade de herbicida na soluo do solo diretamente
proporcional ao contedo de gua no solo. A quantidade de espaos livres
para o herbicida na soluo diminui em solos secos, e assim menor quanti-
dade de herbicida fica livre na soluo do solo (maior soro). Em condies
de seca, as plantas so expostas a menor quantidade de herbicida e assim
menor quantidade absorvida pelas plantas daninhas. Quando a umidade
no solo restabelecida ocorre a dessoro do herbicida voltando a soluo
do solo (Hartzler, 2009). Regitano e colaboradores (2002) observaram uma
reduo na mobilidade do herbicida imazaquin em funo do aumento no
perodo em que o solo foi mantido seco aps aplicao do herbicida e antes
do inicio da simulao de chuvas.
A soro e a dessoro de herbicidas no solo regulam o fenmeno de re-
teno, influenciando o transporte, a transformao e a biodisponibilidade
dessas molculas no solo. Esses processos esto diretamente relacionadas
eficcia dos herbicidas no controle das plantas daninhas e ao risco de
contaminao ambiental por esses compostos. Segundo Andrea e Luchini
(2002), a soro de defensivos agrcolas no solo tambm importante, prin-
cipalmente por estar relacionada diretamente com os processos de disponi-
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bilidade para a atividade do composto, ataque microbiano e biodegradao
e inversamente com a possibilidade de lixiviao e contaminao de guas.
O mecanismo de soro de herbicidas, por estes se tratarem de molculas
orgnicas nos mais variados arranjos, muito mais complexo do que a dos
ons que servem como nutrientes para as plantas (Prata; Lavorenti, 2000).
Foras fsicas como pontes de hidrognio, foras de Van der Walls, foras
eletrostticas, ligaes covalentes e interaes hidrofbicas so os principais
mecanismos que podem contribuir com a soro dos herbicidas, sendo que
estes mecanismos podem atuar concomitantemente na soro de uma mes-
ma molcula (ibidem). Quanto menor o coeficiente de soro do composto
nos coloides do solo (Kd), maior a sua lixiviao potencial. O valor de
Kd pode ser determinado em laboratrio, agitando-se uma amostra do solo
com uma soluo aquosa do defensivo agrcola. Em situao de equilbrio
tem-se: Kd = concentrao do composto nos slidos do solo / concentrao
do composto na gua. Briggs (1981) determinou o valor de Kd de dezenas
de defensivos agrcolas no-inicos, em vrios solos da Inglaterra, tendo
observado uma estreita relao entre o valor de Kd do composto, sua pola-
ridade, expressa na forma do seu coeficiente de partio entre n-octanol e
gua, e o percentual de matria orgnica do solo (Kd = 0,045 x Kow0,52 x
%M.O.). Essa relao tem sido amplamente usada para a previso do valor
de Kd de defensivos agrcolas no-inicos em solos.
No entanto, a natureza orgnica dos herbicidas e sua alta afinidade pela
matria orgnica, tornam o teor de carbono orgnico do solo o melhor par-
metro isolado para predizer o coeficiente de soro padronizado para o car-
bono orgnico (Koc) (Oliveira, 2001; Christoffoleti;, 2005). Para o amicar-
bazone, por exemplo, so encontrados valores de Koc entre 23 e 27, o que o
classifica, segundo Gelber e Spadotto (2004), como um herbicida com fora
de adsoro fraca e consequentemente com alta mobilidade no solo.
Em solos que apresentam altos teores de argila, de matria orgnica ou
ambos, verifica-se maior adsoro e persistncia de herbicidas, seguido
por baixos ndices de dessoro, lixiviao e degradao destes (Li et al.,
2003; Hager; Nordby, 2004; Si et al., 2006). Firmino et al. (2008) avaliando
a soro do imazapyr em solos com diferentes texturas, observou em solos
arenosos e com baixos teores de matria orgnica, uma baixa soro do her-
bicida, o que predispe o produto lixiviao no perfil do solo, podendo at
mesmo contaminar mananciais de guas subterrneas.
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Um termo bastante utilizado na literatura o chamado resduo ligado,
que o nome dado interao entre espcies qumicas originadas ou no
de interaes xenobiticas com as substncias hmicas do solo, sendo esses
resduos no passveis de extrao por mtodos que no alterem significa-
tivamente a natureza da molcula (Fuhr, 1987). Segundo Prata e Lavorenti
(2000), uma significativa proporo das molculas dos defensivos agrcolas
aplicadas na agricultura permanecem no solo como resduos ligados.
A formao de resduo ligado pode ter como consequncias a diminui-
o da degradao do defensivo agrcola (Calderbank, 1989), a perda da
sua atividade biolgica e da sua identidade qumica, a alterao da sua ab-
soro por plantas, e a alterao do escoamento superficial e da lixiviao
desses defensivos agrcolas. A adio de materiais orgnicos oxidados ou
estabilizados ao solo, como o caso das substncias hmicas, promove um
aumento dos stios sortivos do solo, o que contribui com a maior soro e
constituio de resduos ligados, conforme Prata e Lavorenti (2000).
O tipo e contedo de argila, teor e caractersticas da matria orgnica e
umidade do solo afetam as interaes do defensivo agrcola no solo (Leva-
non et al., 1993; Czapar; Kanvar; Fawcett, 1994). A matria orgnica apre-
senta acentuada capacidade de sorver os defensivos agrcolas e isto reduz
a atividade biolgica no solo e a mobilidade dos compostos qumicos a ele
aplicados . A pronunciada reatividade da matria orgnica est relacionada
principalmente com sua elevada rea superficial especfica e presena de
vrios grupos funcionais, como carboxilas, hidroxilas e aminas, e estruturas
alifticas e aromticas (Lee; Farmer, 1989; Stevenson, 1972; Stearman et
al., 1989; Kuckuk et al., 1997).
Sistemas de manejo de solo afetam diferentemente o teor e a qualida-
de da matria orgnica do solo, bem como a proporo de substncias h-
micas. Considerando que o tipo de manejo do solo pode influir no teor e
caractersticas da matria orgnica e das substncias hmicas, diferenas
na soro das molculas dos defensivos agrcolas so esperadas em solos
submetidos a diferentes sistemas de manejo.
O processo de lixiviao refere-se ao movimento descendente dos her-
bicidas com a gua na matriz do solo, sendo sua intensidade dependente
das caractersticas fsico-qumicas do produto e das caractersticas de solo e
clima. Para serem lixiviadas, as molculas dos defensivos agrcolas devem
estar na soluo do solo ou adsorvidas a pequenas partculas, como argilas,
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 67
cidos flvicos e hmicos de baixo peso molecular, aminocidos, peptdeos
e acares, entre outros (Oliveira, 2001).
A movimentao de defensivos agrcolas no perfil do solo ocorre em
todas as direes e dependente da direo do fluxo de gua. Devido
ocorrncia de grandes volumes de gua de percolao nos solos aps chuvas
pesadas ou irrigaes, a direo mais comum na qual o herbicida pode ser
lixiviado a descendente.
Segundo Velini (1992), a ocorrncia da lixiviao fundamental para
a incorporao superficial da maioria dos herbicidas, atingindo sementes
ou plantas em germinao; mas quando excessiva, pode carre-los para
camadas mais profundas do solo, limitando sua ao e podendo, inclusive,
promover contaminao do lenol fretico.
Carbonari (2009) observou para a aplicao do herbicida amicarbazone
em cinco solos cultivados com cana-de-acar, com e sem a presena de pa-
lha na superfcie, que o produto foi detectado em todas as camadas do solo
(0 a 10, 10 a 20 e 20 a 40 cm de profundidade), o que demonstra uma gran-
de mobilidade no solo. Em perodos de maior restrio hdrica foram ob-
servados, maiores concentraes de amicarbazone no solo nos tratamentos
sem palha e com aplicao sob a palha. Em perodos de alta disponibilidade
hdrica e em solos de textura arenosa e mdia, foram observadas maiores
concentraes do herbicida na camada mais superficial do solo para a apli-
cao sobre a palha, o que demonstra uma menor lixiviao do produto no
solo nessa condio.
Devido ao seu uso intensivo, os herbicidas so apontados como o grupo
de defensivo agrcola mais frequentemente detectado em estudos de qua-
lidade de guas superficiais e subterrneas (Carter, 2000; Tanabe et al.,
2001), sendo as reas prximas ao cultivo de cana-de-acar de maior ocor-
rncia de resduos desses compostos, j que esta uma das culturas que
mais utiliza herbicidas no manejo de plantas infestantes (Southwick et al.,
2002; Vivian et al., 2007).
Em solo cultivado com cana, na regio nordeste do pantanal mato-gros-
sense, foram detectados resduos de ametryn na maioria das amostras cole-
tadas em guas de superfcie, embora em baixa concentrao. Entretanto,
em amostras de sedimentos, as concentraes foram superiores a 4,5 g kg
-1
.
A elevada frequncia de deteco de ametryn, juntamente com sua alta
concentrao em algumas amostras, foi atribuda, conforme os autores, ao
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intenso cultivo de cana-de-acar no nordeste do pantanal, em que se utili-
za esse herbicida (Laabs et al., 2002).
A lixiviao potencial dos defensivos agrcolas no solo pode ser determi-
nada por alguns mtodos diferentes, como por exemplo, por meio da perco-
lao em colunas preenchidas com amostras deformadas ou indeformadas
do solo. Assim, os estudos de lixiviao potencial, no Brasil, ficam restritos
a colunas, modelos matemticos e bioensaios. Segundo Vivian et al. (2007),
estudos comumente conduzidos em laboratrio, com objetivo de avaliar o
potencial de lixiviao e contaminao de solo e gua por herbicidas, nem
sempre representam o comportamento real verificado em condies natu-
rais in situ.
Alm da lixiviao, outra forma de transporte de defensivos agrcolas
na gua que se move sobre a superfcie do solo, chamado de escoamento
superficial, o qual tem sido considerado como um dos principais meios de
contaminao de rios e lagos (Gaynor; Mactavish; Findlay, 1992; Lerch;
Blanchard, 2003). O movimento da gua carreia substncias solveis ou
adsorvidas s partculas de solos erodidos. Estudos tm mostrado que per-
das por essa via geralmente variam de 1% a 5%, dependendo das prticas
culturais, solo, dimenso da rea, declividade, extenso do declive, cober-
tura, umidade do solo e das propriedades dos defensivos agrcolas (Patty;
Real; Grill, 1997).
Verifica-se, portanto, que a dinmica de um defensivo agrcola no solo
bastante complexa e envolve diversos processos de perdas e imobilizao,
desde a aplicao, a interao com a palhada, quando esta se faz presente, e
finalmente com a chegada ao solo.
Tecnologia de aplicao de defensivos agrcolas
O tamanho de gotas e o volume de aplicao so fatores bsicos que de-
vem ser considerados em primeiro lugar para o planejamento de uma aplica-
o. Os demais fatores importantes, como o momento da aplicao, as con-
dies climticas, a recomendao do produto e as condies operacionais
devem ser considerados em conjunto para que todo o sistema esteja ajusta-
do, visando o mximo desempenho com o mnimo de perdas, sempre com
o menor impacto ambiental possvel. De maneira geral, os produtos com
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 69
ao sistmica quando direcionados ao solo ou s folhas podem ser aplica-
dos com gotas maiores. Isso facilita a adoo de tcnicas para a reduo de
deriva, melhorando a segurana ambiental da aplicao e aumentando a sua
eficincia . Se usadas de maneira correta, gotas maiores geralmente ofere-
cem bom nvel de depsito (quantidade de defensivo depositado nos alvos),
apesar de no proporcionar as melhores condies de cobertura das folhas
das culturas. Para os produtos de contato ou de menor ao sistmica, o uso
de gotas menores e/ou maior volume de calda necessrio, devido a maior
dependncia dessa tcnica com relao cobertura dos alvos.
O estudo das caractersticas dos alvos deve incluir a anlise de outros
fatores, como movimentao das folhas, estgio de desenvolvimento das
plantas, cerosidade, pilosidade, rugosidade, face da folha em que a cober-
tura mais importante (superior/inferior) e arquitetura geral da planta. Na
diferenciao entre plantas como alvos de aplicaes, a posio e o formato
das folhas apresentam importncia fundamental. Por exemplo, as folhas
das monocotiledneas so geralmente mais estreitas e se posicionam na ver-
tical, enquanto as folhas das dicotiledneas so mais largas e permanecem
na horizontal. Esses fatores so fundamentais para a definio da reteno
das gotas nas folhas e na prpria eficincia de penetrao dos defensivos nos
tecidos vegetais. Por este motivo, em muitos casos, a tecnologia de aplica-
o mais adequada ao milho pode no ser a melhor para a soja, e vice-versa.
A cobertura dos alvos de uma aplicao pode ser definida pela frmula
de Courshee (1967):
2
VRK
C 15
AD
=
Onde:
C = cobertura (% da rea)
V = volume de aplicao (L/ha);
R = taxa de recuperao da calda nas folhas (% do volume aplicado)
K = fator de espalhamento de gotas
A = rea foliar
D = dimetro das gotas (m)
Assim, em termos genricos, para melhorar a cobertura de uma aplica-
o deve-se adotar gotas mais finas ou volumes maiores; na aplicao de
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volumes mais baixos, as gotas mais finas devem ser preferidas, para que
se consiga uma boa cobertura com a calda pulverizada; se a escolha recair
sobre as gotas maiores, o volume de calda deve ser igualmente aumentado
para que se possa garantir um nvel mnimo de cobertura para o tratamen-
to. Por esses motivos, um dos princpios bsicos da tecnologia de aplicao
que no existe uma soluo nica que atenda todas as necessidades.
necessrio, primordialmente, que a tecnologia seja ajustada para cada con-
dio de aplicao.
Para que se faa o ajuste do tamanho das gotas e do volume de calda,
vrias aes podem ser planejadas dentro do manejo dos parmetros de
uma aplicao. Para reduzir o tamanho das gotas, as pontas de jato plano
(leque) podem ser substitudas pelas pontas de jato plano duplo (duplo le-
que) ou cnico vazio; a presso de trabalho das pontas pode ser aumentada
e um adjuvante pode ser adicionado calda (um surfatante, por exemplo).
Para aumentar o tamanho das gotas, as pontas de jato plano (leque) podem
ser substitudas pelas pontas de pr-orifcio ou induo de ar; a presso de
trabalho pode ser reduzida e outro tipo de adjuvante pode ser adicionado
calda (um leo ou um espessante de calda, por exemplo, cuja ao produza
gotas de maior tamanho). No caso do volume de calda, sua variao pode
ser feita tanto pela troca das pontas como pela variao da velocidade de
deslocamento do pulverizador.
Condies climticas
Outro parmetro fundamental para o sucesso do tratamento a adequa-
o da tecnologia de aplicao s condies climticas. Para a maioria dos
casos, devem ser evitadas aplicaes com umidade relativa inferior a 50% e
temperatura ambiente maior que 30C. No caso do vento, o ideal que as
aplicaes sejam realizadas com vento entre 3 e 10 km h
-1
. Ausncia de ven-
to tambm pode ser prejudicial, em funo da chance de ocorrer ar aque-
cido com movimento ascendente, o que dificulta a deposio das gotas pe-
quenas. Esses limites, entretanto, devem ser considerados e eventualmente
flexibilizados de acordo com a tecnologia de aplicao que ser utilizada.
Como exemplo, o uso de gotas grossas ou muito grossas pode facilitar o
trabalho um pouco alm dos limites, sempre com o cuidado para que a apli-
cao no seja feita em condies muito extremas com relao ao clima.
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Mesmo dentro das faixas de trabalho relativas a esses limites, as caracte-
rsticas da tcnica utilizada devem ser consideradas no momento da toma-
da de deciso. Um exemplo de otimizao da escolha do tamanho de gotas
em funo das condies climticas (umidade e temperatura, nesse caso)
pode ser observado na Tabela 3.3. Nessa forma de raciocnio, o princpio a
ser utilizado o da adoo da gota mais segura dentro dos limites de cada
situao. Assim, se a umidade permite uma gota muito fina, mas a tempe-
ratura indica que o melhor seria uma gota fina, a gota maior (fina) deve ser
a escolhida, por ser a mais segura para tal situao (menor risco de perdas
por deriva e evaporao).
Tabela 3.3 Exemplo de relao prtica entre as condies climticas e a escolha do tamanho das
gotas
Fatores
Classes de gotas de acordo com as condies climticas
Muito Finas ou Finas Finas ou Mdias Mdias ou Grossas
Temperatura abaixo de 25C 25 a 28C acima de 28C
Umidade relativa acima de 70% 60 e 70% abaixo de 60%
Fonte: Antuniassi et al., 2005
O incio da manh, o final da tarde e a noite so perodos em que a umi-
dade relativa maior e a temperatura menor, sendo considerados mais
adequados para as aplicaes. Na prtica, possvel e recomendvel a utili-
zao de gotas finas nesses horrios. Porm, necessrio um monitoramen-
to das condies ambientais com o passar das horas do dia, pois se houver,
por exemplo, um aumento considervel da temperatura (com reduo da
umidade relativa), o padro de gotas precisa ser mudado (passando-se a
usar gotas maiores). Nesse caso, o volume de aplicao deve ser aumentado,
para no haver efeito negativo na cobertura dos alvos.
Chuva e orvalho so fatores climticos que tambm requerem ateno
no momento do planejamento das aplicaes. No caso da chuva, recomen-
da-se bastante cuidado na observao do intervalo mnimo de tempo entre
a aplicao e a ocorrncia da chuva, visando permitir o tempo mnimo para a
penetrao e absoro dos ingredientes ativos. No caso do orvalho, a pre-
sena de gua nas folhas pode causar interferncia na tcnica de aplicao.
O risco de um eventual escorrimento est ligado ao uso de espalhantes (sur-
fatantes) na caldas. Entretanto, existem situaes, dependendo da tcnica
empregada e do tipo de defensivo utilizado, em que a ao do orvalho pode
ser benfica (muitos fungicidas se posicionam nesta situao).
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A aplicao noturna apresenta vantagens no que se refere s condies
climticas (umidade, temperatura e vento mais adequadas aplicao de
gotas mais finas), mas essa opo deve considerar a possvel existncia
de limitaes tcnicas relativas aos prprios defensivos, no que se refere s
questes de eficincia e velocidade de absoro/penetrao nas situaes de
ausncia de luz ou baixas temperaturas.
Tamanho de gotas
Atualmente, as gotas produzidas por uma ponta so classificadas como
muito finas, finas, mdias, grossas e muito grossas (em algu-
mas normas de classificao de pontas existe tambm a classe extrema-
mente grossa). Para a classificao de uma determinada ponta usando-se
esse conceito, o seu dimetro mediano volumtrico (DMV) que o di-
metro da gota que divide o volume das gotas pulverizadas em duas partes,
de forma que a soma dos volumes das gotas de dimetro menor seja igual
soma do volume das gotas de dimetro maior, sendo medido em microme-
tros (m) deve ser comparado ao obtido por pontas de referncia avalia-
das utilizando-se o mesmo mtodo de determinao do tamanho das gotas.
Tomando-se como base a norma ASAE S572 (ASAE, 2000), se uma ponta
apresenta DMV inferior ao obtido para uma ponta 11001 operando a 4,5 bar,
o spray classificado como gotas muito finas; se o DMV intermedirio
entre o obtido por uma ponta 11001 (operando a 4,5 bar) e uma ponta 11003
(operando a 3,0 bar), o spray classificado como gotas finas; se o DMV
intermedirio entre o obtido por uma ponta 11003 (operando a 3,0 bar)
e uma ponta 11006 (operando a 2,0 bar), o spray classificado como gotas
mdias; se o DMV intermedirio entre o obtido por uma ponta 11006
(operando a 2,0 bar) e uma ponta 8008 (operando a 2,5 bar), o spray clas-
sificado como gotas grossas e, finalmente, se o DMV maior do que o
obtido por uma ponta 8008 operando a 2,5 bar, o spray classificado como
gotas muito grossas.
A classe de tamanho de gotas um bom indicativo da capacidade da
pulverizao em cobrir o alvo e penetrar na massa da folhas. Gotas meno-
res possuem melhor capacidade de cobertura (oferecem maior nmero de
gotas/cm
2
), assim como propiciam maior capacidade de penetrao, e so
recomendadas quando necessria boa cobertura e boa penetrao. Entre-
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 73
tanto, gotas pequenas podem ser mais sensveis evaporao e aos proces-
sos de deriva. Na maioria dos sistemas de produo as gotas grossas so
preferidas para aplicao de herbicidas de grande ao sistmica, enquanto
as gotas finas so mais utilizadas para inseticidas e fungicidas.
Novas tecnologias para a racionalizao
do uso de defensivos agrcolas
Aplicao area de defensivos usando veculo slido
Para a aplicao de defensivos agrcolas voltados ao solo e com absoro
radicular pelas plantas, o uso de um veculo slido (ou formulaes slidas)
pode apresentar algumas vantagens operacionais e ambientais bastante sig-
nificativas. A mistura de alguns defensivos agrcola, como herbicidas de
ao em pr-emergncia das plantas daninhas, em grnulos de argila de alta
densidade, com sua posterior aplicao area, permite que eles atravessem
os restos culturais e cheguem ao solo, mesmo em sistemas agrcolas com
a presena de restos vegetais na superfcie, o que uma barreira, muitas
vezes, para a aplicao convencional, conforme apresentado anteriormen-
te. Uma vez no solo e dependendo do tipo de porosidade, o grnulo pode
liberar gradativa ou imediatamente todo o ingrediente ativo do defensivo
agrcola, com possibilidade de aumento do perodo residual e eficcia dos
produtos utilizados, alm de reduzir o potencial de lixiviao dos produtos
e risco de contaminao de lenis freticos.
Outra vantagem muito importante que o uso de grnulos elimina um
dos maiores problemas em aplicaes de defensivos agrcolas que a deriva,
em funo do tamanho e da alta densidade das partculas, desde que estas
no formem p. A aplicao area apresenta-se ainda competitiva em cus-
tos com a aplicao terrestre de defensivos agrcolas e com ampla vantagem
em termos de capacidade operacional, permitindo tambm uma tima dis-
tribuio dos grnulos durante a aplicao.
Em reas de reflorestamento, por exemplo, a aplicao de defensivos
agrcolas por pulverizadores de barra convencionais, tracionados por tra-
tores, apresenta baixa capacidade operacional, altos nveis de deriva e, em
geral, grande desuniformidade na distribuio dos defensivos agrcolas
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em funo da grande dificuldade de trfego nas reas, causada por irre-
gularidades no terreno, devido ao uso do cultivo mnimo como sistema de
preparo de solo predominante e, dessa forma, pela presena de resduos
vegetais na superfcie do solo. Devido a essa dificuldade nas aplicaes de
defensivos, observa-se, em muitos casos, alm das perdas citadas, baixa
eficcia dos produtos.
Carbonari e colaboradores (2010), avaliando a eficcia desse veculo s-
lido para aplicao de herbicidas em pr-emergncia das plantas daninhas e
aps o plantio do eucalipto, verificaram resultados de controle semelhantes
ou superiores para a aplicao area da formulao granulada em relao
pulverizao de calda lquida (convencional), indicando uma extenso no
perodo do efeito do residual dos herbicidas estudados.
Tambm para a cultura da cana-de-acar esta uma alternativa vivel,
permitindo a aplicao em reas de cana crua e em reas em que a cultura j
tenha atingido um estgio de desenvolvimento que inviabilize a entrada de
pulverizadores convencionais.
Atualmente, na cultura da cana-de-acar, um dos grandes problemas
a eliminao das plantas daninhas com uma nica aplicao de herbici-
da em pr-emergncia, a qual deve garantir que a cultura permanea sem
a presena de plantas daninhas por um perodo prximo de 180 dias. Em
muitos casos, isso no acontece, havendo a necessidade de se executar o
controle de plantas daninhas atravs de operao manual (aplicao de her-
bicidas em ps-emergncia, com equipamento costal), devido ao tamanho
das plantas e impossibilidade do trnsito de mquinas na rea. Vale desta-
car que o custo dessa operao manual bastante elevado, independente do
custo do produto.
Uma possvel soluo para esse problema seria o fracionamento da dose
do herbicida aplicado em pr-emergncia garantindo sua eficcia por um
perodo maior. Dessa forma seria aplicada uma dose inicial do herbicida
e uma segunda dose antes do fechamento da cultura, garantindo que no
ocorra competio entre a cultura e as plantas daninhas. Tal aplicao es-
barra na dificuldade operacional de aplicao da segunda dose via calda l-
quida, uma vez que no existem mquinas terrestres capazes de aplicar o
produto com a cultura j em estagio avanado de desenvolvimento.
A aplicao fracionada e na forma de grnulos reduz a injria a cultura,
pois no h contato com as folhas e a liberao no solo lenta. Assim, talvez
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a melhor oportunidade para o uso de grnulos corresponda essa extenso
do residual de herbicidas aplicados em pr-emergncia. Essa modalidade
de aplicao tem amplo potencial de uso em cana crua. Nesta, a extenso
do residual , ainda, uma tima oportunidade para garantir o controle de
espcies de difcil controle e germinao tardia como as cordas-de-viola.
Para a aplicao de fungicidas com absoro radicular, essa modalidade
de aplicao tambm oferece vantagens. Antuniassi et al. (2008) avaliaram
a aplicao area do fungicida flutriafol em formulao granulada para con-
trole da ferrugem da soja em diferentes doses, isolado e seguido de apli-
caes convencionais complementares, e verificaram uma boa eficcia do
produto aplicado nessa modalidade, alm da extenso do residual do pro-
duto com a reduo do nmero de aplicaes complementares.
Uso de adjuvantes para reduo de deriva
Entre as caractersticas da pulverizao que influenciam a deriva, po-
dem ser relacionados os tipos de ponta de pulverizao, as propriedades
fsicas da formulao dos defensivos agrcolas, o tamanho das gotas e outros
produtos adicionados ao lquido a ser pulverizado. Mudanas nas proprie-
dades do lquido podem influenciar tanto o processo de formao das go-
tas como o comportamento do contato destas com o alvo, alterando o risco
potencial de deriva (Miller; Butler Ellis, 2000).
O uso de adjuvantes apresenta efeito direto sobre a ocorrncia de deriva
em aplicaes de defensivo agrcolas. Existe o conhecimento de que alguns
adjuvantes podem ter um significativo efeito sobre o tamanho das gotas em
pulverizaes agrcolas (Butler Ellis; Miller, 1997) e o tamanho de gota um
dos fatores mais importante que influenciam a deriva.
A converso de um lquido em gotas e o destino final dessas gotas depen-
dem das propriedades fsico-qumicas das solues empregadas (Prokop;
Kejklcek, 2002). O grau de quebra das gotas est diretamente ligado vis-
cosidade e ao escoamento da soluo. Uma reviso do efeito dos adjuvan-
tes sobre a formao e transporte do lquido pulverizado foi apresentada
por Butler Ellis e Miller (1997). Adjuvantes redutores de deriva tm sido
desenvolvidos especificamente para modificar o espectro de gotas, mas
muitos outros adjuvantes, usados para melhorar a dinmica da gota sobre o
alvo, tambm influenciam o tamanho das gotas.
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76 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Segundo Hall e Fox (1996) polmeros de poliacrilamida so populares
adjuvantes redutores de deriva, entretanto, alguns desses produtos pos-
suem determinadas caractersticas que dificultam o uso e podem prejudi-
car a eficcia, como hidratao lenta, baixa disperso, sensibilidade qua-
lidade da gua e degradao sob determinadas condies. Apesar disso, os
autores relatam que pesquisas indicam redues de deriva da ordem de 70%
para esse tipo de molcula. Zhu e colaboradores (1997) reafirmam existir
evidncias de diminuio de deriva e aumento no dimetro das gotas pul-
verizadas causadas pelo uso compostos, entretanto, na maioria dos casos, a
eficcia reduzida pela recirculao da calda de aplicao no pulverizador.
Western e colaboradores (1999) obtiveram incremento no tamanho das
gotas e reduo na deriva detectada em tnel de vento, ao adicionarem leo
vegetal ou mineral na calda de aplicao, quando comparados aos resultados
obtidos com outros adjuvantes e gua somente. As maiores redues na
deriva foram obtidas com a adio leo vegetal calda. Cunha e colaborado-
res (2003), avaliando estratgias para reduo da deriva de produtos fitossa-
nitrios, concluram que a adio de um leo vegetal calda altera o espec-
tro de gotas pulverizadas, aumentando o dimetro das gotas e diminuindo
a porcentagem delas mais suscetveis s perdas por deriva. Outro exemplo
da eficcia do uso de adjuvante para reduo da deriva foi observado por
Velini e Carbonari (dados no publicados), no qual um adjuvante especfico
(antievaporante e umectante) contribuiu significativamente com a reduo
de deriva, melhorando a chegada do produto at o alvo desejado em at 22%.
Costa (2006) tambm verificou um efeito bastante significativo do uso de
adjuvantes para a reduo da deriva em aplicaes de glyphosate e 2,4-D. O
mesmo autor verificou, ainda, que os efeitos dos adjuvantes utilizados para
reduo de deriva so dependentes das pontas de pulverizao utilizadas.
Aplicao de defensivos agrcolas em operao conjugada
colhedora em cana-de-acar
A colheita mecanizada da cana sem queima da palha deu origem a um
novo sistema de produo denominado de cana crua. A colheita tradicional
com queima da palha dever estar extinta em futuro prximo, em funo de
presses ambientais e trabalhistas. O resduo vegetal que permanece na su-
perfcie, afeta diretamente a dinmica de ocorrncia de plantas daninhas e
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TECNOLOGIA DE APLICAO E INOVAES VOLTADAS AO USO RACIONAL 77
algumas pragas importantes para a cultura da cana-de-acar e a aplicao
de defensivos agrcolas voltados ao solo, conforme j foi discutido.
Em muitas situaes, o controle de plantas daninhas na cultura da cana-
de-acar deve ser mantido por longos perodos, havendo urgncia na pro-
cura de solues e/ou alternativas que permitam o uso de herbicidas de ao
residual em reas com espessas camadas de palha, minimizando as perdas
por reteno e fotodegradao. Uma possvel soluo para se contornar esse
problema o desenvolvimento de um equipamento de aplicao de herbi-
cidas acoplado colhedora de cana, de modo que as operaes de colheita
e aplicao possam ser realizadas simultaneamente. Como a deposio da
palha feita na parte posterior da colhedora, possvel realizar a aplicao,
principalmente de herbicidas, diretamente sobre o solo e cobri-lo com pa-
lha aps a operao. Esse tipo de aplicao apresenta grandes vantagens,
destacando-se a proteo do herbicida contra evaporao e fotodecomposi-
o, a manuteno de nveis estveis e mais elevados de umidade do solo e
a reduo da quantidade do herbicida retido pela palha, aumentando a sua
disponibilidade no solo.
Carbonari (2007) verificou que o herbicida amicarbazone aplicado em
operao conjunta com a colhedora, apresentou elevados nveis de controle
de diversas plantas daninhas na cultura da cana-de-acar, indicando uma
maior disponibilidade do herbicida no solo, principalmente na camada su-
perficial, para essa modalidade de aplicao. Para os herbicidas tebuthiuron,
metribuzim, hexazinone + diuron e imazapic, alguns trabalhos realizados
simulando a condio de aplicao na colhedora, aplicando o herbicida so-
bre o solo e em seguida cobrindo com palha, apresentaram nveis de eficcia,
em geral, iguais ou superiores aos tratamentos convencionais sobre a palha
ou em solo descoberto (Negrisoli, 2005; Rossi et al., 2006; Corra, 2006).
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4
Metagenoma e a desconstruo
da biomassa
Lcia Maria Carareto Alves,
V iviane Schuch, Jackson A. M. de Souza,
Eliana G. M. Lemos
Introduo
Atualmente, uma das preocupaes mundiais so as fontes de energia a se-
rem utilizadas nas prximas dcadas, principalmente porque o petrleo, que
representa 40% da energia mundial, um combustvel fssil no renovvel.
A descoberta de fontes alternativas de energia, portanto, tem despertado
interesse de cientistas ao redor do planeta em virtude tanto da escassez de
petrleo para as prximas dcadas como tambm pelo aumento da preo-
cupao a respeito da poluio do meio ambiente ocasionada pelos deriva-
dos da indstria petrolfera. Uma proposta geral a de utilizar a energia da
biomassa como meio de providenciar energia moderna para os milhes de
pessoas que necessitaro dela no futuro. E uma das mais importantes apli-
caes do sistema de energia a partir da biomassa pode ser a fermentao
para a produo de etanol.
A biomassa parece ser uma interessante fonte de energia por vrias
razes. A principal delas a de que a energia gerada pela biomassa pode
contribuir para o desenvolvimento, alm de as fontes dessa matria-prima
serem frequentemente disponveis e a converso em energia, possvel sem
altos investimentos de capital.
Nas dcadas passadas, j era consenso que a produo de etanol a partir
da biomassa de plantas deveria ocorrer no somente pelo uso dos acares
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84 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
fermentveis, tais como o amido e a sacarose, mas tambm partindo das
fraes de lignocelulose. Isso porque nesse aspecto existe uma grande va-
riedade de fontes de matria-prima para a produo de etanol alm da cana-
de-acar e milho: rvores de crescimento rpido, grama, plantas inteiras,
produtos colaterais da produo industrial, plantas aquticas, lixo orgnico
municipal, entre outros.
Alm disso, o ltimo levantamento da safra 2010/2011 pela Companhia
Nacional de Abastecimento (Conab) mostrou que foram produzidas no
Brasil 625 milhes de toneladas de cana e, aproximadamente, 167 milhes
de toneladas de bagao. O bagao apresenta potencial para contribuir com
um aumento de cerca de 50% do etanol produzido por meio do uso da ligno-
celulose. Esse processo, portanto, pode aumentar significativamente a pro-
duo de etanol sem expanso de reas cultivveis de cana-de-acar. Des-
cobertas nas novas fronteiras da pesquisa de energia da biomassa poderiam
ter profundas implicaes para o futuro do uso da energia de biomassa.
Os microrganismos podem exercer papel fundamental em diferentes
aspectos, como na desconstruo da estrutura da biomassa ou na prpria
sntese de combustveis. Desse modo, podem ser utilizados para melhorar
as enzimas na despolimerizao da celulose, da hemicelulose e na degrada-
o da lignina, ou ainda em sistemas de biologia sinttica diretamente na
produo de combustveis. Essas atividades podem ser realizadas por mi-
crorganismos individuais, ou consrcios microbianos, organismos ntegros
e enzimas isoladas.
O solo o maior reservatrio de carbono orgnico da Terra, constituin-
do-se em um dos mais importantes habitats para microrganismos, compo-
nentes essenciais da biota terrestre. Os microrganismos exercem um im-
portante papel na manuteno da vida na Terra, atuando na ciclagem de
nutrientes e minerais, na produo de biomassa, em relaes simbinticas
e no controle de populaes. Tal versatilidade deriva de um longo cami-
nho evolutivo, no qual inumerveis estratgias metablicas foram acumu-
ladas em diferentes condies de presso seletiva. Essa riqueza tem sido
muito explorada pela biotecnologia na busca por solues diversas tanto na
melhoria no padro de vida humano como na qualidade ambiental. Nes-
se sentido, a busca por novos isolados e consrcios microbianos e mesmo
abordagens no nvel enzimtico para a realizao de diversos processos tm
captado grandes esforos nas esferas acadmica e industrial.
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 85
As rotas para produo de biocombustveis incluem a prospeco de
genes, enzimas e microrganismos. A abordagem metagenmica para pros-
peco de enzimas degradadoras da biomassa vegetal tem especial van-
tagem por se destacar como a base para encontrar genes relacionados s
variadas atividades enzimticas em sistemas biolgicos at ento desco-
nhecidos. Nosso grupo j vem aplicando a abordagem metagenmica para
determinao de estruturas de comunidades e anlises filogenticas. Essas
anlises iniciais so vistas potencialmente como formas de identificar a di-
versidade microbiana em solos e proporcionar um catlogo de promissoras
atividades que podem ser encontradas nos diferentes solos, em virtude da
comunidade neles encontrada.
Tendo como base o DNA metagenmico extrado de solos sob mata, cana-
de-acar e eucalipto, e o gene 16S rRNA obtido desse material, bibliotecas
foram confeccionadas em vetor fosmidial e plasmidial a fim de comporem
um banco de clones prprio do Laboratrio de Bioqumica de Microrganis-
mos e Plantas (LBMP). A partir desse banco, genes relacionados a sntese de
xilose isomerase, amilases, celulases e hemicelulases de diferentes classes po-
dero ser obtidos com sucesso. Esses genes podero ser utilizados em experi-
mentos de engenharia metablica e engenharia evolutiva, visando obteno
de linhagens capazes de realizar uma converso mais eficiente da biomas-
sa em etanol. Os clones contendo os genes 16S rRNA podem, tambm, ser
utilizados para a anlise da diversidade bacteriana e construo de biochips.
Neste captulo, sero apresentados dados referentes diversidade bac-
teriana de solos submetidos a diferentes manejos e prospeco de enzimas
microbianas importantes na degradao de biomassa. A metodologia abor-
dada refere-se aplicao de ferramentas de biologia molecular, microbio-
logia clssica e tecnologia metagenmica para o isolamento de genes de im-
portncia biotecnolgica na rea de produo de etanol a partir de biomassa.
Diversidade de microrganismos do solo
e utilizao dos recursos genticos em processos
biotecnolgicos envolvidos na desconstruo
da biomassa e produo de etanol
Os microrganismos catalisam transformaes indispensveis dos ciclos
biogeoqumicos da biosfera e produzem componentes importantes para a
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86 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
atmosfera, alm de representarem a maior diversidade gentica e metab-
lica dentre as formas de vida existentes. O solo o habitat que contm a
maior quantidade e diversidade de microrganismos, um grama de solo con-
tm mais de 10 mil diferentes espcies (Torsvik; Ovreas; Thingstad,2002).
A utilizao de tcnicas de cultivo puro permite o estudo de microrga-
nismos individualmente e sua caracterizao, principalmente por critrios
metablicos (provas bioqumicas). Entretanto, a abordagem do cultivo li-
mita seriamente a avaliao taxonmica e filogentica como estimativa da
diversidade microbiana, devido falha do cultivo da maioria dos microrga-
nismos pelos mtodos convencionais (Pace, 1997).
Microbiologistas sempre investiram grandes esforos na descoberta de
microrganismos capazes de sintetizar compostos e de catalisar reaes im-
portantes, dentro da perspectiva humana. A busca por eles levou os pesqui-
sadores a isolarem dezenas de milhares de linhagens produtoras de diversas
substncias de interesse biotecnolgico e, ainda hoje, aqueles cultivveis de
solo representam, por exemplo, a principal fonte de antibiticos e outros
compostos bioativos.
Atualmente, o uso de tcnicas de biologia molecular permite uma an-
lise populacional independente do cultivo, baseada no estudo do conjunto
de genomas do ambiente. Anlise da comunidade total de DNA de uma
amostra constitui uma medida de sua heterogeneidade, inferindo-se para
a diversidade microbiana nela presente. Coletivamente, o genoma da mi-
crobiota total encontrada na natureza denominado metagenoma termo
usado pela primeira por Handelsman e colaboradores em 1998 , sendo que
tal estratgia permite o acesso de muito mais informao gentica que os
procedimentos baseados em cultivo. Metagenoma o conjunto de genes de
um determinado ambiente, e pode ser analisado de modo similar ao que se
faz com um genoma nico (Figura 4.1).
Essa abordagem envolve o uso de vetores para clonar, estavelmente,
segmentos de DNA de amostras ambientais (Shizua et al., 1992). Vrios
vetores tm sido utilizados como sistema de expresso para estudar geno-
mas microbianos de organismos pr-cultivados ou do DNA microbiano
total extrado diretamente do solo (Figura 4.2) (Rondon et al., 2000) . Essa
clonagem constitui, portanto, uma ferramenta til para o estudo do con-
tedo genmico total da microbiota de uma amostra, como solo. Atravs
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 87
de clonagem e anlise de grandes segmentos de DNA microbiano do solo
ou de qualquer ambiente, pode-se avaliar com mais detalhes a diversidade,
a fisiologia e a funo dos microrganismos na natureza. Alm disso, essas
metodologias possibilitam o isolamento e expresso de genes de interesse
em diversos setores da indstria biotecnolgica, sem a necessidade de isola-
mento dos microrganismos do ambiente.
O solo constitui, indubitavelmente, um dos principais reservatrios de
carbono orgnico da Terra e um dos mais importantes habitats para mi-
crorganismos, principalmente procariotos. A abundncia do carbono e ou-
tros elementos produzidos por procariticos sugerem que cerca de metade
do protoplasma vivo da terra seja de origem microbiana (Whitman et al.,
1998). Devido vasta diversidade, s grandes populaes e longa histria
evolutiva, os microrganismos vm contribuindo fortemente para a rique-
Figura 4.1 Esquema mostrando a sequncia de procedimentos para estudo do DNA meta-
genmico extrado da amostra de um solo
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88 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Figura 4.2 Comparao esquemtica de duas diferentes abordagens para obteno de no-
vas enzimas. Usando a tecnologia de cultivo a partir de isolamento de organismos (esquer-
da); e a partir da tcnica metagenmica (direita). Pela tcnica tradicional de cultura, enzimas
de interesse podem ser obtidas por cultivo e extrao ou clonagem de um gene especfico.
Pela tcnica metagenmica pode-se isolar e clonar vrios genes de um ambiente, para poste-
rior prospeco e expresso de uma enzima desejada. (Lorenz et al., 2002)
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 89
za e a complexidade das interaes entre os organismos do solo, incluindo
desde simbioses altamente especficas a mutualismos difusos (Beare et al.,
1995). Tais organismos so componentes essenciais no processo de decom-
posio do solo, no qual resduos de plantas e animais so degradados em
matria orgnica, liberando nutrientes na cadeia alimentar.
O nmero dos microrganismos e sua biomassa coletivas varia dentro e
entre os diferentes tipos e condies dos solos, sendo o grupo das bactrias
mais numeroso (Whitman et al., 1998), mas o grupo dos fungos tem igual
ou maior importncia em muitos solos, como mostrado pela ntima asso-
ciao com razes de plantas e pela competncia saproftica com detritos
fisicamente maiores e compostos estruturalmente complexos (Meeting Jr.,
1993; Carrol; Wicklow, 1992). Um grau muito maior de plasticidade feno-
tpica e genotpica existe dentro de comunidades microbianas do que foi
previamente avaliado.
Evidncias demonstram que os microrganismos presentes em ambientes
naturais so filogeneticamente mais diversos do que era sabido pelas anlises
de sequncias de linhagens cultivadas (Hugenholtz; Pace, 1996). A ampla
ocorrncia de partculas virais infecciosas, mutaes, plasmdeos e outros
elementos genticos mveis e seus papis nos processos de transduo, trans-
formao e conjugao permitem concluir que ecossistemas microbianos so
comunidades geneticamente abertas (Terzaghi; OHara, 1990) e com enor-
me potencial de aquisio de diversidade gentica (Whitman et al., 1998).
At recentemente, com o desenvolvimento de tcnicas de cultivo puro,
os microrganismos puderam ser estudados isoladamente e caracterizados,
em algum grau, por critrios nutricionais, principalmente. Entretanto, a
abordagem do cultivo limitou seriamente a avaliao taxonmica e filoge-
ntica, como estimativa da diversidade microbiana, devido falha de cul-
tivo da maioria dos microrganismos pelos mtodos convencionais (Pace,
1997). Nesse contexto, numerosos meios de cultura, seletivos e no-seleti-
vos, foram utilizados para enumerar e isolar microrganismos do solo e da
rizosfera com influncia destes nos graus de diversidade gentica obtida
(Sorheim, 1989; Buyer, 1995; Tabacchioni et al., 2000). Entretanto, ferra-
mentas moleculares e tecnologias baseadas em sequncias gnicas vm re-
duzindo essas limitaes e revelando nova perspectiva sobre a diversidade
microbiana.
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A caracterizao dos microrganismos no-cultivveis, utilizando-se
de mtodos moleculares e anlises filogenticas a partir de sequncias de
DNA, , portanto, um esforo para identificar e conhecer suas distribui-
es e funes no meio ambiente. Os novos mtodos de deteco de micror-
ganismos, sem necessariamente cultiv-los, certamente contribuiro para
inferncias inditas sobre sua significncia nos solos.
Ambas as abordagens, baseada em cultivo (Hattori et al., 1997) ou cul-
tivo independente, apoiam, uma vez mais, o estabelecido de que os solos
representam um dos mais diversos habitats para microrganismos. Estudos
moleculares, tais como os resultantes das anlises de sequncias de 16S
rRNA, confirmam a rica diversidade entre divises bacterianas divergentes
(Hugenholtz et al., 1998), por exemplo. Assim, as divises Proteobacteria
o, |, e o so usualmente bem representadas, como so Cytophagales, Ac-
tinobacteria e Gram-positivas de baixo contedo de GC. Esses resultados
so particularmente relevantes para a descoberta de produtos naturais, pois
membros cultivveis dessas ltimas duas divises so prolferos produtores
de antibiticos (Rheims et al., 1996).
Em relao aos fungos, estimativas sugerem que h 1,5 milho de espcies
na Terra, sendo que aproximadamente 70 mil delas foram descritas, donde
se conclui que 95% encontram-se ainda sem descrio (Hawksworth et al.,
1997). Estratgias utilizadas para tal identificao incluem anlises compa-
rativas de sequncias de 18S rRNA (Pace, 1997; Kowalchuk, 1998). Outros
exemplos poderiam ser citados sobre o impacto dos estudos cultivo inde-
pendentes no conhecimento da filogenia e diversidade microbiana no solo;
e, quo pobremente esto representados pelos seus membros cultivados.
A partir da dcada de 1980, um grande nmero de metodologias mo-
leculares DNsicas vm sendo desenvolvidas para anlise da diversidade
microbiana dos solos (Amann; Ludwig; Schleifer, 1995; Borneman; Tri-
plett, 1997; Cullen; Hirsch, 1998; Duarte et al., 1998; Muyzer et al., 1993;
Torsvik et al., 1998). Com quantidades pequenas de solo, tais procedimen-
tos permitem anlise de mltiplas amostras com eficincias prximas de
80% e purificao de DNA com o emprego de kits, tornando as anlises
mais rpidas (Zhou et al., 1996; Kuske et al., 1998; Ogram et al., 2000).
Empregando-se de reassociao cintica do DNA extrado de comuni-
dades bacterianas, Torsvik e colaboradores (Torsvik et al., 1990a; 1990b)
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 91
encontraram nmeros acima de 10 mil espcies em apenas um grama de
solo sob floresta, muitas das quais nunca haviam sido cultivadas em labo-
ratrio. Ritz e Griffths (1994), empregando hibridizao do DNA total ex-
trado de diferentes solos, e sob diversas condies, verificaram diferentes
padres de diversidade gentica entre os mesmos. Com relao aos fungos,
avaliao por mtodos moleculares sugere que a grande maioria das esp-
cies do planeta ainda est por ser revelada e analisada (Hawksworth et al.,
1997; Amann; Ludwig; Schleifer, 1995).
O acesso molecular individual aos tipos de bactrias existentes no solo
tem sido baseado na determinao das sequncias dos genes 16S rRNA (Fi-
gura 4.3) amplificados e clonados (Borneman; Triplett, 1997; Kuske et al.,
1998; Borneman et al. 1996; Lee et al., 1996; Gesolmino et al., 1999). Por
outro lado, a distino entre espcies de fungos, embora menos frequente-
mente utilizada, tem sido feita com base nas sequncias 18S rRNA (Borne-
man; Triplett, 1997; Amann; Ludwig; Schleifer, 1995; Elsas et al., 2000).
Outras tecnologias tm sido avaliadas e aperfeioadas para anlise da biodi-
versidade do solo, tais como a tcnica do T-RFLP p (Liu et al., 1997) e a de
shotgun para sequenciamento do DNA de clones genmicos, fragmentos de
restrio e produtos de PCR (Birren et al., 1997).
Figura 4.3 Estrutura do genes 16SrRNA O gene do rRNA 16S das bactrias (1542pb)
consiste de nove sequncias conservadas (C1-C9), espaadas por regies hipervariveis
(V1-V9, com 10 a 50 bases). A amplificao do gene 16SrRNA com o uso de primers espec-
ficos para regies conservadas e que consigam amplificar tambm regies variveis facilitam
a identificao das bactrias. (Petrosino et al., 2009)
Atualmente, as novas metodologias de sequenciamento de DNA em
grande escala tm colaborado e tornado mais geis os estudos metagenmi-
cos, quer seja nas anlises de diversidade, quer seja na prospeco de genes.
Essas novas tecnologias, alm de estarem se tornando pouco onerosas, tm
a capacidade de gerao de uma grande quantidade de dados em um curto
espao de tempo. Dessa forma, diversas amostras ambientais esto sendo
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92 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
avaliadas atravs do sequenciamento em grande escala: oceanos (Sogin et
al., 2006; Huber et al.; 2007), solos (Leininger et al., 2006; Fierer et al.,
2007), recifes (Wegley et al., 2007), assim como amostras fecais e de biofil-
mes (Mardis, 2008; Claesson et al., 2010).
A diversidade biolgica de muitos ecossistemas pode ser ameaada por
processos degradativos diversos. Relativamente pouco tem sido feito para
quantificar as relaes benficas entre diversidade microbiana, funciona-
mento do solo-qualidade vegetal e sustentabilidade do ecossistema (Ken-
nedy; Smith, 1995). Em agroecossistemas, as funes mais importantes so
aquelas envolvidas na ciclagem de nitrognio e carbono, na manuteno da
estrutura do solo, na antibiose etc.
Relata-se que a desertificao do ecossistema terrestre atinge milhes de
hectares anualmente, como resultado dos impactos das atividades degrada-
tivas antropognicas, caracterizadas pelo aumento da atividade dos agentes
naturais, ameaando a sustentabilidade dos solos. Distrbios nas comuni-
dades naturais vegetais so os primeiros sintomas visveis desse desequil-
brio; porm, frequentemente so acompanhados ou precedidos por perda
das propriedades fsico-qumicas e biolgicas, principalmente, microbiol-
gicas dos solos (Mder et al., 1996; Requena et al., 2001). Tais propriedades
determinam, decisivamente, a fertilidade e a qualidade dos solos, alterando
diretamente o estabelecimento e a produtividade das plantas.
Desde que apenas uns poucos microrganismos no solo so produtores
primrios, sendo em sua maioria saprfitas ou entidades mutualsticas,
estes, por sua vez, dependem da produo primria das plantas; e, assim,
esses dois sistemas biolgicos esto fundamentalmente interligados (Ohto-
nen et al., 1997). O funcionamento do ecossistema do solo , portanto, go-
vernado, em grande parte, pela dinmica de sua populao microbiana que
fortemente influenciada pelos distrbios aplicados ao solo.
Sistemas convencionais de produo agrcola, baseados em agroqumi-
cos, constituem fontes de poluio que, direta ou indiretamente, contri-
buem para a degradao do ambiente biolgico do solo, com destruio dos
recursos naturais (Filser et al., 1995). Da mesma forma, o cultivo intensivo
baseado em prticas culturais agressivas altera a biota do solo, causando,
inclusive, eroso excessiva com poluio das guas superficiais e lenis
freticos (Filser et al., 1995; Hassink et al., 1991; Valarini et al., 1998). Des-
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 93
matamento (Cullen; Hirsch, 1998) e desertificao, em particular, apre-
sentam impacto negativo, reduzindo o potencial de inculo de simbiontes
microbianos mutualsticos os quais constituem fatores essenciais na cicla-
gem dos principais nutrientes de plantas e, portanto, na sustentabilidade da
cobertura vegetal em habitats naturais (Requena et al., 2001).
O crescimento e desenvolvimento das culturas esto estreitamente rela-
cionados natureza da microbiota do solo. A baixa eficincia de produo
agrcola influenciada por fatores fisiolgicos culturais, pelo ambiente e
por outros fatores biolgicos representados, principalmente, pelos micror-
ganismos do solo. A microbiota do solo e, particularmente, da rizosfera po-
dem acelerar o crescimento das plantas, podendo apresentar efeito primrio
em ambos, qualidade do solo e qualidade do cultivo.
Manejo de associaes simbiticas entre plantas e microrganismos, por
exemplo, pode restaurar ecossistemas desertificados (ibidem). Do ponto de
vista fitossanitrio, as interaes microbianas em alguns solos podem natu-
ralmente prevenir o estabelecimento de patgenos ou inibir suas atividades
patognicas. Tal fenmeno denominado supressividade do solo (Baker;
Cook, 1974), sendo esta relacionada diretamente atividade microbiana do
solo (Rodrguez-Kbana; Calvet, 1994).
A metagenmica uma abordagem promissora que, alm de permitir
estudos da diversidade microbiolgica de um ambiente sem o isolamento
desses, ainda permite acessar o genoma desses organismos incultivveis, e
oferece a oportunidade de recuperao de genes desconhecidos que esto
diretamente envolvidos na biossntese de inmeros compostos de impor-
tncia tecnolgica. Essa tecnologia consiste na extrao de DNA direta-
mente do ambiente e construo de uma biblioteca de grandes fragmentos
desse genoma misto.
Resultados de pesquisas na rea metagenmica
relacionados desconstruo da biomassa para
produo de etanol
A equipe do Laboratrio de Bioqumica de Microrganismos e Plantas
(LBMP) da Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias (Fcav) da Unesp
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94 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
construiu algumas bibliotecas metagenmicas com genes 16SrRNA e
bibliotecas em vetores capazes de receber grandes fragmentos de DNA.
Essas bibliotecas esto sendo usadas para avaliar a diversidade em solos
submetidos aos mais variados manejos agrcolas (Figura 4.4) e para a pros-
peco de genes de importncia biotecnolgica, incluindo genes envolvidos
na biossntese de compostos antioxidantes, enzimas e antibiticos. A sub-
-clonagem dos vetores selecionados, contendo os genes de interesse, per-
mite o isolamento, sequenciamento e expresso dos genes de que podero
contribuir para a busca de bioprodutos e inovaes biotecnolgicas.
Figura 4.4 Fotos dos locais de coleta de solos para anlise da diversidade de microrganis-
mos e construo de bibliotecas metagenmicas. Em sentido horrio: rea de solo sob arbo-
reto de eucalipto (Unesp); solo cultivado com hortalias e tomate; rea de solo sob floresta
nativa (Unesp); solo cultivado (milho, feijo, soja)
Os estudos dos microrganismos dos solos por anlise metagenmica
realizados pelo grupo de Pesquisa de Bioqumica de Microrganismos e
Plantas da Fcav/Unesp revelaram a diversidade bacteriana de solos de flo-
restas nativas ou solos submetidos a diversas manipulaes, como o cultivo
intenso de milho e hortalias, reas de pastagens e reas sob eucalipto, alm
do tratamento com lodo de esgoto. Nesses estudos, puderam ser observadas
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 95
diferenas nas populaes bacterianas e, fundamentalmente, o desapareci-
mento de determinado grupos conforme a manipulao sofrida pelos solos:
Silveira, E. L.; Pereira, R. M.; Scaquitto, D. S.; Pedrinho, E. A. N.;
Moraes, S. P. V.; Wickert, E.; Carareto Alves, L. M.; Lemos, E. G. M.
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springerlink.com/content/d666852488r35335/fulltext.pdf>.
Nesses trabalhos, a metodologia bsica utilizada consistiu em se isolar o
DNA metagenmico, fazer uma reao de PCR com essas amostras meta-
genmicas, clonar os fragmentos obtidos, sequenciar e comparar os resul-
tados com o banco de dados, segundo o esquema a seguir.
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96 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
O DNA metagenmico extrado de diferentes solos apresentou frag-
mentos com alto tamanho molecular (Figura 4.5A), o que pode ser conse-
guido atravs da utilizao de kits comerciais especficos. Esse material foi,
ento, submetido reao de amplificao com oligonucleotdeos especfi-
cos para o gene 16SrRNA (Kuske et al., 1997) gerando, assim, um conjunto
de fragmento com 1500pb (Figura 4.5B). Os fragmentos da PCR foram in-
seridos em vetor plasmdico, clonados em Escherichia coli, sendo as clulas
transformadas selecionados em meio de cultivo contendo IPTG e X-Gal
(Figura 4.5C). A insero do fragmento de DNA d-se na regio do gene
lacZ responsvel pela sntese de |-galactosidase que quebra o substrato
X-gal, originando colorao azul. Por essa metodologia as clulas que recebe-
ram o inserto formam colnias brancas uma vez que no so mais capazes de
sintetizar a |-galactosidase, e as que no receberam formam colnias azuis.
Figura 4.5 Resultados da metodologia aplicada para anlise da diversidade de microrga-
nismos por abordagem metagenmica. A) eletroforese de DNA metagenmico; B) eletrofo-
rese do produto de amplificao do DNA metagenmico com oligonucleotdeos especficos
para o gene 16S rRNA; C) placas contendo clones transformados com plasmdeos contendo
amplicons do gene 16Sr RNA.
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 97
Os clones obtidos puderam ser utilizados para a anlise da diversidade
das amostras ambientais atravs do sequenciamento dos fragmentos clo-
nados e da tcnica de microarranjo de DNA. Demonstrando, assim, que a
diversidade bacteriana dos solos submetidos a diferentes tratamentos pode
ser alterada, alguns microrganismos desaparecem e outros aumentam sua
populao. Em diversas situaes essa alterao populacional pode signi-
ficar perda de elementos importantes de um ambiente ou aparecimento de
organismos de modo desequilibrado.
Um aspecto que est sendo estudado atualmente, e tambm com as fer-
ramentas da metagenmica, a avaliao da interferncia da cana de acar
na microbiota dos solos. Assim, essa abordagem foi aplicada para um estu-
do da diversidade atravs da clonagem e do sequenciamento de fragmentos
16S rDNA de dois sistemas de solo no estado de So Paulo: 1) mata nativa
e 2) cultura da cana. Fragmentos 16S rDNA foram amplificados e clonados
em vetor pGEM-T easy, permitindo o posterior sequenciamento de DNA
e anlise da comunidade do grupo Bacteria.
As sequncias FASTA obtidas foram analisadas e comparadas com o
GenBank do Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI), e
anlises filogenticas foram realizadas utilizando o programa Bionume-
rics (6.0.1 AppliedMaths) baseados em sequncias alinhadas. Os dados
revelaram que, em comunidades do solo da floresta eram predominantes
Acidobacterium, Verrucomicrobium, Proteobacterium, Firmicutes, Ac-
tinobacterium, enquanto no solo das culturas de cana foram encontrados
Firmicutes e Proteobacterium.
O uso de ferramenta da metagenmica um avano real para compreen-
der a funo e como interagem os membros de uma comunidade microbia-
na complexa, assim como isolar genes de interesse biotecnolgico (Streit;
Schmitz, 2004; Handelsman, 2004). As anlises metagenmicas, alm de
possibilitarem a observao dos microrganismos de um habitat que ainda
no se consegue cultivar, possibilitam a obteno de clones com genes codi-
ficadores das mais diversas substncias encontradas na natureza.
A metodologia de construo de bibliotecas genmicas, que envolve a
gerao e clonagem de fragmentos de DNA de alto tamanho molecular em
vetores apropriados, e a prospeco de genes de interesse, tem sido utilizada
exaustivamente por mais de trs dcadas. A clonagem de DNA metagen-
mico, entretanto, foi pela primeira vez reportada na metade da dcada de
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98 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
1990, com a construo de uma biblioteca de metagenoma marinho (Stein
et al., 1996).
Nos ltimos anos, observou-se um progresso significante na metagen-
mica, que comea a proporcionar um entendimento substancial das fun-
es da comunidade microbiana natural (Ward, 2006), assim como uma
utilizao biotecnolgica para seus resultados.Visto que a ampla diversida-
de microbiana do solo e de vrias comunidades constitui-se de um enorme
pool gentico e biolgico que pode ser explorado para a descoberta de novos
genes, vias metablicas inteiras e seus produtos (Cowan et al., 2005).
Vrias abordagens do uso de tcnicas moleculares tm sido realizadas
para a utilizao de genes e organismos transformados para a utilizao da
biomassa como fonte de energia. Uma abordagem metagenmica a partir
de DNA metagenmico dos microrganismos de rmem de bovinos iden-
tificou mais de 20 mil genes com caractersticas de genes envolvidos no
metabolismo de carboidratos e 90 protenas, sendo 57% delas ativas contra
substratos celulolticos (Hess et al., 2011)
A metagenmica tem sido utilizada com sucesso em todas as escalas: para
anlises filogenticas, para o estudo de genes (Streit; Schmitz, 2004; Voget
et al., 2003; Ferrer et al., 2005), vias biossintticas complexas (Brady et al.,
2001; Gillespie et al., 2002; Courtois et al., 2003; Lim et al., 2003) para a
descrio do metabolismo de bactrias desconhecidas (Tyson et al., 2004)
e para estudo de comunidades microbianas contidas em diversas amostras
especficas como biofilmes e consrcio de bactrias contidas em culturas de
enriquecimento (Tyson et al., 2004; Knietsch et al., 2003). Muitos ambien-
tes so focos da metagenmica, incluindo solos (Rondon et al., 2000; Cour-
tois et al., 2003), cavidade oral (Diaz-Torres et al., 2003), rumem (Ferrer et
al., 2005), habitats aquticos (Kim; Fuerst, 2006), entre outros.
Estratgias diferentes para a construo de bibliotecas metagenmicas
variam conforme a inteno do estudo. Bibliotecas que contm grandes in-
sertos de DNA ambiental so construdas principalmente em vetores cos-
mdeos (Courtois et al., 2003), fosmdeos (Ginolhac et al., 2004) e BAC
(Rondon et al., 2000), e permitem identificao e explorao de genes e vias
biossintticas complexas. Vetores com alto nmero de cpias e que acei-
tam insertos pequenos tambm so utilizados pela facilidade de obteno
de DNA plasmidial suficiente para anlises baseadas em sequncia (Tyson
et al., 2004).
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 99
A pesquisa da biblioteca metagenmica pode ser feita de diversas for-
mas e, tipicamente, envolve hibridizao com uma sonda para o gene de
interesse. O sequenciamento de todos os clones da biblioteca e posterior
anlise genmica ou a anlise da expresso de DNA heterlogo dos clones
da biblioteca so tcnicas eficientes, porm muito trabalhosas.
Recentemente, formatos de microarranjos tm sido desenvolvidos e
avaliados para deteco de genes e anlises da comunidade microbiana em
ambientes complexos. Esses estudos indicam que tecnologias baseadas em
microarranjos genmicos possuem grande especificidade, sensitividade e
potencial quantitativo, tornando-se uma ferramenta paralela de alto ren-
dimento para deteco de genes em amostras ambientais (Wu et al., 2001;
Zhou, 2003).
No LBMP esto sendo pesquisados genes relacionados a diversas reas
de interesse biotecnolgico atravs da construo de bibliotecas metagen-
micas. Entre essas pesquisas pode ser citada a prospeco de genes de inte-
resse na produo de etanol a partir da biomassa.
A enzima xilose isomerase catalisa a converso reversvel da D-xilose e
D-glicose para D-xilulose e D-frutose, respectivamente. Xilose o segun-
do carboidrato mais abundante na natureza, e a fermentao comercial des-
se composto para a produo de etanol pode representar uma alternativa de
aumento da produtividade para o futuro. Nos processos industriais de fer-
mentao, a levedura Saccharomy cescerevisiae comumente utilizada para
produo de etanol. A levedura selvagem fermenta prontamente glicose,
mas no capaz de metabolizar xilose. Apenas uma pequena parcela de
bactrias, leveduras e fungos filamentosos so naturalmente capazes de fer-
mentar xilose. Neste trabalho foi realizada a prospeco de novos genes de
xilose isomerase em bibliotecas metagenmicas e em isolados de Burkhol-
drias atravs da tcnica de Reao em Cadeia da Polimerase (PCR).
No foi possvel recuperar genes oriundos das bibliotecas metagenmi-
cas. Dos treze isolados de Burkholdrias testados, seis apresentaram am-
plificao positiva para o gene de xilose isomerase (Figura 4.6). Os genes
foram completamente sequenciados e as sequncias foram utilizadas em
anlises computacionais, que permitiram estabelecer a identidade entre as
sequncias e a deduo da funo das protenas baseadas em similaridades.
Esses genes esto sendo utilizados em ensaios de expresso, para caracteri-
zao das novas enzimas, considerando que essas sequncias representam
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100 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
protenas que formam um grupo distinto quando comparado com outras
enzimas do banco de dados.
Do mesmo modo, esto sendo analisados nas bibliotecas metagen-
micas genes envolvidos na degradao do amido e da celulose. Os genes
envolvidos na degradao do amido esto sendo prospectados a partir de
reao de PCR e os da celulose, pesquisados a partir da anlise funcional
dos clones, duas formas frequentes de se prospectar genes de interesse em
bibliotecas metagenmicas.
Atualmente, a colheita da cana-de-acar sem a utilizao do fogo para
despalha (cana crua) vem crescendo gradualmente devido presso da so-
ciedade contra as queimadas e s vantagens agronmicas da permanncia
da palha no campo. Essa mudana elevou a utilizao de mquinas para a
realizao da colheita, aumentando a quantidade de matria verde (folhas)
que chega indstria. Esse aumento trouxe desvantagens para as usinas,
uma delas a presena do amido no caldo da cana-de-acar, que, em altas
concentraes, pode interferir negativamente no processo de fabricao do
acar, pois as extremidades da cana-de-acar, bem como as folhas, so
ricas em amido.
O amido pode causar vrios problemas durante o refino do acar, in-
terferindo no processo de filtrao e cristalizao, proporcionando turbidez
visvel durante a dissoluo do acar em gua, alm de reduzir drastica-
mente o rendimento. Esses problemas decorrentes da presena do amido
podem fazer com que a indstria tenha prejuzos durante a produo do
acar. Para eliminao do amido, recomenda-se a aplicao de enzimas
o-amilases, essas enzimas agem hidrolisando as ligaes alfa1-4 (presentes
entre as molculas de glicose das cadeias de amido).
As enzimas amilases atualmente disponibilizadas no mercado so co-
mercializadas por um custo elevado e, portanto, precisam ser utilizadas de
forma bem controlada. Desse modo, o desenvolvimento de novos processos
de produo da amilase pode levar tanto diminuio dos custos como
obteno de produtos com caractersticas especiais importantes para o uso
em grande escala.
Considerando-se essa abordagem, a obteno de genes envolvidos na sn-
tese de enzimas degradadoras de amido de grande importncia biotecnol-
gica na atualidade. No LBMP (Milena Tavares, comunicao pessoal) esto
sendo prospectados genes envolvidos na degradao de amido em bibliote-
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 101

Figura 4.6 Anlise filogentica da sequncia de aminocidos do gene de xilose isometa-
se. A reconstruo filogentica foi computada pelo mtodo de distncia, utilizando a ma-
triz PAM, e o mtodo neighbor-joining de construo de filogramas, com 1000 bootstraps.
O nmero de substituies de aminocidos proporcional ao comprimento da escala. As
sequncias obtidas neste trabalho esto ilustradas em vermelho. Os nmeros de acesso das
sequncias oriundas dos bancos de dados esto em parnteses ao lado do nome das linha-
gens. (Viviane Schuk, comunicao pessoal)
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102 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
cas metagenmicas. Na Figura 4.7, pode-se observar a presena de ampli-
ficao gnica em biblioteca metagenmica construda a partir de DNA de
solo cultivado com cana-de-acar, esse material esta sendo sequenciado e
a sequncia gnica de interesse dever ser estudada in silico e clonada em
vetores de expresso para a avaliao de suas caractersticas enzimticas.
Figura 4.7 Perfil eletrofortico de uma amplificao por PCR partindo de 70 ng de DNA
Fosmidial obtidos de trinta pools de 96 clones de fosmdeos utilizando primers especficos
para a amilase. As amplificaes intensas correspondem s placas 07 e 17.
Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade gentica e de-
sempenham funes nicas e cruciais na manuteno de ecossistemas, uma
dessas funes a produo de enzimas extracelulares que ajudam na mi-
neralizao da matria orgnica, liberao de carbono e nutrientes na forma
em que so assimilados. Devido a esses importantes fatores, que cada vez
mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos
setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo.
A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela formada por um com-
plexo multienzimtico capaz de hidrolisar celulose atravs da quebra da
ligao |,1-4. A partir disso, foi realizada uma busca de gene relacionado
com a hidrlise da celulose em biblioteca metagenmica de DNA extrado
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 103
de solo de arboreto de eucalipto. Foram realizados testes bioqumicos e mo-
leculares, partindo de um par de oligonucleotdeos iniciadores degenerados
que foi construdo para identificar o gene da glucanase que est ligado
hidrlise da celulose.
Com o teste bioqumico foi possvel selecionar clones que esto rela-
cionados com hidrlise da celulose (Figura 4.8), a confirmao dos clones
positivos foi feita atravs de reaes de PCR. Aps a escolha do clone, foi
feita uma sub-biblioteca, os clones dessa biblioteca foram sequenciados e
atravs desse sequenciamento foi possvel encontrar gene relacionado hi-
drlise da celulose (Rodrigues, 2009).
Figura 4.8 Placas A, B e C contendo clones da biblioteca metagenmica cultivados em
meio contendo vermelho congo. Resultados positivos para hidrlise da celulose puderam ser
observados atravs da formao do halo amarelo ao redor dos clones que esto indicados
pelas setas. (Rodrigues, 2009)
O sequenciamento dos clones da sub-biblioteca foram feitos para encon-
trar genes relacionados a hidrlise da celulose, as sequncias foram analisadas
pelo pacote phredPhrap/Consed. Foram sequenciados 864 clones dos 1.344
clones da subbiblioteca, entre os 864 clones, o inserto sequenciado possui
aproximadamente 40.000pb e foram gerados 305 contigs (Rodrigues, 2009).
A anotao dos genes foi realizada de forma manual atravs da utilizao
do programa Artemis Release 10. A sequncia de aminocidos em formato
FASTA foi submetida ao banco de genes do National Center for Biotech-
nolgy Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), atra-
vs do programa BLASTP, para comparao com sequncias homlogas
de protenas depositadas no banco de dados. Todos os 305 contigs foram
analisados e foi encontrado resultado positivo nos contigs 33,109 e 184 (ibi-
dem). As possveis protenas foram identificadas pelo programa Artemis e
sua provvel classificao funcional est na Tabela 4.1.
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104 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Tabela 4.1 Relao dos possveis genes relacionados a hidrlise da celulose.
Contigs Funo proposta de
possveis protenas
similares
Bactria fonte
da protena
similar
Similaridade/
Identidade
(%)
n
o
de acesso
protena similar
Contig 33 cellulose synthase
operon protein YhjU
Salmonella
enterica subsp.
80/87 YP_02660285.1|
hypothetical protein
EcolC_0178
Escherichia coli
ATCC 8739
94/95 YP_001723187
Contig 109 PTS system,
N,N-diacetylchitobiose-
specific IIC component
Salmonella
enterica subsp.
enterica serovar
Agona str. SL483
95/93 YP_02664041.1
Contig 184 PTS system, N,N-
diacetylchitobiose-
specific IIC component
Salmonella
enterica subsp.
enterica serovar
Agona str. SL483
95/93 YP_02664041.1
No contig 33, observou-se similaridade da sequncia com a de uma
protena do operon da celulose sintase. O fragmento possui 753 bases e 250
aminocidos e no apresenta domnio conservado, mas sabe-se que dois
genes so codificados e que sua funo atribuda hidrlise de celulose
insolvel, os genes so: celulose 1,4betacellobiosidase (celK) e betagluco-
sidase (bglH).
Os contigs 109 e 184 apresentaram a formao de dois fragmentos que
se complementam e formam a protena PTS (Figura 4.9), esses fragmentos
tm 705 bases e 234 aminocidos e 679 bases e 226 aminocidos. O sistema
PTS, que uma fosfotransferase, responsvel pelo transporte e fosforilao
de carboidratos, acoplado ao PEP (fosfoenolpiruvato). Tambm respon-
svel pela quebra de molculas grandes e insolveis em gua como o
caso da celulose. O sistema utiliza parte do carbono liberado pela quebra
dos compostos nas ligaes |-1,4.
O sistema PTS bem complexo e conta com auxlio de dois conjuntos
de enzimas, enzima I (EI) e HPr, e enzima II (EII) que formada por trs
domnios A, B e C. Os domnios encontrados no contig 109 e 184 esto
relacionados com II C, essa enzima responsvel pela proteo integral da
membrana. Alm disso, as sequncias encontradas apresentam domnios
relacionados ao sistema PRK e genes cel B e cel D (Figura 4.6). PRK um
domnio no qual o sistema PTS atua, mas nesse caso ele quebra a estrutura da
quitina. Por outro lado, os genes cel B e cel D fazem parte de um operoncel,
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 105
que composto por cinco genes ce lA, cel B, cel C, celD, e cel F. O gene cel
B codifica um produto que requerido para o transporte e a fosforilao de
celobiosefosfoenolpiruvato-dependente, e cel D codifica um repressor
do transporte (Rodrigues, 2009).
Figura 4.9 Esquema das sequncias do contig 109 aps ser submetido ao BLASTP.
Outra abordagem que se pode ter atravs dos estudos metagenmicos
quando se inicia a pesquisa de genes a partir de uma cultura enriquecida
de microrganismos. Dessa forma, est sendo realizada pesquisa de genes de
interesse na desconstruo de biomassa a partir de consrcios microbia-
nos degradadores de biomassa. Um conjunto de microrganismos (consr-
cio) foi isolado de solos com resduos de cana. Esse consrcio est sendo
mantido no LBMP, em meios de cultivo contendo bagao de cana ou ce-
lulose, como fonte de carbono (Maria Luiza M. de Almeida, comunicao
pessoal).
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106 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Atravs de anlises metagenmicas os constituintes desse conscio es-
to sendo estudados, assim como o DNA metagenmico dele possibilitar
o isolamento de um conjunto de genes que permitiro a desconstruo da
biomassa e sua utilizao para a produo de etanol. Observaram-se por
anlises microbiolgicas que esse conjunto bacteriano produz celulase e
amilase (Figura 4.10), dessa forma os genes codificadores dessas enzimas
devero ser isolados e clonados em vetores de expresso para posterior estu-
do nos sistemas de utilizao da biomassa de diferentes resduos da agroin-
dstria na produo de etanol.
Figura 4.10 Bactrias de consrcio degradador de biomassa cultivadas por cinco dias em
meio de cultivo BHB contendo amido (A) ou carboximetilcelulose (B) coradas com iodo
(A) ou vermelho congo (B). O halo claro ao redor do consrcio revela a degradao dos dois
polissacardeos por esses microrganismos.
Atravs da abordagem metagenmica, pode-se vencer um grande de-
safio na sntese de biomolculas por processos fermentativos, particu-
larmente de biocombustveis. Alm da possibilidade de seleo de genes
codificadores de enzimas direcionadas diretamente com a desconstruo
da biomassa e disponibilizao dos acares usados nos processos fermen-
tativos, outros aspectos podem ser desenvolvidos. Por essa tcnica, pode-se
obter, por exemplo, microrganismos transgnicos resistentes s condies
adversas que possam ocorrer durante o processo de produo de etanol a
partir da biomassa (baixo pH, alta concentrao alcolica). Por outro lado,
a biologia sinttica, a partir de genes isolados do ambiente, poder criar
tambm microrganismos geneticamente modificados com capacidade de
sntese de hidrocarbonetos mais pesados, que tenham uma maior eficincia
energtica e que se separem mais facilmente da gua.
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METAGENOMA E A DESCONSTRUO DA BIOMASSA 107
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5
Modificaes genticas em plantas de
cana-de-acar visando aumento
de produtividade e a utilizao de genes de
Bacillus thuringiensis para o controle
biolgico de insetos praga
Manoel Victor Franco Lemos,
Janete Apparecida Desidrio
Introduo
Os avanos da pesquisa e da tecnologia associados ao adequado em-
prego das metodologias moleculares dever, em breve, resultar numa for-
te acelerao do ritmo de obteno de espcies de plantas, de animais ou
mesmo de microrganismos com modificaes genticas (OGMs), que os
tornaro melhor adaptados s necessidades do homem moderno, podendo
contribuir de uma maneira mais intensa na produtividade de insumos im-
portantes na atualidade e ao mesmo tempo causando menos danos ao meio
ambiente (Shimoda, 1998).
Curiosamente, em um estudo relatado por Cohen (2005), as naes que
se encontram agora em desenvolvimento tendem a intensificar a busca por
formas alternativas e mais rpidas de alcanar nveis de produtividade de
suas commodities, justamente utilizando os OGMs. No caso de plantas
de cana-de-acar (Saccharum officinarum L.), tais esforos se iniciaram,
provavelmente, com a mera construo e expresso de um transgene rela-
cionado com um fentipo relativo a cor. Realizou-se a clonagem e a expres-
so do gene codificador de uma protena especial denominada protena ver-
de fluorescente (GFP), tpica de organismos que vivem em profundidades
abissais e que, portanto, no pode ser considerado um fentipo observvel
em plantas comuns de cana-de-acar (Elliot et al., 1998). Com essa opo,
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114 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
os autores pretenderam apenas abrir caminho, indicando que tanto a cana-
de-acar como outras plantas j exploradas nesse contexto, como a Arabi-
dopsis thaliana (Haseloff et al., 1997) se apresentam como geneticamente
passveis a tais tipos de interferncias em seu genoma.
Houve tambm um relato da tentativa de melhoria de expresso do gene
de sntese de octopina (ocs) com um gene denominado act1 de arroz, sobre a
expresso do gene gusA em clulas eletrotransformadas de S. officinarum L.
(Gonzles-Cabrera et al., 1998). No incio de 2002, Husler e colaborado-
res, em uma reviso, descreveram uma situao ainda mais intrigante que
foi justamente a modificao gentica de plantas C
3
, como arroz, trigo, soja
e batata com material gentico de plantas C
4
, cuja eficincia fotossinttica
reconhecidamente maior, visando melhorar a taxa de fotossntese das pri-
meiras. Nessa publicao os autores mencionam que a sobre-expresso de
algumas das enzimas comuns aos dois tipos de metabolismo (plantas C
3
e
plantas C
4
) e/ou estruturas celulares relacionadas com a fotossntese nem
sempre resultaram em ganhos de acmulo de carboidratos.
Abordagens iniciais visando modificaes genticas
utilizando ferramentas moleculares
Seguindo nesta linha de tentativas de modificaes genticas visando o
aumento da deposio de sacarose em plantas superiores, Roitsch e cola-
boradores (2003) descreveram vrios experimentos realizados por diferen-
tes autores, nos quais a enzima invertase extracelular foi citada como pea
fundamental nos processos que ocorrem no aparelho apoplstico do floema
durante o transporte de sacarose liberada neste local, interferindo, assim,
na efetiva mobilizao desse carboidrato. Tais autores fazem tambm uma
relao entre a ao de enzimas tais como a invertase extracelular e os meca-
nismos de defesa de plantas sadias contra agentes biticos, descritos como
atuantes em tais plantas, as chamadas protenas PR ou protenas de defesa
(Ruffner; Geissmann; Rast, 1992).
Somente quase no final da primeira dcada do sculo XXI, McCormi-
ck e colaboradores (2008) descreveram alteraes nas taxas de fotossntese
realizada nas folhas com a expresso de alguns genes de cana-de-acar. Os
autores compararam os nveis de expresso gnica por meio de anlises de
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MODIFICAES GENTICAS EM PLANTAS DE CANA-DE-ACAR 115
microarranjos de DNA obtidos de plantas mantidas em ciclos de ilumina-
o/obscuridade e com material colhido de plantas transferidas para a obs-
curidade aps um perodo de crescimento inicial. Entre os genes envolvidos
nessas anlises, pode-se citar os associados com enzimas relacionadas com a
fotossntese (plantas C
4
), os ligados ao metabolismo mitocondrial e aqueles
envolvidos com o transporte de carboidratos (hexoses). Em particular, h
ainda meno de alterao de atividade das enzimas Rubisco (EC 4.1.139)
e hexoquinase (EC 2.7.1.1).
Posteriormente, em outro trabalho do mesmo grupo (McCormick; Watt;
Cramer, 2009), em que hbridos interespecficos entre Saccharum officina-
rum L. e Saccharum spontaneum L. foram analisados em relao ao acmulo
de acares nobres no colmo, ficou clara a relao direta entre capacidade
de sntese e estocagem de hexoses com a eficincia de produo desse tipo
de carboidratos. Em outras palavras, os autores indicaram que parece exis-
tir um controle fisiolgico do tipo feedback entre as taxas de assimilao/
produo de sacarose medida que mais genes da espcie mais eficiente (S.
officinarum L.) so comparados com essa mesma medida a partir da espcie
menos eficiente (S. spontaneum L.) no tocante ao transporte de sacarose.
Numa reviso mais recente, van Heerden e colaboradores (2010) des-
crevem os fatores subjacentes ao crescimento reduzido de plantas de cana-
de-acar, o que, sem dvida nenhuma, caracteriza-se como uma situao
desfavorvel, uma vez que determina menos acmulo de biomassa e, conse-
quentemente, baixa produtividade. Segundo os autores, nem sempre h uma
relao direta entre a incidncia de radiao solar (plantio de vero) e acmulo
de biomassa, podendo haver desvios de at 21% da produtividade esperada.
Esta perturbao foi referida como sendo o fenmeno do crescimento re-
duzido (FCR) e parece estar relacionada com o timing prprio das plantas de
cana-de-acar entre o perodo de plantio e o da colheita. Nesse perodo, em
que a intensa oferta de energia solar deveria propiciar correspondentes recor-
des de acmulo de biomassa, isso no acontece devido a um descompasso en-
tre a capacidade de gerao dos acares nas folhas (fotossntese) e seu trans-
porte para outras regies da planta, como colmo e mesmo razes, fazendo que
o crescimento e o acmulo final de biomassa seja menor do que o esperado.
Essas situaes j descritas indicaram a necessidade de buscar alterna-
tivas determinadoras de modificaes genticas que possam alterar esse
quadro, procurando um ponto de equilbrio entre a produo e o trans-
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116 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
porte de carboidratos de modo que haja energia disponvel para propiciar
o melhor crescimento possvel das plantas e, depois disso, que haja ainda
bastante potencial para acmulo de biomassa, disponvel para ser proces-
sada posteriormente.
Melhorias genticas na utilizao da
biomassa acumulada
Sem dvida, aumentar a capacidade de transformao da biomassa acu-
mulada em plantas de cana-de-acar durante seu ciclo produtivo em eta-
nol ou sacarose tem sido descrito na literatura como o desafio dos novos
proprietrios de usinas transformadoras da biomassa. Na atualidade, mui-
tos autores tm se preocupado em encontrar alternativas metablicas para
desencadear tais transformaes. O caminho mais seguro para se atingir
esses objetivos tem sido a busca de enzimas que possam catalisar as trans-
formaes de maneira a aumentar o ndice de utilizao da biomassa pro-
duzida em campo por plantas de cana-de-acar. Assim que Harrison e
colaboradores (2011) indicaram como uma dos mais importantes objetivos
nessa linha de ao (aumentar a eficincia de produo de etanol) melhorar
a relao custo/beneficio da degradao da grande quantidade de lignoce-
lulose produzida e armazenada nos colmos de plantas de cana-de-acar.
Existem sistemas de consrcios bacterianos e/ou fngicos j descritos
(Wongwilaiwalin et al., 2010) como produtores das enzimas celulolticas
capazes de promover a transformao da lignocelulose a outros substratos
que posteriormente so transformados em etanol ou em sacarose, porm o
rendimento ainda bastante desfavorvel em termos de produtividade.
Na descrio dos resultados obtidos por Harrison e colaboradores (2011)
houve o detalhamento da construo de plantas transgnicas de cana-de-
-acar portando trs genes com possibilidades celulolticas de duas diferen-
tes fontes (duas celolohidrolases I e II obtidas de fungos e uma endogluca-
nase bacteriana) acumulando tais enzimas em suas folhas. Esses resultados
recentes se caracterizam como um dos primeiros passos no sentido de melho-
rar o ndice de transformao da biomassa acumulada por plantas de cana-
-de-acar, vindo a possibilitar a transformao do bagao de cana, gerado
nas usinas, em etanol e/ou sacarose conforme a necessidade de mercado.
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MODIFICAES GENTICAS EM PLANTAS DE CANA-DE-ACAR 117
Tambm Siqueira e colaboradores (2011) teceram comentrios sobre o
mesmo assunto e acrescentaram que as clulas vegetais cobertas por pare-
des de celulose, e por isso recalcitrantes ao ataque das enzimas celulolticas,
precisam ser atingidas por substncias que as tornem permeveis. No caso
desse trabalho, o objetivo foi atingido com tratamento com uma mistura de
cido actico e cido clordrico, permitindo a degradao com um coquetel
de enzimas celulolticas. Houve um aumento considervel na converso da
celulose em outros carboidratos.
Glassop e colaboradores (2007) em uma avaliao metablica em plantas
de cana-de-acar constataram que ao mesmo tempo em que h acmulo de
sacarose nos colmos, ocorre o aumento do espaamento dos interns e que
no material colhido dessas plantas foram identificados por cromatografia
gasosa e espectrometria de massa, um contedo maior de metablitos do
ciclo do cido tricarboxilico e aminocidos, justamente nas regies meriste-
mticas, onde o crescimento celular mais intenso. Alm disso, os autores
detectaram que, concomitante, ao aumento da deposio de sacarose houve
tambm acmulo de trealose e rafinose. Nessa mesma linha de investigao,
Waclawovsky e colaboradeos (2010), em um trabalho de reviso reforam
a indicao da necessidade de melhorias nos mecanismos de degradao de
componentes das paredes celulares das clulas de plantas de cana-de-a-
car, como a lignocelulose, de modo a aumentar o rendimento bioenergtico
da transformao dos materiais biolgicos de plantas de cana-de-acar em
etanol ou sacarose.
Em concluses sobre a anlise de transcriptoma realizada por Manners
e Casu (2011), h indicaes que apontam que, devido a alta complexidade
do genoma de plantas de cana-de-acar, no se pode delinear um conjun-
to de genes considerados os mais importantes no tocante deposio de
carboidratos, assim como fica difcil definir quais as condies mnimas a
serem atingidas em termos de programas de melhoramento gentico para se
atingir essas metas. Por isso propem que ser necessrio num futuro no
muito distante que esforos sejam criados para se proceder ao sequencia-
mento completo do genoma e a correspondente anotao gnica de algumas
espcies do gnero Saccharum. Mencionam tambm a necessidade de se
conhecer o padro de controle metablico exercido em plantas de cana-de-
acar pelo mecanismo dos microRNAs em que genes podem ser silencia-
dos em situaes particulares.
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118 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Biocontrole de pragas da cana-de-acar
A utilizao da bactria gram-positiva, aerbica e formadora de esporos
denominada Bacillus thuringiensis como alternativa ou mesmo suplemento ao
controle qumico de pragas de lavouras tem se intensificado nessas duas lti-
mas dcadas e, exatamente dentro desse cenrio, primeiras experincias rela-
tivas construo de plantas transgnicas de cana-de-acar foram iniciadas.
Downing e colaboradores (2000) relataram uma dessas abordagens ao
avaliar o nvel de controle da praga sul-africana Eldana saccharina utilizan-
do o gene cry1Ac7 em associao com o gene codificador da quitinase (chiA)
isolado da bactria Serratia marcescens. Em seus experimentos, houve a
clonagem do gene cry mencionado em vetores apropriados sob o controle
de promotores adequados, oes autores procuraram a introduo de tal gene
para uma bactria tida como endoftica de plantas de cana-de-acar deno-
minada Herbaspirillum seropedica. Em tais condies, relataram um sucesso
com bons nveis de controle de larvas da praga E. saccharina. No entanto,
descreveram tambm que, quando o mesmo gene foi clonado e transferido
para clulas de Pseudomonas fluorescens 14::tox, houve melhor ao de con-
trole quando o gene chiA de S. marcescens foi associado aos bioensaios reali-
zados. Nesse ltimo caso, h menor necessidade de protena Cry para atin-
gir os nveis referidos de controle das larvas da praga mencionada devido a
cooperao entre as molculas de protenas Cry e as da enzima quitinase.
Em trabalho posterior Rosas-Garcia e colaboradores (2004), em um ava-
liao levada a efeito no Mxico, determinaram que em vrios isolados da
bactria B. thuringiensis foi possvel efetivamente controlar larvas da broca
da denominada Diatraea saccharalis e, inclusive, conseguiram, por meio de
uma abordagem utilizando anticorpos policlonais, determinar quais isola-
dos, dentre os analisados, mostraram significativo nvel de controle e eram
ao mesmo tempo produtores de protenas Cry1A, dado que reagiram com
amostras do anticorpo anti-Cry1A produzido por eles. A definio de quais
isolados efetivamente foram selecionados como efetivos foi baseada nos va-
lores de LC
50
obtidos por eles.
Nesse mesmo formato de controle, Rosas-Garcia (2006) relatou a utili-
zao de uma formulao obtida por suspenses de esporo/cristal processa-
das pela metodologia spray-dried que determinou um controle de aproxima-
damente 100% das larvas em bioensaios realizados no laboratrio. Quando
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MODIFICAES GENTICAS EM PLANTAS DE CANA-DE-ACAR 119
os ensaios foram realizados em campo, o nvel de controle caiu para cerca
de 84%. Em abordagem semelhante, um grupo de autores brasileiros relata-
ram experimentos em que isolados de B. thuringiensis tambm puderam ser
caracterizados como efetivos contra larvas de D. saccharalis. Em especial,
um isolado denominado S76 se destacou por exercer um nvel de controle
onze vezes maior do que a linhagem padro de B. thuringiensis denominada
HD-1. Esses autores descreveram esse isolado como um promissor agente a
ser utilizado no controle dessa praga que, segundo eles mesmos vem deter-
minando enormes prejuzos na produtividade de plantas de cana-de-acar
(Gitahy et al., 2007).
Mais recentemente, Silva Ccero e colaboradores (2009) descreveram a
caracterizao inicial de isolados da bactria B. thuringiensis, no controle de
uma das pragas da ordem Coleoptera, que tem sido descrita como bastan-
te devastadora na produo de subprodutos de plantas de cana-de-acar.
Trata-se da espcie Sphenophorus levis conhecida como o bicudo da cana.
Nesse estudo, os autores descreveram a caracterizao de vrios isolados,
utilizando ferramentas moleculares, para avaliao da ao de protenas
Cry produzidas por genes cry3 e cry35. Foram avaliados cerca de 1.163 iso-
lados e foi possvel detectar um grupo de cinco isolados que, ao serem utili-
zados em bioensaios realizados em laboratrio, determinaram um nvel de
mortalidade de cerca de 70%.
Herana da resistncia protenas Cry de B. thuringiensis
Antes de considerar fatos relativos herana da resistncia s aes de
controle biolgico de pragas, promovidas pelas protenas Cry, faz-se neces-
srio situar o leitor no tpico relativo resistncia das pragas agrcolas em
si, que surgiu com o uso intenso dos defensivos agrcolas ou inseticidas qu-
micos. Este um tpico de grande impacto na discusso relativa produti-
vidade agrcola no s do Brasil, mas de todo o mundo (Hall; Menn, 1999).
Como uma alternativa ao problema do relato de um nmero cada vez
maior de pragas resistentes, os biopesticidas, mais seguros do ponto de vista
ambiental, foram lanados no mercado mundial e, desde ento, tem recebido
muita ateno quer por serem realmente uma alternativa, quer por represen-
tarem uma forma de diminuio da presso sobre a seleo pragas cada vez
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120 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
mais resistentes aos defensivos qumicos. Entre os biopesticidas utilizados
para o controle de pragas, como j mencionado no inicio deste captulo, des-
taca-se a bactria B. thuringiensis (Crickmore et al., 1998; Babu et al., 2003).
Pode-se dizer que a principal dificuldade em se obter plantas de cana-
de-acar geneticamente modificadas e expressando nveis satisfatrios de
protenas Cry de modo a efetivamente desencadear um processo de contro-
le biolgico de diferentes pragas, deve-se ao fato de, nas vrias tentativas
de obteno desse tipo de plantas de cana-de-acar resistentes aos insetos
praga, no ter havido adequado processo de clonagem desses genes e, com
isso, houve sempre baixos nveis de expresso dos genes cry que foram uti-
lizados nesse processos de transformao. Em outras plantas, como o algo-
do, o arroz, a batata, o milho etc., h relatos de sucesso nessa mesma forma
de abordagem gentica (James, 1999; Tu et al., 2000; Bohorova et al., 2003).
Wenge colaboradores (2006) destacam em seu relato acerca de resis-
tncia de plantas de cana-de-acar broca da cana. Em seus experimen-
tos, quando os nveis de produo da protena Cry1Ac produzida a partir
de plantas de cana-de-acar transgnicas portadoras de um gene cry1Ac
sinttico e, portanto, satisfazendo as exigncias relativas preferncia de
cdons tpicas de plantas de cana-de-acar, observaram dois tipos de
comportamentos que so descritos a seguir. Quando ocorreu nveis baixos
de expresso desse gene sinttico, digamos devido a expresso inadequada
do gene sinttico, houve um rpido surgimento de populaes de D. sac-
charalis resistentes e com elevada taxa de sobrevivncia nos bioensaios.
Entretanto, quando as montagens obtidas produziam nveis adequados da
protena Cry1Ac no foram observadas larvas da broca da cana resistentes
nos ensaios realizados indicando, com isso, que ocorre a seleo de insetos
resistentes quando as condies de seleo no so adequadas.
Em dois relatos apresentados na literatura internacional (Wu et al.,
2009a e WU et al., 2009b) h relativamente pouco tempo atrs, h a meno
da utilizao da protena Cry1Ab frente a ensaios de resistncia por parte de
larvas de D. saccharalis, em que se menciona que a piramidizao, ou seja
o uso de mais de um tipo de genes cry, em plantas transgnicas, em geral,
tende a retardar o surgimento de populaes de insetos praga resistentes.
Na outra publicao, os autores descreveram que foram realizados cru-
zamentos entre cultivares de cana-de-acar, transgnicos ou no, envol-
vendo cruzamentos diretos e reversos bem com retrocruzamentos com ge-
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MODIFICAES GENTICAS EM PLANTAS DE CANA-DE-ACAR 121
nitores em que haviam genes de resistncia broca da cana ou no e com
esse tipo de abordagem foi possvel a eles detectar que a resistncia de larvas
de broca da cana parece ser governada por um ou poucos genes autossmi-
cos recessivos herdados num modelo mendeliano de herana.
Consideraes finais
Em um capitulo de livro editado por Tomes, Lekssmanan e Songstad so-
bre o tema biofuels, Matsuoka e colaboradores (2011) relataram a experin-
cia brasileira relativa indstria do etanol, em que os primeiros esforos
levados a cabo, com plantas de cana-de-acar transgnica, iniciaram-se
no final do sculo passado, totalizando nove experimentos buscando obter
plantas tolerantes a herbicidas (Falco et al. 2000). Esses mesmos autores
comentaram em seu texto que se espera, nos prximos anos, haver a efe-
tiva construo de um cultivar de cana-de-acar transgnico, que possa
ser comercializado ou mesmo ofertado aos produtores de acar e lcool
para combustvel, uma vez que j existem vrias iniciativas em andamen-
to, tanto em instituies financiadas por fundos governamentais como em
projetos da iniciativa privada.
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Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 124 07/12/2012 21:49:55
6
Eucalipto adensado:
manejo para florestas energticas
Saulo Philipe Sebastio Guerra,
Klber Pereira Lanas, der Aparecido Garcia,
Raffaele Spinelli
Introduo
Uma das fontes de energia renovvel mais conhecida e utilizada no
mundo, desde a antiguidade, a madeira biomassa de origem vegetal.
Essa fonte de energia foi largamente empregada, dada a facilidade de aces-
so, baixo custo de aquisio, no necessidade de beneficiamento pr-uso e a
no explorao de combustveis fsseis.
Com o surgimento dos derivados de petrleo e do carvo mineral, a pro-
cura pela madeira, como suprimento energtico, teve sua demanda reduzi-
da. Entretanto, em funo das questes ambientais, polticas e econmicas
atuais, alm de fenmenos climticos inesperados, fizeram com que o uso
da madeira voltasse ao cenrio mundial graas a sua potencialidade de pro-
duo energtica com reduzido impacto ambiental.
Diante desse novo paradigma, adicionado da crescente demanda ener-
gtica mundial, surge um conceito, que est em uma fase inicial de implan-
tao no mundo e, praticamente incipiente no Brasil, chamado de sistema
florestal de curta rotao para a produo de biomassa, de forma sustent-
vel, com fins energticos.
Dessa forma, sero apresentados, neste captulo, conceitos, sistemas de
produo e colheita mecanizada de usos nacional e internacional e, dados
tcnicos que possam fomentar o debate, o desenvolvimento e o aprimora-
mento da silvicultura para gerao de energia limpa.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 125 07/12/2012 21:49:55
126 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Sistema florestal de curta rotao
Em funo da crescente demanda energtica, surge no cenrio mundial e
nacional um novo conceito que o Sistema Florestal de Curta Rotao para
gerao de energia. Esse novo sistema de produo apresenta uma relao
direta na produo de matria-prima em quantidade e qualidade superior,
obtido num intervalo de tempo reduzido e a custos inferiores, quando com-
parados aos sistemas silviculturais convencionais.
O sistema florestal de curta rotao, no Brasil, deve ser, inicialmente,
particularizado ao plantio de eucalipto com o intuito de desenvolver um
crescimento natural da planta de forma mais eficiente, sendo que, a renova-
o do plantio e da matria-prima se tornaro fatores de produo com altas
produtividade por unidade de tempo.
Com isso, os fatores de inovao tecnolgica, pesquisa e desenvolvi-
mento so fundamentais para que os sistemas florestais de curta rotao
produzam energia abundante, renovvel e, ainda, que permitam o trans-
porte a longas distncias de forma sustentvel, econmica e socialmente.
Esse tema tem-se tornado alvo de interesse das principais agncias de
fomento e centros de pesquisa na Europa, Estados Unidos e Austrlia, tais
como: Cost (UTF-8) European Cooperation in Science and Techonology;
IEA International Energy Agency; NREL National Renewable Ener-
gy Laboratory (EUA); Federal Aebiom European Biomass Association
(Europe); Ademe Agence de lEnvironnement e de la Maitrise de lEnegie
(Frana); VTT Technical.
No Brasil, agncias de fomento como o CNPq Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico, Fapesp Fundao de Am-
paro Pesquisa do Estado de So Paulo, Finep Financiadora de Estudos
e Projetos e BNDES Banco Nacional do Desenvolvimento, tem pro-
gramas especficos para fomentar e fortalecer novas pesquisas, projetos,
equipamentos e sistemas de utilizao da biomassa como fonte de energia
renovvel.
Diante desse desafio, a pesquisa tem gerado inovaes na silvicultura,
nos sistemas de corte, no transporte e na triturao com solues, equi-
pamentos e sistemas para aumentar a eficincia da produo da matria
prima a madeira.
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EUCALIPTO ADENSADO 127
No Brasil, os mais recentes plantios baseados no sistema florestal de
curta rotao vm apresentando produtividades elevadas, atingindo nme-
ros da ordem de 120 m
3
/hectare (45 toneladas por hectare) em ciclos de
apenas um ano. Os pases lderes na utilizao dessa tecnologia, com mais
de 10 anos de desenvolvimento e aprimoramento, conseguem atingir os n-
dices de produtividade nacional, porm, no dobro de tempo.
Desta forma, para produzir mais madeira, com menos recursos e meno-
res perdas, diversas investigaes cientficas e prticas devem ser conduzi-
das para determinar a rotao da cultura ideal para cada local (12, 18, 20, 24
ou 36 meses), em funo do material gentico desenvolvido para ciclos de
curta rotao e com alta capacidade de rebrota.
Alm da silvicultura, sistemas mecanizados de colheita e transporte,
com colhedoras especficas para a funo, so fundamentais e determinan-
tes para garantir a viabilidade econmica dos novos sistemas florestais de
curta rotao.
Portanto, produzir uma matria prima de alta qualidade, buscando o
limite produtivo mximo das florestas, com retornos financeiros significa-
tivos para as empresas envolvidas no sistema, est diretamente relacionado
com novas tcnicas silviculturais e eficincia das mquinas no campo.
Energia originada de biomassa florestal
Desde a revoluo industrial, a necessidade incessante por fontes de
energia um tema de discusses por todo o mundo. Com o domnio da
tecnologia de se utilizar os combustveis fsseis como fonte de energia, a
capacidade produtiva mundial foi ampliada, gradativamente, at os dias
atuais. A grande dependncia de fontes energticas provenientes do petr-
leo considerada, em vrios pases, um dos maiores problemas, sendo que
muitos deles no tm disponibilidade ou capacidade de explorao do com-
bustvel fssil.
A dcada de 1970 ficou marcada pela primeira crise do petrleo e, para
Smith (1989), o consequente aumento do custo desse produto influenciou o
setor florestal, visto que, acelerou a necessidade de substituio do petrleo
por fontes alternativas de energia. Assim, os plantios florestais, com fina-
lidade energtica, tornaram-se uma fonte alternativa para a substituio do
petrleo e seus derivados.
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128 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Em termos de gerao de energia, a Grfico 6.1 apresenta o volume de
madeira consumido no Brasil, sendo da ordem de 100 milhes de metros c-
bicos anuais a madeira destinada para fins energticos no pas (MME, 2007).
A energia consumida no Brasil, originada de biomassa, principalmen-
te, direcionada ao setor de transformao, atravs da produo de carvo
vegetal para abastecer as siderrgicas, sendo o Brasil um dos maiores pro-
dutores e consumidores de carvo vegetal do mundo. Em 2005, a produo
nacional desse produto foi de 5,5 milhes de toneladas e, desse total, 2,5
milhes de toneladas (46%) foram oriundos de florestas plantadas, sendo
Minas Gerais o principal estado produtor, com 1,74 milhes de toneladas
(IBGE, 2007) e, nesse mesmo ano, foram consumidos 38,05 milhes de
metros cbicos de carvo vegetal. Segundo MME (2007), o setor de trans-
formao seguido pelos setores residencial, industrial, agropecurio e ou-
tros usos (Grfico 6.2).
Grfico 6.1 Madeira consumida no Brasil (Brito, 2007).
Grfico 6.2 Utilizao energtica da madeira no Brasil (MME, 2007)
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EUCALIPTO ADENSADO 129
Para Brito (2007), a experincia da siderurgia brasileira em carvo vege-
tal serve de exemplo para que, se as formas renovveis de energia, em larga
escala, se tornarem viveis, evoluiro de uma situao tecnolgica primitiva
e rudimentar - baseada na simples destruio das florestas para a incorpo-
rao de tecnologias florestais mais avanadas, de forma a assegurar maior
eficincia e tornarem-se ecolgica e economicamente compatveis.
O eucalipto
De origem australiana, o gnero Eucalyptus composto por, aproxi-
madamente, 600 espcies, onde cerca de 100 delas so utilizadas para fins
comerciais no mundo. A capacidade de adaptao s diversas condies e o
rpido crescimento, faz com que esse gnero seja uma das principais esp-
cies utilizada para os mais diversos fins.
O gnero Eucalyptus foi introduzido no Brasil no sculo XIX, mas os pri-
meiros registros de plantaes comerciais e pesquisas so datados de 1904,
no estado de So Paulo, onde se procurava uma soluo para a produo de
dormentes para ferrovias. Aps esse perodo, foi notada a boa adaptao da
espcie s condies do pas e, de acordo com Chandler & Henson (1998),
na dcada de 1940, foram estabelecidas plantaes em regies de minerao
de ferro, para a produo de carvo vegetal, como uma alternativa energ-
tica para substituir o coque no processo de produo do minrio de ferro na
siderurgia.
De 1910 a 1966 o Brasil tinha, aproximadamente, 470 mil hectares de
plantaes florestais. A partir dessa data, o governo brasileiro criou uma lei
de incentivos fiscais para plantaes florestais e, com isso, a rea de reflo-
restamento chegou a quase 6 milhes de hectares em 1987, com pequena
reduo na dcada de 90.
Atualmente, no Brasil, segundo a ABRAF (2011), a rea ocupada por
plantios de Eucalyptus e Pinus, totalizou 6,5 milhes de hectares, sendo 73%
correspondente rea de plantios de Eucalyptus e 27% a plantios de Pinus.
No mundo, a rea plantada de Eucalyptus estimada entre 16 e 19 milhes
de hectares, tendo como principais objetivos a produo de celulose e papel,
a fabricao de painis de fibras e partculas, carvo vegetal, madeira rolia
para a utilizao na construo civil e em aplicaes diversas na rea rural.
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130 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
A grande demanda por madeira, nos ltimos anos, fez com que muitos
agricultores investissem nesse tipo de cultura, atrados pelo alto valor da
madeira e, tambm, pelo seu uso mltiplo. Esse gnero tambm se mostra
interessante pela alta produtividade em curtos ciclos, quando comparado a
outras culturas florestais.
Figura 6.1 Colheita de uma plantao de Eucalyptus com manejo tradicional.
O aumento de incremento na produtividade de plantios de eucalipto,
nas ltimas dcadas, deve-se s pesquisas realizadas em relao ao melho-
ramento gentico e s prticas silviculturais, tais como adubao, irrigao,
tratos culturais, controle de pragas e doenas e espaamento de plantio.
Florestas energticas
As plantaes, com finalidades energticas, so sistemas que visam uma
maior produo de biomassa por unidade de rea e num menor espao de
tempo. Assim, aliado ao conceito de plantaes energticas, surgiu o con-
ceito de plantios de curta rotao (Mller, 2005).
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 130 07/12/2012 21:49:55
EUCALIPTO ADENSADO 131
O termo florestas energticas apareceu na dcada de 1980 com Maga-
lhes (1982) e foi utilizado para definir as plantaes com grande nmero
de rvores por hectare e, consequentemente, com ciclo curto, que tambm
tinham como finalidade a produo do maior volume de biomassa por rea
em menor espao de tempo. No entanto, essas experincias no apresenta-
ram os resultados esperados, em funo do pouco conhecimento tcnico, da
qualidade do material gentico e do baixo desenvolvimento, no Brasil, da
silvicultura naquela poca. Esse perodo foi marcado, essencialmente, por
uma maioria de plantios com baixa produtividade e grande mortalidade,
alm dos impactos sobre a fertilidade e a umidade do solo (Mller, 2005).
Ainda, de acordo com os autores, o desenvolvimento da silvicultura de
eucalipto, como fonte de insumo energtico, foi fundamentado na produ-
o de carvo vegetal para abastecer a indstria siderrgica.
Para Macedo (2003), as altas produtividades obtidas em plantaes flo-
restais, particularmente do gnero Eucalyptus, tornaram menores os custos
de gerao da eletricidade com madeira de reflorestamento, deixando o in-
vestimento mais atrativo.
As caractersticas principais desejveis em uma floresta energtica so a
alta produo de biomassa e ciclos de rotao curtos. Para o aproveitamen-
to total da rea, a tendncia de se reduzir o espaamento de plantio uma
tcnica que est sendo muito estudada e tem demonstrado bons resultados.
Os espaamentos comerciais, mais utilizados no Brasil, para o gne-
ro Eucalyptus so de 3 x 3 m e 3 x 2 m, com densidades populacionais de,
aproximadamente, 1100 e 1700 plantas por hectare, respectivamente. Tc-
nicas de reduo para 3 x 1 m e 3 x 0,5 m, com densidade populacionais de,
aproximadamente, 3300 e 6700 plantas por hectares, respectivamente,
O ciclo da cultura do eucalipto, comumente adotado no pas, est entre
5 e 7 anos, o que pode ser reduzido para 1 a 2 anos com o uso das tcnicas
de plantio adensado.
A utilizao de plantios com espaamento reduzido deve-se muito s
tcnicas de clonagem e melhoramento gentico. Um fator importante para
que o plantio de eucalipto adensado seja bem sucedido a uniformidade das
plantas, normalmente obtido a partir de clones. Para que ocorra o desenvol-
vimento homogneo das plantas, baixa mortalidade e alto incremento de
massa so necessrios alm da escolha adequada das mudas (oriundas de vi-
veiros que apresentem programas de melhoramento gentico e matrizes de
alta produtividade), sistemas mecanizados de plantio e tratos silviculturais.
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132 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Projeto florestas energticas em Botucatu
Em dezembro de 2008, foram plantadas as mudas de clones do hbrido
de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla em uma rea experimental lo-
calizada numa altitude aproximada de 875 m e situa-se entre as longitudes
482443 W e 482621 W e entre as latitudes 225810 S e 225925 S.
O clima predominante no municpio de Botucatu, estado de So Paulo,
segundo os critrios adotados por Koppen Cfa, o clima mesotrmico,
com temperaturas mdias superiores a 10C, cuja temperatura do ms mais
quente igual ou superior a 22C e o ndice pluviomtrico anual est em
torno de 1516 mm.
O sistema florestal de curta rotao recebeu as adubaes de plantio e de
cobertura. A aplicao inicial consistiu em NPK (6-30-6), no plantio, nas
doses de (1) 70, (2) 140 e (3) 280 g/planta; na cobertura, a adubao foi feita
com NPK (20-0-20) adicionados os micronutrientes Zn (0,5%) e B (0,3%),
aos 60, 140 e 360 dias de idade. Aos 60 dias as doses foram de (1) 25, (2) 50
e (3) 100 g/planta; aos 140 dias, (1) 35, (2) 70 e (3) 140 g/planta; aos 360
dias, (1) 50, (2) 100 e (3) 200 g/planta. Os cinco espaamentos entre plantas
ficaram nos valores de 0,5 m; 1,0 m; 1,5 m; 2,0 m; 2,5 m e a distncia entre
as linhas de plantio fixadas em 2,80 m para todos os tratamentos.
No experimento conduzido por Garcia e colaboradores (2009), compa-
rando diferentes espaamentos de plantio com Eucalyptus urograndis, foram
observadas diferenas no desenvolvimento do dimetro do colo das plantas.
O espaamento de 2,8 x 0,5m apresentou menores valores de dimetro do
colo em relao aos espaamentos 2,8 x 1,5m e 2,8 x 2,5m. No Grfico 6.3,
podem ser observadas as mdias dos dimetros do colo das plantas aos 90
dias aps o plantio.
Com a altura total das plantas, pode ser observada uma tendncia de
reduo dos valores mdios com o aumento do espaamento (Grfico 6.4).
Embora o espaamento de 2,8 x 0,5 m tenha culminado no maior valor m-
dio na altura total, no houve diferenas estatsticas entre os tratamentos
aos 90 dias aps o plantio, com base no intervalo de confiana ao nvel 95%.
A princpio foram feitas medies de dimetro, altura e estimativa do
volume atravs da utilizao de um fator de forma. Para as colheitas reali-
zadas aos 18 e 24 meses, perodo em que a floresta estava completamente
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EUCALIPTO ADENSADO 133
estabelecida (Figura 6.2), foi adotado o mtodo da cubagem rigorosa para
a obteno do volume com casca, porcentagem de casca e coleta de dis-
cos para a determinao da densidade bsica mdia das rvores (Soares et
al., 2006).
O princpio de coleta de rvores-amostra considera a escolha de quatro
rvores-modelo em cada parcela, o que significou colher rvores com DAP
prximo ao dimetro mdio ou quadrtico da populao, conforme explica
Soares e colaboradores (2006). A metade das amostras coletadas na regio
do DAP foi moda para determinao do poder calorfico superior e de al-
gumas caractersticas qumicas da madeira.
Grfico 6.3 Dimetros do colo, em mm, das mudas de Eucalyptus urograndis nos trs espa-
amentos aos 90 dias aps o plantio. As colunas indicam a mdia das repeties, enquanto
as barras verticais apresentam o Intervalo de Confiana o nvel de 95% (Garcia et al., 2009).
Grfico 6.4 Altura total, em cm, das mudas de Eucalyptus urograndis nos trs espaamen-
tos 90 dias aps o plantio. As colunas indicam a mdia das repeties, enquanto as barras
verticais apresentam o Intervalo de Confiana ao nvel de 95% (Garcia et al., 2009).
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 133 07/12/2012 21:49:56
134 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Figura 6.2 Plantio do clone de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla no espaamento
de 2,8 x 0,5 m.
Os discos foram coletados em porcentagem da altura total (Figura 6.3) e
a biomassa de folhas e galhos no campo, separadamente (Figura 6.4), foram
determinados por meio de balana eletrnica com de preciso 0,1 kg.
Figura 6.3 Discos coletados em porcentagem da altura total para determinao de volume
de madeira com casca e densidade bsica mdia da rvore.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 134 07/12/2012 21:49:56
EUCALIPTO ADENSADO 135
Figura 6.4 Processamento para a pesagem da biomassa mida de galhos e folhas no campo.
O clculo de volume com casca foi realizado de acordo com as seguintes
frmulas:
( )
AS AS
Vi * L
Vt Vi
1 2
2
+
=


=

Onde:
Vi: volume da seo (m)
AS: rea seccional (m)
L: comprimento da seo (m)
VT: volume total (m)
O clculo da densidade bsica mdia foi obtido da seguinte maneira:
( ) ( ) DB % DB * V DB % DB * V
DBM VT
0 1,3 1 75 100 5
/
2 2
+ +
= ++


Onde:
DBM: densidade bsica mdia (kg.m
-3
)
DBn: densidade bsica no disco na posio n, em porcentagem da altura
total (kg.m
-3
)
Vn: volume da seo n (m)
VT: volume total da rvore (m)
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136 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
A densidade bsica mdia das rvores de fundamental importncia
para o clculo da biomassa seca de madeira com casca. Nota-se na Tabela
6.1 que, nos resultados obtidos no experimento, a biomassa seca de madeira
com casca foi afetada pelo fatorial triplo adubao x espaamento x idade de
colheita (18 e 24 meses).
Tabela 6.1 Anlise de varincia para a biomassa seca de madeira com casca, em t.ha
-1
Fator de Variao G.L. S.Q. Q.M. F p-valor
Idade de Colheita (I) 1 1204,99 1205,0 39,57 0,00
Espaamento (E) 4 10755,76 2688,9 88,31 0,00
Nvel de Adubao (A) 2 3409,13 1704,6 55,98 0,00
I x E 4 1027,72 256,9 8,44 0,00
I x A 2 342,17 171,1 5,62 0,01
E x A 8 4508,34 563,5 18,51 0,00
I x E x A 8 997,60 124,7 4,10 0,00
Resduo 90 2740,38 30,4
Os dados foram submetidos a testes de mdias que resultou na Tabela
6.2, que apresenta os resultados de produtividade em toneladas por hectare.
O melhor resultado foi de 100,8 t.ha
-1
, obtido no tratamento 2,8 x 0,5 m, no
nvel 3 de adubao, colhido aos 24 meses aps o plantio.
A determinao do poder calorfico superior foi realizada pelo mtodo
da bomba calorimtrica que, basicamente, consiste em medir a variao da
temperatura da gua pela energia emitida na forma de calor pela queima
da madeira com casca. A qualidade de combustvel pode ser rotulada pelo
poder calorfico superior (PCS), que definido como sendo a quantidade
de energia liberada na forma de calor por unidade de massa de combustvel,
quando submetido combusto completa. Para a determinao do PCS foi
utilizado um calormetro e a metodologia adotada foi o Mtodo da Bomba
Calorimtrica. O mtodo consiste em queimar o combustvel, no caso a
madeira, em um sistema aproximadamente adiabtico, e medir a variao
de temperatura proporcionada pela queima da madeira numa certa quan-
tidade de gua com massa pr-estabelecida. A variao de temperatura re-
gistrada na gua por um termmetro de mercrio proporcional ao calor
liberado pelo combustvel.
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EUCALIPTO ADENSADO 137
Tabela 6.2 Biomassa de madeira com casca (BMC) em funo da idade de
colheita, do espaamento e do nvel de adubao
Idade (meses) Espaamento (m)
Nvel de
adubao
BMC
(t.ha
-1
)
18
2,8 x 0,5 1 40,8 c
2 51,2 c
3 66,7 b
2,8 x 1,0 1 41,0 c
2 47,1 c
3 47,6 c
2,8 x 1,5 1 38,0 d
3 41,4 c
2 42,7 c
2,8 x 2,0 1 30,1 h
2 34,8 e
3 34,9 e
2,8 x 2,5 1 22,6 h
2 29,7 h
3 32,8 f
24
2,8 x 0,5 1 46,3 c
2 55,4 b
3 100,8 a
2,8 x 1,0 2 38,1 d
1 39,5 d
3 47,3 c
2,8 x 1,5 2 44,3 c
1 45,9 c
3 48,5 c
2,8 x 2,0 1 35,6 e
3 40,3 d
2 46,3 c
2,8 x 2,5 1 31,7 g
2 35,6 e
3 41,2 c
Mdias seguidas de letras iguais no diferem entre si pelo teste Tukey (o = 0,05)
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138 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Os componentes de um calormetro so:
a) Bomba calorimtrica: recipiente de ao inox resistente onde efetua-
da a queima do combustvel.
b) Termmetro de mercrio: utilizado para determinar a temperatura
inicial e final.
c) Sistema de abastecimento de oxignio: necessrio inserir oxignio
na bomba calorimtrica para facilitar a combusto.
d) Recipiente ou vaso calorimtrico: recipiente com uma massa defini-
da de gua (2500 g), que ir trocar calor com a bomba calorimtrica.
e) Sistema de Ignio: um sistema que est ligado rede eltrica por
meio de duas aberturas existentes na bomba calorimtrica, no qual pas-
sa a corrente eltrica formando uma resistncia em um fio de nquel-
-cromo, transpassando a amostra de madeira, que entra em combusto.
O poder calorfico superior determinado pela seguinte equao:
PCS = [(K + M
H2O
) / (M
c
)] * (T
f
Ti)
Onde:
K = constante do calormetro determinada previamente, utilizando-se
o cido benzoico com PCS de 6318 cal.g
-1
; neste trabalho o valor de K foi
de 489.
M
H2O
= massa de gua pr-estabelecida em gramas (2500 g).
M
c
= massa seca da amostra de madeira.
T
i
= temperatura da gua antes da combusto.
T
f
= temperatura da gua obtida aps a combusto.
Seguindo o procedimento explicado por Vale e colaboradores (2000),
com os valores de poder calorfico (kcal.kg
-1
) da madeira com casca e a
produo de massa seca (kg) pode-se obter a produo de energia (kcal). A
energia produzida tambm pode ser expressa em termos de produtividade
energtica (Gcal.ha
-1
) e convertida para tep (tonelada equivalente de petr-
leo), como ser apresentado mais adiante.
A tonelada equivalente de petrleo o produto de um coeficiente re-
sultante da razo entre o poder calorfico superior da madeira e do petrleo
pela biomassa de madeira, em toneladas por hectare (Patusco, 1998).
Nota-se na Tabela 6.3 o desenvolvimento das rvores em dimetro e em
altura e que essas medidas, principalmente de dimetro, comeam a se di-
ferenciar na idade de 18 meses.
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EUCALIPTO ADENSADO 139
Tabela 6.3 Dimetro a altura do peito (DAP) e altura total em funo do espaamento e dos
nveis de adubao nas idades de 12 meses, 18 meses e 24 meses aps o plantio.
Nvel de
adubao
Espaamento
(m)
rvores/
ha
DAP (cm) ALTURA (m)
12 18 24 12 18 24
1
2,8 x 0,5 7143 5 6 (1) 6 (2) 7 11 (2) 10 (2)
2,8 x 1,0 3571 5 7 (1) 7 (1) 6 11 (2) 13 (2)
2,8 x 1,5 2381 5 8 (1) 9 (1) 7 11 (1) 13 (3)
2,8 x 2,0 1786 5 9 (1) 9 (1) 6 11 (1) 13 (2)
2,8 x 2,5 1429 5 9 (1) 10 (1) 6 10 (1) 13 (2)
2
2,8 x 0,5 7143 5 6 (2) 6 (2) 8 10 (2) 11 (3)
2,8 x 1,0 3571 6 7 (1) 8 (1) 8 12 (2) 13 (2)
2,8 x 1,5 2381 6 8 (1) 9 (1) 7 12 (1) 12 (1)
2,8 x 2,0 1786 7 9 (1) 10 (1) 8 11 (1) 14 (2)
2,8 x 2,5 1429 6 9 (1) 10 (1) 6 11 (1) 11 (1)
3
2,8 x 0,5 7143 5 6 (2) 7 (2) 8 11 (3) 12 (3)
2,8 x 1,0 3571 6 8 (1) 8 (1) 7 12 (2) 13 (2)
2,8 x 1,5 2381 6 8 (1) 9 (1) 7 11 (2) 13 (2)
2,8 x 2,0 1786 6 9 (1) 10 (1) 7 11 (1) 13 (2)
2,8 x 2,5 1429 6 10 (1) 11 (1) 7 12 (2) 13 (2)
Na Tabela 6.4, possvel observar o incremento em volume sendo que, na
idade de 12 meses, o volume com casca foi calculado pelo produto resultante
do volume cilndrico por um fator de forma, para as outras idades apresen-
tada a mdia de quatro rvores-amostra cubadas pelo mtodo de Smalian.
A densidade bsica mdia e o poder calorfico superior da madeira com
casca esto apresentados na Tabela 6.5, sendo dados obtidos nas colheitas
dos 18 e 24 meses aps o plantio. A densidade bsica mdia foi obtida pela
mdia ponderada das densidades obtidas em porcentagem de altura total
em que o peso para a mdia foi o volume das sees e o volume total. Na
literatura so encontrados valores de poder calorfico para a madeira se-
melhantes ou at inferiores aos obtidos no projeto, Lima e colaboradores
(2007) avaliaram o poder calorfico de amostras coletadas na regio do di-
metro a altura do peito (DAP) das rvores de Eucalyptus benthamii, aos seis
anos de idade; encontraram poder calorfico mdio de 4681487,6 kcal.kg
-1
.
Os valores de poder calorfico superior (PCS) de Eucalyptus grandis e Eu-
calyptus urophylla ficam entre 4501 e 4790 kcal.kg
-1
e 4422 e 4595 kcal.kg
-1

respectivamente, segundo Quirino e colaboradores (2005).
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140 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Tabela 6.4 Volume com casca, em m, em funo do espaamento, do nvel de adubao e das
idades de colheita, em meses.
Nvel de
adubao
Espaamento (m) rvores/ha
Volume com casca (m)
12 18 24
1
2,8 x 0,5 7143 0,0076 0,0134 (0,0014) 0,0155 (0,0023)
2,8 x 1,0 3571 0,0074 0,0246 (0,0009) 0,0250 (0,0053)
2,8 x 1,5 2381 0,0102 0,0319 (0,0025) 0,0422 (0,0050)
2,8 x 2,0 1786 0,0099 0,0348 (0,0003) 0,0427 (0,0049)
2,8 x 2,5 1429 0,0086 0,0323 (0,0013) 0,0476 (0,0044)
2
2,8 x 0,5 7143 0,0092 0,0166 (0,0021) 0,0200 (0,0023)
2,8 x 1,0 3571 0,0128 0,0286 (0,0039) 0,0242 (0,0024)
2,8 x 1,5 2381 0,0122 0,0368 (0,0026) 0,0392 (0,0072)
2,8 x 2,0 1786 0,0175 0,0396 (0,0053) 0,0563 (0,0080)
2,8 x 2,5 1429 0,0105 0,0417 (0,0038) 0,0523 (0,0033)
3
2,8 x 0,5 7143 0,0152 0,0213 (0,0026) 0,0336 (0,0025)
2,8 x 1,0 3571 0,0128 0,0287 (0,0028) 0,0321 (0,0012)
2,8 x 1,5 2381 0,0116 0,0370 (0,0056) 0,0464 (0,0035)
2,8 x 2,0 1786 0,0126 0,0406 (0,0043) 0,0508 (0,0057)
2,8 x 2,5 1429 0,0142 0,0457 (0,0031) 0,0625 (0,0047)
Tabela 6.5 Densidade bsica mdia e poder calorfico superior obtidos nas idades de 18 e 24
meses em funo do nvel de adubao e do espaamento
Nvel de
adubao
Espaamento (m)
DBM (kg.m
3
) PCS (kcal.kg
1
)
18 24 18 24
1
2,8 x 0,5 423 (53) 418 (14) 4735 (73) 4809 (49)
2,8 x 1,0 467 (10) 443 (10) 4784 (52) 4786 (27)
2,8 x 1,5 502 (30) 458 (11) 4784 (38) 4774 (110)
2,8 x 2,0 486 (4) 457 (9) 4822 (48) 4766 (66)
2,8 x 2,5 491 (8) 471 (5) 4863 (86) 4727 (47)
2
2,8 x 0,5 432 (17) 390 (51) 4753 (60) 4729 (97)
2,8 x 1,0 461 (20) 441 (13) 4824 (47) 4773 (80)
2,8 x 1,5 486 (9) 454 (7) 4825 (26) 4764 (71)
2,8 x 2,0 493 (13) 460 (10) 4808 (25) 4740 (23)
2,8 x 2,5 499 (21) 477 (11) 4897 (88) 4807 (53)
3
2,8 x 0,5 439 (5) 421 (3) 4742 (88) 4718 (81)
2,8 x 1,0 466 (8) 412 (12) 4775 (32) 4751 (109)
2,8 x 1,5 469 (9) 430 (57) 4718 (62) 4790 (69)
2,8 x 2,0 482 (19) 444 (10) 4804 (33) 4799 (74)
2,8 x 2,5 503 (4) 461 (12) 4781 (98) 4809 (44)
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EUCALIPTO ADENSADO 141
A energia da madeira pode ser expressa em toneladas equivalentes de
petrleo, o que d subsidio para interpretaes da rea econmica no que
diz respeito substituio do combustvel fssil pela biomassa florestal. Do
ponto de vista desta medida energtica o tratamento 2,8 x 0,5 m com maior
adubao gerou 88 tep.ha
-1
, em 24 meses, que foi significativamente maior
que os outros tratamentos (Tabela 6.6).
Tabela 6.6 Tonelada equivalente de petrleo (tep)
Espaamento (m) Nvel de adubao
tep.ha
-1
18 meses 24 meses
2,8 x 0,5
1 18 18
2 23 45
3 29 88
2,8 x 1,0
1 18 18
2 21 42
3 21 63
2,8 x 1,5
1 17 17
2 19 38
3 18 54
2,8 x 2,0
1 13 13
2 15 31
3 16 47
2,8 x 2,5
1 10 10
2 13 26
3 15 44
Outra abordagem importante para os projetos florestais de bioenergia a
avaliao econmica com uso de indicadores. Nesta pesquisa foi utilizado o
mtodo de avaliao econmica do grupo de mtodos nos quais se considera
a variao do capital no tempo (Silva et al., 2005). O VPL (valor presente l-
quido), o IBC (ndice benefcio/custo) e o CMP (custo mdio de produo,
considerando produo de briquetes) foram calculados, considerando o flu-
xo de caixa, os custos com insumos, tais como inseticida, herbicida, mudas,
adubo e produo de briquetes. No clculo das receitas foi considerado o
preo de venda do briquete de R$ 380 por tonelada, na qual est instalada a
rea experimental. Os resultados esto apresentados na Tabela 7.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 141 07/12/2012 21:49:57
142 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
O VPL a diferena do valor presente das receitas menos o valor pre-
sente dos custos. Os tratamentos que apresentaram o VPL maior do que
zero foram economicamente viveis, sendo considerado o mais vivel aque-
le que apresentou maior VPL. Foi considerada uma taxa de desconto (i) de
6 % ao ano.
VPL = ER(1 + i)
j
EC(1 + i)
j

Onde:
R = valor atual das receitas
C = valor atual dos custos
i = taxa de juros
j = perodo em que a receita ou o custo ocorrem
O ndice de relao benefcio custo foi obtido a partir da razo entre o
valor atual das receitas e o valor atual dos custos. O tratamento foi conside-
rado economicamente vivel se o IBC for maior que 1.
IBC = ER(1 + i)
j
/ EC(1 + i)
j
O custo mdio de produo consistiu em dividir o valor atual do cus-
to pela produo total equivalente. Para que o tratamento ou projeto seja
vivel, o valor do CMP deve estar abaixo do preo do briquete no mercado
(R$ 380 por tonelada).
CMP = ECT(1 + i)
j
/ EPT(1 + i)
j

Onde:
CT = custo total atualizado em cada perodo
PT = produo total equivalente em cada perodo que, neste trabalho,
foi considerada a produo de briquetes de madeira, 1,5 e 2,0 anos aps o
plantio. PT a quantidade produzida descontada pela taxa de juros.
Os espaamentos considerados adensados foram 2,8 x 0,5 m, 2,8 x 1,0 m
e 2,8 x 1,5 m, dentre os quais o maior VPL foi de R$ 2494.ha
-1
obtido no 2,8
x 1,5 m no nvel 1 de adubao e considerando ciclo de corte de 2 anos (Ta-
bela 6.7). O custo mdio de produo (CMP) deve ser menor que o preo de
venda praticado, que de R$ 380 por tonelada, o referido tratamento apre-
sentou CMP de R$ 213 por tonelada. Outros tratamentos mais adensados,
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 142 07/12/2012 21:49:57
EUCALIPTO ADENSADO 143
2,8 x 0,5 m e 2,8 x 1,0 m, podem ter seus custos amortizados por meio do
manejo de brotao, por exemplo, um ciclo de corte de 1,5 anos resultaria
em trs colheitas, sendo duas colheitas de biomassa resultante de brotao,
no perodo de 4,5 anos.
Tabela 6.7 Valor presente lquido, R$/ha (VPL), ndice de relao benefcio/custo (IBC) e custo
mdio de produo, R$/tonelada (CMP)
Espaamento (m)
Nvel de
Adubao
1,5 anos 2 anos
VPL IBC CMP VPL IBC CMP
2,8 x 0,5
1 88 1 374 540 1,1 347
2 183 1 390 587 1,1 352
3 1190 0,9 431 1902 1,2 327
2,8 x 1,0
1 1539 1,4 265 833 1,3 301
2 1512 1,3 283 817 1,2 316
3 382 1,1 356 719 1,1 338
2,8 x 1,5
1 1668 1,6 236 2494 1,8 213
2 1732 1,5 251 1848 1,5 247
3 988 1,2 307 1721 1,4 275
2,8 x 2,0
1 1431 1,7 229 1886 1,8 213
2 1472 1,6 244 2500 1,8 212
3 969 1,3 292 1565 1,4 264
2,8 x 2,5
1 996 1,6 239 1755 1,8 206
2 1280 1,6 239 1776 1,7 220
3 1040 1,4 276 1858 1,6 240
Um experimento de florestas energticas em andamento, em Botucatu-
-SP, resultou em dados de biomassa da parte area em funo do espaa-
mento, nveis de adubao e idade de corte, verifica-se na Tabela 6.8 que
h maiores porcentagens de madeira com casca em relao a biomassa seca
total nos plantios mais adensados (2,8 x 0,5m, 2,8 x 1,0 m e 2,8 x 1,5 m),
semelhante aos resultados alcanados por Leite e colaboradores (1997) na
Figura 6.2. Por outro lado, espaamentos tradicionais apresentaram por-
centagem de galhos superior, o que evidencia haver mais resduos florestais
no ato da colheita.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 143 07/12/2012 21:49:57
144 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Tabela 6.8 Distribuio da biomassa de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla aos 18 e 24
meses aps o plantio.
Espaamento
(m)
Nvel de
adubao
18 meses 24 meses
% galhos % folhas % mcc* % galhos % folhas % mcc*
2,8 x 0,5
1 18 9 73 16 8 76
2 16 8 77 17 9 74
3 19 8 73 14 5 81
2,8 x 1,0
1 16 10 74 20 12 68
2 20 8 71 29 11 60
3 17 9 73 20 11 69
2,8 x 1,5
1 22 10 67 19 12 69
2 20 10 70 24 11 65
3 20 11 69 25 12 64
2,8 x 2,0
1 25 12 63 25 14 61
2 26 11 63 21 12 67
3 21 12 67 25 14 61
2,8 x 2,5
1 27 14 59 23 14 62
2 21 13 66 22 14 64
3 21 13 66 24 15 61
Outros projetos florestais para fins energticos
Em experimento realizado em Santa Brbara, Minas Gerais, Leite e co-
laboradores (1997) avaliaram o efeito da densidade populacional sobre o
crescimento de Eucalyptus grandis. O experimento foi conduzido com es-
paamentos de 4 x 5m, 4 x 4m, 4 x 3m, 4 x 2m, 3 x 3m, 3 x 2m, 2 x 2m e 2 x
1m, sendo que a densidade populacional variou de 500 a 5000 plantas por
hectare. As avaliaes ocorreram aos 31 e 39 meses aps o plantio, sendo
que as diferenas em relao ao peso da biomassa das plantas podem ser
observadas no Grfico 6.5.
De acordo com esse grfico, nota-se que, com a reduo do espaamento
de plantio, foram obtidos valores superiores com relao ao peso da bio-
massa, sendo que o espaamento de 2 x 2 m apresentou o maior peso. Com
relao distribuio do peso dos componentes da planta, o espaamento
tambm foi um fator relevante, como visto no Grfico 6.6.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 144 07/12/2012 21:49:57
EUCALIPTO ADENSADO 145
Grfico 6.5 Peso seco (t/ha) da biomassa de Eucalyptus grandis aos 39 meses aps o plantio.
Os valores so a soma das massas de lenho, casca, galhos e folhas (adaptado de Leite et al., 1997).
Grfico 6.6 Distribuio da biomassa de Eucalyptus grandis aos 39 meses aps o plantio.
(adaptado de Leite et al., 1997).
Com isso, os autores concluram que os aumentos na densidade popu-
lacional proporcionaram incrementos de forma linear na produo de bio-
massa, por rea, de todos os componentes da parte area e redues no
crescimento individual das plantas (Leite et al., 1997).
Em experimento instalado em Itamarandiba-MG, utilizando um clone
hibrido oriundo do cruzamento de Eucalyptus grandis x Eucalyptus camal-
dulensis, Mller (2005) observou diferentes caractersticas da floresta aos
24 meses, em relao ao espaamento de plantio. Foram analisados os es-
paamentos de 3,0 x 0,5m, 3,0 x 1,0m, 3,0 x 1,5m, 3,0 x 2,0m e 3,0 x 3,0m.
Com relao ao DAP das plantas, o maior espaamento, apresentou
maior incremento mensal, como pode ser observado no Grfico 6.7.
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Grfico 6.7 Incremento mdio mensal no DAP das plantas at os 24 meses aps o plantio
nos diferentes espaamentos (Mller, 2005).
Nesse mesmo experimento, com relao rea basal da floresta, os au-
tores observaram diferente comportamento, como apresenta o Grfico 6.8.
Grfico 6.8 Crescimento na rea basal das plantas at os 24 meses aps o plantio nos dife-
rentes espaamentos (Mller, 2005).
A curva de crescimento mais acentuada observada no espaamento
3 x 0,5m e a curva menos acentuada, no espaamento 3 x 3m. Esta ten-
dncia se justifica em funo da maior competio entre as plantas nos es-
paamentos mais reduzidos, o que proporcionou maior incremento anual
(Mller, 2005).
Ainda, com relao a esse experimento, os autores observaram diferen-
as no volume e peso da biomassa seca, onde foi observada uma relao
direta com a densidade de plantio, ou seja, nos tratamentos com maiores
densidades de plantio foram observados os maiores volumes de madeira e
peso de biomassa seca, como apresentado nos Grficos 6.9 e 6.10.
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Grfico 6.9 Volume das plantas aos 24 meses aps o plantio nos diferentes espaamentos
(Mller, 2005).
Grfico 6.10 Peso da biomassa florestal aos 24 meses aps o plantio nos diferentes espa-
amentos (Mller, 2005).
Com o tempo, a quantidade de madeira estocada em um determinado
stio, tende a se igualar para os diferentes espaamentos, pois nos plantios
mais densos ocorre a estagnao do crescimento das plantas em idades mais
jovens e nos plantios com espaamentos mais amplos a estagnao do cres-
cimento ocorre em idades mais avanadas. Esse fato pode ser muito im-
portante do ponto de vista econmico, visto que possvel economizar no
custo de implantao e na colheita e transporte de madeira, nos espaamen-
tos maiores (Mello et al., 1971; Resende et al., 1983; Klein; FreitaS, 1988;
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148 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Mora, 1986; Gorgulho et al., 1991; Ferreira et al., 1997; Lisita et al., 1997
citados por Mller, 2005).
A prtica de se plantar eucalipto adensado j realizada por algumas
usinas de cana-de-acar, onde a biomassa utilizada para a gerao de
energia eltrica nos meses em que no realizada a colheita da cana (fora
de safra).
O custo de implantao de florestas adensadas se difere de uma flores-
ta tradicional apenas pelo aumento da quantidade de mudas por hectare,
sendo que, a maioria das prticas silviculturais no sofre alteraes no seu
valor.
As florestas energticas baseadas no sistema florestal de curta rotao,
no Brasil, provavelmente, podero ser conduzidas por pelo menos 2 ou 3
cortes, ou seja, uma ou duas rebrotas e, nesse caso, aumentar significativa-
mente os ganhos e melhorar muito a rentabilidade do sistema.
Como exemplo de implantao bem sucedida de sistemas florestais de
curta rotao para fins energticos, pode-se citar o caso italiano com o ma-
nejo de florestas de Populus e Salix.
Florestas energticas de curta rotao na Itlia
Na Itlia, a produo de biomassa florestal muito importante no abas-
tecimento de usinas termoeltricas e centrais de aquecimento, sejam elas
industriais ou residenciais. A dependncia de fontes de energia no renov-
vel, como petrleo e gs natural, fez com que o pas buscasse cada vez mais,
mudar as suas fontes de energia, devido grande dependncia econmica
de pases produtores de petrleo e pelas altas emisses de gases poluentes,
originadas de combustveis fsseis.
A proposta de se realizar estudos com reas florestais de curta rotao
(short rotation coppice SRC) teve incio ao norte da Itlia, na regio da
Lombardia e Veneto, h mais de 10 anos. Com a liberao de subsdios para
o estabelecimento e gesto desse sistema, em menos de cinco anos, 4.000 ha
foram implantados. Atualmente, conforme o anurio florestal da regio
da Lombardia, esta rea ultrapassa os 10.000 hectares.
As florestas de curta rotao italianas so, basicamente, do gnero Po-
pulus e Salix, pelo fato do conhecimento e familiaridade regional com as
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EUCALIPTO ADENSADO 149
caractersticas e comportamento destas espcies, do domnio das tcnicas
de clonagem e por apresentarem bom desenvolvimento para o clima local.
Basicamente o sistema florestal de curta rotao italiano dividido em
trs tipos:
1) Sistema muito curto de rotao (very short rotation): a floresta co-
lhida em intervalos de 1 ano. A densidade de plantio adotada de,
aproximadamente, de 10.000 plantas/ha e as estacas (plantio atravs
de propagao vegetativa) so plantadas em linhas duplas (Figura
6.5), com um espaamento de 2,0 a 2,8 m entre as duas fileiras, 0,7 a
1,0 m entre as fileiras, formando um par, e 0,45 a 0,60 m ao longo das
linhas entre as plantas. (Danfors et al., 1998). O dimetro do caule
das plantas na altura de corte atinge 2 a 3 cm no momento da colheita,
com picos de 6 a 8 cm.
Figura 6.5 Sistema muito curto de rotao (Foto: Gianni Picchi).
2) Sistema de curta rotao (short rotation): a colheita realizada com
intervalos de 2 a 3 anos. Nesse caso, as estacas so plantadas em fi-
leiras simples, com um espaamento de 2,5 a 3,0 m entre as linhas
e 0,4 a 0,6 m ao longo das linhas, entre as plantas (Figura 6.6). Isso
resulta em uma densidade populacional de 6.000 a 7.000 plantas/ha
com dimetro do caule de 10 a 12 cm (dimetro na altura de corte).
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150 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Figura 6.6 Sistema de curta rotao (Foto: Gianni Picchi).
3) Sistema de mdia rotao (medium rotation): a colheita realizada em
intervalos de 5 a 6 anos. As estacas so plantadas em fileiras simples
(Figura 6.7), com um espaamento de 3 m entre as linhas e 2,0 a 2,5 m
ao longo das linhas, entre plantas (1.300 a 1.700 plantas/ha). O di-
metro do caule (DAP), no momento da colheita, pode chegar a 15 cm.
Figura 6.7 Sistema de mdia rotao (Foto: Gianni Picchi).
A colheita florestal para esses tipos de conduo da floresta deve ser
realizada com mquinas adaptadas para cada uma destas condies. Para
cada sistema de manejo o corte diferente, como exemplificado nas figuras
6.8, 6.9 e 6.10.
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Figura 6.8 Sistema de muito curta e curta rotao.
Figura 6.9 Sistema de curta rotao.
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152 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Figura 6.10 Sistema de mdia rotao.
Nesse tipo de sistema, toda a produo florestal convertida em cavaco
(Figura 6.11) e direcionada para a produo de biomassa diretamente ou
processada na forma de briquetes ou pellets para melhorar suas caracters-
ticas fsicas e energticas.
Figura 6.11 Descarregamento dos cavacos.
Equipamentos mecanizados para a colheita dos SFCR
O desenvolvimento de equipamentos para a colheita de florestas de
curta rotao comeou no incio da dcada de 1990, e tem produzido uma
srie de benefcios econmicos e ambientais para os pases que adotaram
esse novo conceito de produo florestal. Vrios projetos de construo de
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EUCALIPTO ADENSADO 153
mquinas e colhedoras simplesmente no evoluram, acabando em poucos
anos, por diferentes motivos tcnicos, econmicos ou comercias. Em outros
casos, o trabalho de desenvolvimento intensivo em vrios pases europeus
(Alemanha, Itlia, Reino Unido e Sucia) e nos Estados Unidos, gerou al-
gumas mquinas que esto trabalhando com sucesso e operam comercial-
mente nos pases citados.
Ao todo, foram projetadas, produzidas e testadas, at agora, mais de
trinta mquinas, muitas vezes, ainda somente disponveis como prottipos
ou verses no comerciais.
As mquinas que trabalham nas florestas de curta rotao podem e de-
vem colher uma ou duas linhas de plantio ao mesmo tempo. Os sistemas
de corte e recolhimento bifilar linhas duplas - so geralmente projetados
para um espaamento de 75 cm a 100 cm, que foi desenvolvido para as con-
dies de trabalho sueco, onde os plantios so realizados com linhas duplas
de 75 e 125 cm. Na Sucia, o espaamento duplo usado para melhorar a
interceptao da radiao solar e para facilitar a colheita mecanizada e, pre-
cisamente, permitir o corte simultneo de dois fustes. Esse sistema , agora,
to generalizado que pode ser chamado, por alguns de sistema europeu,
porque, na verdade - com distncias e objetivos um pouco diferente - am-
plamente utilizado na Alemanha, Reino Unido e Itlia.
Existem dois sistemas de colheita bem distintos, sendo que um fornece a
biomassa cortada, agrupada e picada em uma operao contnua, impedin-
do a separao dessas trs fases. Em geral, toda a operao realizada por
uma nica mquina, e o material transferido para as margens da estrada
j na forma de cavacos.
O outro sistema depende da separao das fases de corte, agrupamento e
triturao, que poder ser realizado com mquinas e momentos diferentes.
O primeiro sistema, normalmente, mais produtivo e mais simples em
termos de organizao, porm tem pouca flexibilidade e pode exigir equi-
pamentos de grande porte. O segundo sistema mais flexvel, permite uma
utilizao parcial de equipamentos convencionais e permite que seja pla-
nejada a triturao, aguardando que a umidade dos fustes chegue a nveis
timos. H a possibilidade de deixar as plantas para secar por algumas se-
manas, o que passa a ser a vantagem mais interessante desse sistema, espe-
cialmente em climas midos.
Quanto forma organizacional, possvel individualizar quatro esque-
mas tpicos, com nveis crescentes de complexidade.
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O primeiro sistema (01) inclui uma mquina de corte, triturao e extra-
o sobre a linha lateral ou traseira.
O segundo sistema (02) utiliza duas mquinas: uma que corta os fustes,
rene e extrai para linha lateral, enquanto o outra faz a triturao, podendo
ser, talvez, depois de algumas semanas.
O terceiro sistema (03), tambm, baseado em duas mquinas: a pri-
meira corta os fustes e coloca em leiras, enquanto a segunda recolhe os fus-
tes das leiras, pica e carrega o cavaco de madeira para fora talho.
Finalmente, o sistema 04, baseado em trs mquinas: usa uma mqui-
na para cortar e agrupar os fustes, uma segunda mquina para recolher os
feixes e carreg-los fora do campo e uma terceira mquina para picar.
Portanto, a mquina inovadora sempre aquela que colhe, pica e re-
move o material, ou que os coloca em leiras. Os outros so equipamentos
convencionais, normalmente utilizados na silvicultura e, portanto, j am-
plamente disponveis.
As mquinas que realizam o corte e a triturao so muito potentes, com
motores entre 450 a 1100 cv e, muitas vezes, so baseadas em uma mquina
de colheita de forragens ou de cana-de-acar auto-propelidas adaptadas
ao processamento de madeira, transformando uma rvore em cavacos ou
lascas, de forma contnua.
Outro tipo de colhedora que pode ser encontrada so as colhedoras
acopladas aos tratores agrcolas no sistema de trs pontos e acionadas pela
tomada de potncia (TDP). As colhedoras acopladas aos tratores agrcolas
so mais baratas, entretanto no podem alcanar a produtividade operacio-
nal horria dos modelos auto-propelidos de colheita contnua.
A escolha entre estas opes depende da disponibilidade de recursos
e das caractersticas de campo (topografia, clima, solo) e no apenas dos
aspectos tcnicos da cultura. Onde existe uma boa rede de fornecedores,
fabricantes ou revendas de mquinas e peas, pode ser mais conveniente
o uso de equipamentos auto-propelidos; caso contrrio, melhor utilizar
equipamentos aplicveis a tratores agrcolas, deixando a cada produtor a
liberdade de gerir os seus recursos como lhe convm.
Como forma de ilustrar o grau de desenvolvimento da colheita meca-
nizada dos sistemas florestais de curta rotao, a Tabela 6.9, apresenta os
mais significativos prottipos e produtos avaliados, na ltima dcada, pelo
CNR IVALSA (Consiglio Nazionale delle Ricerche - Istituto per la Valo-
rizzazione del Legno e delle Specie Arboree).
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EUCALIPTO ADENSADO 155
Tabela 6.9 Colhedoras florestais e estgio de desenvolvimento
Modelo
Pas
(*)
Tipo Produto
Primeira
apario
Estgio de
desenvolvimento
Mquinas para colheita
Saf-Isma I Arrasto rvore inteira 1990 Terminado, em uso
Frbbesta S Arrasto rvore inteira 1993 Terminado, em uso
Dansalix D Montada toras empilhadadas 1993 Terminado, em uso
Berni I Montada toras empilhadadas 1995 Projeto abandonado
Hvidsted D Auto-propelido toras empilhadadas 1994 Terminado, em uso
Segersltt S Auto-propelido toras empilhadadas 1994 Terminado, em uso
Rodster S Montada toras empilhadadas 1997 Produto comercial
Loughry RU Montada toras em feixe bundle 1992 Projeto abandonado
Bundler SM S Montada toras em feixe bundle 1998 Projeto abandonado
ESM 901 S Auto-propelido toras em feixe bundle 1992 Projeto abandonado
HS Locust D Auto-propelido toras em feixe bundle 2001 Em desenvolvimento
Mquinas para colheita e triturao Sistema de 3 pontos (Montada)
Diemelstadt A Arrasto Lascas 1994 Projeto abandonado
LWF A Arrasto Lascas 2002 Em desenvolvimento
ATB-Potsdam A Arrasto Lascas 2006 Em desenvolvimento
Isma Tanesini I Arrasto Cavaco 1997 Projeto abandonado
Bodini I Arrasto Cavaco 2002 Projeto abandonado
Bender SM Si Arrasto Cavaco 1992 Comercial
Gandini Bio93 I Arrasto Cavaco 1993 Projeto abandonado
Pallari F Arrasto Cavaco 1987 Projeto abandonado
Spapperi I Arrasto Cavaco 2004 Comercial
Spapperi I Arrasto Lascas 2006 Em desenvolvimento
Optigep H Arrasto Lascas 2005 Em desenvolvimento
Mquinas para colheita e triturao Sistema Autopropelido
MBB Biber A Auto-propelido Cavaco 1994 Projeto abandonado
JD-Kemper RU Auto-propelido Cavaco 1995 Projeto abandonado
Austoft 7700 S Auto-propelido Cavaco/Lascas 1993 Comercial
Claas HS-1 A-S Auto-propelido Cavaco 1993 Comercial
CRL RU Auto-propelido Cavaco 1999 Comercial
Claas HS-2 A-S Auto-propelido Cavaco 2001 Comercial
Claas GBE A-I Auto-propelido Cavaco 2004 Comercial
Krone A Auto-propelido Cavaco 2007 Comercial
NH FR 130B B Auto-propelido Cavaco 2008 Comercial
(*) A Alemanha; B Blgica, D Dinamarca, F Finlndia, H Hungria, I Itlia, RU Reino
Unido, S Sucia, Si Sua
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156 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
Em alguns casos, a mquina descrita na tabela realmente o expoente
de uma gerao inteira de equipamentos similares produzidos em verses
diferentes, dependendo do estgio de desenvolvimento de projeto especfi-
co e, muitas vezes, ainda disponvel em vrias verses.
Esse o caso da colhedora de forragens autopropelida fabricada pela
Claas, produzido em, pelo menos, cinco verses diferentes (modelo Jaguar
695, 840, 860, 880 e 900) e que permite a utilizao de diversos cabealhos
de colheita florestal, tais como: dois modelos alemes (HS1 e HS2), um mo-
delo francs (Cemagref) e dois modelos italianos (GBE e Veneta Maiz)
Colhedora para corte contnuo de floresta no Brasil
No Brasil, a pesquisa e desenvolvimento de colhedoras auto-propelidas
para os sistemas florestais de curta rotao uma novidade e, est se ini-
ciando atravs de uma parceria entre a New Holland (CNH) e a Faculdade
de Cincias Agronmicas da Unesp, campus de Botucatu/SP.
Figura 6.12 Colhedora New Holland FR 9060 Coppice Header 130 FB em operao na
Europa.
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EUCALIPTO ADENSADO 157
Esse projeto cooperativo est sendo executado pela FCA/Unesp, atra-
vs do NEMPA (Ncleo de Ensaio de Mquinas e Pneus Agroflorestais),
que responsvel pela conduo do projeto de avaliao do desempenho
operacional de uma colhedora florestal New Holland FR 9060 Coppice
Header 130 FB (Figura 6.12) projetada para colher de forma contnua
toda a biomassa de sistemas florestais de curta rotao (SFCR), avaliando
os parmetros operacionais, econmicos e ambientais desse novo e revo-
lucionrio sistema de produo. O projeto, com durao prevista de trs
anos, tem por objetivo determinar a viabilidade operacional e econmica
desta colhedora, as necessidades de manuteno e a adaptao aos SFCR
nacional.
Produtividade e custos das colhedoras
de corte contnuo de floresta
Atualmente, existem dados confiveis sobre a produtividade da colheita
de muitas das mquinas listadas na Tabela 1. Em geral, os dados dispon-
veis hoje indicam uma relao diretamente proporcional entre a produtivi-
dade da mquina, sua potncia e a densidade de biomassa por hectare.
Entre as mquinas que executam o corte, recolhimento e triturao, as
colhedoras de forragens auto-propelidas, adaptadas com cabeotes flores-
tais (sistema industrial), so as mais eficientes que os equipamentos acopla-
dos em tratores agrcolas ou de arrasto (sistema semi-industrial), especial-
mente porque elas tm uma potncia adequada para uso industrial.
Em um talho com conduo bem planejada, considerando o sistema de
colheita mecanizado, pode-se esperar uma capacidade operacional de mais
de 40 toneladas de cavaco de madeira por hectare (base mida).
O custo horrio desse sistema de colheita e transporte, composto por
uma colhedora de forragens adaptada a colheita florestal mais trs tratores
de apoio para transporte dos cavacos, deve atingir valores de at 500/hora
(quinhentos euros por hora ou, aproximadamente R$ 1.200,00/hora). Nesse
cenrio, a operao destas mquinas apresenta um custo 12,5 por tonelada
de cavaco (doze euros e cinquenta centavos por tonelada ou, aproximada-
mente R$ 30,00 por tonelada).
Para os equipamentos acoplados (montados) no trator agrcola ou de
arrasto, que apresentam um custo muito mais baixo de aquisio e de ope-
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158 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
rao, pode ser estimado um valor ao redor cerca de 250/hora (duzentos
e trinta euros por hora ou, aproximadamente R$ 600,00/hora), incluindo
dois tratores de apoio para receber os cavacos. No entanto, a produtividade
muito mais modesta e no chega a 10 toneladas de cavaco (base mida)
por hora de trabalho.
O centro de pesquisa italiano CNR Ivalsa avaliou e analisou todas as
mquinas descritas e, pode concluir que, o custo de colheita e transporte com
um sistema semi-industrial custa 25/tonelada (vinte e cinco euros por to-
nelada ou, aproximadamente R$ 60,00/tonelada), ou seja, quase 13/tone-
lada (treze euros por tonelada ou, aproximadamente R$ 31,00) a mais do que
com uma colhedora autopropelida.
Desta forma, para que o sistema florestal de curta rotao seja vivel
economicamente, o plantio deve apresentar alto rendimento por hectare e a
colheita deve ser realizada de forma contnua. No entanto, necessrio que
o dimetro das rvores, na altura de corte, seja proporcional capacidade
de cada equipamento.
Sistemas de aquecimento domstico
ou centrais de aquecimento
O consumo de bioenergia est crescendo de maneira consistente na Eu-
ropa, tanto para gerao de eletricidade como para o aquecimento da gua
ou para centrais de energia. Esse mercado de biomassa, que era puramente
regional, se tornou uma oportunidade de negcios internacional, segundo
a APC (2006), e o desenvolvimento desse mercado deve incorporar novas
polticas energticas, agrcolas, florestais e industriais em todo o mundo.
Diversos pases europeus, tais como, Sua, Alemanha, Frana, us-
tria e os pases nrdicos utilizam e incentivam, financeiramente, atravs de
programas de fomento e leis, a aquisio e a troca por equipamentos mais
modernos, dos sistemas de aquecimento domstico como fonte de ener-
gia limpa, eficiente e segura. A Blgica , segundo Verma e colaboradores
(2009), o pas mais ativo na utilizao de biomassa como fonte de energia
para aquecimento, com 83,5 MW consumidas em 2007. Um estudo tcni-
co-econmico realizado por Chau e colaboradores (2009) demonstrou que
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EUCALIPTO ADENSADO 159
a instalao de aquecedores base de resduos madeireiros ou pellets para
aquecimento de estufas agrcolas, gerando de 40% a 60% da demanda de
calor, se torna mais econmico quando comparado a um aquecedor a gs
natural funcionando a plena carga.
A utilizao da biomassa florestal como combustvel para gerao de
energia ou calor uma cincia bastante complexa e, suas propriedades
fsicas e qumicas, principalmente, o tamanho do cavaco, influenciam di-
retamente nas caractersticas da queima, de uma forma muito complexa,
conforme relatado por Molcan e colaboradores (2009) e Lu e colaboradores
(2010)
Consideraes finais
Dada a baixa utilizao da biomassa florestal na matriz energtica bra-
sileira, o plantio adensado de eucalipto para a gerao de energia torna-se
uma nova realidade, sendo que algumas empresas j esto adotando esta
prtica para complementar suas demandas energticas.
A tcnica de adensamento dos plantios com eucalipto recente e est
sendo difundida devido os resultados de pesquisas e as avaliaes de campo
realizados por diversas instituies, pesquisadores e empresas. A tendncia
de adensamento dos plantios de eucalipto para produo de biomassa re-
forada pelo fato da necessidade de reduo do ciclo da cultura, resultando
em ganhos de produtividade, tempo e custo com o manejo florestal.
Em alguns pases como, por exemplo, a Itlia, a tcnica de adensamento
florestal vem sendo utilizada com sucesso para outras espcies florestais,
sendo uma interessante estratgia econmica para a reduo da dependn-
cia energtica do pas com relao a fontes fsseis importadas.
O Brasil, por sua vez, necessita de grandes investimentos em pesquisa
na rea de aproveitamento energtico de biomassa, atravs da utilizao de
tcnicas sustentveis para gerao e cogerao de energia limpa e renovvel.
Dada a complexidade ambiental, social e econmica para a implementao
do sistemas florestais de curta rotao, necessrio o aprimoramento de
diversos setores de sua cadeia florestal, desde o melhoramento gentico,
prticas silviculturais, at os sistemas de corte, transporte e beneficiamento
da biomassa.
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160 BIOMASSA PARA BIOENERGIA
muito provvel que o Sistema Florestal de Curta Rotao com fins
energticos venham a ser, em pouco tempo, mais uma grande opo brasi-
leira para produo de energia limpa e renovvel!
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EUCALIPTO ADENSADO 161
MOLCAN, E.; LU, G.; LE BRIS, T.; YAN, Y.; TAUPIN, B.; CAILLAT, S. Char-
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Parte II
Produo de biocombustveis
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7
A complexidade da produo
do bioetanol em fermentaes abertas
de matrias-primas industriais
Ceclia Laluce, Elson Longo,
Sandra Regina Pombeiro-Sponchiado, Eduardo Maffud Cilli,
Jessica C. Medina Gallardo, Maria Olivia Campos Masiero
Introduo
A levedura Saccharomyces cerevisiae o eucarioto mais conhecido em
funo de sua importncia histrica, sendo o principal agente responsvel
pela fabricao de pes, bebidas e, recentemente, usado para produo de
etanol combustvel. As razes do uso amplo e diversificado dessa levedura
so crescimento rpido, facilidade de manipulao gentica, literatura vasta
e diversificada, disponibilidade de banco de dados cinticos e de sequncias
gnicas. O genoma da S. cerevisiae foi o primeiro a ser completamente se-
quenciado e contm um total de 12.052 megabases (Mb) distribudos em 16
cromossomos. Mais de 80% deste genoma (cerca de 5.780 genes) encontra-
-se anotado em bancos de dados internacionais e contribui com informaes
valiosas, tais como microarranjos (microarrays), transcriptoma (expresso
gnica) e genoma funcional (genome-wide function).
A levedura S. cerevisiae utiliza um grande nmero de fontes de carbo-
no para crescer, sendo a glicose (hexose) sua fonte de carbono preferencial.
A utilizao de pentoses (como a xilose) limitada pelo fato de os genes
relacionados com a utilizao destes acares no serem suficientemente
expressos em Saccharomyces cerevisiae (Young et al., 2010). A utilizao de
polissacardeos (amido ou a lignocelulose da parede das clulas vegetais)
pela levedura S. cerevisiae depende da secreo de enzimas como amilases
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166 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
e hemicelulases, as quais so usualmente produzidas por bactrias e outros
fungos. A biologia molecular tem obtido grande sucesso com a expresso
heterloga de enzimas envolvidas na utilizao de hidrolisados do material
lignocelulsico pela levedura S. cerevisiae. Enzimas da via das pentoses de
outros microrganismos tambm j foram clonadas na levedura Saccha-
romyces cerevisiae (Bettiga et al., 2008; Bettiga et al., 2009).
A utilizao de uma fonte de carbono rigorosamente regulada e depen-
de da disponibilidade de oxignio molecular no meio. Apesar de possuir
um metabolismo facultativo, a levedura Saccharomyces cerevisiae prefere
obter energia por meio da atividade de fermentao, mesmo em presena
de oxignio (efeito Crabtree). Por outro lado, o etanol consumido por
meio de metabolismo oxidativo (respirao) com formao de biomassa.
O crescimento aerbico (metabolismo oxidativo dependente de oxignio)
favorecido durante o cultivo em quimiostato quando a concentrao de
glicose for baixa (Fiechter; Von Meyenburg, 1968). Assim, o metabolismo
respiratrio predomina em vazes baixas de alimentao. Em meios con-
tendo concentraes altas de glicose, ocorre a represso catablica de diver-
sos genes, que causa alteraes na concentrao intracelular de metabolitos,
modificao na secreo de enzimas e estabilidade dos RNAs mensageiros
(Gancedo, 2008).
Para que se possa entender, controlar e introduzir melhorias na produ-
o de etanol imprescindvel um conhecimento biotecnolgico bastante
amplo e diversificado em relao aos seguintes aspectos:
metabolismo das leveduras;
taxonomia e microbiologia;
identificao de contaminantes microbianos;
controle de contaminantes durante as fermentaes e,
conhecimento sobre a tecnologia das fermentaes.
Nas fermentaes industriais, nas quais os meios no so esterilizados,
as leveduras e contaminantes (bactrias e leveduras selvagens) competem
entre si por nutrientes, sendo que a dominncia e permanncia de um deter-
minado microrganismo no processo dependem de seu grau de crescimento,
das interaes entre os diferentes subprodutos do metabolismo e dos diver-
sos tipos de levedura e contaminantes presentes. A superioridade quanto
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 167
a atividade de crescimento fator determinante para a dominncia da(s)
linhagem(ns) de levedura no processo.
O sucesso da implantao do processo industrial indicado pela manu-
teno da viabilidade celular e das atividades tanto de fermentao quanto
de crescimento e depende tambm da propagao do inculo e de sua ativi-
dade fisiolgica, do nmero de leveduras industriais utilizadas como in-
culo, da temperatura do meio de fermentao e, por fim, do monitoramento
adequado do processo. A toxidade da matria-prima e a competio entre
as leveduras da biota natural afetam a viabilidade celular, a capacidade de
multiplicao e a produo de etanol.
O uso de leveduras selecionadas e variaes na
populao de clulas ao longo da fermentao
A produo de etanol em nosso pas teve incio com o uso de leveduras
de panificao como inculo. No entanto, os avanos na produo de eta-
nol combustvel foram alcanados com base nos estudos e prticas bem-
-sucedidas na fabricao de bebidas, sobretudo na produo de vinhos.
A maioria das leveduras comerciais destinadas fabricao de vinhos
apresenta as seguintes caractersticas: desempenho fermentativo, tolern-
cia ao etanol produzido, nveis reduzidos de metabolitos indesejveis e au-
mento nos nveis dos metabolitos desejados (Cordero-Bueso et al., 2011).
Uma grande variedade de linhagens de leveduras melhoradas, resultantes
do uso de tcnicas da engenharia gentica, est disponvel para utilizao
industrial, desde que o produtor vislumbre lucros sem nenhum impacto
negativo sobre o ambiente e consumo de produtos por humanos (fonte de
vitaminas) e animais (rao).
Leveduras secas ativas
Atualmente, a maioria das vincolas utiliza leveduras secas ativas que
permitem fermentaes rpidas e reduzem os riscos de ocorrncia de fer-
mentaes lentas (sluggish fermentation) ou interrupo do processo (stuck
fermentation). A dificuldade da implantao de uma levedura seca ativa em
um processo tem sido atribuda etapa de secagem e a longos perodos de
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168 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
reidratao (Henschke, 1991). O tempo necessrio para o incio da fermen-
tao ou partida do processo depender da viabilidade celular e outros fato-
res, tais como as condies de estocagem do fermento, o estgio da reidra-
tao e caractersticas do mosto (ibidem). Aps os estgios da reidratao
e propagao, nos quais a levedura seca ativa suposta a se recuperar das
perdas ocorridas durante o processo de secagem, fundamental que as c-
lulas reidratadas sejam capazes de fermentar eficientemente.
Leveduras selecionadas para a produo de etanol
combustvel
A partir da dcada de 1990, as destilarias brasileiras passaram a utilizar
linhagens de levedura S. cerevisiae selecionadas entre os isolados, obtidas
ao longo do processo fermentativo. A primeira levedura a ser usada indus-
trialmente como starter foi a linhagem IZ-1904, do Departamento de Bio-
logia da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq/USP),
em Piracicaba (SP).
Um dos primeiros trabalhos exaustivos de isolamento e construo
de linhagens de leveduras utilizando isolados de destilarias foi realizado
em nosso laboratrio nos perodos de 1985 a 1987 (Fundo de Incentivo
Pesquisa Tcnico-Cientfica do Banco do Brasil, Convnio Unesp/Fi-
pec n.1/1377-4) e de 1989 a 1992 (Fundao Banco do Brasil, Convnio
Unesp-FBB n.10/1078-2). Embora o repasse dessas leveduras para a escala
industrial de produo de etanol no tenha ocorrido por falta de interesse
do setor alcooleiro na poca, vrias publicaes resultaram desses traba-
lhos (Peres et al., 2001; Sousa et al., 2001). Por fim, estas leveduras foram
avaliadas, quanto ao uso em panificao graas ao interesse da produtora de
fermentos Produtos Alimentcios Fleischmann & Royal Ltda.. Levedu-
ras capazes de fermentar dextrina com alto rendimento alcolico e secretar
enzimas com atividade amiloltica tambm foram obtidas (Laluce et al.,
1988) e algumas das leveduras isoladas tambm mostraram alta capacidade
de flotao (Sousa et al., 2001). As leveduras que apresentaram o fenmeno
da flotao mostraram grande atividade fermentativa e suas clulas perma-
neceram dispersas no meio at o final da produo de etanol. Estas clulas
dispersas no meio de cultivo s foram posteriormente separadas por meio
da injeo de ar na cultura (Palmieri et al.,1996).
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 169
Outros pesquisadores tambm realizaram trabalhos sobre o isolamen-
to de leveduras e muitas delas tm se mostrado boas leveduras starters no
processo de fermentao do melao ou xarope. Linhagens de leveduras
de diferentes origens (linhagens TA, BG1, CR1, SA1, M26, Y-904, PE-
2, PE-5, VR-1. BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1 CB-1,
NR-1,BT-1, AL-1) foram avaliadas quanto a permanncia (% ou propor-
o da levedura starter com menor capacidade de competir frente s le-
veduras selvagens no final da safra de produo de etanol) e prevalncia
ou dominncia (% ou proporo da levedura starter com maior capaci-
dade de competir frente s outras leveduras) em escala industrial, sendo
que a linhagem PE-2 se destacou pelos resultados quanto permanncia
(58% 4,1) e a prevalncia (54% 5,2) no processo (Basso et al., 2008).
A levedura BG-1 apresenta uma prevalncia maior (65% 4,8), mas a sua
permanncia menor (42% 5,1). Por outro lado, a linhagem BG-1 re-
quer mecanismos que reduzem a assimilao de acares quando a tem-
peratura se eleva, evitando perdas em viabilidade (Souza et al., 2007b).
Desta forma, os requisitos de uma boa linhagem industrial para a produ-
o de etanol combustvel so um bom desempenho fermentativo, a ma-
nuteno de alta viabilidade, a produo de nveis reduzidos de glicerol
externo e espuma durante ciclos sucessivos de fermentao (Basso et al.,
2008).
Uso de mais de uma levedura como inculo
H controvrsias quanto s vantagens do uso de mais de uma linhagem
de levedura na partida de um processo ou mesmo quando inoculadas em
sequncia durante a fermentao. Experincias tm mostrado que o uso de
leveduras comerciais selecionadas no garante a uniformidade do produto
final (por exemplo, manuteno de sabor e aroma em vinhos) e tambm no
assegura a implantao destas leveduras no processo (Capece et al., 2010).
Em algumas amostras de mosto de uva, estes mesmos autores observaram
que o grau de implantao de duas linhagens selecionadas foi baixo. Isso foi
atribudo a diferenas na capacidade de essas leveduras tornarem-se domi-
nantes na microflora presente no mosto, bem como as flutuaes na diver-
sidade dos contaminantes ao longo do processo.
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170 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Permanncia e prevalncia de leveduras em um processo
Alguns fatores determinantes da sobrevivncia e predominncia de uma
levedura no incio do processo de fermentao so os seguintes (Barrajn et
al., 2010):
disponibilidade de hidratos de carbono de reserva;
disponibilidade e tipos de fonte de nitrognio;
nvel de leveduras selvagens; e
quantidade da levedura starter utilizada como inculo.
Os teores de trealose indicam o grau de robustez dos inculos. Apesar
da quantidade alta da trealose intracelular das leveduras comerciais, h evi-
dncias de que estas podem apresentar um grau menor de vitalidade (ati-
vidade biolgica) no processo e menor grau de implantao (ibidem). Se-
gundo estes autores, a exigncia por aminocidos depende da linhagem de
levedura. Em geral, as leveduras comerciais consomem mais aminocidos
que leveduras recm-propagadas ou selvagens.
O grau de dominncia das leveduras inoculadas depende das condi-
es do processo (variveis fsicas do ambiente e/ou estado nutricional da
matria-prima). A ideia de que a dominncia de uma levedura selvagem
diminui medida que a levedura starter passa a dominar no processo
tambm controversa. O meio diferencial WLN (Wallerstein Laboratories
Nutrient Agar) o mais utilizado para monitorar as variaes que ocor-
rem na populao de leveduras durante o processo de fermentao, tanto
em fabricao de bebidas (Powell; Diacetis, 2007) quanto em fabricao de
etanol combustvel. A persistncia das leveduras starters selecionadas para
partida de um processo de fermentao (detectada pela anlise dos perfis
cromossmicos e/ou anlise do mtDNA) e a influncia dessas leveduras
sobre a conduo da fermentao tem sido bastante estudada na fabrica-
o de vinhos (Querol et al.,1992; Cordero-Bueso et al., 2011). Em alguns
casos, linhagens de Saccharomyces cerevisiae no so capazes de compe-
tir com sucesso frente s leveduras selvagens do mosto de vinho e, assim,
no podem se tornar dominantes em uma populao de leveduras (Que-
rol et al., 1992). Nas fermentaes espontneas, a dominncia da levedura
Saccharomyces cerevisiae na populao varia com a vincola (Santamara et
al., 2005).
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 171
Dinmica populacional
Independentemente do inculo ou starters usados, outras leveduras
podem se originar de espcies contaminantes presentes no processo de
fermentao, como indicado pela diversidade das linhagens de leveduras
identificadas durante a fermentao de mostos de vinho (Fleet, 2008). Esta
diversidade representa um desafio para a conduo e controle de um pro-
cesso industrial. A adaptao evolutiva um fator determinante no apareci-
mento de leveduras diferentes durante o processo de fermentao. Mutan-
tes isolados de mosto de uva mostram alteraes na excreo de metabolitos
secundrios aps 350 geraes (McBryde et al., 2006).
Mudanas ambientais podem reduzir grupos de leveduras em uma popu-
lao mista e isso parece acontecer sempre que as velocidades das mudanas
ambientais excedem a capacidade de populaes diferentes persistirem e/
ou manterem graus significativos de dominncia durante o processo (Bell;
Gonzales, 2011). As mutaes dependem do tipo e grau de estresse, bem
como do grau de adaptao das clulas de leveduras. Parece que a evoluo
dinmica afeta tanto a persistncia quanto a diversidade de espcies que
surgem em ambientes desfavorveis. Em condies de estresse, mutaes
benficas podem ocorrer para minimizar os efeitos das condies adversas
do ambiente (ibidem). Usando-se a tcnica do PCR-fingerprinting, isolados
obtidos durante a operao do processo, ao longo de meses de fermentao
do melao, foram identificados como variantes genticos que dominaram
a populao de leveduras por terem adquirido um nvel mais elevado de
adaptao ao processo (Da Silva Filho et al., 2005).
A teoria da renovao genmica foi proposta para explicar os aumen-
tos na diversidade de linhagens de levedura que surgem durante o processo
de fermentao, sendo estes aumentos atribudos evoluo dinmica da
populao de leveduras. A diversidade populacional depende da propor-
o dos microrganismos, da converso de heterozigoto em homozigoto e da
formao de haploides que do origem a hbridos intra- e interespecficos
(Mortimer, 2000). Uma levedura hbrida foi inoculada em um fermentador
contnuo de cinco estgios operando em temperaturas crescentes (Souza
et al., 2007a). Os seguintes tipos de isolados foram obtidos deste sistema
quando o mesmo encontrava-se em operao na faixa de 39C a 47C:
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172 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
isolados haploides com ou sem marcas de auxotrofia da levedura star-
ter ou marcas de auxotrofia novas;
isolados, mostrando reaes de cruzamento positivas ou negativas
(mating type), com ou sem marcas de auxotrofia da levedura hbrida
usada como inculo. As caractersticas genticas destes isolados indi-
cam a ocorrncia da renovao genmica induzida por temperaturas
altas neste tipo de sistema de fermentao. Por outro lado, a utiliza-
o de uma levedura, cujo carter killer foi codificado por dois genes
dominantes localizados em cromossomos diferentes, foi usada como
starter e dominou no mosto de uva at o final da fermentao (Goto et
al., 1992).
Populaes microbianas diferentes desenvolvem-se ao longo de fermen-
taes abertas industriais. Os mtodos moleculares de acompanhamento
da dinmica populacional so dispendiosos, requerem tempos longos e
tcnicos especializados, mesmo quando a tcnica da PFGE (Pulsed Field
Gel Electrophoresis) usada (Ivey; Phister, 2011). Os mtodos moleculares
diretos (anlise dos cidos nucleicos totais das amostras) so recomendados
para identificao do perfil das populaes mistas. No entanto, as tcnicas
diretas so mais rpidas e podem identificar organismos em nvel de gnero
e, eventualmente, em nvel de espcie (ibidem). Os mtodos diretos (iden-
tificao de colnias isoladas) parecem interessantes para a identificao de
espcies de leveduras em populaes mistas.
Os estados fisiolgicos e a atividade fermentativa
das leveduras
O conceito de estado fisiolgico em fermentao foi definido por Kons-
tantinov e Yoshida (1989), como uma caracterstica fisiolgica de uma
populao de clulas decorrente de mudanas ocorridas nas condies de
cultivo. Em cultivos em batelada ou contnuos, o estado fisiolgico da po-
pulao de clulas no uma caracterstica constante e deve refletir mu-
danas esperadas e no esperadas no comportamento da planta industrial,
tal que pequenas alteraes na estratgia do processo possam contornar os
eventuais problemas. A caracterizao do estado fisiolgico das clulas dos
microrganismos deveria ser mais bem explorada em biotecnologia, uma vez
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 173
que a velocidade e eficincia dos processos dependem do estado fisiolgico
das clulas. Variveis intracelulares como concentraes de NADH, ATP,
nvel de enzimas chaves das vias metablicas e metabolitos esto relaciona-
dos com as atividades de crescimento e formao de produtos e poderiam
ser usados como indicadores de estados fisiolgicos. Dessa forma, medidas
desses indicadores poderiam ser usadas como uma forma de diagnstico
sobre o andamento do processo, tal que aes preventivas pudessem ser to-
madas para evitar perdas durante o processo de produo do etanol.
As oscilaes em estados fisiolgicos das clulas
Durante fermentaes destinadas produo de etanol combustvel em
bateladas alimentadas sucessivas, a levedura fica exposta a estresses suces-
sivos diversos, sobretudo em escala industrial. Assim, o estado fisiolgico
do fermento varia entre ciclos de fermentao. A levedura tambm fica
exposta a estresses durante as paradas do processo que ocorrem nas des-
tilarias, sobretudo por problemas relacionados com o corte e transporte da
cana-de-acar em perodos de chuva contnua. desejvel que o estado
fisiolgico das clulas possa ser mantido de forma econmica e eficiente.
Para tal, necessrio que se disponha de mtodos de avaliao da vitali-
dade ou atividade metablica antes do uso do fermento, bem como definir
formas de condicionar o fermento, tal que as clulas possam desenvolver
resistncia a essas formas de estresses. Diversos eventos ocorrem durante
a interrupo da atividade fermentativa, causando as seguintes alteraes
(Gabier et al., 2005):
na capacidade de cultivo (cultivability);
na viabilidade (indicativa da capacidade de reoxidar o NADH) que
diminui, embora lentamente, com as perdas em trealose;
a vitalidade ou a atividade metablica reduz a capacidade de cresci-
mento e o teor de trealose;;
no potencial de membrana, pois a despolarizao da membrana causa
quedas no pH intracelular e prejuzo no cultivo das clulas;
no pH intracelular;
na quantidade de produtos inibitrios produzidos (por exemplo, eta-
nol, acetaldedo, cido actico);
no estgio das clulas no ciclo de diviso celular.
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174 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Clulas de levedura em fase lag ou estacionria apresentam limitaes
quanto ao crescimento, enquanto que em fase logartmica a predominncia
das atividades de crescimento ou fermentao depende da densidade das
clulas no processo e da aerao (efeitos Pasteur e Crabtree).
Estgio das clulas da levedura no ciclo de diviso celular
e atividade de crescimento
As caractersticas das clulas variam com o estgio do ciclo de diviso
celular. Parte das clulas da populao de leveduras pode no apresentar
brotos em fase logartmica. Na ausncia de brotos, as clulas apresentam
maiores resistncias ao choque trmico, nveis de transcrio e traduo re-
duzidos e maior resistncia a diversos estresses (Plesset et al., 1987).
Muitos microrganismos sobrevivem em fase estacionria induzida por
ambientes pobres em nutrientes. Conforme j descrito (Werner-Washbur-
ne et al., 1993), clulas da levedura Saccharomyces cerevisiae em fase es-
tacionria so fisiolgica e bioquimicamente distintas de clulas em fase
exponencial. Na fase estacionria, a parede celular torna-se mais rgida,
menos porosa, enquanto as mitocndrias esto em maior nmero e so mais
arredondadas. Ao aproximarem-se da fase estacionria, as clulas passam
a sintetizar proteases (Jones, 1984) que se acumulam em vrias incluses
celulares, enquanto carboidratos de reserva, como glicognio e trealose, se
acumulam no citoplasma. Outra caracterstica das clulas em fase estacio-
nria consiste na capacidade de estas sobreviverem por longos perodos em
gua sem adio de nutriente. A fase estacionria caracterizada por dimi-
nuio da velocidade de crescimento e diminuio progressiva na sntese de
protenas (diminuio de at 95%), bem como acmulo de RNAs (Bouche-
rie, 1985) e, por fim, o ciclo celular totalmente interrompido.
O crescimento afetado por condies de operao do processo (tempe-
ratura, pH) e por propriedades intrnsecas, tais como o tipo de linhagem,
meio de cultura, estado fisiolgico do inculo e design do processo. Os pa-
rmetros relacionados com as diferenas em estado fisiolgico do inculo
so independentes do tipo de linhagem e meios de cultura utilizados (Di
Serio et al., 2003). O aumento do volume das clulas e a proliferao so
processos altamente regulados, e perdas em atividade de regulao causam
a inviabilidade celular (Granot; Snyder, 1991).
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 175
O controle da atividade da levedura (crescimento e fermentao em pro-
duo d e etanol combustvel) e sua viabilidade so parmetros crticos na
otimizao de um processo industrial. Os microrganismos adaptam-se aos
diversos ambientes para sobreviver e multiplicar-se. No entanto, poucos
estudos descrevem a adaptao da levedura ou recuperao da atividade
fermentativa e crescimento frente a estresses fsicos e qumicos durante a
fermentao (Sanchez-Gonzales et al., 2009).
Variaes em sntese de protenas
A sntese de protena ocorre durante o ciclo de diviso celular e cresci-
mento das clulas filhas ou brotos. Na fase lag, o metabolismo celular est
ativado para a progresso no ciclo, passando pelas fases S e G2, fase mittica
e, por fim, a formao da clula broto. A velocidade de sntese de protenas
aumenta muito rapidamente (20 minutos) quando as clulas do Saccha-
romyces cerevisiae esto em fase lag (Brejning; Jespersen, 2002). Neste pero-
do de sntese intensa de protenas, os brotos so liberados das clulas. Como
descrito por esses autores, a velocidade de sntese de protenas tambm au-
menta quando as clulas so transferidas de um meio pobre para um meio
rico, sendo isso acompanhado por aumento das protenas totais, sobretudo
as protenas ribossomais. O acompanhamento da expresso de protenas in-
duzidas na fase lag poderia ser til no controle e otimizao de fermentaes
industriais.
Variaes em nveis de trealose
Glicognio e trealose esto relacionados com o aumento da viabilidade
e vitalidade por serem fontes intracelulares de energia. A manuteno de
funes celulares essenciais e a sobrevivncia das clulas durante a esto-
cagem dependem do nvel de trealose interna (Franois; Parrou, 2001).
A perda de viabilidade est relacionada com o decrscimo da reserva de
carboidratos das clulas, e a queda em teores de trealose induz deteriorao
no processo de polarizao da membrana. Estudos anteriores mostraram
que a reteno de um nvel alto de trealose durante a fermentao no evita
as perdas na capacidade fermentativa, quando a levedura utilizada para
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176 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
fermentar massas congeladas de pes. Isso indica que o incio da fermen-
tao desencadeia uma rpida mobilizao da trealose com consequente
diminuio da resistncia a estresses, mesmo quando os teores iniciais
de trealose so altos (Van Dijck et al.,1995). Quando as clulas perdem a
polaridade, o pH interno cai e a viabilidade diminui lentamente (Gabier
et al., 2005). A trealose tambm atua como um protetor contra o estresse
oxidativo produzido durante o processo fermentativo (Saharan; Sharma,
2010). A mobilizao da trealose observada quando as clulas em fase es-
tacionria passam a se multiplicar com mudanas na atividade das enzimas
essenciais, tais como glutationa redutase que est envolvida com a sobre-
vivncia e recuperao das clulas frente a estresses (Sebollela et al., 2004).
A atividade destas enzimas praticamente abolida a 40C, uma tempera-
tura que induz resposta fisiolgica para acmulo de trealose. A inibio
da glutationa redutase pela trealose aumenta em presena de etanol, indi-
cando que a atividade enzimtica drasticamente afetada pelo etanol. A
inibio enzimtica pode ocorrer mesmo aps um estresse, caso a trealose
acumulada no seja prontamente degradada (ibidem). Um estudo recen-
te mostrou que as leveduras selvagens acumulam menos trealose do que
as comerciais (Barrajn et al., 2011).
Variaes em nveis de glicerol
O glicerol sintetizado em resposta a diversas situaes de estresse. A
sntese do glicerol depende de vrios fatores, tais como a linhagem selecio-
nada, quantidades de clulas no inculo, concentrao de ons bissulfito
presente no mosto, concentrao de acares, estresse osmtico, tipo de
fonte de nitrognio e sua concentrao, pH e condies de aerao (Ough et
al., 1972; Gardner et al., 1993; Albers et al., 1996; Ribreau-Gayon et al.,
2000; Carrasco et al., 2001; Torija et al., 2002). No entanto, quantidades
pequenas de dixido de enxofre ou SO
2
(100 ppm) diminuem significativa-
mente a sntese de glicerol (Rankine; Bridson, 1971). O acmulo de glicerol
interno est inversamente correlacionado com a temperatura de fermenta-
o na fabricao de vinhos. As clulas que no conseguem sintetizar ou
reter glicerol interno fermentam lentamente ou deixam de fermentar em
baixas temperaturas.
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 177
Durante o crescimento anaerbico, o NADH formado no pode ser oxi-
dado pelo oxignio, sendo reoxidado via formao de glicerol. O acmulo de
glicerol causado pela necessidade de as clulas manterem um balano re-
dox favorvel (Berovic et al., 2007). As interaes das linhagens de levedura
entre si, a temperatura e a agitao tambm afetam a produo de glicerol
(Remize et al., 2000). Portanto, o glicerol interno, alm de atuar como um
protetor osmtico, tambm contribui com a manuteno do balano redox
das clulas, em caso de estresse osmtico. A produo elevada de glicerol
est relacionada com o aumento na expresso de duas isoformas da enzima
glicerol-3-fosfato desidrogenase Gpd1p e Gpd2p (Pigeau; Inglis, 2005).
Variaes em nveis de acetaldedo e acetato
bem conhecido que o acmulo de produtos inibitrios durante a fer-
mentao tais como etanol, cido actico e acetaldedo afetam o crescimen-
to e a viabilidade, bem como a estrutura e funo das membranas celulares
que, por sua vez, regulam o transporte de nutrientes. O acetaldedo alta-
mente reativo e biologicamente txico alm de ser muito polar e isso pode
causar estresse aquoso (Hallsworth, 1998). A produo de acetaldedo varia
nas diferentes linhagens de levedura, na faixa de 0,5 mg L
-1
a 700 mg L
-1

(Liu; Pillone, 2000).
A adaptao a um meio acidificado com cido actico protege as clulas
da levedura Saccharomyces cerevisiae contra a morte celular programada ou
apoptose induzida por este cido (Giannattasio et al., 2005). Alm disso, a
formao de aldedos e cido actico diminui com a elevao na quantidade
do inculo em fermentaes realizadas na presena de concentraes altas
de acar (Arshad et al., 2008). Em mostos fermentados de vinho, as con-
centraes de acetaldedo variam normalmente entre 0,3 g.L
-1
a 0,4 g.L
-1

(Martinez et al., 1997). Concentraes altas de acetaldedo adicionado (
400mg L
-1
) reduzem a durao da fase lag e a velocidade especfica de cres-
cimento (Stanley et al., 1997). Por outro lado, em concentraes menores
de acetaldedo (s 580mg L
-1
), a fase lag e a velocidade especfica de cresci-
mento aumentaram tanto em condies aerbicas quanto anaerbicas, mas
somente em presena de 3% a 6% de etanol (idem, 1993). Por fim, sugere-se
que o acetaldedo inicialmente produzido poderia ser utilizado como um
marcador da atividade fermentativa em processos industriais, uma vez que
varia com a linhagem da levedura (Cheraiti et al., 2010).
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178 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
O bissulfito: preservativo qumico
Outros produtos inibitrios esto presentes no melao a ser fermenta-
do. Um deles o bissulfito de sdio que usado como agente antioxidante
e tambm como antimicrobiano na fabricao de vinhos penetrando nas
clulas de levedura por difuso simples. No entanto, o bissulfito forma-
do em pequenas quantidades pelas clulas de levedura a partir do nion
sulfato, sendo um precursor da sntese de aminocidos sulfurados. Den-
tro das clulas, o dixido de enxofre (SO
2
) dissociado em SO
3
2-
e HSO
3
-
,
causando reduo no pH intracelular e consequentemente perda de viabili-
dade (Walker, 1998). Embora S. cerevisiae tolere nveis mais altos de sulfito
(2,0% a 3,1% em p/v) do que as bactrias e leveduras selvagens, nveis ele-
vados causam fermentaes lentas (sluggish) e at a interrupo prematura
da fermentao (stuck fermentations) como j descrito (Boulton, 1996; Free-
man; Donald, 1957).
Os efeitos txicos do etanol produzido
Concentraes de etanol acima de 4%-6% (v/v) podem afetar seriamente
os processos celulares. Entre as estratgias usadas para aumentar a sobrevi-
vncia das clulas na presena de altas concentraes de etanol esto a indu-
o de alteraes na composio e fluidez (ex., aumento nos nveis de cidos
graxos, aminocidos e ergosterol) das membranas, bem como o aumento da
expresso de protenas de choque trmico (Ding et al., 2009). Na verdade,
o efeito inibitrio do etanol e de outros produtos metablicos torna-se evi-
dente durante ciclos sucessivos de fermentao com reutilizao de clulas,
ao longo dos quais ocorre o acmulo intracelular e gradual dos subprodutos
txicos nas clulas (Marques; Serra, 2004).
Variaes nos nveis das espcies reativas
do oxignio molecular
bem conhecido que as mitocndrias geram espcies reativas do oxi-
gnio molecular (ROS) durante a respirao celular. Estas espcies reati-
vas so degradadas pelo sistema enzimtico de defesa das mitocndrias
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 179
medida que so formadas. Temperaturas elevadas estimulam o acmulo
de espcies reativas do oxignio na mitocndria das leveduras (Davidson;
Schiestl, 2001). A expresso de genes que codificam enzimas que destroem
perxidos (superxido dismutase e catlase) foram observados em levedu-
ras (Zhang et al., 2003). Radicais livres tambm so gerados durante conge-
lamento e desgelo das clulas de levedura (Park et al., 1998).
Nutrientes e seus efeitos sobre atividade fisiolgica
das clulas
Para manter as atividades fisiolgicas em um nvel favorvel, as clulas
das leveduras necessitam de uma fonte de carbono, prtons dissociados no
meio (pH baixo), oxignio, nitrognio (sal de amnia, ureia, aminocidos),
fsforo, potssio, magnsio, fonte de enxofre, ctions inorgnicos e fatores
de crescimento (como as vitaminas exigidas em nveis de moles) (Walker,
1998; Walker, 2004). Embora a matria-prima comercial seja rica em nu-
trientes necessrios ao crescimento das leveduras, suplementaes nutri-
cionais com fosfato e nitrognio so necessrias para aumentar o acmulo
de biomassa e produo de etanol. As necessidades de suplementao nutri-
cional dependem da linhagem de levedura, nmero de clulas presentes no
inculo e a composio da matria-prima (Arshad et al., 2008; Mukhtar et
al., 2010). O catabolismo das clulas da levedura Saccharomyces cerevisiae
muito mais preservado durante a privao de uma fonte de carbono do
que uma fonte de nitrognio (Nilsson et al., 2001). Assim, altos nveis de
fontes de carbono associados a baixos nveis de fontes de nitrognio so as
causas mais comuns do desempenho pobre das fermentaes (Pretorius,
2000).
Exigncias por fontes de nitrognio e fosfato
Nitrognio e fsforo constituem as principais exigncias nutricionais
para o crescimento e eficincia da produo de etanol, pois esto presen-
tes nos cidos nucleicos e fosfolipdios. A suplementao com DAP (di-
-amnio-fosfato) tem sido usada como fontes de fosfato e nitrognio. A
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180 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
suplementao com DAP apresenta um timo entre 32 a 54 ppm depen-
dendo da matria-prima. Em concentrao tima de DAP, a quantidade
de cido actico produzido diminui com ganhos em rendimentos de etanol
(Mukhtar et al., 2010). Por outro lado, quando o DAP adicionado ao me-
lao em concentraes maiores que 150 ppm, a ureia reduz a formao de
etanol (ibidem).
Quando as clulas so submetidas ao estresse osmtico, alguns ami-
nocidos (histidina, leucina, lisina, arginina, alanina, asprtico, triptofano)
intracelulares diminuem nas primeiras horas de fase logartmica em meio
contendo 20g.L
-1
de glicose. Isso sugere que a adio de aminocidos in-
duz a sntese de protenas em altas concentraes de acar no meio. Na
fase estacionria, a disponibilidade de aminocidos internos diminui ainda
mais em funo da falta de nutrientes (Pham; Wright, 2008). A elevao
nos nveis de viabilidade e proliferao celular, bem como a ativao da via
glicoltica podem ser conseguidas com a suplementao do meio com um
coquetel de aminocidos (Pham; Wright, 2008).
Em condio de exausto da fonte de carbono, a maior perda das clu-
las consiste na reduo do nvel de energia disponvel (Thomsson et al.,
2003). A falta da fonte de carbono reduz o pool de ATP das clulas a valores
inferiores a 0,1 mol.g
-1
, enquanto as clulas em estado de jejum por falta de
nitrognio apresentam um pool de ATP elevado a 6 mol.g
-1
. Adio de pe-
quenas concentraes de glicose (0,1g.L
-1
para 1,0g.L
-1
de clulas iniciais)
a uma cultura, no incio do estado de jejum ou mesmo em sua fase estacio-
nria mais avanada, permite s clulas preservarem sua atividade fermen-
tativa. A adaptao ao estado de jejum nutricional pode ser conseguida por
meio de uma diminuio gradual de nutrientes (ibidem).
A adaptao ao etanol produzido
As clulas da levedura S. cerevisiae, adaptadas ao crescimento em meios
contendo concentraes crescentes de etanol, no perdem atividade de
crescimento em um meio contendo uma concentrao alta de etanol (Dinh
et al., 2008). No entanto, o teor de lipdios das membranas dessas clulas
adaptadas bem como seus volumes (clulas maiores) so diferentes das c-
lulas no adaptadas. Isso sugere que a adaptao ao etanol est relacionada
com o ciclo de diviso celular.
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 181
Necessidades de ctions inorgnicos
As necessidades nutricionais das leveduras por minerais so bastante
conhecidas e foram extensivamente revisadas. O papel dos minerais est
descrito em detalhes abaixo (Walker, 1998; Walker, 2004).
Potssio: constitui 1% a 12% da massa seca da levedura. O potssio atua
como o cofator principal de enzimas envolvidas com a fosforilao oxidati-
va, sntese de protenas e catabolismo de hidratos de carbono.
Sdio: concentraes elevadas de ons de sdio so prejudiciais s funes
celulares, mas as clulas dispem de mecanismos de extruso de ctions.
Clcio: este ction desempenha um papel fundamental como mensageiro
secundrio na transmisso de estmulos externos em clulas de eucariotos.
Alm disso, o clcio se liga parede das clulas participando da floculao
e apresentando uma ao antagnica quanto ao consumo de magnsio, blo-
queando processos metablicos essenciais. No entanto, quando utilizado
em quantidades apropriadas (0,5 mmol.L
-1
a 1,5 mmol.L
-1
), ocorrem au-
mentos na velocidade da fermentao e do crescimento da clula. O clcio
est relacionado com o aumento da atividade da ATPase das membranas e
nveis de protena (Li et al., 2010).
Magnsio: o metal mais abundante das clulas dos seres vivos, sendo
essencial para a multiplicao celular. Constitui 0,3% da clula viva em peso
seco e atua como um cofator essencial para cerca de 300 enzimas envolvidas
com as vias metablicas. Apesar de sua importncia, o conhecimento das
funes deste on e da regulao dos seus transportadores ainda limitado
em Saccharomyces cerevisiae (Pisat et al., 2009).
Zinco: estes ons podem ser txicos, pois afetam a permeabilidade das
membranas quanto a entrada de potssio, causando diminuio na atividade
de fermentao. Em concentraes de zinco acima de 3,0 mg.L
-1
, a concen-
trao de etanol produzido diminui (Tosun; Ergun, 2007). So necessrios
aproximadamente 7 x 10
8
tomos de zinco/clulas para o crescimento timo
(Simm et al., 2007). Nas clulas crescidas em meio contendo zinco, este me-
tal se acumula nos vacolos por muitas divises celulares consecutivas, mes-
mo quando o meio passa a se tornar pobre em relao a este on (ibidem).
Nquel: este ction no um nutriente essencial, mas pode se acumular
nas clulas da levedura Saccharomyces cerevisiae. Porm, o crescimento e os
teores de protena interna diminuem quando a concentrao de nquel no
meio for superior a 20 mg.mL
-1
(Neelam; Sood, 2008).
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 181 07/12/2012 21:50:01
182 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Interaes entre leveduras
A grande diversidade de microrganismos e de suas atividades metabli-
cas so as razes de os microrganismos estarem envolvidos em tantos pro-
cessos industriais. A compreenso dos efeitos das interaes entre os mi-
crorganismos essencial para o melhoramento de um processo industrial.
A convivncia de leveduras diferentes em culturas mistas depende dos se-
guintes fatores (De Almeida, 2011):
interao entre elas (gnero e espcie);
condies de fermentao (tipo de processo, alimentao, temperatu-
ra, aerao);
seu genoma e sua atividade metablica;
resistncia a estresses (trmico, alcolico);
falta de nutrientes e presena de inibidores.
As interaes entre os organismos podem ser do tipo:
predador/presa;
competio;
inquilinismo;
simbiose;
neutralismo;
comensalismo;
protocooperao;
amensalismo ou antagonismo.
Fatores determinantes da convivncia entre leveduras
Diferentes espcies de leveduras provenientes da matria-prima e/ou
do prprio ambiente podem ser encontradas em um processo de fermen-
tao. As variaes em disponibilidade de oxignio, temperatura e nveis
de etanol produzido, bem como a acidez so fatores ambientais que deter-
minam variaes nas propores das leveduras nos diferentes estgios do
processo. As leveduras do gnero Hanseniaspora, Candida, Metschnikowia,
Pichia, Kluyveromyces, Issatchenkia, Dekerae e Schizosaccharomyces, podem
sobreviver juntamente com a levedura Saccharomyces no mesmo ambiente
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 183
por serem tolerantes ao etanol (Fleet; Heard, 1993). Leveduras do gnero
Hansienospora, Candida, Picchia e Metschnikowia predominam no incio
do mesmo processo de fermentao, mas logo deixam de predominar em
funo da capacidade de propagao maior da levedura Saccharomyces ce-
revisiae em fermentaes espontneas (ibidem).
As leveduras no Saccharomyces so, em geral, menos tolerantes a bai-
xas concentraes de oxignio. A multiplicao celular com consumo de
oxignio pela levedura Saccharomyces cerevisiae nos primeiros estgios da
fermentao pode contribuir para letalidade precoce das leveduras selva-
gens (Fleet, 2003).
A maioria de leveduras no Saccharomyces no tolera concentraes de
etanol superiores a 5-7% (v/v) e isso explica o fato de perderem viabilidade
quando a fermentao prossegue atingindo concentraes superiores de eta-
nol (Heard; Fleet, 1988). No entanto, leveduras como Kloeckera apiculata,
Candida stellata, Candida cruzei, Candida pulcherima e Hansenula anomal
tm sido encontradas em mosto de uva contendo at 15% (v/v) de etanol
na faixa de 10C a 15C, mas redues na viabilidade ocorrem quando a
temperatura eleva-se a 30C (Gao; Fleet, 1988; Heard; Fleet, 1988). Em
fermentaes a baixas temperaturas, algumas leveduras no Saccharomyces
no perdem viabilidade quando o nmero de clulas permanece alto at o
final do processo (Heard; Fleet, 1988).
Alguns estudos tm demonstrado que as linhagens comerciais competem
com as selvagens, mas sem elimin-las completamente e que a escolha da le-
vedura starter gera populaes diferenciadas de leveduras selvagens no meio
(Egli et al., 1998). Em baixas temperaturas, algumas espcies de le veduras
no Saccharomyces persistem no processo em proporo significante duran-
te a fermentao (Heard; Fleet, 1988). Na verdade, a competio entre le-
veduras depende das linhagens, das condies de implantao do processo
e da matria-prima utilizada, dependendo da presena de contaminantes e
da disponibilidade de nutrientes. O uso de leveduras selecionadas seria bas-
tante beneficiado com o desenvolvimento de tcnicas genticas e fisiolgicas
que pudessem claramente identificar os graus de dominncia e permanncia
de leveduras diferentes e seus desempenhos fermentativos na populao mi-
crobiana. Isso possibilitaria o monitoramento do processo fermentativo em
condies industriais e realizao de intervenes quando necessrias.
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184 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Interaes metablicas entre leveduras
Os metabolitos excretados pelas leveduras parecem ser os principais
determinantes das interaes entre microrganismos, quer seja pelo au-
mento na concentrao de um determinado produto (por exemplo, glicerol
ex terno, acetaldedo e etanol) ou assimilao do produto de um microrga-
nismo por outros como o caso da assimilao e metabolizao de cidos
orgnicos fracos. Interaes podem ocorrer entre diversos tipos de levedura
ou entre bactrias e leveduras (Fleet, 2008). As interaes mais conhecidas
entre leveduras so aquelas relacionadas com a diminuio ou aumento de
acidez, aumentos em glicerol externo e modulao de sabores em bebidas
fermentadas (ibidem). A interao entre Turulaspora delbrueckii e Saccha-
romyces cerevisiae reduz a acidez voltil e os nveis de acetaldedo em vinhos
(Bely et al., 2008). J a levedura Schizosaccharomyces pombe reduz a acidez
mlica em culturas mistas quando convive com a levedura Saccharomyces
cerevisiae (Snow; Gallander, 1979). Em culturas mistas de Saccharomyces
cerevisiae e Issatchenkia orientalis, a diminuio da acidez mlica tambm
foi observada. Concentraes de 15-16 mg.mL
-1
de cido mlico podem ser
detectadas em mosto de uva (Kim et al., 2008). O aumento do glicerol foi
observado em coculturas de Candida cantarelli e Saccharomyces cerevisiae
(Toro; Vazquez, 2002).
As leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis tm sido usa-
das como starters na produo de tchapalo, um tipo de cerveja produzida a
partir de mosto de sorgo, em cuja fermentao as duas leveduras interagem
por meio de sinergismo (NGuessan et al., 2010). A cultura pura de S. cere-
visiae produziu menos etanol que a cultura mista (1 parte de Saccharomyces
cerevisiae: 2 partes de Candida tropicalis) em fermentao a 35C para a
produo de tchapalo. Isso indica que ocorreu um sinergismo entre as duas
leveduras em relao produo de etanol. Interaes entre bactrias e Sac-
charomyces cerevisiae tambm ocorrem em fermentaes abertas ou realiza-
das em ambientes no esterilizados (Temudo; Mato, 2009).
Em uma cocultura de Lactobacillus kefiranofaciens e S. cerevisiae, as c-
lulas de levedura consomem cido ltico, reduzindo sua concentrao, en-
quanto a velocidade de produo do kefir pelo Lactobacillus kefiranofaciens
aumenta (Cheirsilp et al., 2003). Este polissacardeo, constitudo por uni-
dades de galactose e glicose, tem sido empregado como espessante, estabi-
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 185
lizante, emulsificante e, em funo de sua atividade antitumoral, tem sido
utilizado no combate a tumores. A quantidade de polissacardeo secretado
maior em cultura mista indicando que o Saccharomyces cerevisiae estimula
o crescimento da bactria e a produo do polissacardeo. Assim, duran-
te a formao de kefir um sinergismo em relao ao crescimento tem sido
observado.
As interaes metablicas entre leveduras em fabricao de etanol com-
bustvel so pouco conhecidas. Efeito sinergstico da temperatura e do eta-
nol produzido (Aldiguier et al., 2004), bem como o sinergismo entre o pH
e componentes do meio (por exemplo, sulfito e cido ltico) com efeitos
sobre a produo de etanol esto descritos na literatura. No entanto, as inte-
raes entre linhagens diferentes de levedura durante a produo de etanol
combustvel so ainda pouco conhecidas (Dorta et al., 2006).
Numa cocultura de Saccharomyces uvarum e uma linhagem hbrida natu-
ral (hbrido entre segregantes do Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces
uvarum, proporo 1:1 no inculo) observou-se alteraes na velocida-
de especfica da produo de etanol, biomassa e formao de acetaldedo,
quando comparadas com os dados obtidos em monoculturas (Cheraiti et
al., 2005). A cultura pura da levedura hbrida Saccharomyces uvarum pro-
duziu uma maior quantidade de acetaldedo e tudo indica que a associao
entre o acetaldedo produzido pelas duas leveduras pode ter causado um
aumento na velocidade especfica da produo de etanol como observado
na cultura mista. Apesar de txico, um nvel baixo de acetaldedo estimula
o crescimento de leveduras com reduo da fase logartmica de crescimento
(Stanley et al., 1993). Em outra cultura mista contendo Saccharomyces ce-
revisiae e Saccharomyces uvarum em meio sinttico (Favale et al., 2007), o
Saccharomyces uvarum tornou-se dominante na populao de clulas em
funo de seu maior grau de multiplicao, bem como a excreo de nveis
superiores de metabolitos secundrios (por exemplo, glicerol e acetato). Os
nveis de cido pirvico excretados tambm so uma caracterstica da li-
nhagem de levedura e podem dar informaes que indicam o andamento
do processo. Em produo de vinho, o nvel de pirvico alcana seu valor
mximo no incio da fermentao, enquanto o acetaldedo aumenta durante
todo tempo e atinge seu valor mximo no final do processo fermentativo
(Morata et al., 2003).
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186 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Inibio da atividade das clulas de levedura e seus
mecanismos de defesa em hidrolisados de materiais
celulsicos
Os hidrolisados lignocelulsicos contm uma grande variedade de com-
postos txicos constitudos por cidos orgnicos fracos, aldedos furnicos
e compostos fenlicos que exercem efeitos negativos sobre o metabolismo
relacionado com o crescimento e a fermentao da levedura Saccharomyces
cerevisiae (Almeida et al., 2007).
Estratgias baseadas em adaptao (modulao da expresso gnica)
podem ser utilizadas para aumentar a tolerncia aos inibidores (Parawira;
Tekere, 2011; Almeida et al., 2009). Uma estratgia simples de adaptao
seria a exposio das clulas de levedura a concentraes crescentes de ini-
bidores em processo de batelada alimentada ou em processo contnuo. Nes-
tas condies, a produo de enzimas capazes de metabolizar os inibidores
se eleva com diminuio da fase lag (Heer; Sauer, 2008).
O cido actico o cido orgnico fraco mais abundante em hidrolisa-
dos de bagao de cana-de-acar, sendo este tambm um subproduto da
fermentao alcolica em baixas concentraes de acar (Almeida et al.,
2007). O efeito inibitrio deste cido sobre a levedura Saccharomyces cere-
visiae pode ser reduzido pelo aumento do pH do meio. O cido frmico
um agente inibitrio de maior efeito sobre a levedura do que o cido actico,
pois apresenta um pKa menor que o do cido actico (Almeida et al., 2007)
e induz apoptose (Du et al., 2008).
Os derivados furnicos resultantes de uma reao de desidratao das
hexoses e pentoses (Almeida et al., 2009) induzem apoptose (Perrone et al.,
2008). A reduo dos nveis dos inibidores (derivados de hexoses e pen-
toses) resulta da formao dos respectivos lcoois pela prpria levedura,
como uma resposta de defesa das clulas (Heer et al., 2009).
Os compostos aromticos derivados da lignina afetam o crescimento e a
fermentao, sendo seus efeitos inibitrios dependentes das estruturas dos
aromticos (Larsson et al., 2000). A lacase uma enzima produzida por
fungos que reduz a toxidade dos hidrolisados por transformar o coniferi-
laldedo no lcool correspondente (ibidem). A vanilina outro derivado
da hidrlise que atua em concentraes muito baixas e seu efeito inibitrio
est relacionado com o metabolismo do ergosterol (Endo et al., 2008; 2009).
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A COMPLEXIDADE DA PRODUO DO BIOETANOL EM FERMENTAES ABERTAS... 187
As leveduras contendo teores maiores de ergosterol so mais tolerantes
vanilina.
Concluses e perspectivas
A levedura Saccharomyces cerevisiae um organismo robusto quanto
sobrevivncia em condies de estresses fsicos e capacidade de tolerar o
etanol. O uso de altas quantidades de clulas (high cell density fermenta-
tions) minimiza os efeitos da evoluo populacional e propicia aumentos
em rendimento alcolico em curtos perodos de tempo. Elevaes na di-
versidade dos contaminantes e o aparecimento de variantes fenotpicas so
observados durante processos de longa durao com reutilizao de clulas.
No entanto, a dinmica populacional deve ocorrer com uma velocidade in-
ferior ao surgimento de variaes populacionais no benficas ao processo.
Leveduras no Saccharomyces, vindas junto com a matria-prima e sua pro-
pagao, podem passar a constituir uma parte significativa da populao de
leveduras que possam ser prejudiciais ao processo. Outro fator que afeta o
processo consiste no uso de volumes grandes de trabalho (large working vo-
lumes) nos biorreatores. Quanto maior o volume do biorreator, mais difcil
ser a manuteno de temperaturas favorveis e a homogeneidade da sus-
penso de clulas. A falta de homogeneidade leva formao de gradientes
de concentrao de nutrientes e de clulas, os quais afetam tanto a dinmica
populacional quanto os parmetros cinticos do processo.
Pouco se sabe sobre as interaes que ocorrem entre produtos metablicos
produzidos por leveduras diferentes durante o processo de produo do bio-
etanol. fundamental conhecer quais os tipos de interaes que contribuem
para aumentar o nvel de subprodutos que afetam de forma negativa a cinti-
ca do processo. Por outro lado, o desenvolvimento de leveduras que expres-
sem genes para a secreo de agentes antibacterianos (lisozima), tolerantes
a preservativos qumicos (bissulfito) e a metabolitos txicos (lcoois, cido
actico, acetaldedo e cido dodecanoico) so desejveis (Pretorius, 2000).
Quanto fermentao de hidrolisados celulsicos, fundamental o iso-
lamento e/ou desenvolvimento de leveduras capazes de secretar altas quan-
tidades de celulases e que sejam tolerantes aos inibidores resultantes da hi-
drlise. As enzimas devem ser tolerantes a pHs cidos e apresentarem boa
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 187 07/12/2012 21:50:01
188 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
atividade de hidrlise na faixa de temperatura de 34C a 37C (temperatu-
ras da fermentao alcolica). Os maiores desafios na produo do etanol
celulsico consistem nos altos custos das enzimas comerciais e a necessidade
de uma quantidade grande destas enzimas. Assim, pesquisas so necessrias
para melhorar o processo de hidrlise enzimtica, reduzir tempos de hidr-
lise e minimizar a inibio por produtos da reao enzimtica. Tambm
importante desenvolver pr-tratamentos para material celulsico que sejam
rpidos, eficientes e de baixo custo (Van de Vyver et al., 2011).
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8
Produo de etanol por Zymomonas mobilis
CCT 4494 utilizando substratos
no convencionais como alternativa
produo convencional
Fernanda Maria Pagane Guereschi Ernandes,
Crispin Humberto Garcia-Cruz
1
Consideraes gerais
A crise do petrleo de 1973 gerou grande interesse na busca de recursos
energticos renovveis, assim como em encontrar fontes de recursos org-
nicos capazes de substituir os atuais produtos petroqumicos. At a dcada
de 1970, o etanol no Brasil era apenas um simples subproduto da indstria
canavieira, contudo esta situao mudou por completo a partir da crise do
petrleo. O governo brasileiro promoveu a busca de uma fonte alternativa
de combustvel e retomou as pesquisas e os investimentos para o desenvol-
vimento do lcool como combustvel. O grande momento deste perodo se
deu em 1975 com a criao do Programa Nacional do lcool (Prolcool).
Dessa forma, por um lado, realizaram-se esforos para melhorar a rentabi-
lidade dos processos de obteno de biolcool, e por outro lado, tratou-se
de substituir os processos do tipo qumico por outros do tipo biolgico. Em
funo da queda no preo do petrleo no incio da dcada de 1980, estes
estudos perderam impulso durante certo tempo; contudo, a conscincia de
que os combustveis fsseis vo se esgotar e que necessrio utilizar tecno-
logias menos poluentes fez renascer o interesse nesses processos biolgicos.
Desde aquela data, toda a produo industrial de lcool realizada utili-
zando leveduras, como microrganismo da fermentao, e pouco se conhece
1 Os autores agradecem Fundao de Amparo Pesquisa (Fapesp).
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 195 07/12/2012 21:50:02
196 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
de outros microrganismos que produzam lcool em escala industrial. Em
virtude da situao mundial de destaque que se encontra o Brasil no se-
tor energtico, algumas instituies vm selecionando microrganismos
eficientes para produo de lcool como alternativa futura.
Nos ltimos 15 anos, a bactria Zymomonas mobilis vem despertando
muito interesse por seu potencial na produo de etanol, produzindo apro-
ximadamente 1,9 mol de etanol por mol de glicose, com velocidade trs a
quatro vezes maior que a Saccharomyces cerevisiae.
Zymomonas mobilis uma bactria gram-negativa, que utiliza sacarose,
glicose e frutose como fonte de carbono e energia, produzindo quantidades
equimolares de etanol e CO
2
. Essa bactria tem sido alvo de pesquisas por
causa de seu alto potencial fermentativo, do qual resulta em uma produo de
etanol comparvel, ou at mesmo superior, a obtida por leveduras. Segundo
a literatura, estudos observaram uma srie de vantagens na fermentao com
Zymomonas em relao levedura Saccharomyces, tradicionalmente utiliza-
da em fermentaes etanlicas. Esta bactria apresenta aproximadamente o
dobro de velocidade de crescimento, produz etanol numa velocidade seis a
sete vezes maior e o fator de converso de glicose em etanol 5% maior.
Ainda que a importncia da produo de etanol como energia renovvel
para o Brasil e gerao de empregos seja inegvel, a elaborao de meios de
cultivo de baixo custo um fator importante em processos fermentativos
industriais. O aproveitamento de subprodutos da indstria do acar con-
tendo alta concentrao de sacarose como substratos no processo biotecno-
lgico uma alternativa atrativa e promissora, uma vez que, os substratos
utilizados so caros o que inviabiliza o custo do produto final. Isso poderia
ser melhorado com a utilizao de matrias-primas regionais.
Reviso bibliogrfica
Histrico da produo e uso de etanol no Brasil
Em 1903, foi proposto pelo 1 Congresso Nacional de Aplicao Indus-
trial do lcool que se estabelecesse infraestrutura para promover a produ-
o e o uso de lcool; e, de fato, durante a Primeira Guerra Mundial seu uso
foi compulsrio em muitas reas do pas.
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 197
O Brasil, desde a dcada de 1920, j estudava e testava combustveis al-
ternativos e renovveis, tais como o lcool de cana-de-acar. Um Decre-
to Federal promulgado em 1931 estabelecia as orientaes de transporte e
comercializao do etanol e decretava que at 5% (por volume) fosse adicio-
nado gasolina. At 1941, a produo de etanol atingiu um patamar de 650
milhes de litros por ano (Campos, 2003; Negro; Urban, 2005).
A deciso poltica e econmica envolvendo investimentos adicionais,
do uso da cana-de-acar para produzir etanol, em adio ao acar, foi
tomada pelo Governo Federal, com o Prolcool, implementado em esca-
la comercial nos anos 1970 (Moreira; Goldemberg, 1999). Esta deciso foi
tomada em 1975, quando a economia brasileira foi bastante afetada pela
crise mundial do petrleo ao mesmo tempo que, no mercado internacional,
o preo do acar declinava rapidamente, tornando atrativa a produo de
lcool. Como resposta direta a este abalo econmico, criou-se o programa
de incentivo produo de etanol, com o intuito de futuramente substituir
a gasolina por este biocombustvel (Goldemberg et al., 2004). Embora o
programa mostrasse autossuficincia para sua implementao, a queda nos
preos do petrleo faria que o Prolcool passasse por anos de dificuldade.
Assim, a perspectiva da produo no s de lcool e acar, mas tambm de
explorar ao mximo os subprodutos gerados durante o processo de obten-
o do lcool caiu no esquecimento governamental, sendo posteriormente
retomada por esforo prprio de usinas e destilarias.
A produo de cana-de-acar e lcool no Brasil entre 1975 e 1985 qua-
druplicou e, o etanol tornou-se o mais importante combustvel. Contudo, a
dinmica que sustentava a oferta e consumo brasileiro do etanol carburante
continuamente esteve pressionada pela competio dos preos oscilantes
do petrleo no mercado internacional e, sobretudo, pela maior atratividade
da commodity acar, o que culminou com a desacelerao do programa na
dcada de 1990 acarretando uma marcante diminuio da frota de carros
100% movidos a lcool e a desestabilizao conjuntural do modelo (Ne-
gro; Urban, 2005).
A competitividade estabelecida entre os preos do petrleo e dos leos
vegetais e visando atender s preocupaes ambientais existentes, a dcada
de 1990 caracterizou-se pela produo comercial e instalao de plantas de
produo de bicombustvel em escala industrial (Campos, 2003).
As principais etapas podem ser observadas na Figura 8.1, esta ilustra a
evoluo dos biocombustveis no Brasil.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 197 07/12/2012 21:50:02
198 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Figura 8.1 Evoluo dos biocombustveis no Brasil
Fonte: Agncia Nacional do Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis ANP, 2010.
Para a Unio da Agroindstria Canavieira de So Paulo nica (2010)
em seu site, a produo mundial de cana-de-acar totaliza quase 1,5 bilho
de toneladas e est localizada predominantemente na faixa tropical do pla-
neta, nos pases em desenvolvimento da Amrica Latina, frica e Sudeste
Asitico. O Brasil lder mundial na produo de cana-de-acar, com 90%
na regio Centro-Sul e 10% no Nordeste.
Segundo a Associao Nacional dos Fabricantes de Veculos Automo-
tores (Anfavea) (2010), a quantidade de vendas internas no atacado por
tipo de combustvel de veculos automotores, considerando automveis e
comerciais leves, entre nacionais e importados, no ano de 2003 foram (em
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 198 07/12/2012 21:50:02
PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 199
unidades): 36,4 mil a lcool, 48,2 mil flex-fuel, 1,16 milhes a gasolina e
54,5 mil a diesel, com participao de mercado, respectivamente, iguais a
2,8; 3,7; 89,2 e 4,2%. Em 2009, os nmeros se apresentaram, segundo a An-
favea (2010), em 70 mil unidades a lcool, 2,65 milhes flex-fuel, 221,7 mil
a gasolina e 3,0 milhes a diesel, com uma participao de 88,2% flex-fuel,
7,4% a gasolina e 4,5% a diesel nos comerciais leves.
Importncia de Zymomonas mobilis no contexto histrico
da produo de etanol no Brasil
As leveduras vm sendo utilizadas pelo homem h pelo menos 8 mil
anos e sua manipulao promoveu grande impacto na produo de alimen-
tos, tendo-se o po, a cerveja, o vinho e o saqu como os produtos mais
representativos desses processos milenares de manipulao.
O considervel progresso na rea da biotecnologia permite a utilizao
de tcnicas fermentativas j bem estabelecidas, para produo de vrias
substncias ou mesmo produtos, tais como: etanol, cido ctrico, corantes,
enzimas e vitaminas entre outros; oriundos da ao de bactrias, fungos fi-
lamentosos e leveduras. O domnio destas tcnicas permite a especificidade
de ao em relao ao substrato utilizado (Sandes; Di Blasi, 2000).
As leveduras tm representado importante papel como organismo-mo-
delo em estudos bioqumicos, genticos e de biologia molecular (Torres;
Moraes, 2000; Akada, 2002). Cerca de 500 espcies de leveduras so co-
nhecidas pelo homem e, dentre as produtoras de etanol destacam-se, es-
pcies do gnero Saccharomyces, Schizosaccharamyces, Pichia e outras. A
espcie mais importante de levedura alcolica a Saccharomyces cerevisiae,
que possui largo espectro de utilizao, sendo empregada na produo de
pes, bebidas alcolicas, etanol e muitos outros produtos.
Quanto tecnologia necessria produo de lcool, utilizando a cana-
de-acar e seus resduos, estudos vm sendo realizados por pesquisadores
para diminuir seu custo econmico de produo, otimizar as condies de
bioconverso etanlica, e selecionar os microrganismos com maior produtivi-
dade em etanol (Tauk, 1976; Pereira Jr.; Bulock, 1994; Menezes et al., 1998;
Venturini-Filho; Cereda, 1998; Cabrini; Gallo, 1999; Ribeiro; Horii, 1999;
Dutra et al., 2001; Laluce et al., 2002; Ernandes; Garcia-Cruz, 2011a, b).
Entre as bactrias produtoras de etanol, a espcie Zymomonas mobilis
apresenta atributos tecnolgicos que potencializam seu emprego na fer-
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 199 07/12/2012 21:50:02
200 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
mentao alcolica em escala industrial, pois possui habilidade de transfor-
mar acares em etanol e gs carbnico em condies comparveis quelas
exigidas pelas leveduras. Sua produtividade de etanol a partir de glicose
ultrapassa 97% do valor terico mximo (Sprenger, 1996).
Gibbs e DeMoss (1954) demonstraram que essa bactria utiliza, para
o catabolismo anaerbio desses carboidratos, uma modificao da via de
Entner-Duodoroff, podendo produzir mais de 1,9 mol de etanol por mol
de glicose fermentada e pequena quantidade de lactato, de acordo com a
seguinte reao:
1 glicose 1,93 etanol + 1,8 CO
2
+ 0,053 lactato
Em 1984, Rogers e colaboradores fizeram estudos comparativos entre
a bactria Zymomonas mobilis e a levedura Saccharomyces carlsbergensis em
relao produo de etanol. Nestes estudos, os autores observaram uma
srie de vantagens na fermentao com Zymomonas em relao levedura.
Esta bactria apresenta aproximadamente o dobro de velocidade de cresci-
mento, produz etanol numa velocidade seis a sete vezes maior e o fator de
converso de glicose em etanol 5% maior. Alm disso, a Zymomonas mo-
bilis no requer controle adicional de oxignio para manter sua viabilidade
em altas concentraes de clulas (Rogers et al., 1980).
A capacidade de crescer rapidamente na ausncia de oxignio sugere
seu uso em processos contnuos de fermentao para a produo comercial
de etanol. Maiores detalhes desses resultados podem ser observados na
Tabela 8.1.
Tabela 8.1 Estudo comparativo entre a bactria Zymomonas mobilis e a levedura Saccharomyces
carlsbergensis utilizando meio de cultura com concentrao inicial de glicose de 100,0 g/L com
relao produo de etanol
Zymomonas mobilis Saccharomyces carlsbergensis
Tempo de processo (h) 2,51 5,64

p
(h
-1
) 5,44 0,82
Y
x/s
0,028 0,043
Y
p/s
0,465 0,460
Velocidade especfica de produo de etanol (
p
), fator de converso de glicose em clulas (Y
x/s
) e em
etanol (Y
p/s
). Fonte: Rogers e colaboradores (1984).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 201
Segundo Lyness e Doelle (1980), a fermentao quantitativa de glicose,
frutose ou sacarose a etanol e dixido de carbono considerada uma carac-
terstica importante do gnero Zymomonas. Quando glicose e frutose so
utilizadas como fonte de carbono, obtido rendimento superior a 95% em
relao ao rendimento terico, pois a fermentao produz quase exclusi-
vamente etanol e CO
2
. Quando sacarose, um substrato industrialmente
disponvel e de baixo custo, utilizado, o rendimento de etanol representa
75-80% do valor terico, em funo da formao de subprodutos como le-
vana e sorbitol.
O microrganismo Zymomonas mobilis
Histrico do microrganismo
O uso de microrganismos com a finalidade de obter produtos que ve-
nham beneficiar e melhorar o estilo de vida do homem faz parte da civili-
zao desde o incio dos tempos. O aguamiel (seiva fermentada natural-
mente por Zymomonas mobilis) foi utilizado pelos astecas na preveno e no
tratamento de infeces intestinais, ainda quando no se conhecia o efeito
benfico dos microrganismos. Em 1911, Barker e Hillier apud Swings e De
Ley (1977) foram os primeiros a estudar a bactria responsvel pela dete-
riorao do flavour de bebidas fermentadas, sendo a eles atribuda a real
descoberta desse gnero. Estes, como no atriburam um binmio latino ao
nome de Zymomonas mobilis, em 1928, foi creditada a Lindner apud Swings
e De Ley (ibidem) a descoberta dessa bactria, por ocasio do seu isola-
mento no Mxico, a partir da seiva fermentada de Agave atroveriens, o qual
constitui uma bebida regional muito popular chamada pulque (Gonal-
ves de Lima et al., 1970).
Logo aps o isolamento da bactria Zymomonas mobilis, em 1931, Lind-
ner, estudando as propriedades antagonistas dessa bactria verificou, aps
ingerir o filtrado, timos resultados quando o mesmo era utilizado no trata-
mento de certas infeces entricas e deu o nome a ela de Termobacterium mo-
bile sendo muito semelhante de Barker e Hillier (Falco de Morais, 1993).
Em 1936, Kluyver e Van Niel reconhecem-na como gnero Zymomonas,
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202 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
considerando uma s espcie Zymomonas mobilis com duas subespcies:
Zymomonas mobilis subsp. mobilis e a Zymomonas mobilis subsp. pomacii
(Swings; De Ley, 1977, Falco de Morais, 1983 a, b).
A dcada de 1970 caracterizou-se por apresentar diversos esforos no
sentido de melhorar e buscar novas fontes para a produo de etanol. Den-
tro deste contexto, a bactria Zymomonas mobilis revelou-se um microrga-
nismo promissor. Durante a fermentao da sacarose para sua converso
em etanol, no entanto, surgiu como uma das razes do baixo rendimento,
um polissacardeo, a princpio de alto peso molecular, formado a partir da
hidrlise da sacarose, denominado ento de levana (Jerez, 1993; Ernandes;
Garcia-Cruz, 2009, 2011). Segundo Garcia-Cruz (1997), a levana pro-
duzida a partir da sacarose e no da glicose e frutose ou mistura de ambas
e, sendo um anidrofructosilfructosdio solvel em gua, pode ser tambm
chamado de polifrutana pelo fato de ser constitudo de molculas de fruto-
se. Na indstria de alimentos, a levana tem vrios usos potenciais: agente
espessante, fixador de cores e sabores e em produtos dietticos. Alm disso,
sua hidrlise produz frutose que tem poder adoante superior sacarose
(Ernandes; Garcia-Cruz, 2005).
A ocorrncia da bactria Zymomonas mobilis foi verificada em vrias
partes do mundo e em diversos meios aucarados (Dadds; Martin, 1973;
Swings; De Ley, 1977). Na Europa, em vinhos de mas e de peras (Millis,
1956), em polpa de ma (Carr; Passmore, 1971) e como contaminante em
indstrias de cerveja (Dadds; Martin, 1973). No Mxico, na fermentao
da seiva do agave (Carr, 1974); na frica, sia e Amricas, fermentando
vinhos de seiva de palmas diversas (Dadds; Martin, 1973).
No Brasil, especificamente em Pernambuco (nordeste brasileiro), Gon-
alves de Lima isolou diversas linhagens de Zymomonas a partir de caldo de
cana-de-acar fermentado, bebida popularmente conhecida como caldo
de cana picado, e que atravs de estudos taxonmicos foi denominada de
Zymomonas mobilis variedade recifensis (Gonalves de Lima et al., 1970;
Falco de Morais, 1983; Falco de Morais et al., 1993).
Desde a dcada de 1950, o Departamento de Antibiticos da Universi-
dade Federal de Pernambuco (DAUFPE) vem estudando a atividade an-
tagonista de Zymomonas mobilis em infeces entricas causadas por Sal-
monella, Shigella e Escherichia coli. Os resultados obtidos indicaram o uso
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 202 07/12/2012 21:50:02
PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 203
desta bactria como agente teraputico no combate a enterocolite e cistite,
sendo obtida a regresso dos sintomas em todos os casos (Gonalves de
Lima et al., 1970).
Swings e De Ley (1977) descrevem em seu trabalho as diferentes linha-
gens de Zymomonas mobilis encontradas em vrios pases e o pesquisador
responsvel por seu isolamento (Tabela 8.2).
Tabela 8.2 Diferentes linhagens de Zymomonas mobilis encontradas em vrios pases e o pesqui-
sador responsvel por seu isolamento
Linhagem
N de
linhagem
Fonte Local
Data de
publicao
Isolado por
Zymomonas mobilis
ATCC
10988,
NCIB 8938,
NRRL
B-806
Agave Mxico 1924 Lindner
Zymomonas mobilis
subsp. pomaceae
1 Cidra Bristol, U.K. 1950 Millis
Zymomonas mobilis
subsp. pomaceae
2 Cidra Bristol, U.K. 1950 Millis
Zymomonas mobilis AG 11 Agave Mxico 1950
Gonalves de
Lima et al.
Zymomonas mobilis
subsp. pomaceae
NCIB 8777,
ATCC
29192
Agave Bristol, U.K. antes 1951 Carr
Zymomonas
anaerbia
D-364 Cerveja Bristol, U.K. 1966 Shimwell
Zymomonas mobilis
VP1, VP2,
VP3, VP4
Elaeis sap
Kinshasa,
Zaire
1969
Swings e De
Ley
Zymomonas mobilis 7.4 Elaeis sap
Kinshasa,
Zaire
1969
Swings e De
Ley
Zymomonas mobilis
70.1, 70.2,
70.3, 70.7,
70.8, 70.9,
70.10, 70.11,
70.12,70.14
Elaeis sap
Kinshasa,
Zaire
1970
Swings e De
Ley
Zymomonas mobilis
CP1, CP2,
CP4
caldo de
cana-de-
-acar
Recife, Brasil 1970
Gonalves de
Lima et al.
Zymomonas mobilis
var. recifensis
CP4
caldo de
cana-de-
-acar
Recife, Brasil 1970
Gonalves de
Lima et al.
Fonte: Swings; De Ley (1977).
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204 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Caractersticas fisiolgicas do microrganismo
A bactria Zymomonas mobilis gram-negativa, no esporulante e mvel,
anaerbia facultativa, sendo que, algumas linhagens so obrigatoriamente
anaerbias. Morfologicamente, apresenta-se na forma de bastonete curto e
grosso medindo de 2,0 a 6,0 m de comprimento e 1,0 a 1,4 m de largu-
ra. Quando apresenta mobilidade, possui de um a quatro flagelos polares
(Falco de Morais, 1983). So encontradas geralmente em pares, embora
tambm apaream isoladas. Possuem rotas catablicas comparativamente
simples e no tm a variedade de alternativas metablicas encontradas em
outros microrganismos. De forma a gerar energia suficiente para o cres-
cimento, a Zymomonas mobilis deve catabolizar substratos com altas taxas
especficas de carbono, resultando em baixos rendimentos de biomassa,
uma vez que, a maior parte deste substrato incorporado no catabolismo
do produto final, o etanol (Toma et al., 2003).
Em meios com altas concentraes de acar (melao com mais de 15
Brix), estas bactrias ocorrem como longos filamentos de extremidades di-
latadas. Em meio slido base de glicose, as colnias apresentam-se lenti-
culares de bordas regulares, de colorao branca ou creme e com 1,0 a 2,0
mm de dimetro aps 2 dias de incubao a 30C (Swings; De Ley, 1977).
Acares fermentveis com glicose, frutose e, em alguns casos, sacarose,
so indispensveis na composio do meio de cultura de Zymomonas mobi-
lis. Esta fermenta glicose e frutose gerando quantidades praticamente equi-
molares de etanol e CO
2
, formando colnias de colorao branca ou creme.
A fermentao de 1 mol de glicose d origem a 1,6 de etanol, 1,8 moles
de CO
2
e pequena quantidade de outros subprodutos com lactato, acetal-
dedo, cido actico, glicerol, acetona, di-hidroxicetona, sorbitol, manitol,
levana e cido glicnico.
As condies ideais para o crescimento desta bactria so intervalos de
temperatura de 30C a 36C e intervalos de pH entre 5 e 7. Cultivadas
em meio complexo, podem converter 98% da glicose presente em etanol,
CO
2
, lactato e outros, seguindo um balano metablico simples. Apenas
2% da glicose so utilizados para formar biomassa. As tabelas 8.3 e 8.4 mos-
tram a porcentagem de crescimento de linhagens de Zymomonas mobilis
em diferentes valores de pH e temperatura de incubao, respectivamente
(ibidem).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 205
Tabela 8.3 Porcentagem de crescimento de linhagens de Zymomonas mobilis
em diferentes valores de pH
pH inicial % de crescimento de linhagens
3,05 0
3,5 43
3,7 71
3,85 90
5,7 100
4,5 87
8,0 0
Fonte: Swings; De Ley (1977).
Tabela 8.4 Porcentagem de crescimento de linhagens de Zymomonas mobilis
em diferentes valores de temperatura de incubao (C)
Temperatura de incubao (C) % de crescimento de linhagens
30 100
34 97
36 97
38 74
40 5
Fonte: Swings; De Ley (1977).
Na hidrlise da sacarose, ou de misturas de glicose e frutose, os sub-
produtos da formao de etanol so principalmente a levana e o sorbitol. A
frutose, formada da hidrlise da sacarose, no primariamente transpor-
tada para o interior das clulas, mas sim utilizada na formao de levana
e fruto-oligmeros pela ao da enzima levanasacarase (Loos et al., 1994).
A maioria das cepas requer cido pantotnico, biotina e, ocasionalmen-
te, alguns outros fatores de crescimento como vitamina B
12
, riboflavina, tia-
mina, cido lipoico e cido flico. Alm disso, altas quantidades de extrato
de levedura aumentam a produo de clulas, mas no necessariamente a
produtividade de etanol, levana ou sorbitol (Cromie; Doelle, 1980).
Belaich e Senez (1965) estudaram o efeito de pantotenato no crescimento
de Zymomonas mobilis e observaram que a limitao desta substncia resul-
ta na reduo da velocidade especfica de crescimento da bactria. Os auto-
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 205 07/12/2012 21:50:02
206 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
res citam que o pantotenato uma vitamina essencial produo de etanol
porque a bactria no sintetiza pantotenato, mas necessita desta substncia
para produzir compostos orgnicos essenciais para o crescimento celular,
produzindo, consequentemente, etanol.
Nas fermentaes com Zymomonas mobilis em meio de cultivo contendo
glicose, extrato de levedura, sulfato de amnio, fosfato de potssio e sul-
fato de magnsio, quando a glicose exaurida, cessa a utilizao da fonte
inorgnica de nitrognio (NH
4
) e a bactria comea a metabolizar os ami-
nocidos do meio como fonte de carbono, com liberao do nitrognio na
forma de amnia, resultando num aumento do pH do meio. Caso o meio de
cultivo seja alimentado novamente com glicose, o pH deste meio diminui
gradualmente. Isto se deve a que o mecanismo que gera o potencial eletro-
qumico, e direciona o processo de transporte de entrada de glicose, opera
via excreo de prtons com os produtos metablicos por ao da enzima
prton-translocante ATPase localizada na membrana celular (Ishizaki et
al., 1994).
Aspectos bioqumicos de Zymomonas mobilis
O processo bioqumico da fermentao alcolica caracteriza-se como
uma via catablica na qual h a degradao de molculas de acar (glicose
ou frutose) no interior da clula de microrganismos (leveduras ou bactrias)
at a formao de etanol e CO
2
, havendo liberao de energia qumica e
trmica. A gliclise a via central do catabolismo da glicose, sendo que o
piruvato o produto final desse processo, o qual pode seguir diferentes vias
metablicas: fermentao alcolica; ltica, ciclo de Krebs e cadeia respira-
tria (Figura 8.2).
Na fermentao alcolica por leveduras, o piruvato descarboxilado,
formando acetaldedo e, posteriormente, reduzido a etanol. A equao da
fermentao alcolica apresenta-se da seguinte maneira:
C
6
H
12
0
6
+ 2 P
i
+ 2ADP 2C
2
H
5
0H + 2CO
2
+ 2ATP + 2H
2
O
O metabolismo de acares por Zymomonas mobilis, ilustrado na Figu-
ra 8.3, aparece como uma via metablica com algumas ramificaes. A
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 207
sacarose metabolizada a glicose e frutose pela ao das enzimas invertase
(INV B) e levanasacarase (LEV U). As duas hexoses entram na clula via
sistema de difuso facilitada (GLF) ou so convertidas pela GFOR (gli-
cose-frutose oxirredutase), uma enzima contendo NADP (nicotinamida-
-adenina-dinucleotdeo-fosfato) que existe apenas na bactria Zymomonas
mobilis. A enzima GFOR madura est localizada no periplasma, oxida
glicose a gliconolactona e reduz frutose a sorbitol. Gliconolactona , ento,
convertida pela gliconolactonase (GL), outra enzima periplasmtica, em
cido glicnico (gliconato). Ambas as enzimas so os principais constituin-
tes do periplasma, formando aproximadamente 20% a 30% das protenas
deste compartimento. O cido glicnico consumido pelas clulas e pode
ser completamente degradado (como um cossubstrato) a etanol e cido ac-
tico. O sorbitol produzido para neutralizar o efeito prejudicial de estresse
osmtico (Sprenger, 1996).
Figura 8.2 Catabolismo da glicose pelas diferentes vias.
Fonte: Lehninger, 2002
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208 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Legendas: INV B: invertase; LEV U: levanasacarase; GFOR: glicose-frutose oxidorredutase; GNL:
gliconolactonase; FRK: frutoquinase; GLK: glicoquinase; PGI: fosfoglicose isomerase; ZWF: glicose-6-
-fosfato desidrogenase; GNTK: gliconatoquinase; TKT: transquetolase; PGL: 6-fosfogliconolactonase;
EDO: 6-fosfogliconato desidrogenase; GAP: gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase; EDA: 2-ceto 3-dioxi
6-fosfogliconato aldolase; PGK: fosfoglicerato quinase; PGM: fosfoglicerato mutase; ENO: enolase;
PYK: piruvato quinase; PPC: fosfoenolpiruvato carboxilase; PDHC: piruvato desidrogenase; ADH:
piruvato descarboxilase lcool deidrogenase; PDC: fosfatase
Figura 8.3 Metabolismo dos carboidratos em Zymomonas mobilis.
Fonte: Sprenger (1996)
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 209
Tecnologia da produo de etanol por Zymomonas mobilis
Em vrios pases tm sido realizados estudos de fermentao que in-
cluem o uso de bactrias em vez de leveduras para reduzir o tempo de fer-
mentao. No Brasil, toda a produo industrial de lcool realizada utili-
zando leveduras como microrganismo da fermentao e pouco se conhece
de outros microrganismos que produzam lcool em escala industrial.
Vrios autores consideram ser Zymomonas mobilis um excelente produ-
tor de etanol, uma vez que possui vrias vantagens perante as leveduras.
Zymomonas mobilis so mais termotolerantes, mais osmotolerantes, mais
tolerantes a altas concentraes de lcool e capazes de converter mais rapi-
damente o substrato em etanol (Rogers et al., 1982, Lawford et al., 1982).
Alm disso, Zymomonas mobilis tem resistncia natural a vrios antibiticos
e no requer oxignio para a sntese de lipdeos (Ingram et al., 1984). Apre-
senta um ciclo de fermentao rpida e com elevada eficincia; apresenta to-
lerncia a elevadas concentraes de glicose, de sacarose e de etanol no meio
de cultura; tolera pH entre 2,5 e 7,5 e apresenta bom rendimento em etanol.
Esta produo de etanol favorecida numa faixa de pH entre 4,5 e 7,0, pois
o pH ideal para o crescimento da bactria varia de acordo com a cepa uti-
lizada (Swings; De Ley, 1977; Viikari; Gisler, 1986; Calazans et al., 1989).
Em 1979, Rogers e colaboradores estudaram a cintica de produo de
etanol por Zymomonas mobilis ATCC 10988 e Saccharomyces carlsbergensis
(uvarum), em altas concentraes de acar, e observaram que ambos os
microrganismos fermentaram completamente 250 g/L de glicose, produ-
zindo etanol, em 30 a 40 horas, com concentrao final de etanol superior
a 100 g/L. Alm disso, a concentrao de biomassa de Zymomonas mobilis
foi consideravelmente menor que a massa obtida pela levedura, indicando
maior velocidade especfica de consumo de acar e de produo de etanol
para Zymomonas.
Aps a descoberta da capacidade de Zymomonas mobilis de produzir eta-
nol, atravs das observaes feitas em fermentaes de bebidas alcolicas,
iniciou-se o estudo de uma possvel utilizao dessa bactria para produo
de etanol em larga escala. Neste caso, a Zymomonas torna-se concorrente do
principal microrganismo responsvel pela produo de etanol: o Saccha-
romyces cerevisiae (Swings, De Ley, 1977; Viikari, 1988, Ernandes; Garcia-
-Cruz, 2009, 2010).
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210 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Fatores que influenciam a fermentao alcolica
por Zymomonas mobilis
muito importante considerar que diversos fatores fsicos (temperatu-
ra e presso osmtica), qumicos (pH, oxigenao, inibidores, nutrientes
minerais e orgnicos) e microbiolgicos (espcie, linhagem e concentrao
da levedura e contaminao bacteriana) afetam o rendimento da fermenta-
o, ou seja, a eficincia da converso de acares em etanol. Geralmente
as quedas na eficincia fermentativa decorrem de uma alterao na este-
quiometria do processo, levando maior formao de produtos secundrios
(especialmente glicerol e cidos orgnicos) e biomassa (Braga, 2006; Shre-
ve; Brink, 1997; Lima et al., 2001).
Nutrientes
A composio do meio de cultura afeta significativamente o consumo de
glicose, o crescimento celular e a produo de etanol pela bactria Zymomo-
nas mobilis (Cromie; Doelle, 1981).
A presena de magnsio muito importante na fermentao por Zymo-
monas, desde que ons magnsio so requeridos como cofatores de vrias
enzimas da via Entner Doudoroff, incluindo glucoquinase, glicose 6-fos-
fato desidrogenase, fosfoglicerato quinase e enolase (Millar et al., 1982, Sols
et al., 1971). Hoppner e Doelle (1983) reportaram que o clcio e o magnsio
ativam a enzima piruvato descarboxilase em Zymomonas, enquanto Bekers
e colaboradores (2000) observaram que o potssio ativa a enzima piruvato
quinase. Segundo Dawes e Large (1970), o on magnsio tem um papel im-
portante na preveno da degradao do RNA prolongando a sobrevivn-
cia das Zymomonas.
Vrios trabalhos descrevem que a taxa de desenvolvimento celular de
Zymomonas mobilis pode ser influenciada de acordo com as concentraes
usadas de ons potssio, magnsio, clcio, sdio e cloro. A presena dos sais
minerais, quando interagem com outra varivel do meio de fermentao
contendo sacarose comercial, tambm influenciam significativamente no
crescimento de Zymomonas mobilis.
Segundo Lawford e colaboradores (1982), a presena de biotina (1,0 mg/L)
e pantotenato de clcio (1,5 mg/L) favorecem um melhor crescimento des-
ta bactria. A incluso de extrato de levedura no meio de cultivo fornece
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 211
as vitaminas necessrias ao crescimento de Zymomonas mobilis, conforme
Fein e colaboradores (1983). Ernandes (2006) obteve concentrao celular
de 2,0 g/L com a ausncia de extrato de levedura no meio de produo, mas
esta foi proporcional ao aumento do extrato no meio obtendo concentrao
de 12,6 g/L de biomassa com 10,0 g/L de extrato. O mesmo autor relatou
que, para a sntese de levana, h necessidade de adio do extrato de leve-
dura ao meio de cultura, porm em quantidades adequadas, evitando assim
a influncia negativa deste na produo de levana.
Observa-se haver um consenso de que o meio de cultivo para Zymomo-
nas mobilis requer diferentes sais, tais como sulfato de amnio, sulfato de
magnsio, fosfato de potssio, citrato de sdio, traos de Fe
+2
e, ainda, vita-
minas como biotina e pantotenato de sdio (Nipkow et al., 1985).
Ernandes (2006) observou em sua pesquisa que a alta concentrao de
potssio proporcionou maior taxa de desenvolvimento de duas linhagens
de Zymomonas mobilis (CCT 4494 e CP4) e de Bacillus subtilis. Jerez (1993)
estudou o efeito da variao da concentrao de potssio e verificou que a
taxa de desenvolvimento foi proporcional ao aumento da concentrao de
potssio at a concentrao de 10,0 g/L. O mesmo autor, entretanto, veri-
ficou que KCl, em concentraes superiores inibidor da produo etanol
e do crescimento de Zymomonas.
Diez e Mancilha (1990) mostraram que, utilizando caldo de beterraba
aucareira, a presena ou ausncia MgSO
4
.7H
2
0 no afetou os rendimentos
fermentativos nem apresentou efeito inibidor da Zymomonas mobilis CP4.
Entretanto, so contraditrios aos reportados por Skotnicki e colaboradores
(1981), que indicaram que o Mg
+
pode ter efeito inibidor da fermentao
por Zymomonas, e aos resultados obtidos por Cromie e Doelle (1981), os
quais observaram incremento na taxa especfica de consumo de substrato
e de produo de etanol com o aumento da concentrao de magnsio at a
concentrao de 3,0 g/L. A concentrao de etanol tambm foi aumentada
com o aumento da concentrao de magnsio at 3,0, diminuindo levemen-
te quando a concentrao aumentou para 4,5 g/L.
Presso osmtica
Zymomonas mobilis pode crescer em concentraes relativamente ele-
vadas de acar (Park; Baratti, 1993). Segundo Belaich e Senez (1965) e
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212 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
DiMarco e Romano (1985), a glicose transportada em alta velocidade,
atravs da membrana plasmtica, sendo sua conduo facilitada pelo siste-
ma de difuso. Assim, a concentrao intracelular rapidamente alcana um
nvel limite em relao s concentraes externas de glicose. Outros autores
(Algar; Scopes, 1985) verificaram que a presso osmtica extracelular pode
ser rapidamente balanceada pela concentrao intracelular de acares e
que a reduo da atividade de gua parece exercer pequeno efeito sobre as
enzimas da via de Entner-Doudoroff.
Na literatura, so encontrados alguns trabalhos que buscam elucidar
o fato de esta bactria tolerar concentraes elevadas de acar. Struch e
colaboradores (1991) observaram que a cepa ATCC 29191 de Zymomonas
mobilis apresenta alta tolerncia a elevadas concentraes de acares por
causa de sua elevada capacidade de regulao osmtica e do eficiente siste-
ma de transporte de glicose. Estudos comparativos realizados por Swings
e De Ley (1977) com quarenta diferentes cepas de Zymomonas mobilis ob-
servaram que a maioria apresenta capacidade de crescer em meio contendo
30% a 40% (p/v) de glicose.
A cintica de produo de etanol por Zymomonas, em altas concentra-
es de acar, foi estudada por Rogers e colaboradores (1979). Resultados
revelaram que 100 a 250 g/L de acar podem ser rpida e eficientemente
convertidos em etanol. Comparando Zymomonas mobilis ATCC 10988 e
Saccharomyces carlsbergensus (uvarum) ATCC 26602, esses autores encon-
traram que ambos os microrganismos fermentam completamente 250 g/L
de glicose, produzindo etanol, em 30 a 40 horas, com concentrao final de
etanol superior a 100 g/L. A concentrao de biomassa de Zymomonas mo-
bilis foi consideravelmente menor que a massa obtida por S. uvarum, indi-
cando maior velocidade especfica de consumo de acar e de produo de
etanol par Zymomonas.
Lyness e Doelle (1983) determinaram a glicose livre no meio, a fim de
estabelecer a correlao entre hidrlise de sacarose, formao de glicose e
utilizao de glicose em duas cepas de Zymomonas. As duas cepas estuda-
das, Z7 e Z10, apresentaram respostas diferentes. A cepa Z7 apresentou
alta atividade de invertase acompanhada da no utilizao de glicose, e
significativo acmulo de glicose no fermentador. Os autores concluram
que o incremento no acmulo de glicose em consequncia do aumento
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 213
da concentrao de sacarose pode indicar limitado sistema metablico ou
progressiva inibio pelos dois carboidratos monomricos sobre o sistema
enzimtico catablico.
Loos e colaboradores (1994) relataram em sua pesquisa que, em seu
habitat natural, Zymomonas se encontra exposta a altas concentraes de
sacarose. Neste caso, o sorbitol produzido e acumulado pelas clulas, pela
ao das enzimas periplasmtica glicose-frutose oxidorredutase (GFOR).
A funo fisiolgica da formao de sorbitol , portanto, proteger as clulas
do stress osmtico causado pelas altas concentraes de acar.
Presena de etanol
O etanol tem um efeito prejudicial sobre a membrana celular de Zymo-
monas, diminuindo sua eficcia como barreira semipermevel e permitin-
do a sada de cofatores e coenzimas essenciais (Viikari, 1984). Ainda se-
gundo Ingram (1984), altas concentraes de etanol geralmente destroem
a estrutura e as funes da membrana celular. De acordo com Bringer e
colaboradores (1985), a membrana precisa permitir uma alta velocidade
de difuso para fora do citoplasma e, ao mesmo tempo, necessita opor-se
a suas propriedades solventes. Viikari (ibidem) afirmou que, em geral, o
efeito inibidor do etanol pode estar relacionado desregulao da funo
da membrana inibio das enzimas glicolticas. Em clulas de Zymomonas
mobilis, entretanto, as enzimas glicolticas no so inibidas pela presena de
etanol e a via metablica indiretamente inibida pela perda de cofatores e
coenzimas, provavelmente por causa da ao do etanol sobre a membrana
celular (Buchholz et al., 1987).
Segundo Rowe (1983), em baixas concentraes (menores que 25 g/L),
o etanol diminui a temperatura de transio e, portanto, fluidiza a membra-
na. Sob altas concentraes (maiores que 25 g/L), ocorre o chamado efeito
freezing, no qual se verifica um simultneo aumento de temperatura de
transio e cooperatividade do processo de transio.
Em Zymomonas mobilis, tanto a boa capacidade de difuso de sua parede
celular quanto sua resistncia ao prejudicial do etanol se devem grande
quantidade de cido cis-vacnio presente na parede (cerca de 70%). Por pos-
sui alta fluidez, esse cido graxo , provavelmente, o responsvel pela alta
velocidade de difuso do etanol pela membrana citoplasmtica (ibidem).
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214 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
A presena de hopanoides como 1, 2, 3, 4-tetra hidroxipentano 29-ho-
peno (THBH), principalmente, parece ser a causa da considervel estabili-
dade da membrana plasmtica sob altas concentraes de etanol (Schmidt
et al., 1986).
Altas concentraes de THBH, assim como hopeno e hopanol, foram
verificadas em Zymomonas mobilis. Essas substncias foram primeiramen-
te encontradas em vrias fraes de leo minerais (Ourisson et al., 1985).
Laudrin e Goma (1982) observaram, em fermentao por Zymomonas mo-
bilis, um aumento significativo de THBH durante a fase exponencial de
crescimento. Este aumento ocorreu no momento em que o etanol intrace-
lular era acumulado. Por essa razo, a formao destes lipdeos parece ter
correlao primria com o etanol intracelular, cuja concentrao maior
que aquela medida no meio de cultura.
O THBH contido nas clulas bacterianas aumenta consideravelmente
com o acmulo de etanol intracelular. Isso indica que a tolerncia ao etanol
est provavelmente correlacionada com a presena de hopanoides nas clu-
las. Zymomonas mobilis reage ao solvente do etanol com o aumento da
biossntese e incorporao de hopanoides. Os hopanoides tm, nas bact-
rias, uma funo aparentemente similar aos esteroides nas leveduras. Estes
compostos estabilizam a membrana, fazendo que os microrganismos resis-
tam ao etanol. A formao dos hopanoides est diretamente correlacionada
com a diminuio da proporo de fosfolopdeos/protenas na membrana
de Zymomonas mobilis, aumentando a estabilidade da membrana plasm-
tica pelo aumento da hidrofobicidade. Os hopanoides so sintetizados nas
clulas bacterianas, tanto em condies de aerobiose como anaerobiose. J
os esteroides nas leveduras so sintetizados apenas em aerobiose (Carey,
Ingram, 1983).
Erzinger (1996) estudou, em regime descontnuo e descontnuo alimen-
tado, a influncia da concentrao inicial de glicose e do etanol formado so-
bre a atividade da GFOR em clulas ntegras de Zymomonas mobilis ATCC
29191. A GFOR a mais importante enzima envolvida na converso de
glicose e frutose em cido glucnico e sorbitol, respectivamente. Neste es-
tudo, o crescimento celular e a produo de etanol foram tambm conside-
rados. Adicionalmente, ensaios de biotransformao, para a produo de
sorbitol e cido glucnico, foram realizados. Com concentraes iniciais
de glicose (G0) entre 40 e 100 g/L foram medidas as mximas velocidades
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 215
especficas de crescimento (X,M = 0,48 h
-1
). Acima desta faixa, a con-
centrao de glicose inibiu, progressivamente, o crescimento de Z. mobilis.
Com G0 = 230 g/L, o valor de X,M foi de, apenas, 0,17 h
-1
. Com con-
centraes de etanol maiores que 35 g/L, observa-se uma diminuio da
velocidade especfica de crescimento (X), indicando um efeito inibidor
deste produto sobre o crescimento celular. O fator de converso de glicose
em clulas (Yx/s) mximo obtido foi de, aproximadamente, 0,042, com G0
at 100 g/L. Os valores de G0 maiores que 100 g/L levaram, reduo de
Yx/s. As mximas velocidades especficas de formao de etanol (Et,m)
se mantiveram, aproximadamente, constantes entre 4,3 e 4,9 h
-1
, com G0
entre 40 e 210 g/L. O valor de Et,m (3,4 h
-1
), entretanto, diminui com
G0 = 230 g/L. Com relao converso em produto (YEt/S), foram obtidos
valores, aproximadamente, constantes (YEt/S ~ 0,49), at G0 de 150 g/L.
Concentraes iniciais de glicose maiores que 210 g/L resultam em dimi-
nuio de YEt/S. Tal como descrito por Zachariou e Scopes (1986) para a
enzima livre, a atividade de GFOR (A) em clulas ntegras de Z. mo bilis,
mostrou ser dependente da concentrao de glicose utilizada no cultivo da
bactria. Valores crescentes de atividade foram medidos at G0 = 150 g/L,
condio na qual se verificou o mais alto valor de A (~12,5 U/g de clulas).
Com G0 = 230 g/L, A (3,6 U/L) foi drasticamente reduzido. As menores
atividades de GFOR em clulas ntegras, com G0 >150 g/L, so decorren-
tes das concentraes elevadas de etanol alcanadas nestes casos (Ex.: G0 ~
210 g/L, Et ~ 94 g/L). Este efeito se deve, provavelmente, a alteraes na
interao enzima/substrato, relacionadas com a formao de hopanoides,
cidos graxos produzidos por Z. mobilis na presena de altas concentraes
intracelulares de etanol, cuja funo a impermeabilizao da parede celu-
lar, a fim de proteger o microrganismo da ao solvente do etanol. O pro-
cesso de biotransformao de glicose e frutose em cido glucnico e sorbitol
foi realizado utilizando clulas provenientes de diferentes condies de cul-
tivo. Nos ensaios com clulas ntegras que apresentavam alta atividade em
GFOR.
Temperatura
Segundo Doelle e colaboradores (1989), a temperatura utilizada para o
crescimento diferente da requerida para a produo de etanol. Zymomonas
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216 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
mobilis apresenta melhor crescimento em temperatura entre 25C e 37C.
A temperatura tima em meios contendo sacarose como fonte de carbono
de 35C, porm a 38C, ocorre uma diminuio de aproximadamente
26% do crescimento e, em temperaturas prximas de 40C, o crescimento
raro, dificultado ou inibindo a produo de etanol (Lee et al., 1989). Quan-
do exposta temperatura da ordem de 60C por 5 minutos, Zymomonas
mobilis sofre inativao irreversvel (Viikari, 1984).
Lee e colaboradores (1989) verificaram o comportamento de duas dife-
rentes cepas de Zymomonas mobilis (ZM1 e ZM4) com relao sensibilida-
de temperatura de 25C a 40C e observaram que, em temperaturas mais
altas, os rendimentos da biomassa e de etanol decresciam. Porm as veloci-
dades especficas de crescimento, de consumo de substrato e de formao
de produtos no foram afetadas pela temperatura na faixa de pH estudada.
Em estudos feitos por Fieschko e Humphrey (1983), a respeito do efeito
da temperatura sobre o coeficiente de manuteno de Zymomonas mobilis
ATCC 10988, cultivada em processo contnuo com glicose como fonte de
carbono, foi observado que, entre 23C e 33C o coeficiente de manuten-
o se manteve constante. Com o aumento da temperatura de 30C para
35C foi verificado que o fator real de converso de substrato em clulas
apresentava pouca variao, enquanto o coeficiente de manuteno era sen-
sivelmente afetado.
Borrego e colaboradores (1987) estudaram o efeito da temperatura nos
parmetros cinticos de fermentao por Zymomonas e encontraram, na fai-
xa de temperatura de 25,0C a 35,0C, que a produtividade de etanol per-
maneceu constante, em aproximadamente 49,0 g/L.h, e que estes valores
diminuram em temperatura menores que 25,0C. Lyness e Doelle (1980)
tambm observaram variao na produo de etanol na faixa de 30,0 a 42,5
g/L, em funo da variao da temperatura em meio utilizando sacarose
(200,0 g/L), sendo que para faixa de temperatura entre 30,0C e 35,0C
encontraram concentraes de etanol de 69,5 g/L para Zymomonas mobilis
Z7 e de 66,1 g/L para Zymomonas mobilis Z10.
Ananthalakshmy e Gunasekaran (1999) produziram etanol com cepas
de Zymomonas mobilis B4286 e dois mutantes (ZML1 e ZML2) obtidos por
meio do tratamento com NTG (N-metil Nnitroso guanidina) e atingiram
a produo mxima de etanol de 55,1; 41,0 e 44,2 g/L, respectivamente em
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 217
24 horas de fermentao a 30C com sacarose na concentrao de 150,0
g/L, e observaram que os mutantes ZML1 e ZML2 possuem taxas de pro-
duo de etanol significativamente menores que a cepa natural.
pH
O pH ideal para o crescimento varia de acordo com a cepa utilizada (Ca-
lazans et al., 1989). Estudos ressaltam a importncia do controle de alguns
parmetros de fermentao na formao dos subprodutos para aumentar o
rendimento alcolico (Diez et al., 1991). De modo geral, na literatura cons-
ta que a produo de etanol favorecida em valores de pH entre 4,5 e 7,0
e que o controle do pH inicial importante para que se possa maximizar a
produo de etanol e reduzir a formao de outros subprodutos, como bio-
polmeros e sorbitol (Kannan et al., 1997). Relao similar foi descrita por
Diez e colaboradores (1991), os quais relataram que o controle do pH foi
um fator muito importante na hidrlise da sacarose e, portanto, na forma-
o de etanol, concluindo ainda que os rendimentos fermentativos foram
superiores na fermentao com controle de pH.
Doelle e colaboradores (1989) relataram que o pH, dentro de certos li-
mites (6,5 a 8,0), tem pouca influncia na taxa de desenvolvimento, mas
pode influenciar o nmero total de bactrias, no entanto, valores de pH
extremamente baixos (menores que 4,5) podem levar o microrganismo ra-
pidamente morte.
Lawford e colaboradores (1988) observaram que os maiores valores
de velocidade especfica de crescimento com Zymomonas mobilis ATCC
29191 so obtidos com pH entre 5,5 e 6,5, sendo o pH 6,0, aparentemente,
o timo. King e Houssain (1982), trabalhando com uma cepa diferente Zy-
momonas mobilis ATCC 10988, concluram que, na faixa de pH 6,0 a 7,5, a
bactria tem um melhor crescimento.
Trabalhos realizados por Calazans e colaboradores (1990) indicaram
que fermentaes em meio de glicose iniciadas em pH no controlado na
faixa de 5,3-6,6 apresentaram bons resultados em termos de rendimento e
produtividade de etanol; porm, os valores obtidos nesses parmetros fo-
ram reduzidos drasticamente em pH 4,2.
Na Tabela 8.5, observa-se o efeito da variao do pH sobre alguns par-
metros de fermentao para a produo de etanol por 4 linhagens de Zymo-
monas mobilis (ATCC 10988, ATCC 12526, NRRL B 4286 e IFO 13756).
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218 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Tabela 8.5 Efeito do pH inicial sobre a produo de etanol por vrias linhagens de Zymomonas
mobilis
pH
Parmetros
fermentativos
Linhagens
ATCC
10988
ATCC
12526
NRRL B
4286
IFO
13756
4,0
P
Su
g/gs
E
2-7
74-4
26-37
0-18
2-2
68-1
21-48
0-16
4-0
85-6
0-23
39-06
3-5
75-0
0-23
34-18
5,0
P
Su
g/gs
E
2-9
ND
ND
28-32
3-2
ND
ND
31-25
4-2
87-5
0-24
41-02
4-4
81-3
0-27
42-97
6,0
P
E
g/gs
Su
3-9
80-6
38-09
0-24
4-0
81-2
0-25
39-06
4-3
0-25
87-5
41-99
4-7
88-1
0-27
45-9
7,0
P
E
g/gs
Su
6-6
82-77
0-40
64-45
6-3
79-0
0-40
64-51
5-2
88-1
0-30
50-29
6-4
92-5
0-35
62-5
P produtividade de lcool % (v/v); Su substrato utilizado % (v/v); g/gs gramas de lcool produzido/
g de substrato utilizado; E porcentagem terico de rendimento; ND no determinado.
Fonte: Gunasekaran; Karanakaran; Kasthuribai (1986)
Oxignio
A habilidade de Zymomonas crescer em presena de oxignio foi obser-
vada por Lindner (1977). Portanto, Zymomonas no pode ser considerada
uma bactria anaerbia estrita.
Bringer e colaboradores (1985) investigaram os efeitos do oxignio no
crescimento e metabolismo de Zymomonas mobilis ATCC 29191. Estes au-
tores verificaram que, de fato, a inibio do crescimento celular em culturas
aeradas foi maior com o aumento da concentrao de acar, pelo acmulo
de acetaldedo formado. Estes autores observaram tambm que as velocida-
des especficas de produo de etanol e do consumo de substrato foram 25%
a 40% menores na presena de oxignio do que em condio de anaerobiose.
Pankova e colaboradores (1985) comprovaram que o declnio da ativi-
dade metablica de Zymomonas mobilis em regime descontnuo com alto
suprimento de oxignio foi resultante do acmulo de acetaldedo formado.
A formao de acetaldedo leva a uma diminuio da velocidade mxima
de crescimento e do rendimento em clulas. Ainda, segundo estes autores,
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 219
a converso do acetaldedo em etanol, pela enzima lcool desidrogenase
(ADH), prejudicada em presena de oxignio. Isso se deve ao fato da
ADH necessitar NADH como cofator, e ao fato de Zymomonas, em aero-
biose, priorizar a remoo de oxignio por meio de enzimas protetoras
como NADH oxidase e NADHP oxidase. Estas enzimas, alm de tambm
usarem NADH como cofator, apresentam maior atividade que ADH, acar-
retando num acmulo do acetaldedo formado.
Concentrao de acar
Zymomonas mobilis precisa de um acar fermentvel no meio de cultura
para o crescimento, podendo ser glicose ou frutose ou ainda, para algumas
linhagens, sacarose (Dadds; Martin, 1973), entretanto, uma maior desvan-
tagem da aplicao da Zymomonas foi apresentada por Stokes e colaborado-
res (1981) com respeito restrita utilizao dos acares como substrato.
Emprega-se a bactria Zymomonas mobilis, geralmente para produo de
etanol a partir da sacarose, frutose e glicose (Falco de Morais et al., 1993).
Na fermentao em alta concentrao inicial de sacarose, porm, a taxa de
hidrlise deste dissacardeo maior do que o consumo de seus monossaca-
rdeos (Parker et al., 1997; Tano et al., 2000). Consequentemente, os mo-
nossacardeos acumulam-se no caldo de fermentao e favorecem a forma-
o de subprodutos, como levana, polmero de frutose, que torna o meio
turvo (Ribbons et al., 1962) e sorbitol (Barrow et al., 1984) o que reduz
o rendimento em etanol (Kannan et al., 1997; Parker et al., 1997). Alm
disso, tambm capaz de produzir outros metabolitos em altas concentra-
es sob condies de cultura adequadas como, por exemplo, acetaldedo,
cido glucnico e cido actico (Belaich; Senez, 1965), gluconato e fructoo-
ligossacardeos e pequenas quantidades de alguns lcoois superiores e fenol
(Bekers et al., 1999).
Esta bactria que utiliza a via metablica de Entner Doudoroff fermenta
glicose, frutose e sacarose. Por esta via metablica, a bactria obtm 1 mol de
ATP por mol de glicose, consequentemente deve minimizar os requerimen-
tos energticos de crescimento e manuteno, de modo a conduzir o mximo
de glicose possvel para a produo de etanol (Cromie, Doelle, 1980). Quan-
do glicose e frutose so utilizadas como fonte de carbono, obtido um ren-
dimento superior a 95% em relao ao rendimento terico (Lee et al., 1989),
j que a fermentao produz quase exclusivamente etanol e CO
2
(Swings;
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220 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Deley, 1977). Quando sacarose, um substrato industrialmente disponvel
e de baixo custo, utilizado, o rendimento de etanol representa 75-80% do
valor terico, em funo da formao dos subprodutos (Viikari, 1984).
Dawes e colaboradores (1966) observaram, no meio contendo frutose,
rendimento de massa celular relativamente baixo e crescimento lento. No
meio contendo sacarose, a reduo observada no rendimento da massa ce-
lular comparando-se ao crescimento em glicose tem sido atribuda forma-
o de levana (Lee et al., 1989; Ribbons et al., 1962).
Skotnicki e colaboradores (1981) estudaram as velocidades de crescimen-
to e produo de etanol de 11 diferentes cepas de Zymomonas. Os resultados
revelaram que algumas cepas so mais tolerantes a altas concentraes de
acar e de etanol que outras. Das duas cepas selecionadas a CP4 foi superior
ATCC 10988 em todas as condies de crescimento em meio contendo gli-
cose, enquanto no meio preparado com sacarose, o crescimento e a produo
de etanol das duas cepas foram similares, embora a CP4 seja menos produ-
tiva em meio com sacarose e mutaes provocadas no tenham melhorado
significativamente a produo de etanol a partir deste carboidrato.
Lyness e Doelle (1983) estudaram a fermentao descontnua da saca-
rose com duas linhagens de Zymomonas mobilis e observaram que um au-
mento na concentrao de sacarose afetou a velocidade especfica de cres-
cimento na linhagem Z10, bem como a atividade hidrolisante da sacarose
para a linhagem Z7, mas no influenciou significativamente a formao de
biomassa. Demonstraram que a hidrlise da sacarose pode ser independen-
te da utilizao da glicose, que, de acordo com a linhagem usada, a hidrlise
da sacarose pode levar ao acmulo de glicose no meio e que a velocidade de
produo de etanol e o tempo de fermentao dependem da velocidade de
catabolismo dos produtos de hidrlise da sacarose.
Viikari e Gisler (1986) observaram baixa velocidade de hidrlise da
sacarose, a qual parece estar associada com a formao de levana, pois Zy-
momonas mobilis utilizou o substrato inicial para seu crescimento e para fa-
vorecer, possivelmente, a atividade da enzima levanasacarase extracelular
(SacB), que converte a sacarose em frutanas com pontes (2-6), formando a
cadeia de levana (Kannan et al., 1993). Essa distribuio da fonte de carbo-
no para o crescimento celular e formao de frutanas tambm foi observada
por Dawes e Ribbons (1966), os quais acompanharam a formao de levana
durante o crescimento da bactria Zymomonas mobilis N.C.I.B. 8938.
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 221
Wisbeck e colaboradores (1997), em trabalhos realizados com diferen-
tes linhagens desta bactria, relatam rendimentos em etanol superiores a
90%. Estes autores descrevem, entretanto, que altas concentraes iniciais
de glicose, em processo em batelada, levam a significativa reduo da pro-
dutividade por causa da inibio pelo substrato.
Na Tabela 8.6, observa-se o efeito da concentrao inicial de acar
sobre alguns parmetros de fermentao para a produo de etanol por 4
linhagens de Zymomonas mobilis (ATCC 10988, ATCC 12526, NRRL B
4286 e IFO 13756).
Tabela 8.6 Efeito da concentrao inicial de acar sobre a produo de etanol por vrias linha-
gens de Zymomonas mobilis
Acar inicial
% v/v
Parmetros
fermentativos
Linhagens
ATCC
10988
ATCC
12526
NRRL B
4286
IFO
13756
15
P
Su
g/gs
E
6-6
82-77
0-43
68-75
6-3
79-0
65-63
0-44
5-1
88-0
0-31
53-13
6-1
93-3
0-33
63-54
20
P
Su
g/gs
E
5-9
73-0
46-09
0-32
6-1
0-33
75-0
47-65
10-15
89-0
0-46
79-29
8-85
91-0
0-39
69-14
25
P
E
g/gs
Su
5-2
76-0
0-22
32-05
5-5
78-0
0-23
34-38
7-9
84-8
49-38
0-30
7-2
75-6
0-30
45-0
P produtividade de lcool % (v/v); Su substrato utilizado % (v/v); g/gs gramas de lcool produzido/
g de substrato utilizado; E porcentagem terico de rendimento.
Fonte: Gunasekaran; Karanakaran; Kasthuribai (1986)
Bioprocessos fermentativos empregados na
fermentao alcolica por Zymomonas mobilis
Bioprocessos so um conjunto de operaes que vo desde o trata-
mento da matria-prima, passando pela transformao do substrato em
produto(s), at a separao e purificao do produto obtido; e nesta catego-
ria esto includas as produes industriais do lcool para fins de consumo
humano e combustvel (Pereira Jr., 1999).
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222 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
A importncia deste tipo de processo tem relao direta com os diver-
sos setores da agroindstria, destacando-se entre estas a alcooleira (Belluco,
2001). Segundo Robinson, (1980), a fermentao, em termos gerais, um
processo de transformao bioqumica em que se potencializa deliberada-
mente o crescimento dos microrganismos que consomem certa quantidade
de substrato e enriquecem o meio de cultivo com os produtos de seu me-
tabolismo. A fermentao tem como efeitos principais o aumento do valor
nutricional e modificaes desejveis na textura e aroma das matrias-pri-
mas e dos alimentos produzidos por este tipo de biotecnologia.
Quanto disponibilidade de gua presente no meio, os processos fer-
mentativos podem ser classificados em fermentao submersa e semiss-
lida. Dependendo do tipo de produto a ser obtido, a fermentao pode ser
realizada com ou sem aerao (Pereira Jr., 1999; Bertolin et al., 1998a). Na
fermentao alcolica, o processo acontece em anaerobiose, podendo ser
submerso como ocorre industrialmente na produo de lcool de cana-de-
-acar ou semisslida, como no processamento artesanal e tradicional de
algumas bebidas fermentadas (Maccari Jr., 1997).
Na produo de materiais via fermentao submersa ou semisslida,
dependendo da natureza do produto a ser obtido, existe a necessidade do
conhecimento e otimizao dos seguintes parmetros: composio do meio
de cultivo, temperatura, pH, condies de aerao e agitao, a presena de
indutores e repressores; alm claro da escolha adequada do microrganis-
mo a ser usado (Bertolin et al., 1998a).
Em relao escolha do mtodo de fermentao, estudos como o de
Bertolin e colaboradores (1998b), que investigaram a hidrlise do amido
de farelo de trigo via sistema submerso e semisslido; indicam haver equi-
valncia de resultados para os dois tipos de tcnicas, ficando a definio
por conta de critrios referentes aos menores custos de produo e maior
qualidade do produto formado a ser obtido, conforme o sistema escolhido.
Quanto conduo dos processos, estes podem ser: em batelada, sim-
ples e alimentada e, sistema contnuo. No sistema em batelada, o substrato
disponibilizado em sua totalidade no incio do processo (simples) ou ao
longo deste (alimentada), sem haver retirada do produto. Enquanto no con-
tnuo, ocorre uma oferta gradativa de substratos e h retiradas peridicas do
produto formado (Pereira Jr. 1999).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 223
Os processos de fermentao alcolica so frequentemente conduzi-
dos pelo sistema em batelada, onde no tipo submerso as clulas ficam em
suspenso (Kaseno; Kokugan, 1997). A fermentao em batelada, na qual
a formao do produto est diretamente relacionada ao microrganismo
biocatalisador, tem como principal desvantagem, a forte inibio de gran-
de nmero de linhagens dos microrganismos pelo produto e mesmo pelo
substrato. Enquanto no processo de fermentao contnuo, usando-se clu-
las de leveduras imobilizadas, tem-se como vantagem a reduo de custos
operacionais e de capital, alm da alta produtividade em etanol em longos
perodos de fermentao (Tosta, 2004).
Uma estratgia eficiente para evitar a inibio da atividade metablica
pelo produto formado, no caso de bioprocessos para produo de lcool,
onde o acmulo de etanol durante longo perodo acarreta progressivos de-
crscimos do crescimento celular e produtividade, a contnua remoo do
lcool produzido; o que pode ser conseguido ao usar o sistema semicont-
nuo (Kaseno; Kokugan, 1997).
Os processos contnuos so favorecidos, em muitos aspectos, na inds-
tria de fermentao por muitas razes, incluindo as vantagens econmicas
de ter operaes ininterruptas por longos perodos. Estes processos promo-
vem substanciais melhorias na eficincia do processo fermentativo alcoli-
co e subsequente aumento da produtividade e menores custos operacionais
(Kourkoutas et al., 2005).
Tipos de bioprocesso fermentativo empregados
na fermentao alcolica por Zymomonas mobilis
Pesquisadores vm realizando estudos da tecnologia necessria para pro-
duo de lcool utilizando a cana-de-acar e seus resduos, visando dimi-
nuir o custo de produo, otimizar as condies de bioconverso etanlica,
e selecionar os microrganismos com maior produtividade de etanol (Tauk,
1976; Pereira Jr.; Menezes et al., 1998; Venturini-Filho; Cereda, 1998; Ca-
brini; Gallo, 1999; Ribeiro; Horii, 1999; Dutra et al., 2001; Ludwig; Oliva-
-Neto, 2001; Laluce et al., 2002).
A produo de etanol pela bactria Zymomonas mobilis por meio de di-
ferentes regimes de cultivo tem sido descrita na literatura. Sem dvida, os
regimes de cultivo mais estudados so o descontnuo e o contnuo.
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224 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Regime descontnuo
Os principais resultados em regime descontnuo encontrados na lite-
ratura, utilizando glicose como fonte de carbono, demonstram que, neste
tipo de processo, apesar da inibio causada pela concentrao de substrato,
altas concentraes de etanol podem ser obtidas com Zymomonas mobilis.
Lee e colaboradores (1989) e Rogers e colaboradores (1982) em trabalho
realizado com Zymomonas mobilis ZM4, utilizando diferentes concentra-
es iniciais de glicose, em regime descontnuo, observaram que a mxima
velocidade especfica de crescimento foi significativamente afetada pelo
aumento da concentrao de glicose. Nestes trabalhos, foi observado que
concentraes iniciais de glicose maiores que 100 g/L reduziram conside-
ravelmente a velocidade mxima especfica de crescimento. No entanto,
estes autores no observaram alterao das velocidades especficas de con-
sumo de substrato (~ 10 h
-1
) e de produo de etanol (~ 5 h
-1
). Foi verificada
ainda uma diminuio do fator de converso de glicose em biomassa com o
aumento da concentrao inicial de glicose, mas este aumento no alterou
o rendimento em etanol (~ 95%)
Segundo Rogers e colaboradores (1982), o rendimento em etanol nor-
malmente maior que 95%; o fator de converso de glicose em biomassa
varia de 0,015 a 0,050, dependendo da concentrao inicial de substrato e a
produtividade em torno de 5 a 7 g/L.h.
Silman (1984), trabalhando com fermentao em regime descontnuo
alimentado, com a linhagem CP1, verificou que diferentes velocidades de
alimentao do meio no influenciam significativamente o rendimento, a
produtividade volumtrica e a concentrao final de etanol. Este autor ob-
servou que, para a linhagem CP1, concentraes maiores que 8% (p/p) de
glicose inicial resultaram em inibio pelo substrato. O processo foi, ento,
iniciado com 8% de glicose e o incio da alimentao se deu aps 4 horas, com
o volume de alimentao correspondente a 36% do volume total do fermen-
tador. A concentrao de clulas obtida ao final do processo (21 a 29 horas)
ficou em torno de 4,0 g/L e a produtividade em etanol de 4,6 a 5,2 g/L.h.
Regime contnuo
Estudos conduzidos usando duas tcnicas para o processo contnuo: o
reciclo de clulas (Lawford; Rousseau, 2003) e o uso de clulas imobilizadas
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 225
(Amin; Khalaf; Allah, 1992) apresentaram excelentes resultados em labo-
ratrio, entretanto os mesmos autores observaram que o custo excessiva-
mente elevado para o uso em processos industriais.
Lawford e Rousseau (2003) demonstraram que, em cultivo contnuo
de Zymomonas mobilis linhagem ATCC 39676, medida que os valores de
velocidade de duplicao foram elevados de 0,05 a 0,20 h
-1
, os valores
de biomassa e etanol tambm aumentaram.
Hermans (1992), trabalhando com fermentao em regime contnuo,
com a linhagem Zymomonas mobilis ATCC 29191, utilizando concentra-
es de glicose (150,0 170,0 e 200,0 g/L) obteve uma produtividade mdia
de 4 g/L.h, com rendimentos em etanol em torno de 98% e velocidade es-
pecfica de produo de aproximadamente 1,1 h
-1
.
Costa e colaboradores (2001) estudaram a fermentao contnua por
Zymomonas mobilis ATCC 29191 em concentraes elevadas de sacarose
e concluram que a melhor condio para fermentao de sacarose a 10%
(p/v) mostrou ser na taxa de diluio de 0,21 h
-1
. Entretanto, para a fermen-
tao de sacarose a 20% (p/v), mesmo em taxa de diluio baixa, a cultura
mostrou um perodo prolongado de oscilaes, indicando dificuldades, se-
no impossibilidade, em atingir o estado estacionrio.
Segundo Ingram (1984), no Canad, no Biohol, existe em funcionamen-
to uma planta-piloto para a produo de etanol utilizando serragem hidro-
lisada por via cida e fermentao por Zymomonas mobilis e no Japo, Aus-
trlia e Nova Zelndia existem vrias plantas-piloto operando em sistema
contnuo utilizando diferentes linhagens de Zymomonas para a produo de
etanol. Segundo esses autores, este microrganismo pode ser especialmente
til em pases como o Brasil e a ndia, levando em considerao a caracte-
rstica termotolerante de Zymomonas mobilis.
Fermentao alcolica utilizando substratos alternativos
de baixo custo comercial
A matria-prima utilizada na fermentao alcolica
Qualquer material vegetal que contenha acar ou carboidratos, de for-
ma direta ou indireta, pode ser matria-prima para obteno de etanol, mas
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226 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
para que haja viabilidade econmica preciso considerar-se seu volume de
produo, o rendimento industrial e o custo de fabricao; assim sendo, um
substrato ou matria-prima considerada apropriada quando nestas estive-
rem includas nutrientes economicamente atraentes, no apenas do ponto
de vista do valor comercial como um todo, mas tambm quanto aos custos de
seu armazenamento, pr-tratamento, esterilizao, processamento, entre
outros (Aquarone et al., 1987; Greasham; Inamine, 1986).
Dada a importncia dos carboidratos no metabolismo de qualquer via
celular, no por acaso que eles so a principal matria-prima nas fer-
mentaes. Devem estar presentes compostos nitrogenados, alm de pr-
-biticos (fatores de crescimento), como vitaminas e coenzimas. Tambm
indispensvel presena de fsforo, sob a forma de fosfatos, o qual costu-
ma ser adicionado aos meios, onde exerce ao tamponante ou inibidora de
flutuaes de pH (Tano; Buzato, 2003).
Recentes dados mostram que, atualmente, a produo fermentativa
de etanol, a partir de recursos renovveis, tem recebido maior ateno por
causa do aumento da escassez e elevados preos de mercado do petrleo
(Gokhale; Sivaramakrishnan, 1986; Nigam, 1999; Amutha, Gunasekaran,
2001). O elemento chave no custo dominante da produo fermentativa de
etanol combustvel o substrato/matria-prima, embora alguns amidos
fermentveis e sacarose sejam facilmente obtidos de produtos agrcolas tais
como mandioca e cana-de-acar, respectivamente.
A expanso de alternativas de uso de substratos de baixo valor oferece
uma excelente perspectiva para a reduo dos custos de produo e aumen-
to da utilizao do bioetanol, quer como aditivo ou combustvel propria-
mente dito (Lee, 1997; Amutha; Gunasekaran, 2001).
Na obteno de um produto biotecnolgico, a matria-prima pode re-
presentar at 75% do custo total de produo, o que tem determinado um
crescente interesse no aproveitamento de resduos agroindustriais e seus
subprodutos como: o bagao, melao e vinhoto da cana-de-acar, o sa-
bugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz. O interesse decorre do
fato destas matrias-primas no possurem custos de produo associados
diretamente; sendo uma forma de agregar valor a resduos que se formam
em abundncia, alm de solucionar um srio problema ambiental para
as indstrias que o acmulo desses resduos (Cereda, 1994; Pereira Jr,
1999).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 227
Fermentao alcolica utilizando substratos alternativos
de baixo custo comercial por Zymomonas mobilis
Neste novo milnio, a sociedade tem se tornado mais consciente da ne-
cessidade de implementar tecnologias baseadas em matrias-primas renov-
veis e adequadas, tanto sob o ponto de vista energtico, quanto o de preser-
vao do meio ambiente. O domnio tecnolgico na fabricao de produtos
de baixo custo provenientes de matrias-primas e resduos da agroindstria,
com alto valor agregado como o lcool, determinante para insero de nos-
so pas numa parcela significativa do mundo dos agronegcios.
Apesar dos inmeros trabalhos realizados utilizando glicose como ma-
tria-prima para a fermentao com Zymomonas, evidente que a glicose
como matria-prima representa um custo muito elevado para fermentaes
industriais, tornando-se assim, importante investigar a produo de etanol
por Zymomonas mobilis a partir de substratos baratos e disponveis em gran-
des quantidades (Ernandes; Garcia-Cruz, 2011b).
Vrias pesquisas esto sendo desenvolvidas para aumentar o rendimen-
to de etanol juntamente com o emprego de tcnicas mais econmicas de
produo, recuperao e purificao, visando diminuir o custo total do
processo. Em nvel experimental, o uso de diversas matrias-primas como
substratos de baixo custo tais como sacarose, amido, amido hidrolisado, xa-
rope de milho e melaos residuais da indstria aucareira tm sido pesqui-
sadas para a produo de etanol por Zymomonas mobilis.
Millichip e Doelle (1989) utilizaram sorgo modo a seco como substrato
para Zymomonas produzir lcool em larga escala (586.000 litros), obten-
do 13% (v/v) de etanol. Alm do sorgo, o milho e outras matrias-primas
amilceas foram testadas por Doelle e colaboradores (1989) para a fermen-
tao em escala industrial (64.000 litros), utilizando um sistema de inculo
em cascata que substitui o sistema de recirculao de biomassa e, portanto,
reduz os custos envolvidos em centrifugao e reciclo de clulas de Zymo-
monas mobilis.
Amin e Khalaf Allah (1992) testaram Zymomonas mobilis ATCC 396769
para fermentar pedaos de beterraba aucareira (185 g/L) em fermentao
em estado slido obtendo produtividade de 12 g/L.h e concentrao de eta-
nol de 130 g/L.
Park e Baratti (1993) utilizaram uma cepa osmotolerante (Zymomo-
nas mobilis SBE15), mutante de Zymomonas mobilis ATCC 32821, para
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228 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
fermentao de melao de beterraba aucareira previamente hidrolisado
enzimaticamente, em processo contnuo de dois estgios. O fermentador
operou 18 dias, obtendo-se concentrao de etanol de 60 g/L e 97% de con-
verso de acar.
Abaixo, segue-se uma descrio dos principais substratos que podem
ser utilizados para a fermentao alcolica por Zymomonas mobilis.
Cana-de-acar como matria-prima na fermentao alcolica por
Zymomonas mobilis
Numa avaliao global do setor sucroalcooleiro brasileiro, verifica-
-se um subaproveitamento dos potenciais da cana-de-acar. A cana-de-
-acar uma planta da famlia das gramneas (Saccharum officinarum L.)
cultivada nas regies tropicais e subtropicais e no Brasil, ela a base para a
produo de acar, lcool e outros subprodutos.
Seus principais constituintes esto indicados na Tabela 8.7. Entre as
substncias encontradas na cana-de-acar, a mais importante a sacaro-
se, que um dissacardeo formado por uma molcula de glicose e uma de
frutose. Alm de etanol, da sacarose podem tambm ser produzidos, por
rota qumica ou bioqumica, poliis, cidos orgnicos, steres de sacarose,
enzimas, biopolmeros, dentre outros.
Tabela 8.7 Constituintes da cana-de-acar
Constituintes Slidos solveis ( %)
Acares 75-93
Sacarose 70-91
Glicose 02-04
Frutose 02-04
Sais 03-05
cidos orgnicos 1,5-4,5
cidos inorgnicos 1,0-3,0
Protenas 0,5-0,6
Amido 0,001-0,05
Canas 0,3-0,6
Ceras e graxas 0,05-0,15
Corantes 03-05
Fonte: Caderno Copersucar (1988).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 229
O mercado sucroalcooleiro movimentou cerca de R$ 36 bilhes anual-
mente (Tabela 8.8), correspondendo ao notvel valor de 3,5% do PIB bra-
sileiro, com faturamentos diretos e indiretos nas 302 unidades produtoras
(128 no estado de So Paulo), no ano de 2003 (Jornal da Cana, janeiro 2004).
Este setor faz do Brasil o maior produtor mundial de cana-de-acar, e o
nico pas do mundo a implementar, em larga escala a produo de um
combustvel alternativo ao petrleo.
Atualmente, o lcool reconhecido mundialmente por suas vantagens
ambientais, sociais e econmicas, e os pases desenvolvidos vm investindo
maciamente na produo deste biocombustvel, como o caso dos Estados
Unidos da Amrica do Norte, Sucia e Canad.
No Brasil, os estados de So Paulo, Alagoas, Pernambuco e Rio de Ja-
neiro so os que mais se beneficiaram. O agronegcio brasileiro respon-
svel por 20,6% do Produto Interno Bruto (PIB) brasileiro e gera 14% dos
empregos totais do pas. Aqui, destaca-se o agronegcio da cana-de-acar,
que rene 6% dos empregos agroindustriais brasileiros e responsvel por
35% do PIB e do emprego rural do estado de So Paulo.
De acordo com o Relatrio de Produo Agrcola do Instituto Brasileiro
de Geografia e Estatstica (IBGE), em 2007 a cultura da cana-de-acar
cresceu 7% em relao ao ano anterior. Esse crescimento informa o IBGE,
resultado do surgimento de novas reas plantadas. O estado de So Paulo,
onde a produo de cana mais relevante, responde por aproximadamente
57% de toda a produo nacional. De acordo com o relatrio, em 2007, So
Paulo dever crescer 5,3% em relao ao obtido em 2006. Justifica-se esse
incremento, sobretudo, pelo lado do consumo interno e pelas expectativas
do crescimento da demanda do mercado mundial.
Uma vantagem importante do Brasil em relao s diversas economias
mundiais a abundncia de terra agriculturvel. So poucos os pases em
desenvolvimento que ainda possuem territrio rural a ser aproveitado
em larga escala. Segundo os dados obtidos pela Unica, (Unio da Agroin-
dstria Canavieira de So Paulo), a agricultura brasileira utiliza menos de
10% da superfcie do pas. A maior parte do territrio ocupada por pas-
tagens e engorda de animais (35%). As florestas correspondem a 55% e a
cana-de-acar a 0,7%, com produo de 455 milhes de toneladas na safra
em curso de 2006 e 2007, sendo recorde histrico.
A cana-de-acar pode ser uma fonte alternativa para a produo de
etanol a um baixo custo por ser considerada abundante e de fcil disponibi-
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230 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
lidade no pas. Cada hectare de cana plantada produz de 50 a 100 toneladas
de cana. A proporo do caldo de cana produzido de 500 a 1.000 litros/
tonelada de cana, mdia de 850 litros/ tonelada de cana, dependendo da
embebio na moenda; 25 a 40 litros de melao por tonelada de cana. Cada
tonelada de cana produz cerca de 130 kg a 140 kg de acar (Unica).
A expanso da rea plantada de cana-de-acar, entre 2000 e 2005, cres-
ceu 14%, passando de 49 mil km para 56 mil km
2
. Apesar de ainda estar
concentrada no estado de So Paulo, a produo de cana-de-acar e lcool
cresce rapidamente em outros estados. Em Minas Gerais, por exemplo, a
produo de cana cresceu de 21,6 para 24,5 milhes de toneladas ou 13,5%
entre as safras de 2005 e 2004 e de 2006 e 2005. De acordo com informa-
es do Sindicato da Indstria do Acar (Sindacar), em Minas Gerais,
espera-se que a produo de cana-de-acar atinja 28,7 milhes de tonela-
das na safra de 2006 e 2007. Projeta-se que, at 2007, mais quatro usinas
de acar, com investimentos estimados de R$ 500 milhes, entraro em
operao no estado.
Pelas estimativas da Unica, a produo de cana-de-acar na Regio
Centro-Sul do pas dever atingir 375 milhes de toneladas na safra de
2006 e 2007, com crescimento de 11,3% em relao aos 336,8 milhes da
safra de 2005 e 2006. Sero produzidas 25,5 milhes de toneladas de acar
equivalente, com um aumento de 15,8% em comparao aos 22 milhes al-
canados na safra do ano anterior. A produo de lcool anidro e hidratado
dever chegar a 15,6 bilhes no Centro-Sul do pas, com uma elevao de
8,9% em relao safra de 2005 e 2006.
O Brasil e os Estados Unidos so os lderes mundiais na produo de
etanol, utilizando como matria-prima o acar e milho, respectivamente.
Apesar do incentivo produo de etanol de milho nos EUA, apoiado por
foras polticas, algumas associaes de classe e inclusive o USDA (United
States Depatment of Agriculture), cientistas da Universidade de Cornell e
de Berkeley tm demonstrado que, tanto do aspecto energtico como am-
biental, a produo de etanol-milho no racional. Alm disso, impor-
tante ressalvar para o fato que os custos de produo do lcool de cana so
muito mais baratos do que os de milho (Andreoli, Souza, 2006). Na Tabela
8.8, encontram-se alguns parmetros comparativos dos custos estimados
de produo de etanol de milho nos Estados Unidos e de cana-de-acar
no Brasil.
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 231
Tabela 8.8 Sumrio dos custos estimados de produo de etanol (U$/ galo)
Item de custos
EUA
Milho
EUA
Cana
EUA
Beterraba
EUA
Melao
EUA
Acar
cru
EUA
Acar
refinado
Brasil
Cana
Europa
Beterraba
Matria-prima 0,53 1,48 1,58 0,91 3,12 3,61 0,30 0,97
Processamento 0,52 0,92 0,77 0,36 0,36 0,36 0,51 1,92
Custo Total 1,05 2,40 1,35 1,27 3,48 3,97 0,81 2,89
Alm dos fatores geogrficos vantajosos para o plantio da cana-de-a-
car no Brasil, importante ressaltar ainda que, por causa de sua compo-
sio qumica (compostos nitrogenados, vitaminas, coenzimas e acares
fermentescveis), alguns autores consideram-na como matria-prima ade-
quada para a fermentao alcolica a partir de Zymomonas mobilis (Borsari
et al., 2003).
Caldo de cana-de-acar
Diante dos fatores geogrficos vantajosos para o plantio da cana-de-
acar no Brasil, justifica-se que o caldo da cana, obtido da cana-de-acar,
destaca-se como uma fonte alternativa para a produo de etanol a um bai-
xo custo por ser abundante e de fcil disponibilidade no s no pas como na
regio de So Jos do Rio Preto, pertencente ao estado de So Paulo, e ainda,
considerada uma matria-prima adequada para as fermentaes com Zy-
momonas mobilis em virtude de sua composio qumica (alto teor de aca-
res, nitrognio, vitaminas e sais minerais) (Ernandes; Garcia-Cruz, 2010).
Conforme Luiz da Cmara Cascudo (1971), o caldo de cana (garapa)
um refresco cujo consumo h muito se universalizou no pas, particular-
mente nas pocas de vero, fazendo parte tambm de uma diversidade de
prescries na medicina popular, como, por exemplo, acontece no Nordes-
te, onde se acredita que possua qualidade hemosttica e cicatrizante e exce-
lente galactognio.
O caldo de cana uma suspenso coloidal cuja cor, que varia de verde-
-escuro a marrom, resulta da presena de substncias diversas, como clo-
rofila, antocianinas, xantofilas e carotenos. Sua opacidade causada por
coloides, protenas, pentosanas e sais inorgnicos como fosfatos, xidos de
clcio, ferro e magnsio. Contm ainda terra, bagacilho e goma (Fioravanti,
2000; Kitoko et al., 2004).
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232 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
O caldo de cana-de-acar comercial uma matria-prima consumida
in natura no Brasil e considerado de baixo custo comercial. Soccol e co-
laboradores (1990) relataram que a composio qumica do caldo de cana-
de-acar apresenta: 74,5% a 82,0% de gua; 14,0% de hidratos de carbono;
10,0% de fibras; 0,4% de substncias nitrogenadas. As substncias slidas
representam 18,0 a 25,0% do total de sua composio. A composio do
caldo de cana-de-acar pode ser visualizada na Tabela 8.9.
Gunasekaran e colaboradores (1986) estudaram o efeito de diferentes
meios (sinttico, caldo e melao de cana-de-acar) para a produo de eta-
nol, com diferentes linhagens Zymomonas mobilis e os resultados obtidos es-
to representados na Tabela 8.10, onde pode ser observado que os melhores
rendimentos foram obtidos com o caldo de cana-de-acar. Das linhagens
testadas, apenas a NRRL B 4286 produziu mais etanol quando foi usado o
meio sinttico. Com Zymomonas mobilis ATTCC 10988, o rendimento de
etanol foi 82-94%, aps 48 horas de fermentao.
Duarte (1995) analisou o efeito da lecitina de soja e do destilado do de-
sodorizado do leo de soja (DDOS) na fermentao da sacarose e do cal-
do de cana por Saccharomyces cerevisiae e por Zymomonas mobilis CP4 em
cultura de batelada. Com o acar redutor total em valor nominal de 15%
Tabela 8.9 Composio do caldo de cana-de-acar
Composio centesimal do caldo de cana-de-acar
Elementos (%) Percentagem dos componentes
gua 74,50
Slica (SiO
2
)
Potssio (K
2
O)
Sdio (Na
2
O)
Clcio (CaO)
Magnsio (MgO)
Ferro (Fe
2
O
3
)
0,25
0,12
0,01
0,02
0,01
traos
Cinzas 0,50
Fsforo (P
2
O
5
)
Sulfatos (SO
3
)
Cloretos (Cl)
Celulose
0,07
0,02
traos
5,50
Fibra 10,0 Sacarose 12,50
Matrias nitrogenadas 0,40
cido asprtico
cido ntrico
0,20
0,01
Nitrognio total 0,06%
Amonaco
Corpos xnticos
traos
traos
Fonte: Soccol e colaboradores (1990).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 233
(p/v) e sem adio de suplemento lipdico, os acares no foram eficien-
temente utilizados e os resultados para Saccharomyces e Zymomonas, num
meio contendo sacarose e caldo de cana foram, em mdia, respectivamente:
eficincia de converso (YE con.) 12,55 e 20,54%; taxa especfica de cresci-
mento mximo (Mmax.) 0,25 e 0,20 h
-1
. Com adio de lecitina de soja ou
DDOS a 0,01% (v/v) em sacarose e caldo de cana-de-acar os resultados
para Saccharomyces ou Zymomonas foram, em mdia, respectivamente: YE
con. 13,69 e 26,15%, enquanto os valores de Mmax. foram: 0,24 e 0,22 h
-1

e Yx/s: 0,025 e 0,012.
Cao (1999) realizou um estudo utilizando o planejamento fatorial de 2
nveis equidistantes de 3 variveis 23 para determinar as melhores condies
de cultivo quanto a temperatura (25 e 35C), agitao (0 e 150 rpm) e con-
centrao de acares redutores totais no caldo de cana (100,0 e 200,0 g/L)
e, 3 repeties no ponto central, onde a temperatura foi de 30C, agitao
de 150 rpm e concentrao de acar redutor total no caldo de cana, usado
como substrato para a produo de sorbitol e etanol, foi de 150,0 g/L. Ob-
servou-se que altas concentraes de acar no caldo de cana estimularam
Tabela 8.10 Efeito da concentrao inicial de acar sobre a produo de etanol por vrias linha-
gens de Zymomonas mobilis
Substrato Linhagens
Parmetros
fermentativos
ATCC
10988
ATCC
12526
NRRL B
4286
IFO
13756
Meio
sinttico
P
Acar inicial
Su
g/gs
E
5-9
46-09
0-32
73-0
20-0
6-1
20-0
75-0
47-65
0-33
10-15
89-0
20-0
79-29
0-46
8-85
20-0
69-14
0-39
91-0
Cana-de-
-acar
P
Acar inicial
Su
g/gs
E
10-3
18-0
89-4
0-48
95-0
10-3
18-0
89-4
0-48
95-0
9-2
18-0
79-86
0-42
97-2
10-3
89-4
97-2
0-47
18-0
Melao
P
Acar inicial
Su
g/gs
E
3-05
10-0
ND
47-66
ND
2-9
10-0
45-31
ND
ND
3-29
10-0
ND
51-41
ND
1-97
10-0
ND
30-78
ND
P produtividade de lcool % (v/v); Su substrato utilizado % (v/v); g/gs gramas de lcool produ-
zido/ g de substrato utilizado; E porcentagem terico de rendimento; ND no determinado. Fonte:
Gunasekaran e colaboradores (1986).
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234 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
a produo de sorbitol e etanol. Os cultivos estticos proporcionaram os
melhores valores de produo de sorbitol, porm, os melhores valores de
etanol foram encontrados em cultivos com agitao de 150 rpm. Em rela-
o s temperaturas testadas verificou que estas no foram uma varivel
significativa para a produo de sorbitol e etanol.
Tano e Buzato (2003) avaliaram a produo de etanol em caldo de cana
fermentado por Zymomonas mobilis com alta concentrao inicial de acar
(150,0 g/L), rico em sais minerais, adicionado de 5,0 g de extrato de leve-
dura e incubado a 28C, durante 48 horas a 180 rpm, num pH de 5,4. Neste
meio, observou-se a presena de etanol e foi constado que este reduziu a
formao de mais etanol, porm no afetou a produo de levana nem o
coeficiente de produtividade, quando relacionado biomassa (g biomassa/
g acar consumido). Estes mesmos pesquisadores observaram que alguns
dos componentes presentes no caldo de cana-de-acar inibem o cresci-
mento e a fermentao por Zymomonas mobilis. Os nveis relativamente ele-
vados de alguns sais inorgnicos, especialmente cloreto de potssio e alguns
ons como clcio e magnsio, apresentam um efeito inibidor significativo
na fermentao, alm da competio de outros microrganismos que pro-
grediram nele.
Borsari (2004) estudou diferentes condies de fermentao por Zymo-
monas mobilis CP4, por meio de delineamentos estatsticos variando a con-
centrao e tipo de substrato, forma de cultivo, suplementao com cido
pantotnico, extrato de levedura, cloreto de sdio e a tcnica de permeabili-
zao celular e observou que o caldo de cana-de-acar estimulou a produ-
o de biomassa, sorbitol e etanol.
Melaos de cana-de-acar
Segundo Resoluo n.12 D.O. de 24/07/1978 do CNNPA (Comisso
Nacional de Normas e Padres para Alimentos) que estabeleceu os pa-
dres de identidade e qualidade para os alimentos (e bebidas) em todo o
territrio brasileiro, melao o lquido que se obtm como resduo de fa-
bricao do acar cristalizado, do melado ou do refino do acar bruto e
deve ser designado com a denominao de melao seguido do nome da
substncia de origem, como por exemplo, melao de cana.
No Brasil, so produzidos cerca de 17,9 milhes de toneladas de melao
de cana-de-acar por ano durante a fabricao do acar. Por causa de sua
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 235
composio rica em acares fermentescveis, seu baixo custo (R$ 0,15/kg)
e alta disponibilidade no territrio brasileiro, o melao de cana-de-acar
tem sido sugerido como substrato para melhorar e reduzir custos na pro-
duo de diversos produtos, como por exemplo, de cido ltico pelo Lac-
tobacillus curvatus e para produo de etanol a partir de Zymomonas mobilis
(Lima, 1975).
O melao um subproduto do processo de extrao e refinao de sa-
carose, quer seja de cana ou beterraba, o qual pode ser utilizado como ma-
tria-prima para a produo de etanol por fermentao. O melao de cana-
-de-acar caracteriza-se por apresentar maior contedo de vitaminas, ao
passo que o melao de beterraba mais rico em nitrognio e minerais. Am-
bos contm aproximadamente 50% de acar, sendo a maior parte sacarose.
A composio mdia do melao de cana-de-acar corresponde a 20%
de gua; 72% de constituintes orgnicos dos quais 62% correspondem aos
acares (sacarose, glicose, frutose, ou acar invertido e rafinose), 10% de
no acares (material nitrogenado, cidos livres e combinados e substn-
cias gomosas solveis) e 6% de constituintes inorgnicos (xidos de silcio,
potssio, clcio, magnsio, sdio, ferro, fsforo e alumnio, alm de res-
duos de soda, carbonatos, sulfatos e cloretos) (Soccol et al.,1990).
A composio do melao depende da variedade de cana-de-acar uti-
lizada, portanto, fatores como: idade, limpeza, maturao, sistema de cul-
tivo, adubao, tratos culturais e condies climticas, alm dos processos
de fabricao normais utilizados nas diversas usinas conforme pode ser ob-
servado na Tabela 8.11.
Doelle e Greenfield (1985) detalharam ainda mais estes fatores que
influenciam a composio do melao, aos quais acrescentaram: natureza
da matria-prima (cana de acar, beterraba etc.); processo de extrao do
caldo; sistema de clarificao, evaporao e cozimento; sistema de resfria-
mento; sistema de turbinagem; tipo de acar e condies tcnico-econ-
micas da regio aucareira.
Segundo Kaseno e Kokugan, (1997), o melao resultante da fabricao
de lcool pode conter uma srie de impurezas advindas de processos de ca-
liao, sulfitao e fosfatao aplicados ao caldo de cana, os quais promo-
vem a formao de um grupo (floco) de precipitados de impurezas, estando
neste includos os agentes de colorao (corantes) e ao se adotar este tipo
de tratamento tm-se como resultado um licor negro (black strap) conten-
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236 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Tabela 8.11 Variabilidade de composio do melao em Usinas de Acar
Elemento
Valores observados
So Paulo Alagoas
Mdio Mnimo Mximo Mdio Mnimo Mximo
gua (%) 17,3 8,2 26,8
Slidos totais (%) 82,7 73,2 91,8
Brix (%) 80,0 65,0 88,0 78,61 76,77 83,30
Pureza (%) 65,0 56,0 76,0 46,54 40,41 55,67
Sacarose (%) 52,0 47,0 64,0
Glicose (%) 12,0 6,0 20,0
Frutose (%) 9,0 5,0 17,0
Acares redutores (%) 6,0 4,0 12,0 16,20 14,45 18,03
Acares totais (%) 65,6 52,1 72,1 54,73 51,11 61,09
Gomas (ppm) 0,0 2000
Ph 6,3 5,0 6,8
Cinzas (%) 5 3,5 7,0
P
2
O
5
0,05 0,01 0,15 0,07 0,02 0,14
K
2
O 2,1 1,23 2,68 3,51 2,93 4,52
CaO 0,36 0,14 0,73 1,36 0,93 2,03
MgO 0,12 0,03 0,60 1,03 0,60 1,31
SiO
2
0,58 0,56 0,62
F
2
O
3
0,32 0,28 0,56
SO
3
1,17 1,0 1,19
Cl 0,18 0,14 0,28
Na
2
O 0,12 0,11 0,19
Vitaminas A
1
, B
1
e B
2
Varivel Varivel Varivel
Fonte: Copersucar (1988).
do impurezas como sais inorgnicos, acares no fermentveis, cinzas de
sulfatos e corantes.
O melao contm uma srie de impurezas como sais inorgnicos, c-
dmio, acares no fermentveis e resduos sulfatados, incluindo subs-
tncias corantes; oriundas entre outros, do prprio tratamento aplicado
cana-de-acar na produo do acar e do solo onde esta foi cultivada e
que interferem na produtividade em etanol e viabilidade celular dentro do
bioprocesso (Prado-Filho et al., 1998).
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PRODUO DE ETANOL POR ZYMOMONAS MOBILIS CCT 4494 237
Alm do melao de cana-de-acar existe tambm o melao de alta qua-
lidade (HTM) que pode ser usado como substrato para produo de etanol.
HTM definido como um xarope clarificado, parcialmente invertido para
evitar a cristalizao e evaporado a 85 Brix. A composio do melao de alta
qualidade difere notavelmente da composio do melao tradicional. Possui
alto contedo de acares o que o faz muito interessante para a produo
de lcool. O contedo de P
2
O
5
, K
2
O, MgO, CaO e nitrognio mnimo
comparado com a do melao de cana e de beterraba (Cromie; Doelle, 1980).
Gunasekaran e colaboradores (1986) estudaram o efeito da adio de
melao de cana-de-acar em meios de cultivo para a produo de etanol,
com diferentes linhagens Zymomonas mobilis. As linhagens ATCC 10988 e
(3,05% v/v) a NRRL B 4286 (3,29% v/v) mostraram mxima produtivida-
de enquanto IFO 13756, mnima produtividade (1,97% v/v). A partir des-
ses resultados, a performance de Zymomonas mobilis ATCC 10988 foi mais
bem estudada em diferentes concentraes de acares presentes no melao
de cana-de-acar. A mxima produo de etanol (3,35% v/v) foi com 15%
de concentrao inicial de acar e abaixo dessa concentrao, a produo
de etanol diminuiu significativamente. Em geral, os autores concluram
que a habilidade das linhagens de Zymomonas mobilis produzirem etanol
a partir de melaos foi menor quando comparada com os outros substratos
(meio sinttico e cana-de-acar).
Resduos lignocelulsicos como matria-prima na fermentao
alcolica por Zymomonas mobilis
Devemos lembrar que a produo mundial de etanol no realizada com
a mesma matria-prima; para cada regio existem peculiaridades geogr-
ficas a serem observadas, como o caso do milho nos EUA, beterraba na
Europa e a cana-de-acar no Brasil, Mxico e ndia.
H que se ressaltar que as matrias-primas de natureza lignocelulsica
vm ganhando cada vez mais ateno dos pases avanados, verificando-
-se fortes investimentos em desenvolvimento tecnolgico para o aproveita-
mento integral desses recursos abundantes em nosso planeta.
A importncia do aproveitamento de resduos lignocelulsicos (agroin-
dustriais e florestais) se revela ainda quando identificamos grandes centros
de pesquisa internacionais de elevada reputao dedicando-se exclusiva-
mente ao tema (Chum; Overend, 2001; Mielenz, 2001; Pereira Jr., 2005).
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238 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Os resduos lignocelulsicos so os materiais orgnicos mais abundan-
tes da biosfera, representando aproximadamente 50% da biomassa vegetal
e podem ser usados como matria-prima em processos industriais para a
produo de alimentos, combustveis insumos qumicos, enzimas e bens de
consumo diversos (Kadam; Forrest; Jacobson, 2000).
O Brasil, com sua grande extenso territorial, apresenta alto potencial
de explorao de recursos renovveis para a gerao de diversos insumos.
Um resduo abundante no pas e proveniente de material renovvel o ba-
gao de cana-de-acar, pois o Brasil o maior produtor de cana-de-acar
do mundo com uma produo estimada de aproximadamente de 570 mi-
lhes de toneladas referentes safra dos anos 2008-2009, segundo dados da
Unio da Indstria de Cana-de-acar (Unica) e Ministrio da Agricultu-
ra, Pecuria e Abastecimento (Mapa).
Uma indstria sucroalcooleira produz cerca de 280 kg de bagao por
tonelada de cana moda (Molina et al., 1995) o que corresponde a uma pro-
duo de bagao de aproximadamente 100 milhes de toneladas por ano.
Grande parte deste resduo, tambm considerado por muitos como subpro-
duto, utilizada pela prpria usina como fonte de energia.
Embora o bagao possa ser utilizado para gerao de energia ou como
suplemento em rao animal, ainda h um grande excedente que poder uti-
lizado para produo de diversos bens sociedade. Algumas alternativas
para sua utilizao como matria-prima so a produo de etanol, hidroxi-
metilfurfural, papel e celulose, revestimentos acsticos, madeira prensada,
lcool, alcaloides, enzimas e xilitol (Cunha et al., 2005).
Segundo Takahashi (1998), o etanol pode ser produzido a partir de res-
duos lignocelulsicos. A hidrlise destes resduos proporciona uma mistu-
ra de pentoses e hexoses, e a converso completa destes acares em etanol
fundamental para que o preo do etanol produzido seja competitivo com
o da gasolina. Escherichia coli KO11, possuindo os genes PDC (piruvato
descarboxilase) e ADH (lcool desidrogenase) de Zymomonas mobilis inse-
ridos em seu cromossomo, mostrou-se capaz de fermentar eficientemente
pentoses e hexoses a etanol, em condies anaerbicas. Em meio LB (Lu-
ria-Bertani), contendo extrato de levedura, peptona e NaCl, acrescido de
50 g/L de glicose, a bactria produziu 21,1 g/L de etanol, equivalente a
82,2% do rendimento terico mximo. Em meio LB acrescido de 40 g/L
de xilose, produziu 16,3 g/L de etanol, o que corresponde a uma eficincia
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de converso de 80,2%. Em uma mistura de 10 g/L de glicose e 40 g/L de
xilose, a bactria recombinante produziu 24,5 g/L de etanol, com eficin-
cia de 96,4%. No hidrolisado de bagao de cana-de-acar, os acares fo-
ram completamente consumidos em 48 horas e a eficincia de converso foi
de 95%. O meio corn steep powder (CSP), na concentrao de 12,5 g/L,
substituiu eficientemente o meio LB como fonte de nutrientes. O acetato,
potencial inibidor do crescimento e do metabolismo de E. coli, est presen-
te nos hidrolisados hemicelulsicos numa faixa de concentraes de 2,0 a
15,0 g/L. E. coli KO11 mostrou-se extremamente tolerante ao acetato. Em
meio LB acrescido de glicose ou xilose mais acetato, foi observado que con-
centraes de 2,0 a 12,0 g/L no afetaram o desempenho fermentativo da
bactria. No entanto, foi verificado que todas as concentraes de acetato
testadas (2,0 a 12,0 g/L) tiveram um efeito inibitrio sobre o crescimento
bacteriano. Nos valores de pH mais baixos (5,5 e 6,0), a inibio foi exa-
cerbada em funo de maior concentrao da forma protonada do cido
actico.
O cenrio futuro
Inquestionavelmente, o lcool a melhor alternativa para substituir o
petrleo nas prximas dcadas em veculos automotores. A era do petrleo
no vai se encerrar por falta de petrleo, mas porque o preo subir tanto
que ser necessrio desenvolver fontes alternativas, dentre elas, o etanol do
milho ou da cana-de-acar.
O cenrio futuro mostra que somente os maiores pases consumidores
de energia, Estados Unidos, Japo e Europa, vo precisar importar mais de
10 bilhes de litros de etanol at 2012. A Etanol-frica anunciou o investi-
mento de US$ 1 bilho para a produo de etanol na frica do Sul. Se uma
tonelada de cana produz 88 litros de etanol, seriam necessrios mais de 110
milhes de toneladas de cana para atender o mercado futuro, o que acres-
centaria mais 1,2 milhes de hectares a serem cultivados.
Em conjunto com o grande avano da produo convencional de lcool
no Brasil, conforme relatado anteriormente, a biotecnologia tem sido uma
ferramenta bastante explorada para a obteno de inmeros produtos de in-
teresse econmico e social. Os processos biotecnolgicos tm se mostrados
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240 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
promissores e com inmeras vantagens em relao aos processos conven-
cionais. Tal interesse pode ser justificado pelas condies de operaes mais
brandas empregadas na biossntese, que reduzem o consumo de energia e
aumentam a segurana do processo, pela alta especificidade das enzimas,
que minimiza a formao de subprodutos e pelo menor impacto ambiental.
A crescente importncia industrial dos mtodos biolgicos de produo
deve, entretanto, ser acompanhada durante a produo de compostos. As-
sim, uma intensa e constante pesquisa visando entender melhor as vias me-
tablicas de sntese e a funo fisiolgica dos microrganismos produtores
necessria para regular a otimizao do processo de fermentao alcolica
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9
Hidrlise enzimtica na cadeia produtiva
do bioetanol e uso de enzimas para
diagnsticos de produtos da fermentao
Edwil Aparecida de Lucca Gatts,
Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro
Introduo
A Biotecnologia vem rompendo fronteiras propiciando grandes avan-
os em muitas reas do conhecimento cientfico que tem se traduzido na
melhoria da qualidade de vida da populao. Entretanto, a utilizao de
tcnicas que fazem parte desta rea no nova e vem sendo utilizada h
muito tempo pela humanidade. Entre as inmeras vantagens e tecnologias
originadas nesse campo, podemos chamar ateno para a gerao de pro-
dutos nas reas farmacutica, alimentar, ambiental, qumica e energtica
(Higgins, 1985). Sua importncia vem sendo alicerada desde seu incio
emprico, no qual o homem conseguia produzir por meio da fermentao
produtos como po, vinho, cerveja e mesmo pela modificao de alimentos
como vinagre e queijos. A Biotecnologia ganhou sua magnitude quando os
processos complexos comearam a assumir grande significado comercial,
iniciado com a contribuio de Pasteur, no desenvolvimento da produo
de diferentes solventes como etanol, acetona, butanol e na produo da pe-
nicilina pelo fungo Penicillium chrysogenum (Demain, 2007). De modo sig-
nificante nesse avano, a produo de clulas de levedura tambm assumiu
grande importncia ao lado de sua inerente capacidade fermentativa para a
produo de etanol. Em todas as fases desta evoluo, muitos processos e
procedimentos assumiram papel definitivo e, aliado principalmente s no-
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252 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
vas tecnologias que surgiram na dcada de 1970, a Biotecnologia se conso-
lidou utilizando o conhecimento acumulado e sendo capaz de gerar enorme
riqueza e influncia em cada setor da economia com destaque para a sade,
produo e processamento de alimentos, proteo ambiental e produo de
materiais (Gavrilescu; Chisti, 2005). Dentro deste panorama, o Brasil tem
adquirido competncia indiscutvel na rea de produo de energia renov-
vel como no caso do etanol a partir de cana-de-acar (Goldemberg, 2008).
A cana-de-acar (Saccharum officinarum) representa alimento e ener-
gia para o setor industrial; e a gerao de bioetanol tem avanado produzin-
do conhecimento em reas diversas (DeVries et al., 2010; Glvez, 2000).
Hoje a produo de bioetanol est operando com leveduras selecionadas
que imprimem rendimento na fermentao de 91,5% e viabilidade final da
ordem de 97%. Estes nmeros representam aumentos de 37% em relao
manuteno da viabilidade e, da ordem de 4% em relao ao rendimen-
to, quando comparados com processos de produo de etanol combustvel,
que utilizavam leveduras de panificao. Atualmente, o Brasil o maior
detentor de conhecimento e tecnologia na gerao de etanol combustvel a
partir da cana-de-acar. O etanol, um combustvel menos poluente que os
derivados de petrleo, assume importante papel no processo de conteno
do aquecimento do planeta. A otimizao de seu processo de produo, o
desenvolvimento de novas variedades de leveduras e o aproveitamento de
outros materiais para gerao de fontes alternativas de carbono, constitui
alvo para diversos estudos (Amorin, 2005).
Na produo de etanol, o bagao da cana-de-acar vem sendo utili-
zado para gerao de vapor e eletricidade. O resduo queimado representa
um processo tradicional de baixa eficincia quanto quantidade de ener-
gia gerada e, portanto tm sido buscadas novas aplicaes j que ele possui
alto teor de carboidrato e relativamente baixo teor de lignina. Esta tcnica
da produo de etanol utilizando-se de subprodutos industriais que con-
tm lignocelulose como bagao de cana-de-acar vem sendo explorada
h algum tempo (Dale et al., 1984; Wright, 1998; Azzam, 1989; Cadoche;
Lopez, 1989; Reshamwala et al., 1995; Bjerre et al., 1996; Duff; Murray,
1996; Martn, 2002; Sun; Cheng, 2002; Vasques et al. 2007; Ojeda; Kafa-
rov, 2009; Balat, 2011; El-Zawawy et al., 2011). Nesse processo, o bagao
submetido a um tratamento cido, que aps a prensagem, segue duas rotas:
a parte lquida vai para a fermentao gerando etanol e a slida deve ser
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HIDRLISE ENZIMTICA NA CADEIA PRODUTIVA DO BIOETANOL 253
submetida deslignificao. Aps a remoo da lignina, a parte celulsi-
ca restante pode ser fermentada com enzimas celulolticas, que iro liberar
acares, dos quais a levedura produzir etanol. O etanol celulsico, que
pode ser considerado como aquele obtido a partir da quebra de resduos
celulsicos como bagao de cana, bagao e palha de milho, atravs de di-
ferentes tecnologias incluindo enzimas, tem um impacto positivo sobre o
meio ambiente no sentido de reduo de CO
2
gerado em torno de 65-95%
em comparao ao uso de gasolina como combustvel. Assim, podemos
considerar como um dos pontos importantes a hidrlise enzimtica, uma
tecnologia que resulta na utilizao destes substratos ricos em celulose que
ir contribuir para utilizao de uma fonte de energia mais limpa em relao
ao meio ambiente (Solomon et al., 2007).
No Brasil, as fontes de matria-prima de celulose so os subprodutos da
produo de cana-de-acar: a palha, que fica no campo aps a colheita, e
o bagao da cana, resultante do processo convencional de produo de a-
car e etanol nas usinas (Bastos, 2007). A quebra da celulose realizada por
enzimas como celulases, xilanases e enzimas acessrias produzidas durante
a fermentao nos processos de fermentao desses microrganismos, que
podem auxiliar a degradao de fibras celulsicas presentes no bagao de
cana podendo gerar, deste modo, etanol. Uma grande atrao para a utiliza-
o de enzimas em processos biotecnolgicos reside no fato de que enzimas
so macromolculas catalisadoras de reaes qumicas, presentes em todos
os seres vivos, dos quais podem ser extradas e aplicadas, livres ou imobili-
zadas, em sistemas diferentes daqueles que as originou (Said; Pietro, 2004).
Na hidrlise enzimtica da celulose, as enzimas celulolticas assumem
grande importncia e muitos microrganismos so capazes de produzir
enzimas celulolticas entre os quais podemos citar as bactrias aerbicas,
nas quais encontramos o gnero dos Actinomicetos e dentro destes espe-
cialmente Streptomyces sp. Ainda so consideradas boas produtoras de
enzimas celulolticas Celulomonas sp. e Bacillus sp. Entre as bactrias anae-
rbicas so encontrados Clostridium e Bacterioides. Numerosos fungos so
considerados bons produtores de enzimas celulolticas como, por exemplo,
Trichoderma, Aspergillus e Penicillium (Bisaria, 1991; Sternberg, 1976; Fan
et al., 1987; Pentilla et al., 1987; Duff; Murray, 1996).
A celulase, ou complexo celuloltico secretado por fungos filamento-
sos, formada por trs componentes enzimticos majoritrios, as endo-
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254 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
glucanases (EG; EC 3.2.1.4), as celobioidrolases (CBH; EC 3.2.1.91) e
as |-glicosidases (EC 3.2.1.21). Essas enzimas atuam em cooperao, ou
seja, as endoglucanases (EG) clivam randomicamente ao longo da cadeia
de celulose, produzindo novos stios de ataque para as celobioidrolases; as
celobioidrolases (CBH) agem como exoenzimas, isto , nas extremidades
das cadeias, e liberam celobiose como produto principal; e as |-glicosidases
completam o processo pela hidrlise da celobiose e de outros oligossaca-
rdeos at a gerao final de glicose (Whitaker, 1971; Pentilla et al., 1987;
Beguin; Aubert, 1994; Persson et al., 1991; Jiang et al., 2011; Chandra et
al., 2009).
As celulases quebram a celulose em acares simples, que servem como
fonte de carbono e energia para os microrganismos. A busca atual da cin-
cia est em encontrar e desenvolver enzimas que possam atender s neces-
sidades industriais, isto , enzimas estveis e que no sejam inibidas pelos
produtos de hidrlise. Muitas tentativas foram feitas para determinar a na-
tureza das caractersticas do substrato, que levam diminuio da taxa de
hidrlise da celulose (Mooney et al., 1998; Ramos et al., 1993; Grethlein,
1985). A hidrlise enzimtica da celulose em acares solveis tem sido
estudada extensivamente para utilizao de parede celular vegetal como
substrato nos processos de produo de bioenergia (Tomme et al., 1995;
Duff; Murray, 1996). De interesse central atualmente o desenvolvimento
de um processo eficaz para converso da celulose em etanol para uso como
combustvel. No entanto, apesar dos esforos de pesquisa intensiva, a con-
verso rpida de substratos de celulose por hidrlise enzimtica ainda de
difcil obteno.
Diversos fatores impedem a utilizao eficaz de matrias-primas de
lignocelulose em processo de gerao de bioetanol. A velocidade de rea-
o diminui rapidamente durante a realizao da hidrlise, e pode levar
a uma diminuio da produo e nos longos tempos de processo (Gregg;
Saddler 1996). Altas concentraes de enzimas so necessrias para atingir
a converso de celulose, e a reciclagem das mesmas difcil por causa da
adsoro na lignocelulose residual (Gregg; Saddler 1996). Alguns estudos
tm demonstrado que a superfcie da celulose tem importncia na veloci-
dade inicial de hidrlise (Grethlein, 1985; Thompson; Chen H-C, 1992).
A celulose apresenta regies cristalinas com cadeias paralelas firmemente
unidas por ligaes de hidrognio. Tem sido sugerido que as partes cris-
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HIDRLISE ENZIMTICA NA CADEIA PRODUTIVA DO BIOETANOL 255
talinas do substrato devem tornar a celulose menos acessvel s enzimas,
o que poderia explicar a observao de que substratos cristalinos so mais
resistentes degradao enzimtica em comparao com substratos mais
amorfos (Fan et al., 1980). No entanto, h tambm relatos de que o grau
de cristalinidade no significativamente alterado ao longo do tempo de
hidrlise prolongada (Lenz et al., 1990). Alguns estudos fornecem como
sugesto que a lignina presente em substratos complexos, tais como madei-
ra, especialmente madeiras macias, tratada por exploso a vapor poderiam
ter um efeito negativo sobre a reao de hidrlise (Mooney et al., 1998).
Tratamentos qumicos seguidos pela utilizao de enzimas celulolticas
encarecem a produo de etanol em at 40% por causa do alto preo dessas
protenas. Uma soluo para a viabilidade da realizao da tcnica em esca-
la industrial seria a produo dessas enzimas com custo relativamente mais
baixo (Gabhane et al., 2011).
Estudos de otimizao na produo e utilizao de enzimas celulolticas
produzidas a partir de Trichoderma reesei e Aspergillus niger mostraram re-
sultados satisfatrios, com custos mdios de produo at 200% menores
que as disponveis no mercado. Quando essas enzimas so utilizadas na eta-
pa de produo de acares a partir dos resduos de celulose, implicar-se-
uma diminuio significativa do custo final do etanol (Pal; Khanum, 2011;
Ahamed; Vermette, 2008; Fang et al., 2010; Mekala et al., 2008).
O aumento de estudos nestas reas tem gerado maior conhecimento
sobre a atuao das enzimas e, consequentemente, pode determinar efeti-
vamente sua utilizao. Assim, por exemplo, os estudos de processos de
fermentao para produo de enzimas tm fornecido cada vez maior quan-
tidade dessas protenas por meio de processos biotecnolgicos. Alm do co-
nhecimento adquirido, estes estudos devem levar a diversas aplicaes, por
exemplo, na extrao de leos essenciais que so utilizados pela indstria
farmacutica e/ou de alimentos.
Neste sentido, experimentos de aumento do rendimento de extrao de
leos essenciais de Melampodium divaricatum e Mentha spicata realizados
com as enzimas celulolticas e xilanoltcas produzidas por fungos como Tri-
choderma reesei e Aspergillus niger demonstraram a eficcia da utilizao
destas enzimas, com um aumento mdio de 60% da produo de leo para
M. divaricatum e 55% para a M. spicata, em relao extrao sem a aplica-
o das enzimas (Santos, 2008).
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256 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
A anlise por cromatografia gasosa dos leos extrados de M. spicata na
presena ou ausncia de enzimas mostrou, para esta espcie, que a carvona
foi o composto majoritrio com uma concentrao de 59,12% do leo ex-
trado sem tratamento enzimtico e 55,36% no leo extrado com tratamen-
to enzimtico. Para a M. divaricatum, o composto majoritrio foi o trans-
cariofileno, contribuindo com 48,59% do leo nas partes areas secas. No
leo extrado das partes areas frescas, com e sem tratamento enzimtico,
este composto contribuiu com valores menores: 36,78 e 39,94%, respectiva-
mente. Os leos obtidos, avaliados por cromatografia gasosa no demons-
traram alteraes significativas no teor de seus componentes com o uso de
enzimas sugerindo que sua aplicao pode auxiliar nos rendimentos de ex-
trao. Isso pode representar um grande aliado para obteno de maiores
rendimentos de leos que possam estar presentes em algumas espcies ve-
getais em baixas concentraes, mas que representem importante matria-
-prima para a indstria farmacutica ou de alimentos (Santos, 2008). Outra
aplicao vivel das enzimas seria na gerao de kits enzimticos para deter-
minao de produtos e subprodutos de fermentao.
A produo de biodiesel, alternativa de combustvel renovvel, tem
mostrado preocupao com a gerao de subprodutos, principalmente o
glicerol bruto (Lin et al., 2009). Estratgias biotecnolgicas visando uti-
lizao do glicerol como fonte de carbono para obteno de produtos de
maior valor agregado tm estimulado pesquisas na rea. A dosagem da con-
centrao de glicerol uma importante ferramenta para o acompanhamen-
to do rendimento na produo de biodiesel. O glicerol, tambm conhecido
como glicerina, resultante da reao de transesterificao de leos vegetais,
apresenta concentrao muito varivel conforme a eficincia da reao. Sua
determinao por meio de um mtodo econmico e rpido de interesse
para as indstrias de bioetanol e biodiesel.
Outras aplicaes industriais de leveduras incluem a produo de prote-
nas, nucleotdeos, vitaminas, glicoprotenas, coenzimas, lipdeos etc. Com
o desenvolvimento das novas tcnicas moleculares, principalmente aquelas
relativas engenharia gentica, as leveduras, em especial a do gnero Picchia
pastoris foram transformadas e utilizadas como produtoras de protenas he-
terlogas (Creeg et al., 1993) e utilizada tambm, por meio da engenharia
metablica, para melhorar a eficincia de converso de substratos em pro-
dutos de interesse biotecnolgico (Ostergaard et al., 2000).
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HIDRLISE ENZIMTICA NA CADEIA PRODUTIVA DO BIOETANOL 257
A utilizao de enzimas em mtodos analticos para anlises tem como
resultados economia, preciso, facilidade de manuseio e rapidez nas respos-
tas. Os kits enzimticos tm aplicaes no controle de qualidade na inds-
tria de bebidas e combustveis (bioetanol e biodiesel).
Utilizao de enzimas em mtodos analticos
Alguns mtodos para anlises em laboratrios clnicos compreendem
reaes de oxidao, esterificao, formao de ter, desidratao e procedi-
mentos cromatogrficos. As determinaes enzimticas, utilizando as oxi-
dorredutases so as que apresentam maior sensibilidade e especificidade.
As oxidorredutases, segundo a Unio Internacional de Bioqumica e
Biologia Celular (IUBMB) so uma categoria de enzimas responsveis pela
catlise de reaes de oxidao e/ou reduo de substratos, ou seja, partici-
pam de reaes em que h transferncia de eltrons entre espcies qumicas.
O substrato oxidado (agente redutor) considerado doador de hidrognio
ou eltron, enquanto aquele que foi reduzido (agente oxidante) denomi-
nado receptor (IUBMB, 1992; Devaux-Bassguy et al., 1997).
A nomenclatura adotada para as oxidorredutases baseia-se na estrutu-
ra: doador: receptor oxidorredutase (nome sistemtico). As oxidorredutases
so subdivididas em quatro tipos principais

(Dixon; Webb, 1979; IUBMB,
1992):
Desidrogenases: catalisam a transferncia de hidrognio do substrato
ao cofator nicotinamida adenina dinucleotdio (NAD
+
);
Oxidases: catalisam a transferncia de hidrognio do substrato para o
oxignio molecular (espcie receptora) produzindo perxido de hidro-
gnio como subproduto;
Peroxidases: catalisam a oxidao do substrato pelo perxido de
hidrognio;
Oxigenases: catalisam a oxidao do substrato pelo oxignio molecu-
lar, produzindo gua como produto reduzido.
A utilizao de diferentes oxidorredutases em mtodos analticos e en-
saios de validao dos mesmos so descritos neste captulo.
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258 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
A validao de um mtodo analtico de dosagem deve atingir alguns
critrios que so descritos como especificidade, seletividade, preciso, re-
petibilidade, reprodutibilidade, exatido, linearidade, limite de deteco
etc. (Anderson; Ngeh-Ngwinbi, 1995).
A seletividade e a especificidade de um mtodo esto relacionadas com
a capacidade de realizar o teste na presena de interferentes. Os kits comer-
ciais utilizam enzimas altamente purificadas, fato que exclui a ocorrncia
das reaes paralelas dos interferentes, presentes nas amostras biolgicas
(Boehringer Mannheim, 1997). Diluies das preparaes enzimticas par-
cialmente purificadas possibilitam o uso de enzimas em mtodos analticos
de dosagens, e a ao dos interferentes minimizada pelas diluies tanto
da preparao enzimtica como da amostra a ser quantificada. A preciso
em um mtodo analtico se mede pela concordncia entre muitas determi-
naes analisadas e expressa pelo desvio padro. A preciso varivel
conforme a amostra. Para amostras de alimentos pode ser considerado o
intervalo compreendido entre 2 - 20% no desvio padro.
Quando se deseja comprovar a repetibilidade de um mtodo, realiza-se
um grande nmero de anlises num nico laboratrio, j a reprodutibilida-
de, necessita que as anlises sejam feitas em diferentes laboratrios.
Estudo de recuperao de algum componente da amostra est relacio-
nado com a acuidade do mtodo. Estes estudos so realizados comparati-
vamente, analisando-se a amostra-teste e uma soluo-padro contendo
a substncia de concentrao conhecida. A soluo original utilizada para
preparo do padro no necessariamente deve apresentar grau extremo de
pureza (Zanon, 2007). Portanto, exatido e a recuperao podem ser ana-
lisadas conjuntamente, uma vez que a exatido medida pela concordn-
cia com os valores da referncia, podendo ser recuperada com a adio de
quantidade da substncia conhecida e analisada na amostra.
A resposta de um mtodo pode ser medida como funo do aumento da
concentrao da substncia analisada. Na menor concentrao da substn-
cia, as leituras das anlises podem conter o rudo do aparelho de quantifi-
cao, ao passo que, no outro extremo, pode haver fuga da linearidade na
curva analtica. O intervalo linear, compreendido entre o limite mximo e o
mnimo considerado para efeito dos clculos de concentrao.
A linearidade da curva de calibrao possibilita o clculo direto da
quantidade da substncia na amostra, naquele intervalo, com aplicao
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HIDRLISE ENZIMTICA NA CADEIA PRODUTIVA DO BIOETANOL 259
da equao de regresso linear e seu intercepto prximo do zero. A faixa de
dosagem indica o intervalo entre os nveis superior e inferior que tenha pre-
ciso, exatido e linearidade do mtodo, j o limite de deteco e o limite de
quantificao dependem do equipamento usado e das condies dos clcu-
los (Camargo et al., 2007). A revalidao do mtodo tambm citada por
alguns autores (Driffield et al., 2007; Zanon, 2007)

e as faixas operacionais
devem ser definidas para cada mtodo, baseadas na comparao com outros
mtodos semelhantes.
A dosagem do etanol e glicerol durante a produo de combustveis
tem se mostrado importante para o aumento de rendimento do processo
e qualidade do produto. Embora existam vrios mtodos de dosagens, os
enzimticos so os mais interessantes por serem rpidos, precisos, de fcil
manuseio e baixo custo.
Ensaio de produtos e subprodutos de fermentao, utilizando enzimas,
podem derivar para diversas leituras, tais como: bioluminescncia (Eggs-
tein; Kuhlmann, 1962; Kahle; Tesarich, 1980), cromatogrficas (Pecina et
al., 1984; Prablu; Baldwin, 1990; Hamano et al., 1991; Kobasyashi; Kawai,
1982), fluorimtricas (Carlson; Wadstrom, 1959; Compton; Purdy, 1980;
Bergmeyer, 1983; Wang et al., 1993; Fossati et al., 1992; Wimmer et al.,
1986), amperomtricas (Wimmer, et al.,1985) etc. Os mtodos enzimticos,
com leituras espectrofotomtricas na regio do visvel so os menos com-
plexos no preparo das amostras e utilizao do equipamento. Vrias cita-
es na literatura utilizam reaes de formao de gua oxigenada acoplada
reao com peroxidase e determinadas por diferentes tcnicas (Ince et al.,
1987; Laurell; Tibbling, 1966; Lric et al., 1970; Lim; Buttery, 1977).
Alguns exemplos de aplicaes das enzimas na montagem
de mtodos analticos
Enzimas extradas de Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae vendida no comrcio como fer-
mento de po e comercializada de duas formas: mida e seca. Na primeira,
a torta de leveduras, procedente do filtro rotatrio empacotada, e sua pre-
servao necessita de refrigerao. A vida til deste produto de aproxima-
damente trs semanas. Na segunda, a secagem da levedura feita a vcuo
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260 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
numa temperatura de 55C, e permanece ativa por um ano temperatura
ambiente. Mtodos analticos de dosagens podem ser desenvolvidos usan-
do levedura seca comercial como fonte de glicerol 3 fosfato desidrogenase
e glicerol quinase, necessitando tratamento prvio de ruptura das clulas
para extrao das enzimas.
As desidrogenases so amplamente utilizadas nos ensaios analticos de
compostos de interesse industrial, incluindo glicerol e etanol. So enzimas
que necessitam da coenzima NAD
+
na reao e podem ser acompanhadas
pela quantidade de NADH gerado, pela leitura espectrofomtrica a 340 nm
(leitura na regio do ultravioleta). Outro mtodo analtico de dosagem de
glicerol, envolvendo as enzimas, glicerol quinase e glicerol 3-fosfato oxi-
dase, (GPO; EC 1.1.3.21) alm das peroxidases (PO; EC 1.11.1.7) utiliza
leitura espectrofotomtrica a 540 nm (leitura na regio do visvel).
Tininis (2000) estudando uma preparao enzimtica, obtida a par-
tir de levedura de panificao contendo as enzimas glicerol quinase (GK)
e glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPDH), determinou a concentrao
de glicerol em diferentes amostras. O mtodo de dosagem de glicerol foi
sensvel na faixa de 6,64 a 27,02 x 10
-3
g/l de glicerol presente em bebidas
e caldos fermentados de destilaria, mostrando reprodutibilidade analtica e
baixo custo (Tininis, 2000).
A dosagem enzimtica do glicerol, por meio das leituras a 340 nm foi
descrita por Wieland (1962), e envolve duas reaes: na primeira, o subs-
trato glicerol fosforilado a glicerol fosfato na presena de ATP e glicerol
quinase (EC 2.7.1.30). Na segunda reao, glicerol fosfato transforma-
do em diidroxicetona fosfato por ao da glicerol-3-fosfato desidrogenase
(EC 1.1.1.8) na presena de NAD
+
e hidrato de hidrazina, em condies de
pH bsico, conforme as reaes:
GK
Glicerol + ATP Glicerol-P + ADP
+
(reao 1)
GPDH
Glicerol-P + NAD
+
Dihidroxicetona-P + NADH + H
+
(reao 2)
Outro mtodo analtico de dosagem com leitura na regio do ultraviole-
ta objetiva o ensaio do etanol. O ensaio enzimtico do etanol utiliza lcool
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HIDRLISE ENZIMTICA NA CADEIA PRODUTIVA DO BIOETANOL 261
desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1). lcool desidrogenase, uma oxidorredu-
tase, presente em tecido animal, plantas e microrganismos, acelera a reao
de xido-reduo de transformao do etanol em acetaldedo na presena de
NAD
+
, descrita por Bonnischsen (1965). A reao ocorre em pH 8,8 com o
equilbrio deslocado para a formao do acetaldedo pela reao com semi-
carbazida, conforme:
ADH
Etanol + NAD
+
Acetaldedo + NADH + H
+
O mtodo apresenta sensibilidade na faixa de 5 M a 20 M no tubo de
dosagem, o que equivale a solues-padro do etanol na faixa de 74,54 x
10
-4
g/L a 298,08 x 10
-4
g/L. A concentrao do etanol foi determinada
em amostras de diferentes bebidas comerciais (Zanon, 2006). A anlise
de etanol pelas leituras espectrofotomtricas na regio do visvel necessita de
reao prvia com reagente que confere cor, como sal de tetrazlio. A cur-
va analtica de dosagem do etanol apresentou linearidade e coeficiente de
correlao no valor de 0,998. A enzima mostrou estabilidade em diferentes
temperaturas por at 12 meses. Ensaios de estocagem da ADH demons-
traram que, na presena de 15% (p/v) de polietilenoglicol (peso molecular
3350), ou 1,0 mM de azida de sdio, a atividade da enzima foi mais estvel
por maior perodo de tempo (Zanon et al., 2007).
O mtodo colorimtrico para determinao de etanol, baseado na redu-
o do sal de tetrazlio e leituras espectrofotomtricas, mostrou eficincia
em termos de rapidez, simplicidade, sensibilidade e baixo custo e sensibi-
lidade na faixa compreendida entre 4,6 x 10
-2
- 23,0 x 10
-2
g/L de etanol.
As determinaes do contedo alcolico de diversas bebidas fermentadas
(Tabela 9.1) foram examinadas utilizando o mtodo padronizado.
Tabela 9.1 Ensaio de etanol em bebidas utilizando metodologia colorimtrica
Amostra
Referncia
(% vol.)
Analisado
(% vol.)
Usque 40,0 37,6 1,0 (94,0 %)
Aguardente 39,0 36,3 0,5 (93,1%)
Rum 38,0 36,3 0,5 (95,5%)
Vinho branco 10,2 10,7 0,4 (104,9%)
Vinho do Porto 19,5 19,2 1,0 (98,5%)
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262 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Enzimas glicerol quinase e glicerol fosfato desidrogenase
de Saccharomyces cerevisiae expressas na levedura
Pichia pastoris
A levedura Pichia pastoris vem sendo largamente utilizada como um
eficiente sistema de expresso para a produo de protenas heterlogas,
pois um sistema seguro, fcil e gera altos nveis de expresso proteica.
1
A levedura P. pastoris apresenta duas caractersticas que a tornam uma
hospedeira ideal para a produo de protenas heterlogas. A primeira o
forte promotor usado para transcrever genes heterlogos, o qual derivado
do gene da enzima lcool oxidase (AOX1). Esse promotor regulado trans-
cricionalmente por metanol, um indutor relativamente barato. Em clulas
expostas a metanol como nica fonte de carbono, o incio da transcrio
no promotor AOX1 altamente eficiente e comparvel aos promotores
derivados dos genes altamente expressos da via glicoltica. No entanto, ao
contrrio dos promotores glicolticos, o promotor AOX1 firmemente re-
gulado e reprimido sob condies de crescimento sem metanol. A maioria
das protenas heterlogas deletria para a clula, quando expressas em
altos nveis, portanto, a habilidade de manter a cultura em um estado re-
primido ou desligado altamente desejvel. Alm de metanol, o sistema
AOX1 necessita da ausncia de glicose para ser plenamente ativado. Uma
vez que o promotor AOX1 controlado pela manipulao da fonte de car-
bono adicionado ao meio de cultura, o crescimento e a induo de cepas de
P. pastoris, que expressam protenas heterlogas, so facilmente obtidos em
todas as escalas, desde frascos at grandes fermentadores.
A segunda caracterstica importante da P. pastoris que esta levedura
no realiza fermentao como S. cerevisiae (Cregg, 1993; Cregg 2011). Es-
tas duas caractersticas da levedura P. pastoris possibilitou sua utilizao na
expresso de duas enzimas usadas no mtodo de dosagem de glicerol. Para
tal, os genes GUT1 e GPD2 de Saccharomyces cerevisiae foram inseridos na
levedura P. pastoris a fim de produzir, no meio de cultivo, a glicerol quinase
e glicerol-3-fosfato desidrogenase, segundo Peres et al. (2010). Resultados
de dosagens de glicerol em bebidas mostram a validao do mtodo (Tabela
9.2) e possibilidade de aplicao no acompanhamento de fermentaes.
1 Ver: <http://www.pichia.com/pichia_system.pdf>.
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HIDRLISE ENZIMTICA NA CADEIA PRODUTIVA DO BIOETANOL 263
Tabela 9.2 Comparao de dosagem de glicerol utilizando kit comercial e GK e GPD recombi-
nantes de P. pastoris.
Amostra
Tempo de
cultivo (h)
Concentrao de glicerol (g.L
-1
)
Kit
comercial
GK e GPD
recombinantes de P. pastoris
Caldo fermentado por S.
cerevisiae
12
4,2 0,3 4,7 0,3
Caldo fermentado por S.
cerevisiae contendo 5,7 mg
L
-1
de glicerol adicionado
de 2,8 mg L
-1
de glicerol

8,3 0,0
(97,6%)
8,2 0,1
(96,4%)
Enzima lcool desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae
expressa em E. coli
O gene codificador da enzima lcool desidrogenase (ADH1) de S. ce-
revisiae foi clonado no vetor pET28a para expresso em E. coli (BL21) e a
ADH utilizada num kit de dosagem de etanol. A produo e solubilidade
da enzima lcool desidrogenase foi determinada. A purificao da protena
recombinante foi realizada por cromatografia de afinidade.
A atividade enzimtica de lcool desidrogenase purificada foi determi-
nada por meio de ensaios para leituras no UV, bem como sua estabilidade
em diversas condies de tempo e temperatura. Os resultados demonstra-
ram que a enzima obtida apresentou boa atividade biolgica in vitro, com
sensibilidade na deteco de, no mnimo, 2,3 x 10
4
g/L de etanol em 2
minutos. Alm disso, a protena purificada teve sua atividade preservada
quando estocada a -20C durante quatro meses. A quantificao enzim-
tica de etanol em diferentes bebidas, utilizando lcool desidrogenase de S.
cerevisiae, purificada a partir da bactria E. coli mostrou valores de desvio
padro inferiores a 10% (Tabela 9.3).
Tabela 9.3 Valor esperado e valor encontrado de etanol em bebidas utilizando ADH de S. cere-
visiae clonada em E. coli.
Amostra
Valor esperado
(% Vol.)
Valor encontrado
(% Vol.)
Cerveja 1 4,8 4,8 0,2
Cerveja 2 4,6 4,6 0,3
Usque 40 39,5 0,4
Aguardente 39 41 0,3
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264 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Consideraes finais
Estudos das enzimas podero servir de base para aplicaes industriais na
quantificao de produtos em processos de obteno de energia renovvel. O
custo de produo das enzimas , juntamente com a etapa de pr-tratamen-
to da biomassa, um dos principais entraves na comercializao tecnolgica
da hidrlise enzimtica. A aplicao de celulases na converso de biomas-
sa celuloltica em acares para a fermentao de etanol e outros produtos
pode prover grandes benefcios ambientais e econmicos. A utilizao de
enzimas estveis temperatura ambiente tem potencial aplicao em kits de
quantificao de concentraes de etanol e glicerol, produto e subproduto de
fermentao alcolica que so determinados pelos mtodos rpidos, precisos
e de baixo custo, ferramenta importante na indstria cosmtica, alimentcia
e de combustvel. Clonagens de genes codificadores de enzimas da classe
das oxidorredutases em diferentes microrganismos e visando secreo des-
tas no meio de cultivo constituem procedimentos promissores para novos
mtodos analticos de dosagens de produtos e subprodutos do metabolismo
celular na obteno industrial do etanol de segunda gerao.
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10
Resduos agrcolas e agroindustriais:
potencialidades de uso na produo
de etanol
Eleni Gomes, Joo Cludio Thomo,
Heloiza Ferreira Alves Prado, Daniela Alonso Bocchini Martins,
Roberto da Silva, Maurcio Boscolo
Introduo
A crescente demanda energtica, principalmente a de combustveis
para motores, associada a problemas relacionados ao petrleo e ao meio
ambiente tem direcionado o foco para a bioenergia e principalmente para
os biocombustveis. Diversos estudos tm mostrado que a mistura de 10%
de etanol a gasolina poderia reduzir em 3-6% a emisso de CO
2
, alm de ser
fonte renovvel alternativa ao petrleo em todo o mundo.
Por outro lado, o aumento previsto no consumo de etanol e a consequen-
te necessidade de aumentar sua produo geram preocupaes com uma
possvel competio dos canaviais por terras agriculturveis prejudicando
uma produo agrcola mais diversificada. Assim, passou-se a considerar
o uso de resduos lignocelulsicos, que so matrias-primas renovveis e
residuais da cadeia produtiva, como fonte de acares fermentescveis para
produo do etanol.
A oferta de resduos lignocelulsicos em todo o mundo corresponde a
aproximadamente 2,9 x 10
3
milhes de toneladas produzidas em culturas de
cereais, 3x10
3
na produo de sementes e 5,4x10
2
de outros tipos de cultura.
Cerca de 50% dessa biomassa seria disponvel para produo de etanol.
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 271 07/12/2012 21:50:05
272 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
A economia brasileira est baseada na produo agrcola e agroindustrial,
tendo como principais produtos a soja e outros gros, a cana-de-acar, o
caf, mandioca e frutas. Essas atividades geram milhares de toneladas de
subprodutos como o bagao de cana-de-acar, bagao de laranja, casca de
frutas, farelo de trigo, palha e sabugo de milho etc., os quais correspondem
a uma quantidade estimada de 1.000 t/ano. As principais culturas produzi-
das no Brasil e o tipo de subproduto que estas podem gerar so relacionados
na Tabela 10.1.
O bagao de cana-de-acar, ou bagao como normalmente cha-
mado, um material fibroso resultante da prensagem da cana para extrao
do suco. O Brasil produziu na safra 2009/2010 cerca de 600 milhes de
toneladas de cana-de-acar que, processadas, geraram em torno de 180
milhes de toneladas de bagao. Parte desse material est sendo usada para
gerar energia eltrica ou para aquecimento de caldeiras, porm o excedente
encontra-se nos ptios das usinas.
A composio do bagao varia de 9-10% de umidade, 2-2,7% de cinzas,
32-55% de celulose, 16-25% de hemicelulose, 23-32% de lignina depen-
dendo da variedade da cana e das condies climticas durante o cultivo.
Embora cerca de 80% de materiais lignocelulsicos possam corresponder a
acares, sua complexidade exige uma tecnologia ainda no disponvel para
sua converso a etanol de alta eficincia e rendimento. Na Tabela 10.2, so
apresentadas as composies de outros resduos agrcolas.
Tabela 10.1 Porcentagem de produo de subprodutos de algumas culturas cultivadas no Brasil
e respectivos componentes.
Cultura Subproduto (%) Componentes do subproduto
Algodo 53,0 Caroo, farelo, lnter, borra e estearina
Amendoim 74,5 Farelo, casca e borra
Soja 75,0 Farelo e borra
Arroz 55,7 Palha e farelo
Trigo 47,5 Palha e farelo
Cevada 49,2 Palha e farelo
Cana-de-acar 10,0* Ponta de cana
Milho 50,0 Colmo, folha, sabugo e brcteas.
*10% do total de cana-de-acar colhida para industrializao.
Fonte: Peixoto et al., 1995.
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 273
Tabela 10.2 Composies qumicas das paredes celulares de alguns resduos
agrcolas
C Cultura
Celulose
(%MS)
Hemicelulose
(%MS)
Lignina
(%MS)
Palha milho 33.5 24.9 7.8
Colmo milho 33.6 23.7 8.7
Folha milho 24.5 27.3 5.4
Sabugo milho 37.7 39.6 7.3
Fibra de coco 36.0-43.0 0.15-0.25 41.0-45.0
Palha de trigo 33-38 26-32 17-19
Farelo de trigo 30.0 50.0 15.0
Palha de arroz
28.0-36.0 23.0-28.0 12.0-14.0
32.0-47.0 19.0-27.0 5.0-24.0
35.2 22.1 4.3
Colmo de sorgo 27.0 25.0 11.0
Palha de cevada
31.0-45.0 27.0-38.0 14.0-19.0
31.6 25.4 11.0
Palha de aveia 30.0 22.0 8.5
Semente de uva 7.10 31.1 43.5
Grape stalk 29.9 35.3 22.9
Fonte: Graminha et al. (2008).
Composio qumica e estrutural dos constituintes
da parede celular vegetal
A parede celular das plantas uma estrutura biolgica complexa que
contm polmeros e outras molculas, cujas propores e organizao es-
trutural dependem do tipo e idade da planta. O crescimento da parede pri-
mria se d quando a clula vegetal est em fase de alongamento e, durante
esta fase, composta por polissacardeos como pectinas, xilanas e celulose,
por protenas e cidos fenlicos, porm, no h deposio de lignina. Quan-
do o alongamento cessa, a clula da planta passa para a fase de formao da
parede secundria. Nessa fase, a parede celular comea a engrossar crescen-
do da poro interior da parede primria em direo ao centro da clula da
planta (Jung et al., 1992).
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274 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Durante o engrossamento progressivo da parede secundria, h maior
depsito de celulose do que xilana, e pectina e cido ferlico no so mais
adicionados, iniciando-se a deposio de lignina (Jung; Allen, 1995). A in-
cluso da lignina na parede celular comea na lamela mdia (espao entre
as clulas do tecido da planta e a parede primria) e continua em direo
parede secundria. Esse padro de deposio de lignina faz que os polissa-
cardeos mais recentemente depositados na parede secundria no estejam
lignificados enquanto o centro da lamela, regio original da parede prim-
ria, mais intensamente lignificado (Dey; Brinson, 1984).
Dessa forma, para que a celulose e a hemicelulose, que constituem a base
de fornecimento de carboidratos, possam ser totalmente utilizadas, suas liga-
es com a matriz de lignina precisam ser quebradas. Para um entendimento
da recalcitrncia dessa estrutura e das limitaes da ao das enzimas e de ou-
tros mecanismos usados na hidrlise, ser feita uma descrio dos componen-
tes e da forma de organizao dos polmeros que compem esses materiais.
Celulose
A celulose o principal componente de diversos tipos de material ve-
getal; encontrada tambm em clulas procariotas (Acetobacter xylinum,
Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium spp., Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Salmonella typhimurium, Sarcina ventriculi) e em eucariotos
tunicados (Ascite), algas (Valonia e Microdicyon), fungos (Oomycetes).
As cadeias de celulose esto organizadas dentro de microfibrilas que so
a base da estrutura da parede celular. Essas microfibrilas constituem cerca
de 20%-30% e 15% do peso seco e volume da parede celular, respectivamen-
te. Nas paredes secundrias, a celulose chega a 40%-90% da biomassa. As
fibrilas de celulose da parede encontram-se em uma matriz entrelaada de
polissacardeos hemicelulsicos os quais se ligam por pontes de hidrognio
a mais de uma fibrila, alm disso, interaes inicas e pontes de sais entre os
polissacardeos e protenas so observadas (Prado et al., 2010)
A estrutura bsica de celulose uma cadeia linear de resduos de D-gli-
cose ligados por ligao glicosdica |-(1,4) e com terminaes quimica-
mente diferentes, sendo uma com grupo D-glicopiranosil com o carbono
anomrico envolvido na ligao glicosdica e outra, com resduo D-glico-
piranose, com o carbono anomrico livre. Esse hemiacetal cclico promove
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 275
um equilbrio anomrico o, | via uma pequena proporo de aldedo livre
e d as propriedades da terminao da cadeia (Figura 10.1). O grau de poli-
merizao varia de centenas a milhares de unidades de glicose, dependendo
da fonte de origem (Prez; Somain, 2010).
As cadeias de glicose so alinhadas em estrutura mais ou menos organi-
zadas denominadas regies cristalinas e amorfas. As regies cristalinas so
formadas por pontes de hidrognio entre os grupos de hidroxilas livres na
molcula e obedecem a vrios ordenamentos de arranjos e, em geral, corres-
pondem a 70% da estrutura.
Na conformao cristalina, cada glicose est torcida em 180 em re-
lao anterior e a seus anis subsequentes, de forma tal que os grupos
exocclicos alcolicos primrios apontam alternadamente para a direita e
para esquerda da direo da cadeia. A cadeia estabilizada por ligaes de
hidrognio que ajudam a manter e reforar a conformao linear e plana da
cadeia. Em funo dos tomos de hidrognio alifticos em posies axiais
e todos os grupos polares de hidroxilas em posies equatoriais, as partes
superior e inferior das cadeias de celulose so hidrofbicas, enquanto as la-
terais das cadeias so hidroflicas e capazes de fazer ligaes de hidrognio
(Ogeda; Petri, 2010).
Figura 10.1 Estrutura bsica e de polarizao qumica da cadeia de celulose
n = nmero de unidades de dissacardeos
Fontes: Atala; Isogai, 2010; Perez; Samin, 2010.
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276 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Em funo da cristalinidade, as celuloses so divididas em famlia alo-
mrficas I, II, III e IV as quais, por difrao de raios x, podem ser diferen-
ciadas em sete formas (Io, I|, II, III
I
, III
II
, IV
I
e IV
II
) com caractersticas
fsicas e qumicas prprias, como solubilidade, densidade, ponto de fuso,
forma do cristal, alm de propriedades pticas e eltricas as quais so inter-
conversveis (Ogeda; Petri, 2010).
A celulose I ou celulose nativa a mais abundante e complexa com re-
gies cristalinas Io e I|. Celulose Io a alomorfa majoritria em bactrias e
fungos com um resduo de celobiose por cela unitria e pode ser convertida
forma mais estvel I| por aquecimento a 270C. Celulose I| a forma
cristalina mais comum em plantas superiores e tem duas metades de celo-
biose por cela unitria.
A celulose II formada a partir de regenerao (mistura da celulose em
solvente adequado seguida de coagulao e recristalizao) ou mercerizao
(tratamento com NaOH concentrado) da celulose I e o polimorfo mais
adequado para produo de tecidos por ser termodinamicamente mais es-
tvel (Prez; Samain, 2010).
A celulose III obtida a partir da celulose I (celulose III
I
) ou II (celulose
III
II
) tratadas com 1,2-diaminoetano. Essas celuloses tratadas com glicerol
em alta temperatura formam as celuloses IV
I
ou IV
II
. As formas da celulose
e suas interconverses so mostradas na Figura 10.2.
Figura 10.2 Esquema da conversibilidade entre os tipos de celulose
Fonte: Ogeda, Petri 2010
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 277
As celuloses com grau de polimerizao (DP) de 200-300 so solveis
em NaOH a 6-9%, enquanto aquelas com DP maiores que 500 so solubili-
zadas apenas em NaOH quando associado a exploso de vapor. Vrios sol-
ventes tambm so capazes de solubilizar a celulose como dimetilsulfxido
(DMSO), N,N-dimetilacetamida (DMAc) cido tricloroactico (TCA).
Os grupos acetal das ligaes |-(1,4) so instveis em meio cido, o que tor-
na a celulose mais suscetvel a hidrlise cida, porm, essa suscetibilidade
maior nas regies amorfas, permitindo uma hidrlise sequencial da celulose
(amorfa/cristalina) (Abeer et al., 2010).
Hemiceluloses
A hemicelulose representa de 15% a 35% da biomassa vegetal e, dife-
rentemente da celulose, no quimicamente homognea, sendo formada
por pentoses (|-D-xilose, o-L-arabinose), hexoses (|-D-manose, |-D-
glicose, o-D-galactose) e cidos urnicos (o-D-glicurnico, o-D-4-O-
metilgalacturnico e cido o-D-galacturnico). Pode ainda aparecer a-
cares como o-L-raminose e o-L-fucose, alm de acares com grupos
hidroxilas substitudos com grupo acetil. As xilanas, que so polmeros
lineares de xilose, podem corresponder de 20%-30% da hemicelulose de
plantas herbceas e 50% em capins e cereais (Glazer; Nikaido, 2007).
As hemiceluloses so formadas por diferentes propores e combina-
es dos acares relacionados acima em funo das quais so classifica-
das. A seguir so descritos os tipos de hemiceluloses de acordo com Girio
et al. (2010).
As glicuronoxilanas (O-acetil-4-O-metil glicuronoxilana) consistem
de polmero de |-D-xilopiranosil ligados por ligaes glicosdicas |-(1,4).
Algumas unidades de xilose so acetiladas nos carbonos 2 e/ou 3, alm de
algumas fazerem ligao o-(1,2) com cido O-metil glicurnico. Essas he-
miceluloses podem conter glicomananas, L-raminose e cido galacturni-
co e aparecem em madeiras duras nas quais representam de 15%-30% da
biomassa.
As galactoglicomananas (O-acetil galactoglicomanana) possuem ca-
deia linear central formada por resduos de |-D-glicopiranosil e |-D-
manopiranosil unidas por ligaes glicosdicas |-(1,4). Esses resduos po-
dem ser acetilados nos C2 ou C3 e substitudos pelo o-D-galactopiranosil
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278 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
ligado a glicose ou manose por ligaes tipo o-1,6. Essas hemiceluloses so
tpicas de madeiras moles e podem corresponder a 20%-25% da biomassa.
As arabinoglucuronoxilanas (arabino-4-O-metil glicuronoxilanas) con-
sistem de uma cadeia central linear de |-(1,4)-D-xilopiranose contendo
ligaes glicosdicas laterais tipo o-(1,3) e o-(1,2) com 4-O-metil-o-D-
glicopiranosil cido urnico e o-L-arabinofuranosil. So as principais he-
miceluloses de tecidos no lenhosos, como os resduos agrcolas, e apare-
cem em menor proporo em madeiras moles.
As xiloglicanas consistem de cadeia central de unidades de D-glicose
ligadas por ligao |-1,4. A maior parte dos resduos (75%) tem xilose subs-
tituintes em O-6. Resduos de L-arabinose e D-galactose podem aparecer
ligados aos resduos de xilose formando sequncias de di ou triglicosil, alm
de grupos acetilas. Essas hemiceluloses ligam-se s microfibrilas de celulo-
se por pontes de hidrognio e contribuem para a formao da estrutura do
material. So mais frequentes na parede primria de madeiras moles dico-
tiledneas e aparecem tambm em pequenas quantidades, nas gramneas.
As arabinoxilanas so cadeias lineares de |-(1,4)-D-xilopiranosdeo
com unidades de o-L-arabinofuranosil como substituintes nas posies
2-O e/ou 3-O e de o-D-glicopiranosil urnico ou seu derivado 4-O-metil
na posio 2-O. Os resduos arabinofuranosil podem estar esterificados
com cidos ferlico e p-cumrico. Essas xilanas so comuns na parede celu-
lar de gros de cereais.
As heteroxilanas complexas so cadeias de |-(1,4)-D-xilopiranose
com cadeias laterais mono e oligoglicosil, alm de resduos de cido ur-
nico e arabinosil. Aparecem em cereais, sementes, gomas e mucilagens
(Figura 10.3).
O tipo de hemicelulose interfere nos processos de hidrlise do mate-
rial lignocelulsico. Por exemplo, nas glicuronoxilanas, os grupos laterais
4-O-metil glicurnicos so mais resistentes ao tratamento cido do que as
pores acetiladas, enquanto as fraes ligadas a L-raminose e cido ga-
lacturnico so resistentes aos agentes alcalinos. As galactoglucumananas
com maiores contedos de galactose so mais solveis em gua. A esteri-
ficao das arabinoxilanas com os cidos fenlicos podem formar ligaes
cruzadas de xilanas (intra e intermolecular) o que reduz a extratibilidade da
mesma (Prez; Samain, 2010).
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 279
Figura 10.3 Tipos de hemicelulose de paredes secundrias
Fonte: <http://bioenergy.ccrc.uga.edu>
Ligninas
A lignina um heteropolmero amorfo, tridimensional e de alta mas-
sa molecular, formada via polimerizao oxidativa de monmeros de fenil
propano com os derivados dos lcoois coniferlicos, sinaplicos e p-cuma-
rlicos. Esse polmero atua como material incrustante, conferindo rigidez
s paredes celulares, resistncia ao ataque da maioria dos microrganismos
clula vegetal, refora a parede dos vasos condutores e reduz o acesso da
gua aos polissacardeos.
A lignificao (polimerizao da lignina) iniciada pela oxidao de gru-
pos hidroxilfenlicos, catalisada pelas peroxidases e lacases ligadas parede
celular das plantas, para formar radical fenoxila mesomrico e s ento ocor-
re a polimerizao. Os radicais monolignis formados so ligados de forma
aleatria formando um composto intermedirio altamente reativo com es-
trutura de quinona, os quais so convertidos em diferentes dilignis por ata-
que nucleoflico intramolecular no carbono benzlico, efetuado por grupos
hidroxila de lcool primrio ou por grupo quinona (Figura 10.4a). A seguir,
os dilignis so desidrogenados enzimaticamente a seus respectivos radicais.
A polimerizao posterior envolve a ligao dos monolignis com os grupos
fenlicos terminais de dilignis ou de oligolignis ou pelo acoplamento de
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280 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
dois radicais terminais, resultando em um polmero ramificado atravs
de formao tri, tetra, penta e oligolignis (Jung; Himmelsbach, 1989).
Em gimnospermas, a lignina formada principalmente pela polimeriza-
o de lcool coniferlico e nas angiospermas, pela polimerizao de mistura
de lcoois coniferlico e sinaplico. A lignina de gramneas formada por
uma mistura dos lcoois coniferlico, sinaplico e p-cumarlico. Esses com-
ponentes so ligados ao acaso, sendo a ligao mais abundante na lignina a
aril-glicerol-|-eter (|-O-4) porm, outros tipos de ligao como fenilcuma-
rana (|-5), diaril propano (|-1), pinoresinol (|-|), difenil (5-5) e difenil
ter (4-0-5) so encontrados (Da-Silva; Gomes, 2004).
A lignina sempre associada com carboidratos, principalmente com as
hemiceluloses, via ligao covalente nos carbonos o e C-4 do anel benz-
nico, sendo essa associao chamada complexo lignina-carboidrato. Em
plantas herbceas, como no bagao de cana, os cidos p-cumrico e ferlico
fazem uma ponte entre a lignina e a hemicelulose por ligaes ster ou ter,
formando o complexo lignina/fenlicos-carboidrato (Figura 10.4b).
O aproveitamento de polissacardeos de materiais lignocelulsicos de-
pende da extrao da lignina, cuja eficincia dos mtodos est diretamente
relacionada com a quebra das ligaes ster e ter entre a lignina e os polissa-
cardeos. Tratamento cido quebra as ligaes o-aril ter do complexo ligni-
na/carboidrato mais rpido do que as |-aril ter, enquanto em meio alcalino
essas ltimas so mais rapidamente quebradas (Buranov; Mazza, 2010).

Figura 10.4 Estrutura de lignina de gramneas. a = estrutura proposta para lignina de gramneas;
b = complexo lignina/fenlicos-carboidratos
Fontes: Sun et al., 1997; Anvar; Mazza, 2008.
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 281
Hidrlise do bagao de cana para produo de etanol
A converso de materiais lignocelulsicos a etanol implica duas etapas
fundamentais: a sacarificao em acares fermentescveis e a subsequen-
te fermentao alcolica. Atualmente, existem muitas patentes e trabalhos
cientficos publicados sobre a produo de acares para produo de eta-
nol tendo como material de partida materiais residuais como o bagao de
cana-de-acar. No entanto, as poucas plantas industriais de etanol celul-
sico existentes sobrevivem com subsdios estatais, indicando que um longo
caminho ainda deve ser percorrido para alcanar um processo econmico e
tecnicamente vivel.
A hidrlise dos materiais lignocelulsicos para produo de aca-
res pode ser alcanada por mtodos qumicos e/ou enzimticos. Existem
processos patenteados para hidrlise qumica de bagao de cana em meios
cidos e alcalinos com temperaturas acima de 180C e altas presses, pro-
duzindo hidrolisados ricos em acares fermentescveis (glicose e xilose).
Entretanto, so geradores de situao de riscos na planta industrial e pro-
piciam a liberao de muitos compostos inibidores do processo de fermen-
tao alcolica subsequente, pois podem transformar a glicose liberada em
hidroxifurfural, cido levulnico, cido frmico (Figura 10.5) que so txi-
cos para a levedura Saccharomyces cerevisiae.
Figura 10.5 Efeitos dos tratamentos trmico e cido sobre a gerao de produtos secund-
rios/txicos no tratamento do bagao
Fonte: Atalla; Isogai, 2010.
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282 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
A hidrlise enzimtica, que desejvel por ser especfica, no geran-
do produtos txicos e por ser ambientalmente segura, porm, encontra um
enorme obstculo que a estrutura altamente organizada desse material
conferindo grande recalcitrncia ao mesmo.
Hidrlise enzimtica dos materiais lignocelulsicos
Na natureza, a degradao da biomassa por microrganismos realizada
por uma mistura complexa de enzimas, dentre as quais se destacam as celu-
lases, hemicelulases e ligninases, cujas aes resultam em carboidratos que
podem ser hidrolisados a sacardeos solveis e metabolizveis, alm dos
produtos de despolimerizao da lignina que podem ter ampla aplicao
tecnolgica (Sandgren et al., 2005). No processo de produo de etanol ce-
lulsico, a ao dessas enzimas fundamental, em funo da especificidade.
Uma descrio geral do modo de ao e produtos das principais enzimas
degradadoras da biomassa ser apresentada a seguir.
Celulases
A produo de celulases microbianas ocorre, principalmente, por bact-
rias e fungos filamentosos, havendo poucos relatos de produo significativa
por leveduras. Os ascomicetos e os fungos anamrficos tm grande impor-
tncia como decompositores de celulose dos resduos vegetais no solo, sen-
do conhecidos como fungo de podrido marrom (Sandgren; Hiberg, 2005).
Um sistema celuloltico baseado em enzimas livres, as quais agem
sinergisticamente para a degradao completa da celulose (Figura 10.6),
normalmente produzido por fungos e bactrias aerbicos. Este sistema en-
zimtico inclui pelo menos trs tipos de celulase (Alves-Prado et al., 2010).
Dois tipos de celulase so distinguidos em funo da capacidade de re-
conhecer ou no a poro terminal da cadeia de glicose: as exocelulases ou
celobiohidrolases (CBH) e as endocelulases ou endoglucanases (EG). As
endoglucanases ou endo-|-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) reconhecem e hi-
drolisam o polmero internamente nas regies amorfas de forma aleatria,
resultando na reduo do grau de polimerizao da molcula e, ao mesmo
tempo, fornecendo substrato para as celobiohidrolases para agirem. As exo-
glucanases ou celobiohidrolases (EC 3.2.1.91) reconhecem as extremidades
da cadeia e atuam removendo unidades de celobiose. So distinguidos dois
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 283
tipos de CBH, as que atuam a partir da extremidade redutora (CBHI) e as
que quebram a partir da extremidade no redutora (CBH II).
Alguns estudos, entretanto, questionam a existncia dos tipos exo e endo
e sugerem que todas as celulases so tipo endo. Desse modo, tem sido su-
gerida a classificao usada para as hidrolases de glicosdeos (Davies, Hen-
rissat, 1995) que agruparia as celulases em processivas (ao continuada) e
no processivas (ao no continuada) com base no modelo de hidrlise da
cadeia. O tipo processivo pode hidrolisar sucessivamente a celulose at a
formao da celobiose, por deslizamento ao longo da cadeia, sem separao
do stio de ligao da cadeia de celulose. Na celulase no processiva, o stio
ativo desligado da celulose aps cada hidrlise. Com base nessa classifica-
o, a CHB poderia ser classificada como tipo endoprocessiva, enquanto a
EG seria uma endo no processiva (Figura 10.6).
Figura 10.6 Modelo de ao endoprocessivo e endo no processivo das celulases
Fonte Davies, Henrissat, 1995; Atalla; Isogai, 2010.
O terceiro componente do sistema as |-glicosidases (celobiases) ou
|-1,4-glicosidase (EC 3.2.1.21) que hidrolisam a celobiose e outros celo-
-oligossacardeos curtos liberando glicose. Algumas delas tambm esto
envolvidas nas reaes de transglicosilaes de ligaes |-glicosdicas de
glicoses conjugados.
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284 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
As enzimas do complexo celuloltico esto sujeitas represso catab-
lica pelo produto final de hidrlise. Por prevenir o acmulo de celobiose, a
|-glicosidase responsvel pelo controle da velocidade global da reao de
hidrlise celuloltica, desempenhando, assim, um efeito crucial na degrada-
o enzimtica do polmero (Leite et al., 2008).
Alm das celulases clssicas, a Figura 10.7 mostra tambm a ao da
suolenina (wollenins em ingls, sinnimo de inchamento, expanso, intu-
mescimento), a qual desempenha papel importante na degradao da ce-
lulose cristalina. Ela uma protena com similaridade de aminocidos da
expansina (expansin), uma protena de plantas que regula o alargamento
da parede celular de clulas em crescimento. Expansinas foram primeira-
mente isoladas do Trichoderma reesei em 1992, e acredita-se que estejam
envolvidas no rompimento de ligaes de hidrognio entre as microfibrilas
de celuloses ou entre celuloses e outros polissacardeos da parede celular
sem hidrolis-los, mas causando o deslizamento de fibras de celulose ou
de expanso da parede celular (Whitney et al., 2000). Tem sido relatado
que a ao da suolenina ajuda a degradao enzimtica de celulose, uma
vez que causa um dano parcial e afrouxa a estrutura da celulose, semelhante
causada pelo tratamento com ultrassom, em liberar acares redutores
(Saloheimo et al., 2002).
Figura 10.7 Representao esquemtica do sistema celuloltico. Os stios de maiores ativi-
dades das enzimas celulolticas so mostrados, alm de um caminho alternativo de formao
de soforose pela atividade de transglicosilao de |-glicosidase
Fonte: Aro et al., 2005.
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 285
A maioria das hidrolases de carboidratos so protenas modulares que,
alm do stio cataltico, contm tambm, um mdulo de ligao ao carboi-
drato (CBM) (Jrgensen; 2007). Estes mdulos foram inicialmente desco-
bertos em celulases, mas agora evidente que muitas outras hidrolases de
carboidratos agem tanto em polissacardeos solveis quanto insolveis, e
a funo deles tanto trazer o stio cataltico mais prximo ao substrato,
quanto tambm garantir sua orientao correta. Alm disso, j foi notado
que alguns CBMs apresentaram um efeito rompedor de fibras de celulose
(Boraston et al., 2004).
Nas celulases, o domnio de ligao celulose formado de aminocidos
hidrofbicos como a fenilalanina, triptofano e tirosina, os quais se ligam
superfcie hidrofbica da celulose por fora de Van der Waals. Essa intera-
o facilita a associao da enzima com seu substrato, aumenta a concentra-
o e a atividade da enzima no ponto de atuao e ainda auxilia diretamente
na hidrlise da celulose por rompimento da estrutura cristalina. Os CBMs
so classificados em 33 famlias em funo de suas sequncias peptdicas.
Alguns CBMs, alm de ligao a celulose, podem tambm apresentar afini-
dade por mananas, glicanas, xilanas. Alm disso, um linker entre os dois
domnios tem sido descrito (Flint et al., 2004).
O domnio cataltico contm o stio ativo para hidrlise da celulose e o
substio que interage com a cadeia de celulose prxima ao centro ativo. Esse
substio estressa mecanicamente a cadeia de celulose e um dos resduos de
glicose forado a assumir a forma de barco instvel, levando a reduo
da energia de ativao para a reao de hidrlise e o stio ativo do domnio
cataltico pode ento atacar a cadeia de celulose.
Alm das celulases hidrolticas, enzima com atividade de oxidao de
celodextrinas, denominada celobiose desidrogenase (CDH), atua de forma
importante na degradao da celulose. Essa enzima, quando descoberta foi
denominada celobiose quinona redutase (CBQ), posteriormente chamada
de celobiose oxidase (CBO) e, finalmente, identificada como CDH (Wood;
Wood, 1992). Essa enzima, com grupo prosttico heme, atua como uma
desidrogenase tpica com ao de oxidao e reduo. Na reao de oxida-
o, o hemiacetal do C1 livre da celobiose convertido a lactona que sofre
hidrlise espontnea a cido carboxlico formando o cido celobionico. Os
dois eltrons liberados nessa reao so transferidos para receptor de dois
eltrons ou para dois receptores de um eltron. Como receptor interme-
dirio de eltrons tem sido indicado o FAD, que reduzido a FDH
2
poderia
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286 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
transferir esses eltrons a um aceptor final. Embora os substratos especfi-
cos das CDH sejam di ou trissacardeos com ligaes |-1,4 e com resduos
de glicose ou manose na extremidade redutora, essa enzima pode tambm
oxidar celodextrinas, lactose, manobiose e galactosilmanose. Semelhante ao
modelo das celulases, essas enzimas tambm possuem stio cataltico sepa-
rado do stio de ligao celulose. Este ltimo, com propriedade hidrof-
bica, diferencia-se dos stios de ligao de celulose das celulases por serem
altamente especficos para a regio amorfa da celulose e no se ligam em
xilanas, manana, amido ou quitina.
Outro sistema importante de degradao natural de celulose diz respeito
ao sistema de celulossomas. Celulases sintetizadas por bactrias anaerbias,
particularmente do gnero Clostridium e microrganismos do rmen, fre-
quentemente se agrupam em um grande complexo multienzimtico (peso
molecular >3MDa) denominado celulossomo e identificado pela primeira
vez em 1983 a partir do Clostridium thermocellum esporulante (Lamed et
al., 1983). Este celulossomo bacteriano apresenta atividade muito elevada
sobre celulose cristalina (a verdadeira atividade celulase ou avicelase) que
no comumente observada entre celulases fngicas (Johnson et al., 1981).
Em C. thermocellum, as enzimas celulolticas esto normalmente distri-
budas tanto na fase lquida quanto na superfcie das clulas. No entanto,
vrias espcies anaerbias que degradam celulose no liberam quantidades
mensurveis de celulases extracelulares, ficando os complexos localizados
diretamente na superfcie da clula ou no glicoclice da clula (Lynd et al.,
2002). Alm de Clostridium e outras bactrias anaerbias, h evidncias da
presena de celulossoma em pelo menos uma bactria aerbia e alguns fungos
anaerbios, como Neocallimastix, Piromycese Orpinomyces (Li et al., 1997).
Alm de celulases, o complexo de celulossomas tambm inclui enzimas
como xilanases, mananases, arabinofuranosidases, liquenases e pectina lia-
ses (Bayer et al., 2004). Todos os celulossomas descritos compartilham al-
gumas caractersticas (Figura 10.8). Suas enzimas esto ligadas a mdulos
no catalticos (domnio de peptdeo repetido-DPR) ou domnios chamados
doquerinas (dockerins, com significado em ingls de ancorar, neste texto
traduzido para doquerina), por meio dos mdulos de ligao ao carboidrato
(CBMs). Doquerinas se ligam, por meio de interaes clcio-dependen-
tes, aos mdulos coesinas (coesin com significado em ingls de prote-
na de integrao, neste texto traduzido para coesina) localizadas em uma
grande protena no cataltica que atua como um escafolde (scaffoldin,
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 287
com significado em ingls de matriz de suporte, neste texto traduzido para
escafolde). Em geral, o escafolde que uma protena grande e distinta, per-
mite a ligao do complexo inteiro parede celular da planta, por meio de
uma CBM celulose-especfica famlia3 (CBM3a), e clula bacteriana por
meio de um dockerin divergente C-terminal (Bayer et al., 1998; Nordon et
al., 2009; Maki; Leung, 2009; Fontes Gilbert, 2010).
Figura 10.8 Mecanismo de agrupamento do celulossoma
Fontes; Gilbert, 2010, Bocchini, 2011.
A recalcitrncia e complexidade qumica de alguns polmeros represen-
tam um obstculo para a degradao enzimtica do material lignocelulsico,
portanto, sistemas enzimticos mais eficientes so necessrios. Os celulos-
somas destacam-se como uma das nanomquinas mais elaborada da natu-
reza e o arranjo das enzimas degradadoras de parede celular de planta neste
complexo tem vantagens sobre os sistemas de enzimas livres. Menos protena
total se torna necessrio para a solubilizao da celulose, incluindo a celu-
lose cristalina, o que sugere que a atividade especfica do celulossoma para
tais substratos maior do que a de sistemas de enzimas livres (Johnson et
al., 1982; Boisset et al., 1999). Pode-se dizer que as enzimas do celulossoma
esto concentradas e posicionadas em uma orientao adequada, tanto com
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288 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
relao umas s outras quanto ao substrato celulsico, facilitando assim o si-
nergismo entre as unidades catalticas e evitando a adsoro no produtiva.
Estando o celulossoma prximo superfcie celular dos microrganismos, os
produtos de hidrlise inibidores no se acumulam, e so mantidos em con-
centraes adequadas para o uso mais eficiente da clula (Shohan et al., 1999).
Hemicelulases
Em funo da heterogeneidade da hemicelulose, sua hidrlise requer um
amplo complexo enzimtico formado por (Sunna, Antranikian, 1997): En-
do-1,4--D-xilanases (EC 3.2.1.8) que hidrolisam ligaes glicosdicas |-1,4
entre resduos de xilose da cadeia central de xilana; 1,4--D-xilosidases (EC
3.2.1.37) que liberam resduos de |-D-xilose a partir da extremidade no
redutora da xilobiose e de 4-|-D-xilooligossacardeos curtos; -L-arabino-
furanosidases (EC 3.2.1.55) que removem cadeias laterais de L-arabinose li-
gadas xilose da cadeia central de arabinoglicuronoxilana; -glicuronidases
(EC 3.2.1.1) que hidrolisam ligaes glicosdicas o-1,2 entre resduos de
cido glicurnico e de |-D-xilopiranosil das glicuronoxilanas (Figura 10.9).
Figura 10.9 Representao esquemtica de uma molcula de xilana e as respectivas aes
das enzimas do sistema xilanoltico. 1 endoxilanases; 2 -L-arabinofuranosidases; 3
glucuronidases; 4 feruloil e cumaril esterases; 5 acetil xilana esterases; 6 -xilosidases
Fonte: Chvez et al., 2006.
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 289
As endoxilanases, por atuarem internamente na xilana reduzindo o grau
de polimerizao, representam um papel crucial na decomposio das he-
miceluloses. Xilanases com as protenas em diferentes formas, mecanismos
catalticos, propriedades fsico-qumicas e especificidades para substratos
(sua preferncia para degradar substratos com diferentes DP, DS e padro
de substituio) so produzidos por uma grande variedade de organismos
pro-e eucariotos (Iembo et al., 2002; Da-Silva et al., 2005; Bocchini et
al., 2005).
A maioria das xilanases classificada em famlia glicosilhidrolase (GH)
10 e GH11, enquanto uma minoria pertencente s famlias GH5 e GH8
(Pollet et al., 2010). As xilanases pertencentes famlia glicosilhidrolase10
(GH10) apresentam maior versatilidade cataltica ou menor especificidade
ao substrato do que aquelas pertencentes famlia 11 (Biely et al., 1997).
As xilanases da famlia 11 (GH11) clivam preferencialmente nas regies
no substitudas do esqueleto AX, enquanto a GH10 tem preferncia pela
regio mais substituda, sendo, portanto, menos prejudicada pela presena
de substituintes 4-O-metil-D-glucuronato, acetato e o-L-arabinofuranosil
ao longo da cadeia principal de xilana (Biely et al. 1997).
Geralmente, um alto grau de ramificao na cadeia principal con-
siderado um empecilho na degradao da xilana (Pollet et al. 2010), por
obstruir a formao do complexo enzima-substrato. A degradao hemice-
lulose envolve tambm esterases como as acetil xilano esterases (AcXEs) e
ferruloil esterases ou esterases de cidos p-cumrico e ferlico (EC 3.1.1.1). As
primeiras, acetil xilana esterases (EC 3.1.1.72), removem grupos O-acetil
das posies 2 e/ou 3 de resduos |-D-xilopiranosil de xilanas acetiladas,
enquanto as segundas representam uma subclasse das hidrolases de ster
carboxlicos, as quais liberam cidos fenlicos (cidos ferlico e p-cumri-
co) de ligaes steres entre esses grupos fenlicos e grupos carboxlicos de
acares de hemicelulose e pectina (complexo lignina/fenlico-carboidra-
to, mencionado anteriormente).
A determinao das atividades dessas enzimas pode ser feita usando
substratos sintticos de steres metlicos e etlicos de cido hidroxicinmi-
co (cido trans-ferlico) ou cido ferlico esterificado com oligossacardeos
como metil 5-O-transferruloil-o-L-arabino-furanosdeo.
O crescente interesse pelas EAF deve-se principalmente por estas enzi-
mas facilitarem a desestruturao do material lignocelulsico, promovendo
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290 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
a separao dos polmeros de acar da lignina. Essas enzimas de procario-
tos e eucariotos pertenciam originalmente famlia 1 das carboidrato-este-
rases e sugere uma relao evolutiva entre a EAF, as xilano acetil-esterases
e certas lipases. Recentemente, as EAF foram organizadas em 4 classes
(A-D), levando-se em conta a especificidade por substratos sintticos de
steres metlicos de cido hidroxicinmico, especificidade para mono e di-
ferulatos, atividade sobre substratos com substituies no anel aromtico
do fenol e a sequncia primria da protena. As EAF do tipo A mostram
preferncia por substratos contendo uma ou duas hidroxilas substitudas
de cidos p-cumrico ou cafeico; as do tipo B atuam mais eficientemente
sobre substratos hidrofbicos como derivados de benzeno; os tipos C e D
exibem alta atividade sobre cidos hidroxicinmico como cidos ferlico,
p-cumrico, cafeico e sinapinico (Topakas et al., 2007).
Outro interesse na ao das FAE tem a ver com a qumica fina. A hi-
drlise especfica da ligao ster entre a poro do cido fenlico e o a-
car resulta na produo de um cido fenlico livre, que pode ser usado na
produo de outros compostos de importncia comercial, como o cido p-
-cumrico, que utilizado como ingrediente fotoativo em filtros solares, ou
a biotransformao adicional que dar origem a vanilina natural.
Ligninases
A decomposio de lignina indispensvel para a reciclagem do carbo-
no, uma vez que esse polmero a mais abundante fonte renovvel de com-
postos aromticos na natureza. Por causa de sua estrutura complexa e hete-
rognea, a lignina quimicamente recalcitrante degradao pela maioria
dos organismos. Os basidiomicetos, chamados fungos da podrido branca,
so os fungos que degradam a lignina de forma mais eficiente (Abraho
et al., 2008). Entre as enzimas envolvidas na biodegradao da lignina, as
principais so as lacases, as lignina peroxidases e mangans peroxidases
(Gomes et al., 2009; Wong, 2009).
Lacases
As lacases (benzenediol: oxignio oxirredutase, EC 1.10.3.2) fazem par-
te de um grupo de enzimas com funes de degradao e polimerizao.
Em plantas, essas enzimas exercem funes como cicatrizao do tecido
vegetal, biossntese e degradao da lignina e, em fungos, participam, alm
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 291
da biodecomposio da lignina, de processos fisiolgicos vegetativos e re-
produtivos, como pigmentao do conidiforo e sntese de melanina para
composio da parede das hifas.
A lacase classificada como fenol oxidase e catalisa a oxidao de vrios
compostos aromticos e inorgnicos (particularmente fenis) com conco-
mitante reduo de oxignio a gua. Entre os substratos oxidados por essa
enzima encontram-se: corantes fenlicos, fenis, clorofenis, alguns di-
fenilmetanos e benzopirenos (Duran; Esposito, 2000). A lacase pode de-
gradar lignina mesmo na ausncia de outras ligninases, como a mangans
peroxidase e a lignina peroxidase (Mayer; Staples, 2002).
Essas enzimas pertencem ao grupo das enzimas cobre oxidases (ou oxi-
dases de cobre) e de acordo com a ligao dos ons de cobre em seus stios
ativos, as enzimas de cobre so divididas em oxidases que possuem stio
mononuclear de cobre (um cento de cobre), como as amino oxidases, e as
oxidases com stio multinuclear de cobre (mais de um cento de cobre), como
a tirosinase, ascorbato oxidase, ceruloplasmina e lacases.
As lacases, portanto, so protenas multicobre pertencentes famlia das
enzimas oxidases azuis e geralmente contm quatro ons cobre, agrupados
em trs grupos: T1, formado por um on e encarregado da oxidao do
substrato e pela transferncia de eltrons; T2, tambm formado por um on
e, juntamente com o grupo T3, que contm dois ons, constitui o centro
trinuclear de cobre, envolvido na reduo do oxignio e liberao de gua
(Torres et al., 2003). O cobre localizado no stio T1 o responsvel pela
forte absoro da enzima na faixa dos 600nm; no entanto j foram descritas
lacases deficientes de cobre em T1, chamadas de lacases brancas, por causa
da ausncia da absorbncia caracterstica na faixa do azul (Baldrian, 2010).
O mecanismo de catlise est fundamentado na reduo do oxignio
molecular formando gua, custa de sucessivas oxidaes monoeletrni-
cas do substrato. O ciclo cataltico das lacases inicia-se com a ligao de um
substrato redutor em T1, no stio ativo da enzima. O cobre ligado a T1 ex-
trai eltrons do substrato e os transfere para o domnio trinuclear T2/T3,
que reduz o O
2
a H
2
O, ao mesmo tempo que libera o substrato oxidado (Fi-
gura 10.10). Os radicais formados deflagram reaes no enzimticas que
envolvem quebras alquil-arlicas, polimerizao de compostos fenlicos e
anilinas, oxidaes nos Co e desmetilaes (Duran et al. 2002; Baldrian,
2010)
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292 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Figura 10.10 Mecanismo de ao da lacase. esquerda, o stio cataltico das lacases, onde
se pode observar a lacase nativa, constituda de seus 4 tomos de cobre com estado de oxi-
dao 2+. direita, o ciclo cataltico das lacases, o qual envolve sucessivas transferncias de
eltrons entre os tomos de cobre. medida que a enzima vai promovendo a oxidao de
seus substratos, iniciado pelo stio T1 que se reduz, os tomos de Cu
2+
vo se reduzindo e
transferindo seus eltrons, de forma que o stio 1 sempre esteja pronto para promover a oxi-
dao de um substrato, at a completa reduo de todos os stios e sua reoxidao formando
gua para retomar novamente o ciclo.
Fonte: Duran et al. 2002; Villela, 2006.
As lacases podem interagir diretamente com substratos fenlicos e oxid-
-los. Porm, em funo do baixo potencial de oxidorreduo, estas enzimas
so incapazes de atuar diretamente sobre molculas aromticas no fenlicas,
havendo ento a necessidade de uma molcula mediadora para a degradao
de tais compostos. Nesse mecanismo lacase-mediador, os mediadores oxi-
dam substratos de alta massa molecular (Torres et al., 2003; Moreira Neto
et al., 2009). Os mediadores so, de modo geral, substncias de baixo peso
molecular, secretadas pelo prprio fungo que, quando oxidados pelas laca-
ses, so capazes de oxidar compostos que no seriam alvos diretos da enzima.
O fenmeno da mediao amplia significativamente a gama de substratos
destas enzimas (Leonowicz et al., 1999; Da Silva, Gomes, 2004). Entre os
mediadores descritos esto os metabolitos de fungos como lcool veratrlico,
cido fenilactico, benzaldedo, anisaldedo, hidroxibenzaldedo 4-hidro-
benzil lcool, aminocidos e derivados (metionina, cistena, tirosina e gluta-
tiona) e sintticos como o 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-cido sul-
fnico) (ABTS), 1-hidroxibenzotriazol (HBT epolioxometalatos PMO).
Peroxidases
As peroxidases so um grupo de enzimas oxirredutases que oxidam
substratos orgnicos, tendo o perxido de hidrognio como molcula acep-
tora de eltrons. Essas enzimas apresentam stios ativos contendo gru-
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 293
pos prostticos como ferriprotoporfirina IX. Na degradao da lignina,
duas peroxidases so muito importantes: A lignina peroxidase (LiP; EC
1.11.1.14) e mangans peroxidase (MnP; EC 1.11.1.13), ambas so glico-
protenas globulares formadas por 11%-12% de o-hlice com dois domnios
delimitando uma cavidade central que abriga o grupo heme. Seus mecanis-
mos de ao so apresentados a seguir.
Lignina peroxidases (LiP)
A lignina peroxidase (LiP) (E. C. 1.11.1.14) uma glicoprotena com
grupo prosttico constitudo de ferro protoporfirina IX cuja atividade ca-
taltica depende de H
2
O
2
O H
2
O
2
necessrio atividade da LiP origina-se
de diferentes vias bioqumicas, expressas diferencialmente de acordo com
fatores nutricionais e condies de crescimento do microrganismo (Evans
et al., 1994; Pointing, 2001). LiP uma enzima capaz de oxidar vrios com-
postos aromticos no fenlicos como o lcool benzlico, clivar cadeias la-
terais desses compostos, catalisar reaes de abertura de anis aromticos,
desmetoxilao e desclorinao oxidativa (Conessa et al., 2002).
A Figura 10.11 mostra o ciclo cataltico das LiP. O primeiro passo da
catlise a formao do composto I pela reao do perxido de hidrog-
nio com o on frrico da forma de repouso da enzima. Nesse mecanismo, o
perxido liga-se ao ferro do grupo heme com concomitante doao de um
prton para o resduo de histidina distal do tomo de oxignio ligado ao
ferro heme (o-oxignio), enquanto o resduo de arginina distal o estabi-
lizador de cargas. A transferncia do prton da histidina para o tomo de
|-oxignio resulta na clivagem heteroltica da ligao O-O do H
2
O
2
e na
formao de H
2
O e composto I. O composto I com dois eltrons oxidados
sofre duas redues sucessivas, via formao de composto II, com um el-
tron oxidado at retornar ao estado nativo de Ferro III.
O lcool veratrlico pode induzir a ao da enzima, proteg-la contra
ativao por altos nveis de H
2
O
2
, alm de atuar como cossubstrato, con-
duzindo as oxidaes de compostos aromticos no fenlicos (Mesteret al.,
1995; Pointing, 2001).
O perxido de hidrognio o aceptor natural de dois eltrons, entretan-
to, nas peroxidases ligninolticas diferem em seus substratos redutores que
so oxidados por um eltron pelo composto I e II, respectivamente.
A LiP difere das demais peroxidases pelo fato de terem substratos aro-
mticos no fenlicos como preferenciais. Enquanto radicais fenoxilas so
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294 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
os primeiros produtos de oxidao de substratos fenlicos pelas peroxida-
ses em geral, os ctions aromticos so formados aps a oxidao de anis
aromticos no fenlicos pela LiP.
Figura 10.11 Ciclo cataltico da lignina peroxidase (LiP). Inicialmente, a enzima e o Fe
3+

contido no stio ativo so oxidados pelo H
2
O
2
, gerando gua e um intermedirio com dois
eltrons oxidados, denominado Composto I. Este composto oxida o lcool veratrlico ou
outro substrato, gerando um substrato-radical livre e o Composto II, no qual o ferro ainda
est presente como Fe
4+
. O Composto II oxida um segundo substrato (que pode ser outra
molcula de lcool veratrlico), originando outro substrato-radical livre, e a enzima volta a
sua conformao original.
Fonte: Hammel; Cullen, 2008.
Mangans peroxidase (MnP)
A mangans peroxidase (MnP, E. C. 1.11.1.13) uma enzima extra-
celular glicosilada com grupo prosttico heme, encontrada apenas em
basidiomicetos.
De modo geral, a MnP no desencadeia transformaes diretas em seus
substratos por ser uma oxidorredutase no especfica. Com mecanismo ca-
taltico da MnP muito semelhante quele descrito para a LiP e inclui uma
enzima com on frrico, bem como, compostos intermedirios I e II. Porm,
em contraste com a LiP, a MnP usa apenas o Mn
2+
como substrato doador
de eltrons, oxidando-o a Mn
3+
que o responsvel pelo desencadeamento de
reaes de oxidao de outras molculas orgnicas.
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 295
O ciclo cataltico inicia-se com a ligao de H
2
O
2
ou um outro perxido
orgnico ao on frrico da enzima, formando um complexo ferro-perxido.
A subsequente clivagem da ligao O-O do perxido requer a transferncia
de dois eltrons do grupo heme, resultando na formao do Composto I da
MnP, o qual um complexo Fe
4+
-oxo-porfirina. Em seguida, a ligao dio-
xignio quebrada heteroliticamente e uma molcula de gua liberada. A
reduo subsequente prossegue atravs do Composto II de MnP (comple-
xo Fe
+4
-oxo-porfirina). Um on Mn
+2
atua como doador de 1 eltron para
essa porfirina, sendo oxidado a Mn
+3
. A reduo do Composto II gera um
outro Mn
+3
a partir de um segundo Mn
+2
levando regenerao da enzima
nativa e liberando uma segunda molcula de gua (Figura 10.11).
Enquanto o composto I da MnP, semelhante ao da LiP, pode ser redu-
zido por Mn
2+
e tambm por outros diferentes doadores de eltrons, tais
como compostos ferrocianidas e fenlicos, o Composto II MnP produzi-
do muito lentamente por outras substncias e requer Mn
+2
para completar o
ciclo cataltico. As transferncias de eltrons envolvendo o mangans ocor-
rem na presena de radicais dicarboxlicos, como oxalato, malato, fumarato
e malonato (Leonowicz et al., 1999). Esses radicais so agentes quelantes
de Mn
3+
. Ao se complexarem, aparentemente, atuam como medidores de
baixo peso molecular que efetivamente oxidaro os compostos fenlicos da
lignina (Higuchi, 2004; Conessa et al., 2002).
O mecanismo de reao da MnP similar ao de outras peroxidases,
como a lignina peroxidase, mas nesse caso, os compostos I e II da MnP
oxidam Mn
2+
(Conessa et al., 2002).
Quelatos de Mn
+3
com cidos carboxlicos podem ainda reagir um com
o outro e se converterem em radicais alquila, com subsequente reao es-
pontnea com dioxignio, resultando na formao de radicais superxidos,
que podem ser utilizados pela MnP em ausncia de H
2
O
2
externo. Com-
postos aromticos no fenlicos, com baixo potencial redox, como tetrame-
toxibenzeno ou antraceno so sujeitos oxidao pelo Mn
+3
via retirada de
um eltron do anel aromtico, originando radicais ctions arila.
Algumas MnP, alm do Mn
2++
, oxidam tambm compostos arom-
ticos fenlicos e no fenlicos (vermelho fenol, lcool veratrlico) sendo
consideradas formas hbridas de LiP e MnP. Ainda no clara a forma
como atuam, a despeito do fato de LiP e MnP serem enzimas intimamente
relacionadas.
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296 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Figura 10.12 Ciclo cataltico de mangans peroxidases. O ciclo cataltico da MnP inicia-se
pela transferncia de dois eltrons do stio ativo da enzima para o H
2
O
2
, gerando o Compos-
to I oxidado denominado Complexo Fe
4+
-oxoporfirina, com liberao de gua. A seguir, o
Mn
2+
reduz o Composto I a composto II, e liberado na forma de Mn
3+
. Uma segunda re-
duo do composto II por outro tomo de Mn
2+
restitui a enzima a sua configurao nativa.
Fonte: Hofrichter, 2002
Hidrlise do material lignocelulsico por mtodos fsicos
e qumicos
Apesar da disponibilidade de complexos enzimticos potencialmente ca-
pazes de hidrolisar materiais lignocelulsicos, a recalcitrncia dos mesmos,
em funo da baixa porosidade desse material, da cristalinidade da celulose
e da presena de hemicelulose e ligninas, dificulta o acesso das enzimas a
seus substratos. Desse modo, tratamentos fsicos e/ou qumicos anteriores
hidrlise enzimtica como diferentes formas de energias de alta frequn-
cia como micro-ondas, ultrassom, radiao ionizante e exploso de vapor,
assim como diferentes combinaes com cidos ou lcalis so propostos.
Exploso a vapor
A exploso a vapor foi desenvolvida em 1925 por W. H. Mason para
a produo de madeira compensada. Desde ento, o uso do processo tem
sido expandido para outras aplicaes como a produo de alimentos para
ruminantes e polpao de madeira. O uso de exploso a vapor, para trata-
mento da biomassa vegetal, foi introduzido no incio de 1980 (Fody, 1980).
Neste trabalho foram descritos vrios tempos de residncia e presses no
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 297
rendimento de xilose e glicose. Desde ento, vrios estudos aplicando ex-
ploso com vapor para pr-tratamento de vrios materiais lignocelulsicos
foram relatados. Schultz et al. (1984) avaliou a eficincia da exploso com
vapor para pr-tratamento de misturas de cavacos de Madeira, casca de ar-
roz, talos de milho e bagao de cana-de-acar. Esses materiais, submeti-
dos exploso com vapor a 240C-250C por 1 minuto, apresentaram taxa
de hidrlise enzimtica semelhante quelas obtidas com papel de filtro.
O mecanismo de exploso com vapor foi descrito por Chornet e Overend
(1988) como um processo termomecanoqumico que leva a um desarranjo
dos componentes estruturais dos materiais lignocelulsicos pelo calor na
forma de vapor (termo), por foras de atrito, por causa da expanso de umi-
dade (mecnico) e por hidrlise de ligaes glicosdicas (qumicos).
No reator, vapor sob alta presso penetra a estrutura lignocelulsica por
difuso e condensa-se, sob a alta presso, molhando o material. A umidade
na biomassa hidrolisa os grupos acetis da frao hemicelulsica, formando
cidos orgnicos como acticos e urnicos. Os cidos, por sua vez catalisam
a despolimerizao da hemicelulose, liberando xilana e pequena quantidade
de glicanas. Sob condies extremas, as regies amorfas da celulose podem
ser hidrolisadas em algum grau. Condies excessivas, isto , temperaturas e
presses altas, porm, podem tambm promover a degradao da xilose para
furfural e glicose para 5-hidroximetil furfural, os quais inibem crescimento
microbiano, sendo ento indesejvel em uma fermentao. A biomassa mo-
lhada explodida quando a presso dentro do reator liberada subita-
mente. O material expulso do reator pela ao da fora induzida. Vrios
fenmenos acontecem neste momento. Primeiro, a umidade condensada
dentro da estrutura evapora instantaneamente em funo da diminuio s-
bita da presso. A expanso do vapor da gua exerce uma fora de atrito na es-
trutura circundante. Se esta fora alta o suficiente, o vapor causar o desar-
ranjo mecnico da estrutura lignocelulsica. A descrio do processo destaca
a importncia de aperfeioar os dois fatores governantes: tempo de reteno e
temperatura. A quantidade de tempo que a biomassa passa no reator ajuda
a determinar a extenso de hidrlise da hemicelulose pelos cidos orgnicos.
Tanahashi (1990) estudou os efeitos de exploso com vapor na morfologia
e propriedades fsicas da madeira. Foi mostrado que, em presses maiores que
28 kg/cm
2
(230C) e 16 minutos como tempo de residncia, as microfibri-
las da madeira tornaram-se completamente separadas umas das outras, alm
disso, ficaram mais finas e curtas com o aumento do tempo de exposio ao
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298 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
vapor. A cristalinidade aumentou 1,5 vezes, e a largura da micela aumentou
2 vezes. Isso levou os pesquisadores a concluir que a celulose amorfa se torna
cristalina durante o processo de exploso com vapor. Deste modo, o ndice
de cristalinidade e a largura da micela aumentam na madeira explodida com
vapor. Uma anlise trmica (baseada em temperatura de transio vtrea, Tg)
tambm foi realizada na madeira explodida, a qual demonstrou que a exploso
com vapor, com moderada severidade, promove a deslignificao. Entretan-
to, os mesmos autores encontraram que, com tempos de tratamentos prolon-
gados, pode ocorrer a repolimerizao da lignina. Os efeitos de exploso com
vapor em material lignocelulsico de madeira, divulgados na literatura, po-
dem ser resumidos: 1) aumento da cristalinidade da celulose promovido pela
cristalizao da frao amorfa; 2) aumento da hidrlise da frao hemicelulose;
3) aumento de deslignificao; 4) tanto a deslignificao quanto a hidrlise da
hemicelulose aumentam o volume dos poros das clulas na planta, e so ento
benficas para a subsequente hidrlise da celulose; 5) o aumento de cristalini-
dade de celulose, porm, uma desvantagem, pois reduz a hidrlise da celulose.
Micro-ondas
A ao das micro-ondas sobre molculas de gua provoca um intenso
movimento rotacional que, por atrito, gera aquecimento. Os choques pro-
vocados por este movimento rotacional podem ser teis para promover a
desestruturao do complexo ligno-hemicelulsico. Pr-tratamentos de bio-
massa com a aplicao de micro-ondas em meio alcalino reduziram em 50% o
tempo para obteno da mesma quantidade de acares redutores por hidr-
lise enzimtica da palha de arroz quando comparado ao processo sem micro-
-ondas, e foi verificado um aumento de 5% no etanol obtido a partir de palha
de trigo (Zhu et al., 2006). Dessa forma, a tecnologia na hidrlise de bagao
de cana-de-acar parece ser promissora principalmente pelo fato de poder
ser aplicada sobre o bagao em leito mvel, o que possibilita automao.
O uso de micro-ondas com pr-tratamento de bagao de cana, associado
com glicerol e H
2
SO
4
demonstrou ser eficiente para liberao de componen-
tes fenlicos a partir da lignina, assim como promoveu maior hidrlise en-
zimtica (Magalhes, 2011; Moretti et al., 2011, submetido) (Tabela 10.3).
Ultrassom
A utilizao de ultrassom em processos qumicos vem se tornando mais
frequente nos ltimos anos. As ondas de choque ultrassnicas geradas em
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 299
meio lquido concentram alta energia e do origem ao fenmeno da cavi-
tao acstica, podendo romper paredes celulares o que favorece a ao
enzimtica. A irradiao ultrassnica tem sido usada para acelerar proces-
sos qumicos e biolgicos como a solubilizao da lignina e da hemicelulose
de bagao de cana (Sun et al., 2004). A irradiao de ultrassom durante o
processo enzimtico de sacarificao de resduos de papis tem um efeito
significativo na cintica do processo e no teor de acares solveis totais. A
utilizao de ultrassom em ciclos intermitentes pode aumentar a produo
e a liberao de glicose a partir da celulose (Wood et al.,1997).
Tabela 10.3 Efeitos do tratamento com micro-ondas associado a cido e glicerol
Solues de
glicerol
Soluo aps pr-tratamento com
micro-ondas (2 min.)
Hidrolisado enzimtico
(Power cell-prozin)
Compostos fenlicos
(mg/g bagao)
Acares redutores
(m/g bagao)
Acares redutores
(mg/g bagao)
Glicerol 100% +
H
2
SO
4
0,01M
33,0 + 2,0 4,9 + 0,9 512,9 + 7,0
Glicerol 70% +
H
2
SO
4
0,01M
17 + 0,4 11,7 + 0,8 356,9 + 6,0
Glicerol 30% +
H
2
SO
4
0,01M
0,95 + 0,8 2,2 + 0,2 195,6 + 4,0
Glicerol 10% +
H
2
SO
4
0,01M
0,74 + 0,1 1,5 + 0,1 234,2 + 2,0
Glicerol 100% +
H
2
SO
4
0,05M
62,4 + 0,3 16,2 + 0,9 377,3 + 10,0
Glicerol 70% +
H
2
SO
4
0,05M
23,3 + 0,2 20,91 + 0,8 256 + 5,3
Glicerol 30% +
H
2
SO
4
0,05M
5,5 + 0,5 0 195,4 + 6,0
Glicerol 10% +
H
2
SO
4
0,05M
1,41 + 0,4 9,09 + 1,0 176,9 + 5,0
Fonte: Magalhes, 2011.
Radiao ionizante
A radiao ionizante (raios gama) provm do decaimento espontneo
por emisso beta de radionucldeos, como, por exemplo, o Cobalto-60, e
considerada segura, uma vez que alimentos so irradiados com esta forma
de energia para aumentar seu tempo de prateleira bem como instrumentos
mdicos so esterilizados sob seus efeitos. uma via muito promissora para
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300 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
degradao da celulose em carboidratos mais susceptveis ao microbio-
lgica e pode ser tambm aplicada sobre leito mvel o que permite proces-
sos em fluxo contnuo.
O bagao de cana submetido radiao ionizante em meio alcalino
apresentou uma solubilidade em gua de 79% e um teor total de acares
solveis de 46%, sendo 78% de trissacardeos, 16% dissacardeos e 6% mo-
nossacardeos, contrastando com a amostra-controle que teve apenas 7% de
sua massa solubilizada e 0,4% de acares solveis. Tambm foram obser-
vadas alteraes qumicas na estrutura de materiais celulsicos submetidos
radiao ionizante como escurecimento e aumento da higroscopicidade.
Estas alteraes esto mais relacionadas a um efeito ionizante diretamente
na fibra e no gerao de radicais hidroxilas provenientes da gua (Bou-
chard et al., 2006).
Ozonlise
O oznio pode ser empregado como promotor de solvncia de lignina
com liberao de compostos fenlicos de baixo peso molecular. Dentre os
polmeros constituintes dos materiais lignocelulsicos, a lignina a mais
susceptvel solubilizao por ozonlise (Quesada et al., 1999). Em estudo
realizado com resduos de algodo foi provado que os teores de compostos
fenlicos monomricos solveis aumentaram em 100% com a utilizao de
oznio e que o teor de glicose aumentou de 3,0 para 10,0 g/100g de matria
seca aps a aplicao de celulases. O tratamento com oznio aumentou em
54% o teor de acares fermentescveis aps ao enzimtica sobre a palha
de arroz (Yosef et al., 1994).
Produo de enzimas para aplicao na sacarificao
de material lignocelulsico: aspectos gerais da
fermentao em estado slido (FES) e a produo
de enzimas em biorreatores
O uso de enzimas despolimerizantes na sacarificao de resduos agroin-
dustriais para produo de etanol celulsico leva a duas questes importan-
tes: a necessidade de desenvolver a tecnologia de produo de enzimas no
Brasil e reduo dos custos das mesmas.
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 301
Nesse aspecto, dentre os processos usados para a produo de enzimas, a
fermentao em estado slido (FES) atrativa principalmente pela possibi-
lidade do uso de meio base de resduos slidos agrcolas e agroindustriais
para crescimento do microrganismo (Gomes et al., 2005, Silva et al., 2005).
Tais resduos tm mostrado bons resultados na produo de enzimas como
pectinases (Martins et al., 2002), celulases, xilanases (Leite et al. 2007;
2008), amilases (Ramalho, 2002), ligninases (Xavier-Santos, 2003), inuli-
nases (Bender et al., 2005), quitinases (Binod et al., 2006) e fitases (Roo-
pesh, 2006).
Esta tcnica pode tornar-se economicamente vantajosa para os pases
subdesenvolvidos, ou em fase de crescimento, onde a dificuldade econ-
mica atual e a globalizao da economia mundial no permitem que todo
o setor agropecurio acompanhe evoluo biotecnolgica. Estes processos
seriam uma oportunidade mpar se for considerada a possibilidade de se
acoplar a produo de enzimas ao sistema de produo de etanol de cana
e celulsico, de modo que os resduos gerados na produo da cana e na
indstria possam ser utilizados como substratos.
A FES pode ser definida como um processo que ocorre na ausncia, ou
prximo da ausncia, de lquido nos espaos entre as partculas (Lonsane et
al., 1985). Neste sistema, a gua pode estar adsorvida sobre a superfcie do
slido e/ou estar retida por capilaridade entre as partculas, mas no pode
preencher totalmente os poros. As caractersticas higroscpicas do slido,
as propriedades da soluo aquosa, a geometria das partculas e a porosi-
dade do meio definem a capacidade de reteno de lquido no meio slido.
Estudos FES em reator de coluna realizados por Zanelato (2011) demons-
traram que farelo de trigo adsorve mais gua a uma taxa mais elevada do
que bagao de cana. Desse modo, a adio de gua ao meio a ser fermentado
deve levar em considerao o tipo do material que est sendo hidratado. Na
fermentao submersa (FSM), os slidos, fase dispersa, esto em soluo
no lquido, fase contnua, sendo que as reaes ocorrem nesta ltima fase.
Em geral, o crescimento e o metabolismo microbianos dependem de al-
tas quantidades de gua para a dissoluo e difuso de solutos, substratos e
metabolitos, enquanto as trocas gasosas, basicamente de O
2
e CO
2
, podem
ocorrer tanto na fase lquida como na gasosa, sendo mais eficientes nesta l-
tima. Portanto, h um equilbrio delicado entre as pores slida, lquida e
gasosa para atender aos requisitos metablicos do microrganismo, de modo
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302 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
que estudos extensivos devem ser realizados para encontrar a proporo
tima de cada uma das fases (Gervais et al., 1996).
Na FSM, h maior homogeneidade dos constituintes do processo (mi-
crorganismo, nutrientes e metabolitos) e, consequentemente, o controle dos
parmetros de fermentao mais simples e direto, resultando em maior
padronizao dos produtos (Gomes et al., 2009). Por outro lado, na FES h
heterogeneidade do meio de cultivo e o controle de processo deficiente,
resultando em grande variabilidade de concentrao de produtos, o que
representa o maior entrave aplicao industrial desta tcnica. Para mini-
mizar tal heterogeneidade, podem-se usar sistemas de mistura do meio de
cultivo, microrganismos com maior capacidade de colonizao do meio po-
roso, como fungos filamentosos, e aerao forada, para prover O
2
, remo-
ver CO
2
e dissipar calor (Gervais; Molin, 2003).
De um modo geral, fungos filamentosos adaptam-se melhor FES do
que bactrias ou leveduras. Por causa de sua estrutura em filamentos, esses
microrganismos penetram por entre e/ou dentro das partculas por eroso
do substrato slido, causada pela liberao de enzimas fibrolticas pela pon-
ta da hifa. Alm disso, podem crescer em menor atividade de gua (a
w
).
Entretanto, trabalhos tm mostrado resultados satisfatrios de obteno de
diferentes produtos utilizando culturas bacterianas (Soares et al., 1999).
O material slido usado na FES pode ser inerte, servindo de suporte
soluo nutriente e/ou como fontes de carbono e nutrientes. Neste l-
timo caso, na medida em que o slido consumido, o miclio fngico ad-
quire a funo de estruturar o meio e evitar o colapso da matriz porosa.
Eventualmente, um suporte inerte pode ser empregado em conjunto com
substratos slidos para evitar aglomerao das partculas e consequente re-
duo de aerao e dificuldade de remoo de calor metablico conforme
demonstrado por Silva et al. (2002) e por Martins et al. (2002). Em geral,
os materiais slidos empregados em FES so compostos naturais, tais como
resduos agrcolas, agroindustriais e de atividade urbana, agregando valor a
materiais que frequentemente so descartados inadequadamente (Pandey,
2003; Economou et al., 2010).
A inexistncia de gua nos poros entre as partculas influencia todos
os aspectos da fisiologia do microrganismo, como crescimento vegetativo,
esporulao e germinao de esporos, alm da produo e caractersticas
dos metabolitos. Esporos de fungos produzidos em FES so mais estveis,
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 303
mais resistentes desidratao e tm maior taxa de germinao aps lon-
gos perodos de congelamento do que os obtidos em FSM (Hlker; Lenz,
2005). Essas propriedades so atribudas ao fato de os conidiforos obtidos
em FES terem maior hidrofobicidade, parede celular mais rgida e menor
volume (Munoz et al., 1995; Pascual et al., 2000).
Fungos cultivados em FES tendem a acumular poliis em suas clulas,
como glicerol, manitol, eritrol e arabitol, sendo a composio desta mistura
dependente das condies de cultivo (Adler et al. 1985; Ruijter et al., 2004;
Arakaki et al., 2011). A produo destes metabolitos o resultado de um
mecanismo desenvolvido para manter a presso de turgor das clulas, de-
monstrando a adaptao do microrganismo ao acesso limitado gua.
Outro fator importante a ser considerado em FES a aerao, que assu-
me vrias funes: oxigenao, remoo do CO
2
, disperso de calor e dis-
tribuio de componentes volteis metabolizados. No entanto, a remoo
de umidade do meio um aspecto deletrio da aerao, pois, mesmo que o
ar entre saturado no sistema, a elevao de temperatura decorrente da gera-
o de calor metablico torna-o insaturado, causando um desequilbrio ter-
modinmico que restaurado pela remoo de gua das partculas slidas
(Umza-Guez et al., 2009).
A taxa de aerao depende dos requisitos de O
2
do microrganismo para
a metabolizao de determinado produto e da remoo de CO
2
, da taxa
dissipao de calor metablico gerado, do ressecamento da fase slida e da
estrutura fsica do meio poroso, devendo ser otimizada para cada tipo
de meio, microrganismo e processo (Chahal, 1987). Restries na oferta de
O
2
podem afetar a morfologia de fungos e a produo de metabolitos. O
crescimento das hifas individuais de A. oryzae no foi influenciado para
concentraes de O
2
de at 0,25%, mas a taxa de crescimento especfico to-
tal decresceu, bem como a produo de o-amilase (Rahardjo et al., 2005).
Por outro lado, a produo de flavorizantes por Kluveromyces marxianus
foi relacionada baixa disponibilidade de oxignio, resultando na produ-
o de aromas variados, tais como lcoois, aldedos e cetonas (Medeiros et
al., 2001).
Uma grande limitao da FES a dificuldade de remoo do calor gera-
do pelo metabolismo do microrganismo em funo da baixa condutividade
trmica efetiva do meio poroso. Na prtica, a FES necessita mais de aerao
como veculo de dissipao de calor do que para suprimento de O
2
(Vies-
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304 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
turs et al., 1981). O aumento excessivo da temperatura em um biorreator
provoca alteraes nos mecanismos fisiolgicos dos microrganismos, po-
dendo levar queda no rendimento dos produtos almejados e at morte
das clulas. Eventualmente, pode ocorrer a desnaturao do produto, prin-
cipalmente de substncias termolbeis. Esses problemas podem ser con-
tornados com uso de microrganismos termoflicos. Na produo de pecti-
nases por Thermomucor indicae-seudaticae em FES usando fermentador de
coluna Umza-Guez (2009) demonstrou-se que o aumento da temperatura
decorrente do calor gerado pelo metabolismo do fungo no interferiu nas
taxas de crescimento e de produo da enzima, no requerendo, portan-
to, sistema de resfriamento. Esse dado importante do ponto de vista de
escalonamento, visto que contorna um dos grandes problemas da FES com
microrganismos mesoflicos.
De um modo geral, a concentrao de enzimas em FES maior do que
em FSM (Aguilar et al., 2004). A produo mxima de poligalacturonase e
xilanase por Trichoderma viridae ocorreu a a
w
de 0,99, enquanto a sntese de
|-glicosidase foi aumentada em a
w
de 0,96 a 0,98 (Grajek, Gervais, 1987).
Esse perfil tem sido relatado para a produo de diferentes grupos de enzi-
mas e microrganismos. Xilanases, celulases e pectinases foram produzidas
em maior quantidade em FES do que em FSM por Curvularia inaequalis
(Gomes et al., 2001), Penicillium spp. (Silva et al. 2002, Martin et al., 2004,
Ferreira et al., 2010) Thermoascus auraniacus (Martins et al., 2002, Mar-
chione et al., 2007) e Aspergillus sp. (Freitas et al., 2006). Embora vrios
autores tenham relatado menor produo de protease em FES, uma enzima
frequentemente associada ao decaimento da produo de outras enzimas
em FSM (Auria et al., 1990; Viniegra-Gonzlez et al., 2003) Zanphorlin et
al. (2010), demonstraram que o fungo termoflico Myceliophthora sp. pro-
duziu maior quantidade de protease em FES do que em FSM.
Contudo, necessrio ter cautela quanto aos estudos comparativos en-
tre FES e FSM, para que concluses parciais no sejam aceitas como abso-
lutas. Estudos da produo de invertase e pectinase por A. niger mostraram
que o fungo cresceu mais eficientemente e produziu mais enzimas em FES
do que em FSM; apenas nesta ltima havia alta concentrao de sacarose,
indicando que a produo de enzimas mais sensvel represso catablica
em FSM (Aguilat et al., 2001; Viniegra-Gonzlez et al., 2003). Entretanto,
a represso catablica tambm pode ser exercida em FES. Dados de Silva et
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 305
al. (2002) demonstraram que o uso de cascas de frutas contendo altos teores
de acares na produo de pectinases em FES resultou em forte represso
da produo da enzima quando comparado a meio contendo acares em
baixas concentraes.
As caractersticas fsico-qumicas de enzimas tambm podem ser afeta-
das pela forma de cultivo microbiano. Acun-Argelles et al. (1994) com-
pararam as propriedades de endo e exo-PG produzidas por A. niger em FES
e verificaram que estas enzimas foram acentuadamente mais termoestveis
do que as similares produzidas em FSM. A endo-PG mostrou-se mais es-
tvel em faixas mais amplas de pH do que enzima de FSM. Da mesma for-
ma, exo-PG produzida por Penicillium veiridicatum RFC3 em FES foi mais
termoestvel do que a equivalente produzida em FSM (Silva et al., 2007).
Entretanto, estudos com fungos termoflicos levaram a resultados opostos.
Martins et al. (2007) demonstraram que PG de Thermoascus auranticaus
CBMAI-756 produzida em FES foi menos termoestvel que a obtida por
FSM. Os mesmos resultados foram descritos por Martins et al. (2010) e
Gomes et al. (2011), dados ainda no publicados) para PG de Thermomucor
indicae-seudaticae e Rhizomucor pussilus. O maior nvel de glicosilao de-
terminado para as enzimas produzidas em FSM foi considerado um fator
provvel da maior termoestabilidade dessas enzimas.
Vrias outras vantagens da FES podem ser citadas em relao con-
vencional FSM, tais como: maior produtividade; semelhana com o habitat
natural dos fungos filamentosos, que se adaptam mais facilmente ao meio
de cultivo, permitindo o uso de microrganismos selvagens, que apresentam
melhor performance do que cepas geneticamente modificadas; etapas pos-
teriores mais simples em funo da maior concentrao do produto; menor
gasto energtico; e menores requisitos de tratamentos de resduos. Algu-
mas desvantagens so: problemas com aumento de escala; as dificuldades
no controle de parmetros do processo, como pH, temperatura, forneci-
mento de nutrientes e umidade; alta impureza do produto, uma vez que a
degradao do material slido e a atividade microbiana podem gerar meta-
bolitos indesejados de difcil separao e que podem provocar dificuldades
nos procedimentos posteriores fermentao. Deste modo, a FES, a des-
peito de sua grande potencialidade, necessita de estudos microbiolgicos,
bioqumicos e de engenharia mais profundos para que possa ser aplicada
em larga escala industrial (Saiz-Jimenez, 1995).
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306 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Como anteriormente mencionado, a FES particularmente atrativa pela
possibilidade do uso de resduos slidos agrcolas e agroindustriais de baixo
valor. Tais resduos tm mostrado bons resultados na produo de enzimas
como descrito anteriormente. No cenrio de produo de biocombustveis,
a FES economicamente vantajosa para produo de enzimas despolime-
rizantes de materiais lignocelulsicos (Hsieh, Yang, 2004; Ito et al., 2011).
A grande maioria dos trabalhos publicados sobre FES trata de aspec-
tos microbiolgicos e/ou bioqumicos, sendo os experimentos realizados
em frascos de vidro ou sacos plsticos. A transposio dos resultados ob-
tidos nestes trabalhos para a escala de biorreatores no trivial e requer
experimentos especficos, uma vez que nos frascos de vidro as condies
de temperatura, umidade e pH so homogneas e facilmente controladas,
enquanto nos biorreatores o controle muito mais complexo.
Os fermentadores para FES podem ser divididos em duas classes bsi-
cas: os de leito fixo e os de leito mvel. Os primeiros podem ser subdividi-
dos em de bandeja e os de colunas de leito empacotado, enquanto os de leito
mvel, em de leito fluidizado e rotativos. Para a escolha do projeto ideal
devem ser considerados os objetivos da fermentao, custos envolvidos no
processo, facilidade de carga e descarga, limpeza e manuteno, possibili-
dade de monitoramento e controle dos parmetros do processo, caracters-
ticas do microrganismo empregado e necessidade ou no de sistema estril.
importante que o reator seja construdo com material incuo, resistente
corroso e no txico para os organismos. Alm disso, deve promover
aerao eficiente e manter a uniformidade e integridade do substrato (Ra-
ghavarao et al., 2003). Ao contrrio da FSM, poucos so os fabricantes que
dispem de fermentadores para FES em linha, sendo os projetos quase cus-
tomizados para o trinmio substrato-microrganismo-produto.
Nos biorreatores de bandeja, o ar escoa paralelamente superfcie do
meio fermentativo, enquanto nos de leito empacotado, o ar percola a matriz
porosa. A camada de slidos nas bandejas no pode ultrapassar alguns pou-
cos centmetros para evitar o acmulo de energia trmica, que insuficien-
temente removida pelo ar que escoa na superfcie (Sato; Sudo, 1999). Desse
modo, sistemas industriais que empregam esta alternativa de cultivo, tais
como a de produo de koji no Japo, requerem grandes reas e mo de obra
extensiva, de modo que os custos de instalao e operacionais so elevados.
Um caso particular dos biorreatores em leitos estticos o da produo de
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 307
esporos de fungos entomopatognicos, como Metarhizium anisopliae, que
ocorre industrialmente em sacos plsticos com at 1 kg de substrato. Neste
processo, o meio de cultivo, em geral arroz, inoculado com a suspenso
fngica, acondicionado em sacos plsticos e mantido em salas com tempe-
ratura, umidade e luminosidade controladas. Estas so tcnicas muito arte-
sanais e aspectos de engenharia so relegados a plano secundrio.
Os fermentadores de leito empacotado tm projeto simples, so de f-
cil operao, requerem pouco espao e baixo consumo de mo de obra. Os
controles das variveis de processo so mais eficientes do que no fermenta-
dor de bandejas (Ashley et al., 1999). Estes biorreatores so tubos verticais
encamisados, por onde circula gua temperatura desejada; o meio poroso
previamente inoculado acomodado no interior da coluna e ar percola lon-
gitudinalmente o sistema. So particularmente recomendados a microrga-
nismos intolerantes agitao, como fungos de hifas cenocticas e mesmo
alguns de hifas septadas.
Nesta classe de biorreatores, o oxignio no fator limitante, por causa
da aerao forada, desde que no haja colapso e aglomerao do meio po-
roso ao longo da fermentao. Para os casos onde aglomerao previsvel,
um material fibroso inerte pode ser empregado para estruturar a matriz po-
rosa, como fez Umsza-Guez (2009) no cultivo de Thermomucor indicae-se-
daticae N31 nos substratos farelo de trigo e bagao de laranja, tendo bagao
de cana-de-acar como inerte.
A grande desvantagem deste projeto a remoo deficiente de calor me-
tablico gerado pelo microrganismo, que provoca ressecamento do meio e
heterogeneidade na produo dos metabolitos (Rahardjo et al., 2006). As
taxas de reao e os equilbrios qumicos no fermentador so fortemen-
te dependentes da temperatura do sistema. Assim, experimentos que se
desenvolvem satisfatoriamente em escala de frascos podem no ser bem-
-sucedidos neste biorreatores. Nos perodos de maior atividade metablica,
o aumento de temperatura pode superar em 10C a temperatura tima da
fermentao (Lonsane et al., 1992; Khanahmadi et al., 2006).
O controle da temperatura em leitos empacotados fica restrito a aes
sobre a velocidade e a temperatura do ar e sobre a temperatura da camisa.
Ambas alternativas so pouco eficientes, uma vez que o ar tem baixa ca-
pacidade calorfica e a disperso condutiva de calor deficiente em funo
da baixa condutividade trmica efetiva do substrato slido. O mecanismo
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308 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
mais efetivo de controle de temperatura seria a remoo de calor evapora-
tivo (Gutierres-Rojas et al., 1996). Para tanto, ar com umidade abaixo da
saturao poderia ser empregado e, para restabelecer o equilbrio termodi-
nmico, gua seria vaporizada do material slido, um processo endotrmi-
co. No entanto, apor conta da impossibilidade de repor a gua evaporada do
meio, esta alternativa leva ao ressecamento do substrato e a todos os efeitos
deletrios a ele associados.
Alguns autores observaram um perfil de umidade no interior da coluna,
crescente da base para o topo do leito (Lonsane et al., 1992; Umsza-Guez,
2009). Nas proximidades da entrada do ar no leito houve ressecamento e
nas proximidades da sada houve inundao, e ambos os fenmenos afeta-
ram negativamente a produo de enzimas, uma vez que nas pores mais
centrais do biorreator a produo de enzimas foi maior do que nas extre-
midades. A queda de umidade na entrada deve-se ao efeito da remoo de
calor evaporativo j comentado, e a inundao na sada ao fato de o ar sair
saturado do fermentador e deparar-se com o ambiente a uma temperatu-
ra mais baixa, condensando o excesso de umidade, que retorna ao leito. A
gua ento ocupa os poros e dificulta as trocas gasosas, afetando o metabo-
lismo microbiano.
Em reatores de leito fixo de grande porte, a tendncia que estas he-
terogeneidades de processo e de produtos se acentuem, sendo necessrias
alternativas tecnolgicas para super-las.
O fermentador de leito mvel mais pesquisado na literatura o de tam-
bor rotativo, pois apresenta boas alternativas de controle de temperatura
e de umidade do meio. Neste projeto, o contato fluido-partcula inten-
so, conferindo grande homogeneidade trmica ao sistema, favorecendo a
padronizao das condies de processo e dos produtos. O projeto deste
sistema mais complexo do que o dos reatores de leito empacotado, assim
como os requisitos de manuteno, resultando em custos mais elevados de
execuo e de operao.
A operao destes biorreatores no implica rotao contnua do tambor,
que normalmente tem rotao intermitente. Quando estacionrio, este sis-
tema assemelha-se ao reator de bandejas, pois ar introduzido no equipa-
mento no sobre-espao acima do material slido e nesta alternativa de ope-
rao a remoo de calor metablico limitada (Mitchell et al., 2000). No
entanto, enquanto o meio slido revolvido, gua pode ser aspergida sobre
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RESDUOS AGRCOLAS E AGROINDUSTRIAIS 309
o mesmo, de modo que ar pode ser empregado com umidades relativas mo-
deradamente baixas, removendo calor evaporativo, sem que o meio torne-se
ressecado. Evidentemente, a tolerncia do microrganismo ao cisalhamento
deve ser testada a priori, antes do projeto definitivo do equipamento, o que
pode ser feito em frascos de vidros aerados a serem girados periodicamente
ao longo da fermentao, comparando-se o resultado final com colunas es-
tticas assumidas como controle (Van de Lagemaat; Pyle, 2001).
Vrios produtos tm sido obtidos com sucesso em fermentadores de
tambor rotativos, principalmente enzimas, tais como celulases e hemicelu-
lases por Thermoascus auranticus em palha de trigo, celulases por Trichoder-
ma harzianum em fibras de palma, xilanase e exo-PG por A. awamori em
polpa de uvas e amilases por A. awamori, em torta de babau (Kalogeris et
al.,1999; Daz et al., 2009). No entanto, alguns produtos, como pigmentos
por Monascus sp. em arroz e tanases por Penicillium glabrum em fibra sin-
ttica embebida em soluo inoculante, no deram resultados satisfatrios
(Van de Lagemaat; Pyle, 2001; Eduardo, 2010). Na produo de pigmen-
tos, o processo foi muito longo, cerca de doze dias, levando desestrutura-
o do meio e aerao inadequada do sistema, enquanto na produo das
enzimas, o sistema projetado implicava rotao contnua, causando srios
danos ao miclio fngico.
Concluso
Existem ainda muitos obstculos a serem vencidos para conseguir al-
tos rendimentos no processo de obteno de acares fermentescveis por
hidrlise enzimtica, como o custo das enzimas e a recalcitrncia do ba-
gao. A cristalinidade da celulose e a lignina, que dificultam o acesso das
enzimas s fibras celulsicas, so obstculos que podem ser superados com
pr-tratamentos fsicos e/ou qumicos do bagao. Entretanto, alguns fato-
res devem ser considerados para a escolha do tratamento ao qual o bagao
ser submetido: rendimento econmico, segurana operacional, consumo
energtico e gerao de resduos.
O custo das enzimas pode ser reduzido com processos de produo al-
ternativos, como a fermentao em estado slido usando resduos agrcolas
ou agroindustriais como substratos para cultivo dos fungos produtores.
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11
Utilizao de enzimas lipolticas
na produo de biodiesel
Mariana R. Pereira,
Thas C. Maester, Lcia M. Carareto Alves,
Eliana G. M. Lemos
Introduo
As enzimas catalisam processos biotecnolgicos e tm sido usadas por
dcadas, como por exemplo, na aplicao de leveduras para a fermentao
do acar a lcool; na produo de vinhos e pes; em processos enzimticos
na indstria txtil e alimentcia etc. (Aehle, 2004).
Recentemente, as propriedades catalisadoras destas enzimas esto sendo
compreendidas corretamente e uma nova fase comeou, na qual h a fuso
de ideias de qumica proteica, biofsica molecular e biologia molecular. Con-
tribuies sobre a bioqumica enzimtica, cintica, estudos estruturais e po-
tenciais biotecnolgicos podem ser encontrados em livros, artigos e enciclo-
pdias (ibidem). Neste captulo, ser discutida a nomenclatura das enzimas
e suas relaes, dando um enfoque aplicao das enzimas lipolticas para
a produo de biodiesel, visto que o uso do biodiesel no Brasil tem atrado
ateno por ser um combustvel renovvel, biodegradvel e atxico, propi-
ciando o desenvolvimento de uma fonte energtica sustentvel. O biodiesel
composto de alquil steres de cidos graxos e pode ser sintetizado por ca-
tlise qumica ou enzimtica, principalmente a partir de fontes renovveis.
Dentro deste contexto, o uso de enzimas para produo de biodiesel tem
recebido muita ateno uma vez que apresenta muitas vantagens sobre os
mtodos qumicos: realizado em condies de reao moderada, utiliza
pouca quantidade de lcool, a recuperao do produto mais fcil e o pro-
cesso gera menor interferncia ambiental (Kourist; Brundiek; Bornscheuer,
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320 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
2010). Dentre estas enzimas, a aplicao de lipases para produo de bio-
diesel, a partir de leos vegetais brutos, possibilita produzir um produto de
alta pureza, proveniente de gorduras descartadas, pois atuam sobre cidos
graxos tanto livres quanto ligados acilgliceris.
Em funo da intensa utilizao de lipases na produo de biodiesel ne-
cessria a identificao de novas enzimas lipolticas que aumentem sua pro-
duo, sem resultar no custo elevado do produto final. Tambm necessrio
que estas enzimas no sejam inativadas pela concentrao do lcool, possuam
elevada atividade, entre outras caractersticas. Vrias propostas so viveis
para a busca de novas enzimas, sendo uma delas a abordagem metagenmica.
Esta abordagem foi proposta em 1998 e envolve a extrao direta do
DNA genmico de amostras do ambiente e clonagem do material obtido,
resultando em complexas bibliotecas que apresentam vrias aplicaes
como analisar a diversidade microbiana e identificar genes codificadores de
protenas de interesse biotecnolgico (Chu et al., 2008; Couto et al., 2010;
Lee et al., 2004; Ranjan et al., 2005; Rhee et al., 2005; Wu; Sun, 2009). Di-
versos estudos tm demonstrado que a anlise metagenmica propicia uma
combinao quase ilimitada para encontrar novos genes codificadores de
lipases, como por exemplo, os genes que foram prospectados em bibliote-
cas metagenmicas advindas de diferentes amostras ambientais como: solo
(Lee et al., 2004), gua de lagoa e lago (Ranjan et al., 2005), de mar (Chu et
al., 2008), de rio (Wu; Sun, 2009), sedimento de manguezais (Couto et al.,
2010) e campos termais (Rhee et al., 2005).
Segundo Ranjan e colaboradores (2005), a busca incessante por lipases
ir aumentar a diversidade desta enzima e, consequentemente, o nme-
ro de famlias as quais esto classificadas. Por serem enzimas versteis e
amplamente utilizadas, a expectativa que as lipases futuramente sejam
to importantes como catalisadores industriais, o quanto so atualmente as
proteases e carboidrases (Trevisan, 2004). Como exemplo disso, a gran-
de ateno destinada a esta enzima para a produo de biodiesel, por meio
da transesterificao de gorduras, uma alternativa do combustvel petrleo
para os problemas ambientais (Kourist; Brundiek; Bornscheuer, 2010).
Diversidade de enzimas
Enzimas de diferentes organismos so usadas para aplicao industrial,
tanto de sistema procaritico quanto de eucaritico. O primeiro abrange
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 321
famlias gram-negativas e gram-positivas. J o segundo, inclui leveduras e
fungos, assim como clulas de mamferos e insetos, cujas enzimas so usa-
das em produtos biofarmacuticos (Aehle, 2004).
Para vrios casos envolvendo explorao de novas enzimas ocorre o es-
tudo das estirpes para produzir enzimas de interesse, fato conciliado com a
variedade de microrganismos existentes. Como exemplo, a bactria Bacillus
licheniformis, que secreta naturalmente protease alcalina, foi selecionada
para produzir uma das primeiras enzimas comerciais, Subtilisin Carlsberg,
para uso em detergentes. Vrias outras estirpes produtoras de altos nveis
de protease tambm foram selecionadas para aplicao industrial (ibidem).
Do fungo Trichoderma foi descoberto um complexo enzimtico de celu-
lase cida que capaz de decompor substrato de celulose em glicose, e esta
aplicao est sendo utilizada no tratamento de matrias txteis. Estudos
constantes com este complexo enzimtico so realizados a fim de verificar
o potencial para degradao de celulose, e assim como para outros sistemas
j descritos, novas estirpes so isoladas (ibidem).
Nestes exemplos, os microrganismos podem ser vistos como sistemas
metablicos que convertem substratos em massa celular e bioprodutos, e
as enzimas atuam nestes sistemas a fim de catalisar diferentes reaes (ibi-
dem). Cada clula possui mecanismos regulatrios que atuam na sntese
e atividade enzimtica, permitindo clula responder adequadamente a
mudanas ambientais.
O processo bsico de sntese enzimtica envolve transcrio, traduo e
processos ps-traducionais, este em organismos eucariticos. Vrias dife-
renas existem entre as vrias classes de organismos, principalmente en tre
os procariontes e eucariontes. As enzimas diferem enormemente entre si
quanto massa celular, nmero de cadeias polipeptdicas, ponto isoeltrico
e grau de glicosilao. E esta variedade na produo de enzimas ocorre entre
as diferentes espcies (ibidem).
Classificao enzimtica
Na dcada de 1950, houve um crescimento rpido no nmero de enzi-
mas conhecidas e a nomenclatura ficou inapropriada e confusa para abran-
g-las. Assim, para algumas enzimas que desempenham diferentes reaes,
o nome frequentemente mencionava pouco ou quase nada sobre a natureza
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322 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
da reao catalisada, alm do que nomes similares foram dados a enzimas de
tipos completamente diferentes.
Tendo em vista esta situao, no terceiro Congresso Internacional de
Bioqumica, em Bruxelas em 1955, a Unio Internacional de Bioqumica
e Biologia Molecular (IUBMB) decidiu criar o Comit Internacional de
Enzimas (Enzyme Committee E. C.), sob orientao da Unio Interna-
cional de Qumica Pura e Aplicada (IUPAC). Por esta razo, cada enzima
recebe ento uma nomenclatura no formato EC X.Y.W.Z.
Como princpios gerais da nomenclatura, o primeiro consiste que a ter-
minao ase deve ser usada em enzimas nicas e no deve ser aplicada em
sistemas que usam mais de uma enzima. Portanto, quando desejar nomear
um sistema em funo da reao total catalisada por ele, a palavra sistema
deve ser includa no nome. O segundo princpio menciona que as enzimas
devem ser nomeadas e classificadas de acordo com as reaes que catalisam.
Isto se refere a mudanas qumicas resultantes da atuao da enzima e que
so representadas em equaes qumicas, normalmente o mecanismo de ao
e os cofatores intermedirios no so includos no nome. Assim, a enzima
no pode ser sistematicamente nomeada at que as propriedades da catli-
se sejam identificadas. Quanto ao terceiro princpio geral, adota-se que as
enzimas devem ser divididas em grupos com base no tipo de reao que ca-
talisam, em funo do substrato, que a base para a classificao individual
da enzima. Isso fornece base para a classificao em nmeros (cdigos), de
acordo com o Comit Internacional de Enzimas (E. C.).
Em 1961, este Comit sugeriu a classificao das enzimas em seis clas-
ses, usando os nmeros (cdigos) com o prefixo E. C. seguido de quatro
nmeros separados por pontos, que representam:
1. O primeiro nmero indica qual das seis classes a enzima pertence;
2. O segundo indica qual a subclasse;
3. O terceiro indica a sub-subclasse;
4. O quarto especfico reao que a enzima catalisa.
As seis classes propostas so:
1
Classe 1. Oxidorredutases: esta classe compreende todas as enzimas
que catalisam reaes de oxirreduo, ou seja, reaes de transferncia
1 Mais informaes sobre a classificao enzimtica esto disponveis em <http://www.
chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/>, que propicia dados constantemente atualizados.
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 323
de eltrons. O nome recomendado dehidrogenase sempre que poss-
vel, no entanto, redutase pode ser tambm utilizado. Quando o O
2
o
aceptor da reduo usa-se oxidase.
Classe 2. Transferases: enzimas que transferem um grupo especfico
como metil, acil, amino, glicosil ou fosfato, de uma substncia para
outra.
Classe 3. Hidrolases: enzimas que hidrolisam ligaes C C, C O,
C N, e outras pontes incluindo fosfrico e anidrido. O nome siste-
mtico sempre inclui hidrolase.
Classe 4. Liases: enzimas que quebram ligaes C C, C O, C N
e outras pontes, atuando em duplas ligaes ou anis. Inversamente,
tambm adicionam grupos em duplas ligaes. O nome sistemtico
de acordo com o grupo substrato liase.
Classe 5. Isomerases: enzimas que catalisam mudanas geomtricas
ou estruturais em uma molcula. Dependendo do tipo de isomerismo
podem ser chamadas de racemases, epimerases, cis-trans-isomerases,
isomerases, tautomerases, mutases ou cicloisomerases.
Classe 6. Ligases: enzimas que catalisam a unio de duas molculas,
em conjunto com a ponte pirofosfato do ATP ou outro nucleosdeo.
At 1983, o nome recomendado era sintetase, no entanto, na recomen-
dao atual, o nome X - Y ligase, a fim de evitar confuso com o nome
sintase que no faz parte de enzimas da classe 6. O nome sistemtico
formado de acordo com X:Y ligase.
Enzimas lipolticas
As enzimas lipolticas esto atualmente atraindo enorme ateno por
causa de seu potencial biotecnolgico (Trevisan, 2004), como por exem-
plo, na indstria alimentcia e na rea dos detergentes e, recentemente, na
produo de biodiesel, por meio da transesterificao de gorduras, uma al-
ternativa do combustvel petrleo para os problemas ambientais (Kourist;
Brundiek; Bornscheuer, 2010).
A maioria das enzimas lipolticas industriais de origem microbiana,
bacteriana ou fngica. As lipases (EC 3.1.1.3) e esterases (EC 3.1.1.1) so
enzimas representantes da classe 3, que hidrolisam cadeia longa ( 10 to-
mos de carbono) e cadeia pequena (< 10 tomos de carbono).
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324 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Nos procariotos, as enzimas lipolticas podem ser classificadas em
oito famlias diferentes, de acordo com os pesquisadores Arpigny e Jaeger
(1999). Esta classificao est baseada nas sequncias conservadas, motivos
e propriedades biolgicas, denominadas: verdadeiras lipases, GDSL, lipase
hormnio-sensitiva (HSL) e as famlias III, V-VIII.
A famlia I (verdadeiras lipases) constituda de seis subfamlias, que
possuem em sua maioria a presena do pentapeptdeo conservado <Gly-
-Xaa-Ser-Xaa-Gly>. As subfamlias I.1 e I.2 da famlia I compartilham
homologia na posio de dois resduos de aspartato e dois de cistena, que
esto envolvidos na formao do stio de ligao ao Ca
+2
e pontes dissulfeto,
respectivamente. Por estes resduos estarem perto dos stios catalticos da
histidina e aspartato, acredita-se que eles estejam envolvidos na estabiliza-
o do centro ativo das enzimas (Figura 11.1).
Figura 11.1 Alinhamento de sequncias de aminocido de representantes da famlia I.
possvel verificar nos blocos conservados os stios catalticos (

).
A famlia II apresenta o motivo <Gly-Asp-Ser-(Leu)> sendo, por isso,
conhecida como famlia GDSL (Figura 11.2). Os membros da famlia III
possuem o dobramento regular alfa/beta hidrolase e a tpica trade catalti-
ca, alm de exibirem 20% de identidade com sequncias de aminocidos do
PAF-AH humano (Acetil-hidrolase do fator ativador de plaquetas).
Figura 11.2 Alinhamento de sequncias de aminocido de representantes da famlia II,
sendo possvel visualizar a presena do bloco conservado GDSL, caracterstico desta famlia.
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 325
A famlia IV apresenta similaridade com as Lipases Hormnio-Sensiti-
va de mamferos, sendo conhecidas como HSL. Nesta famlia, verifica-se o
stio conservado HGGG e logo aps, o pentapeptdeo GDSAG localizado
no N-terminal da protena (Figura 11.3).
Figura 11.3 Alinhamento de sequncias de aminocido de representantes da famlia IV.
Presena do bloco conservado HGGG e GDSAG; e da trade cataltica (

).
A famlia V possui membros com estruturas similares dehalogena-
ses, haloperoxidases e epoxide hidrolases, e folha alfa/beta hidrolase como
caracterstica da estrutura terciria. Nesta famlia, possvel verificar os
blocos conservados GXSMGG, PTLV e GH, que so caractersticos dos
membros desta famlia (Figura 11.4).
Figura 11.4 Alinhamento de sequncias de aminocido de representantes da famlia V.
Presena do bloco conservado GXSMGG e PTLV; e da trade cataltica (

).
As enzimas lipolticas da famlia VI esto entre as menores esterases co-
nhecidas, com massa molecular entre 23-26 kDa. O stio ativo destas enzi-
mas um dmero, e a subunidade possui dobramento alfa/beta hidrolase e
a clssica trade cataltica <Ser-Asp-His>.
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326 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Na famlia VII, grande parte das enzimas bacterianas divide homologia
com sequncias de aminocidos de acetilcolina esterases de eucariotos e
com carboxilesterases de intestino e fgado. J a famlia VIII constituda
por enzimas com 380 resduos de aminocidos, as quais compartilham si-
milaridade com vrias |-lactamases da classe C, sendo o motivo <Ser-Xaa-
-Xaa-Gly>. No entanto, para outros autores este motivo conservado que
as caracteriza outro, sendo necessrio mais informao sobre esta famlia.
Embora em 1999 tenha sido proposta esta classificao abrangente (Ar-
pigny; Jaeger, 1999), novas lipases e esterases esto sendo identificadas no
decorrer dos anos (Chu et al., 2008; Couto et al., 2010; Lee et al., 2004,
Ranjan et al., 2005, Rhee et al., 2005, Wu; Sun, 2009). Com o advento da
tecnologia do DNA recombinante e construo de complexas bibliotecas
metagenmicas, diferentes amostras ambientais esto sendo estudadas e,
consequentemente, novas enzimas lipolticas foram identificadas, como
por exemplo: a LipEH166 (Kim et al., 2009) e EstY (Wu; Sun, 2009). Se-
gundo pesquisadores da rea, a busca incessante por lipases e esterases em
diferentes ecossistemas ir aumentar a diversidade das enzimas lipolticas
e, provavelmente, o nmero de famlias (Ranjan et al., 2005).
Tipos de reao catalisada pelas lipases
Como mencionado anteriormente, as lipases (E. C. 3.1.1.3), denomina-
das lipases verdadeiras, esto dentro da classe 3 da classificao enzimtica
e catalisam a hidrlise total ou parcial de triacilglicerol para liberar diacilgli-
cerol, monoacilglicerol, cidos orgnicos e glicerol (Carvalho et al., 2003).
Elas possuem uma capacidade peculiar de atuar apenas na interface leo/
gua, o que exclui as enzimas que agem em steres solveis em gua (este-
rases) ou que hidrolisam outros lipdeos (acilidrolases, colesterolesterases,
tioesterases e outras).
A partir do estudo destas enzimas, foi comprovado que elas podem re-
verter a hidrlise do triacilglicerol no sentido da reao de esterificao, por
meio da quantidade de gua presente, portanto, a reao reversa (sntese)
tambm pode ocorrer quando h baixa concentrao de gua. Este conhe-
cimento tornou possvel o uso da lipase como biocatalisador da interesteri-
ficao de leos e gorduras, como consequncia, sua aplicao na produo
de biodiesel.
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 327
A reao de interesterificao traz alteraes na composio e distribui-
o dos cidos graxos da molcula de triacilglicerol e est relacionada com
a troca de radicais acil entre um ster e um cido (acidlise), um ster e um
lcool (alcolise), ou de um ster e outro ster, na forma de glicerdeos ou de
monoster, reao esta denominada de transesterificao por alguns autores.
Dentro deste contexto, as diferentes reaes desempenhadas pelas li-
pases so: hidrlise, esterificao e interesterificao (acidlise, alcolise e
glicerlise) (Figura 11.5).
Figura 11.5 Esquema representando as reaes catalisadas por lipases: hidrlise, esterifi-
cao e interesterificao.
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328 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Biodiesel
Estima-se que os recursos fsseis no renovveis usados como fonte
de energia sero suficientes apenas por um curto perodo de tempo. Alm
disso, emisses macias dos gases responsveis pelo efeito estufa por causa
da utilizao desses combustveis causam mudanas irreversveis no clima
global. Dessa forma, faz-se necessrio solucionar a dependncia ao petrleo
bruto e estabelecer uma alternativa, que pode ser baseada em energias reno-
vveis e matrias-primas abundantes, como a biomassa de vegetais (Rttig
et al., 2010). O mercado de biocombustveis representado pelo bioetanol
e biodiesel, utilizados para substituir os combustveis de primeira gerao,
gasolina e diesel, em larga escala.
A desvantagem associada produo do biodiesel est ligada a seu preo
final e a problemas ticos, como concorrncia com a produo mundial de
alimentos. Porm, existe uma compensao quando se utilizam matrias-
-primas de menor valor ou resduos, como leo de cozinha que seria des-
cartado. O biodiesel considerado extremamente competitivo em relao
ao combustvel derivado do petrleo, pois alm de ter qualidade similar
possui caractersticas vantajosas, como a dependncia de fontes renovveis,
muitas vezes domsticas, ser biodegradvel e emitir baixa concentrao de
poluentes (Knothe; Krahl; Gerpen, 2005).
Gorduras animais, leos descartados e resduos de gordura so alter-
nativas de substratos frente aos leos vegetais. No entanto, por conta do
alto grau de saturao que os cidos graxos de animais possuem, seus s-
teres no so recomendados para o uso em baixas temperaturas. Produtos
de descarte contm um alto ndice de cidos graxos livres, precisando de
um pr-tratamento para posterior aproveitamento. Outra possibilidade
a utilizao de cidos graxos formados como subprodutos da produo de
celulose (tall oil). A produo de uma tonelada de celulose resulta em 30 kg
a 40 kg desse leo, que contm uma mistura de cidos graxos (42%-55%),
resina (33%-47%), esteris e outros componentes. Este leo considerado
um dos leos mais baratos do mercado.
A substituio dos combustveis fsseis deve atender alguns requisitos
para que esta ao seja vantajosa e, em muitos aspectos, o biodiesel tem
se mostrado um excelente combustvel de segunda gerao. Ele menos
txico e mais facilmente degradado (Rttig et al., 2010). A composio do
diesel quimicamente mais complexa e sua biodegradao requer mais
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 329
energia. Finalmente, alguns compostos do diesel comum so txicos para
os microrganismos, o que contribui para uma menor biodegradabilidade.
leos vegetais e gordura animal despertaram interesse a partir de 1970,
por causa da crise de energia que ocorreu nessa dcada, sendo investigados
como fontes possveis de combustveis alternativos por Rudolf Diesel (1858-
1913). Como estes compostos apresentam elevada viscosidade em compara-
o aos combustveis derivados de petrleo, o que acarreta problemas aos
motores automotivos, quatro solues foram encontradas para resolver o
problema: microemulsificao, pirlise, diluio com combustveis conven-
cionais derivados de petrleo e transesterificao (Knothe; Krahl; Gerpen,
2005). A ltima a metodologia utilizada para a produo de biodiesel.
Reao de transesterificao
O biodiesel formado pela reao de transesterificao de leos vegetais ou
gordura animal, que possuem em sua composio principalmente triacilgli-
ceris, tambm denominados triglicerdeos. Nessa reao, os tria cilgliceris
reagem com lcool na presena de um catalisador, formando alquil steres
(biodiesel) e glicerol (Figura 11.6). A constituio do produto corresponde ao
tipo de triacilglicerol utilizado na reao, mas os componentes mais comuns
so cido palmtico (C16:0), cido esterico (C18:0), cido oleico (C18:1),
cido linoleico (C18:2) e cido linolnico (C18:3) em diferentes propores
(Rttig et al., 2010).
Figura 11.6 Esquema da reao de transesterificao. R uma mistura de vrias cadeias
de cidos graxos.
Fonte: Knothe; Gerpen; Krahl, 2004.
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330 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Os produtos mais comuns so os metil steres, visto que o metanol o
lcool com menor custo em diversos pases. No Brasil, no entanto, o etanol
utilizado mais frequentemente, por ser o lcool menos oneroso em sua
produo em funo da fermentao da cana-de-acar, resultando em etil
steres. Estes, por sua vez, possuem numerosas vantagens em comparao
aos metil steres, desde sua eficincia at sua taxa reduzida de emisso de
poluentes. Porm, o desempenho mximo de ambos menor em compa-
rao com o combustvel de origem fssil (Knothe; Krahl; Gerpen, 2005).
A reao de transesterificao ocorre por catlise cida ou bsica. Co-
mumente, a forma bsica a mais utilizada por ser um processo mais rpi-
do de catlise, menos corrosiva e tem uma taxa de eficincia 4 mil vezes
maior. Porm, a principal dificuldade relacionada catlise bsica a sa-
ponificao que ocorre quando esto presentes gua e cidos graxos livres
na amostra (Rttig et al., 2010). Para que a reao ocorra resultando em
mxima produo, o lcool precisa ser puro, e o leo utilizado deve conter
uma porcentagem menor que 0,5% de cidos graxos livres.
O rendimento final da formao de etil steres no influenciado pelo
tipo de lcool, mas lcoois de cadeias mais longas so mais solveis em leo e
permitem que sejam utilizadas altas temperaturas, acelerando a velocidade
de reao. O mesmo no ocorre com relao proporo entre lcool e leo.
Para deslocar o equilbrio no sentido da formao do produto, a relao mo-
lar ideal de 3:1 para catlise bsica e at 30:1 na catlise cida. Parmetros
de temperatura foram estabelecidos, sendo 60C, em uma proporo de
6:1 de lcool: leo, para o metanol, 75C para o etanol e 114C para o buta-
nol, nesta mesma proporo (Knothe; Krahl; Gerpen, 2005).
Na reao de transesterificao, alcxidos em soluo com o lcool cor-
respondente impedem que ocorra a formao de gua e resultam na forma-
o de glicerol com maior pureza. Em princpio, a reao de transesterifica-
o reversvel, porm, para a produo de biodiesel, o mesmo no ocorre,
pois o glicerol formado no miscvel com o produto, resultando em um
sistema de duas fases.
Nessa reao, ocorre a formao de di e monoacilgliceris como produ-
tos intermedirios, que podem variar de acordo com as condies aplicadas.
A formao de glicerol a partir de triacilgliceris ocorre por etapas atravs
de di e monoacilgliceris, com uma molcula de alquil ster sendo formada
em cada passo. Sabe-se que diacilgliceris atingem mxima concentrao
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 331
antes dos monoacilgliceris, ento, no ltimo passo, a formao do glicerol
a partir deste ocorre mais rapidamente em relao a sua formao por dia-
cilgliceris. A adio de solventes pode acelerar a reao, j que supera a
limitao envolvendo a miscibilidade do lcool com o leo ou gordura uti-
lizada. Outras alternativas para acelerar o processo envolvem a utilizao
de micro-ondas ou irradiao ultrassnica (Knothe; Krahl; Gerpen, 2005).
Os processos qumicos descritos acima englobam a base da produo
industrial de biodiesel, que est intimamente relacionada com sua qualida-
de. As etapas realizadas para refinar a matria-prima utilizada determinam
se o combustvel atingir as especificaes para sua aplicao industrial.
Embora catalisadores qumicos sejam relativamente baratos e ofeream
elevada taxa de reao, estes compostos apresentam inconvenientes, como
consumo de energia, necessidade de neutralizao do catalisador e vrias
etapas de purificao final por causa da complicada remoo do catalisador
e do glicerol. Alm disso, a catlise alcalina industrial exige alta qualidade
de reagentes, matrias-primas ausentes de gua e cidos graxos livres (Bi-
sen et al., 2010). Entretanto, outra forma vivel de produo de biodiesel
realizada pela catlise enzimtica, que possui vantagens em relao ao m-
todo qumico, visto que menos prejudicial ao ambiente e resulta em um
produto com elevada pureza.
Tabela 11.1 Propriedade dos lcoois contendo de 1 a 4 carbonos.
Frmula
Peso
molecular
Temperatura de
ebulio (C)
Temperatura
de fuso (C)
Metanol CH
3
OH 32,042 65 -93,9
Etanol C
2
H
5
OH 46,069 78,5 -117,3
1-Propanol CH
2
OH-CH
2
-CH
3
60,096 97,4 -126,5
2-Propanol
(iso-Propanol)
CH
3
-CHOH-CH
3
60,096 82,4 -89,5
1-Butanol
(n-Butanol)
CH
3
-CH
2
-CH
2
-CH
2
-
OH
74,123 117,2 -89,5
2-Butanol CH
3
-CHOH-CH
2
-CH
3
74,123 99,5
2-Metil-1-Propanol
(iso-butanol)
CH
2
OH-CH-CH
2
-CH
3
|
CH
3
74,123 108
2-Metil-2-propanol CH
3
-CHOH-CH
3
|
CH
3
74,123 82,3 25,5
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332 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Transesterificao por enzimas
A transesterificao realizada por enzimas permite o uso de leos e gor-
duras com menor qualidade, isto , contendo cidos graxos livres (o que
facilita a separao do produto), utiliza condies moderadas de reao;
no necessita de grande quantidade de lcool, levando a um menor gasto
de energia e custos de produo reduzidos. Atualmente, este processo
quase exclusivamente feito em escala laboratorial e suas principais desvan-
tagens so o elevado custo das enzimas e sua possvel inativao por lcoois
de cadeia curta, como metanol, ou outros componentes do leo (Bisen et
al., 2010).
A produo de biodiesel pela catlise enzimtica depende, do mesmo
modo que a catlise qumica, de fatores como temperatura, relao taxa de
lcool: leo e teor de gua na reao. No entanto, neste caso, outros fatores
influenciam o processo de reao, como o tipo de lcool, o uso de solventes
e as propriedades das enzimas utilizadas (Rttig et al., 2010). Essa reao
realizada pelas lipases, anteriormente descritas neste captulo.
Para a produo deste combustvel, podem ser utilizadas tanto lipases em
sua forma livre como imobilizadas. Embora os custos do processo de prepa-
ro das lipases livres sejam reduzidos, o custo da produo do biodiesel au-
menta, pois as enzimas no podem ser reutilizadas. Alm disso, elas exigem
longo tempo de reao para atingir rendimentos elevados. Por outro lado, a
imobilizao das enzimas tem um efeito estabilizador sobre ela, e permite
a aplicao no sistema de elevadas temperaturas, que levam a uma taxa de
converso mais rpida e com menor tempo de reao (Bisen et al., 2010).
Entre as vantagens do uso de lipases na produo de biodiesel (ibidem)
esto:
possibilidade de regenerao e reutilizao dos resduos imobilizados,
j que eles podem ser mantidos no reator sem sofrer alteraes;
utilizao de enzimas em reatores, o que permite seu uso em alta con-
centrao e contribui para uma ativao das lipases por maior perodo
de tempo;
maior estabilidade trmica da enzima, por estar em seu estado nativo;
a imobilizao de lipases as protege do solvente que pode ser necess-
rio para a reao;
a separao do produto facilitada ao utilizar este biocatalisador.
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 333
As lipases mais frequentemente utilizadas so isoladas de microrganis-
mos do gnero Candida, como C. rugosa e C. antarctica. Diferentemente
da catlise qumica, que geralmente ocorre em temperaturas ligeiramente
abaixo do ponto de ebulio do lcool (> 60C), a temperatura ideal para
a catlise enzimtica depende da lipase utilizada, mas , geralmente, entre
30C e 45C (Rttig et al., 2010).
Quase todos os tipos de lcool podem ser usados, embora lcoois de
cadeia curta, como o metanol (Tabela 11.1) possam inativar a lipase. Esta
inativao atribuda baixa solubilidade dos lcoois de cadeia curta no
leo ou gordura. Dessa forma, o metanol menos adequado do que o etanol
tambm para a catlise enzimtica (Bisen et al., 2010, Rttig et al., 2010).
Embora a produo com lcoois de cadeia longas seja geralmente maior,
o rendimento de alquil steres depende da especificidade do substrato da
lipase utilizada. Algumas lipases tambm so capazes de agir com presena
de at 20% de gua.
Alm das enzimas em sua forma purificada ou imobilizada, pode ser
aplicada toda a clula atuando como biocatalisador, o que reduz significa-
tivamente os custos, uma vez que no so necessrios isolamento, purifica-
o e imobilizao da lipase. Esse tipo de imobilizao de toda a clula no
s permite seu uso por repetidas vezes, mas tambm aumenta a atividade
especfica da lipase intracelular de quatro a sete vezes (Bisen et al., 2010).
Tcnicas de Engenharia Gentica, envolvendo a produo de protenas
podem ser teis para melhorar a eficincia cataltica de lipases. O uso da
tecnologia do DNA recombinante para produzir grandes quantidades de li-
pases e a utilizao das enzimas ou clulas imobilizadas so uma abordagem
para estimular a produo de biodiesel. Alm disso, a transesterificao en-
zimtica considerada melhor para o ambiente, e precisa ser explorada para
a produo industrial deste biocombustvel.
Apesar de inmeras lipases serem usadas atualmente, muitas vezes os
biocatalisadores precisam ser mais bem estudados para mostrar a especi-
ficidade desejada, estabilidade, propriedades operacionais, entre outras
caractersticas. A criao de enzimas consideradas personalizadas para
uma reao de interesse, mtodos clssicos, como variao de solventes e
metodologias de imobilizao so complementados com o uso de mtodos
da engenharia de protenas (Kourist; Brundiek; Bornscheuer, 2010). Adi-
cionalmente, o isolamento eficaz de novas lipases obtidas pela abordagem
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334 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
metagenmica pode ser um caminho para a obteno de enzimas mais efi-
cientes na produo do biodiesel.
Metagenoma e lipases
A metagenmica uma abordagem recente e que tem possibilitado a
descoberta de uma infinidade de novas enzimas, como por exemplo, as di-
versas enzimas lipolticas que puderam ser isoladas de diferentes fontes,
como a gua de lagoas, sedimento marinho, microflora do rmen de bovi-
nos, do solo, entre outros.
Elend e colaboradores (2006) isolaram, entre vrias esterases, uma lipa-
se ativa em baixas temperaturas oriunda de uma biblioteca metagenmica
de solo contaminado com leo. A lipase foi purificada e teve alta similari-
dade com lipase de Pseudomonas fluorescens. Outra lipase ativa em baixas
temperaturas foi isolada de uma amostra de sedimento marinho por Jeon
e colaboradores (2009). A enzima encontrada possuiu similaridade muito
baixa com protenas caracterizadas at a data, com exceo de uma lipase de
um microrganismo no cultivado.
Dentro deste contexto, no Laboratrio de Bioqumica de Microrganis-
mos e Plantas, da Unesp de Jaboticabal, foram prospectados genes para a
codificao de enzimas lipolticas em 4,5 mil clones de uma biblioteca me-
tagenmica fosmidial construda a partir de DNA de um consrcio micro-
biano degradador de leo diesel. A seleo foi feita pela atividade lipoltica
por meio do cultivo dos clones em placa de petri, contendo o meio Luria-
-Bertani (LB) suplementado de 1% de tributirina (v/v), 1% de goma arbica
(p/v), 0,00125% de cloranfenicol (v/v) e 0,001% arabinose (v/v). As clulas
ficaram em cultivo a 37C por 48 horas e depois foram transferidas a 4C.
A avaliao foi realizada pela observao de um de halo ao redor da colnia,
sendo positiva para 30 clones dentre os quais trs se destacaram (Figura
11.7). Estes trs clones que apresentaram halos maiores foram seleciona-
dos, e tiveram seu DNA subclonado em vetor pUC19.
Os DNAs das sub-bibliotecas foram sequenciados no ABI 3100 (Ap-
plied Biosystems), gerando um contig completo para cada clone, que foram
comparados com as sequncias do genbank hospedadas no banco National
Center for Biotechnology Information (NCBI), por meio do programa
ORF Finder. Uma ORF de 322 aminocidos com 76% de identidade para
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 335
uma possvel esterase/lipase foi identificada em um dos contigs analisa-
dos. Por outro lado, quatro ORFs relacionadas a esterase/lipase puderam
ser identificadas no segundo clone analisado, dentre as quais uma alcan-
ou 58% de identidade com uma possvel esterase/lipase de bactria no
cultivvel. No terceiro contig, foi encontrada outra ORF codificadora de
esterase/lipase de 303 aminocidos e 61% de identidade com microrganis-
mo no cultivvel. Foram feitos alinhamentos com o programa Clustal W e
construo de rvores filogenticas pelo MEGA 4.0.2, mtodo de neighbor-
-joining com mil bootstrap, para comparao entre as ORFs encontradas e
sequncias depositadas. As rvores indicam que o primeiro clone apresenta
a ORF similar famlia IV das enzimas lipolticas; o segundo possui trs
ORFs pertencentes famlia V e uma famlia IV; e o terceiro apresenta
uma ORF similar famlia IV; no entanto, esta ORF est localizada em
um ramo nico, diferenciando-se dos outros representantes desta famlia.
Figura 11.7 Anlise in vitro em placa de petri dos 30 clones da biblioteca metagenmica,
previamente selecionados, em meio LB suplementado com 1% de tributirina (v/v); 1% de
goma arbica (p/v); 0,001% de arabinose (v/v); 0,00125% de cloranfenicol (v/v); e 0,001%
de Rhodamine-B (v/v). A Clone Pl17.E10; B Clone Pl32.D09; C Clone PL28.H10;
D Controle negativo.
Fonte: Pereira, 2011 (modificado).
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336 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Atravs dos alinhamentos, foi possvel identificar os stios ativos represen-
tativos de cada famlia, confirmando o resultado das rvores filogenticas.
Quando a mesma anlise foi realizada com sequncias j patenteadas,
algumas ORFs mostraram baixa similaridade com sequncias pertencentes
Bayer Chemicals, Monsanto e BASF, fato este concordante com a anlise
do dendrograma, no qual possvel verificar o isolamento em ramos das
ORFs identificadas neste estudo (Figura 11.8).
Tais descobertas enfatizam que a abordagem metagenmica oferece
acesso s enzimas que, dificilmente, estariam disponveis por meio das tc-
nicas tradicionais de cultivo, tornando possvel a busca e compreenso de
novas enzimas assim como o estudo da diversidade gentica de microrga-
nismos em determinado ambiente.
Figura 11.8 Dendrograma do agrupamento hierrquico baseado nas 11 sequncias paten-
teadas e extradas do NCBI, com as ORFs encontradas nos clones Pl17.E10 e Pl32.D09.
Construo da rvore filogentica pelo MEGA 4.0.2, mtodo neighbor-joining com mil
bootstrap.
Fonte: Maester, 2011; Pereira, 2011 (modificado).
Biodiesel no Brasil
Em 2008, a produo global de biodiesel foi de 12,2 milhes de tonela-
das, sendo 7,7 milhes produzidos na Europa, dos quais 2,8 milhes somen-
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UTILIZAO DE ENZIMAS LIPOLTICAS NA PRODUO DE BIODIESEL 337
te na Alemanha. No Brasil, a entrada do biodiesel no mercado nacional vai
gerar uma expressiva economia reduzindo as importaes do diesel de pe-
trleo, alm de contribuir para a preservao do meio ambiente. Esse com-
bustvel substitui total ou parcialmente o diesel de petrleo em motores de
caminhes, tratores e automveis e tambm pode ser utilizado para gerao
de energia e calor. Pode ser usado puro ou misturado ao diesel em diversas
propores. A mistura de 2% de biodiesel ao diesel de petrleo chamada de
B2 e assim sucessivamente, at o biodiesel puro, denominado B100.
De acordo com Governo Federal, o Brasil importa, atualmente, 10% do
diesel que consome. Este, por seu uso em transportes de cargas e passagei-
ros, o combustvel mais utilizado no pas (57,7% dos combustveis lqui-
dos), o que representa um consumo anual de 38,2 bilhes de litros. Segundo
dados da ANP (Agncia Nacional de Petrleo), aproximadamente 45% da
energia e 18% dos combustveis consumidos no Brasil j so renovveis e,
no restante do mundo, 86% da energia vm de fontes energticas no reno-
vveis. Desde 1 de janeiro de 2010, o leo diesel comercializado em todo
o Brasil contm 5% de biodiesel. Esta regra foi estabelecida pela Resoluo
n 6/2009 do Conselho Nacional de Poltica Energtica (CNPE), que au-
mentou de 4% para 5% o percentual obrigatrio de mistura de biodiesel ao
leo diesel.
O Brasil rene condies ideais para tornar-se um grande produtor
mundial de biodiesel, pois dispe de extensas reas agricultveis, parte de-
las no propcias ao cultivo de gneros alimentcios, mas com solo e clima
favorveis ao plantio de inmeras oleaginosas. Pode ser produzido a partir
de gorduras animais ou de leos vegetais, existindo dezenas de espcies ve-
getais no pas que podem ser utilizadas, tais como mamona, dend (palma),
girassol, babau, amendoim, pinho manso, soja, dentre outras. Dessa for-
ma, estudar as formas de obteno do biodiesel, envolvendo aspectos ticos
e favorveis para o meio ambiente contribuir com a economia e desenvol-
vimento do pas.
Perspectivas
Muitos desafios precisam ser transpostos na tecnologia atual de produ-
o de biodiesel e estes incluem o desenvolvimento de catalisadores melho-
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res e mais baratos, resultando em produtos de alta qualidade, utilizao de
solventes no fsseis e a converso dos subprodutos, como o glicerol, em
produtos teis.
O custo de produo do biodiesel pela catlise enzimtica o princi-
pal obstculo para a comercializao deste produto. Vrias tentativas tm
sido feitas para desenvolver sistemas de baixo custo usando as ferramentas
da tecnologia do DNA recombinante. possvel aumentar a eficincia das
lipases por meio da caracterizao enzimtica e Engenharia de Protenas
(Kourist; Brundiek; Bornscheuer, 2010).
Resultados obtidos pelo grupo do Laboratrio de Bioqumica de Mi-
crorganismos e Plantas, da Unesp de Jaboticabal, so promissores nesta
busca por novos biocatalisadores. Aps a caracterizao das ORFs encon-
tradas ser possvel inferir se resultaro em enzimas lipolticas com elevada
especificidade com o substrato, se possuem estereoespecificidade e termo-
estabilidade suficientes para beneficiar a produo de biodiesel e reduzir os
custos de todo o processo.
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12
Estressores biticos em cana-de-acar:
reflexos quali-quantitativos na matria-prima
e no processamento industrial
Mrcia Justino Rossini Mutton, Miguel Angelo Mutton,
Leonardo Lucas Madaleno, Jos Antonio de Souza Rossato Jnior,
Eduardo Rossini Guimares, Gisele Cristina Ravaneli,
Maria Ins Tiraboschi Ferro, Odair Aparecido Fernandes
Introduo
A cana-de-acar (Saccharum spp.) uma planta C
4
e apresenta uma
das maiores eficincias fotossintticas encontradas em culturas agrcolas
(Cock, 2003) e potencial geneticamente favorvel para acmulo de acares
na forma de sacarose (Mutton, 2008). Quanto habilidade para transfor-
mar e fixar energia, verifica-se que, para a cana-de-acar, a relao entre a
energia consumida e a energia produzida da ordem de 1:8, enquanto para
a cultura do milho a relao de 1:1,4 e para a beterraba de 1:2,5.
Encontra-se amplamente distribuda entre os pases tropicais e subtro-
picais, ocupando 1% de rea entre as 18 culturas mais cultivadas (Leff et al.,
2004). Os pases que cultivam a cana-de-acar produziram 1,66 bilho de
toneladas de colmos e o Brasil participou com 40,4% deste total numa rea
de 8.514.370 ha no ano de 2009 (Faostat, 2011).
A cana-de-acar ocupa atualmente 8,4 milhes de hectares ou aproxi-
madamente 2% da terra agricultvel do Brasil (394 milhes de ha). O pas
apresenta a regio Centro-Sul como principal produtora de matria-prima
para a indstria sucroenergtica, sendo que a produo do estado de So Pau-
lo representa 61% da produo nacional (Unica, 2011). Em mdia, a produ-
tividade anual brasileira est entre 70 a 80 t/ha, enquanto que, para o estado
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342 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
de So Paulo, principal produtor (21% da produo mundial), os valores so
de 80 t/ha a 85 t/ha (Conab, 2011).
A cana-de-acar vem passando, nos ltimos anos, por mudanas pro-
fundas de mbito tecnolgico e social, para adaptar-se s demandas de pro-
duo com alta produtividade, competitividade, respeito ao meio ambiente
e sustentabilidade. O aumento da rea colhida mecanicamente e a restrio
queima da cana-de-acar tm ocasionado mudanas significativas no
manejo dessa cultura (Almeida et al., 2004).
Esta mudana no sistema de produo ocorreu especialmente por causa
do aspecto da preservao do meio ambiente para atender legislao am-
biental. Alm disso, h outras vantagens do sistema de colheita denomina-
do cana crua, tais como: proteo do solo contra eroso, reduo dos custos
com os tratos culturais (menor incidncia de plantas daninhas), maior lon-
gevidade da cultura e ainda a possibilidade de aproveitamento energtico
da palha (Souza et al., 2005).
No sistema de colheita mecnica da cana-de-acar, a quantidade de
palha que deixa de ser queimada e depositada sobre o solo pode variar
de 10 a 20 t/ha de massa seca, em funo da variedade, estdio fenolgico
e da produtividade agrcola. Essa mudana no manejo da colheita teve re-
flexos imediatos nas caractersticas do agroecossistema da cana-de-acar,
resultando em alteraes no perfil da entomofauna, principalmente no que
se refere composio das diferentes espcies de pragas e respectivas den-
sidades populacionais (Garcia; Sverzut Jnior, 2008). Alm deste aspecto,
a expanso da cultura para novas reas e a no utilizao de cuidados fi-
tossanitrios adequados na implementao e nos tratos culturais propor-
cionaram condies para a expanso da rea de ocorrncia e de danos de
algumas pragas.
Estressores biticos e fisiologia da planta
O conceito de estresse como fenmeno surpreendentemente recente.
Originalmente, o termo estresse foi associado ao conceito mecnico em que
uma fora aplicada a um corpo. A seguir, o conceito de estresse foi aplica-
do aos seres humanos e definido como resposta a vrias condies fsicas e
fisiolgicas (Seyle, 1973). Neste mesmo contexto, o estresse de uma planta
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 343
est envolvido por uma reao adversa aos fatores do ambiente, podendo
ser bitico e/ou abitico (Higley et al., 1993).
A produtividade da cana-de-acar regulada por diversos fatores de
produo, dentre os quais se destacam: o potencial gentico da variedade, o
ambiente de produo (solo e clima), as prticas culturais adotadas, a quali-
dade da colheita, incluindo a qualidade da matria-prima e o controle fitos-
sanitrio de patgenos, plantas invasoras e insetos-pragas. Vrios insetos-
-pragas podem estar presentes no sistema de produo de cana-de-acar,
atacando o sistema radicular ou a parte area da planta. Dentre estes, des-
tacam-se trs importantes estressores biticos: a broca-do-colmo, Diatraea
saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), a cigarrinha-das-razes, Mahanarva
fimbriolata (Hemiptera: Cercopidae) e o bicudo-da-cana, Sphenophorus levis
(Coleoptera: Curculionidae).
A broca-do-colmo e a cigarrinha-das-razes esto presentes em todas as
regies de produo de cana-de-acar do pas. A primeira uma praga
que ataca as plantas de cana-de-acar durante todo o desenvolvimento da
cultura em qualquer poca do ano e pode apresentar quatro a cinco gera-
es por ano. O adulto uma mariposa com as asas anteriores de colora-
o amarelo-palha. As posturas se assemelham a escamas de peixe e so
realizadas geralmente na face adaxial das folhas da cana-de-acar ou em
outras plantas hospedeiras. A longevidade dos adultos de dois a nove
dias. Neste perodo, a fmea pode ovipositar de 300 a 600 ovos, os quais
invariavelmente, esto agrupados em massas imbricadas contendo de 5 a
50 ovos cada uma. A durao do perodo embrionrio de 4 a 12 dias. De
colorao branco-amarelada e cabea marrom-escura, a lagarta pode atingir
at 2,5cm de comprimento e a fase larval tem durao entre 20 e 79 dias.
Este inseto, na forma jovem, responsvel pelo estresse s plantas, uma vez
que as larvas de primeiro instar iniciam a alimentao no parnquima das
folhas. No segundo ou terceiro instar realizam injria na planta por meio
da construo de galerias ascendentes no interior dos colmos (Figura 12.1).
O ataque da broca-do-colmo pode causar a morte da gema apical e con-
sequente secamento de folhas novas (sintoma conhecido como corao-
-morto), enraizamento areo, brotao das gemas laterais, encurtamento
dos entrens e perda de peso. As galerias construdas pela praga tambm
podem ser colonizadas por microrganismos oportunistas (Colletotrichum
falcatum e Fusarium moniliforme) que podem potencializar os prejuzos
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344 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
causados, caracterizando o chamado complexo broca-podrido. Estes mi-
crorganismos causam a inverso da sacarose armazenada na planta. Esse
processo afeta consideravelmente a qualidade da matria-prima e dos pro-
dutos obtidos, uma vez que interfere na cristalizao do acar, promoven-
do a contaminao do caldo e causando perdas da eficincia industrial (Ga-
gliumi, 1973; Parra, 1993).
Outro estressor bitico extremamente relevante nos sistemas de produ-
o de cana-de-acar a cigarrinha-das-razes (M. fimbriolata). Trata-se
Figura 12.1 A broca-do-colmo, Diatraea saccharalis, um importante estressor bitico,
abrindo orifcio de entrada no colmo para, posteriormente, perfurar galeria em cana-de-
-acar.
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 345
de inseto sugador, que, at a dcada de 1990, se mostrava de importncia
econmica restrita apenas a algumas regies do Nordeste brasileiro, sendo
praga secundria no Centro-Sul do Brasil (Mendona et al., 1996). Entre-
tanto, com o incio da mudana do sistema de colheita da cana-de-acar
sem a utilizao prvia de fogo para queima da palha (cana crua), a infesta-
o desta praga atingiu grande importncia. A prtica de colheita da cana
crua passou a deixar sobre o solo uma cobertura vegetal abundante, que
favorece a manuteno de alta umidade e menor oscilao de temperatura,
que so extremamente favorveis ao desenvolvimento da praga (ibidem;
Dinardo-Miranda et al., 2001a). Somado a isso, o controle fsico com o uso
do fogo que indiretamente destrua todos os estgios de desenvolvimento
da praga, especialmente os ovos em diapausa, passaram a no mais ocorrer
e, com isso, houve favorecimento do potencial bitico dessa praga.
Com potencial para injuriar as plantas de cana-de-acar em qualquer
estdio fenolgico, a cigarrinha-das-razes tem seu perodo de infestao
restrito estao chuvosa, haja vista a dependncia do inseto por nveis
elevados de umidade e temperatura. As fmeas do inseto realizam postura
no solo, na regio do colo da planta, nas proximidades dos perfilhos, em
nmero mdio de 50 a 80 ovos. O desenvolvimento embrionrio do inseto
ocorre em torno de 21 dias em condies de temperatura favorvel e alta
umidade no solo (Mendona et al., 1996). Desde a ecloso, as ninfas, que
passam por cinco ecdises, permanecem durante todo o perodo de desen-
volvimento alimentando-se no sistema radicular do hospedeiro (Stingel,
2005). As ninfas produzem espuma caracterstica (Figura 12.2) formada
de lquidos eliminados pelo nus que so formados pelo volume de seiva
sugado e de substncia muscilaginosa excretada pelas glndulas epidrmi-
cas do stimo e oitavo segmentos abdominais, denominadas glndulas de
Batelli.
A espuma protege a forma jovem do inseto contra dessecao (Gar-
cia, 2002) e inimigos naturais (Macedo et al., 1997). Ao alimentarem-se,
ocasionam desordem fisiolgica na planta em decorrncia do ato de sugar,
atingindo os vasos lenhosos da raiz, deteriorando-os e impedindo ou difi-
cultando o fluxo de gua e nutrientes. Isso constitui a fase mais prejudicial
da praga, e a necrose das razes permite a entrada de fungos patognicos na
planta (Macedo, 2005).
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346 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Os adultos apresentam longevidade de aproximadamente 20 dias (Gar-
cia; Sverzut Junior, 2008) e vivem sobre a parte area da planta sugando as
folhas ao mesmo tempo que injetam toxinas que produzem manchas longi-
tudinais. Esses adultos medem aproximadamente 12 mm de comprimento
e 5 mm a 6,5 mm de largura (Macedo, 2005; Stingel, 2005).
A magnitude dos danos provocados pelo ataque de cigarrinhas-das-ra-
zes varia com diversos fatores, entre os quais a poca de colheita da cultura e
a variedade cultivada (Dinardo-Miranda, 2008). Os danos provocados pela
praga sobre o crescimento da cana-de-acar podem ser observados quan-
do se verifica o aparecimento da praga e a cultura se encontra desenvolvida
Figura 12.2 Ninfas da cigarrinha-das-razes encontradas na base da planta e sempre envol-
vidas por espuma. No detalhe, a forma adulta do inseto.
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 347
e quando o canavial ainda est em incio de crescimento e ser colhido no
meio e final de safra (Dinardo-Miranda et al., 1999).
O ataque de ninfas e adultos de M. fimbriolata resulta em colmos me-
nores e mais finos (Dinardo-Miranda et al., 2000a), que leva a reduo do
teor de sacarose (Mendona et al., 1996). Segundo Dinardo-Miranda et al.
(2006a), reduo de 25% na produtividade foi observada para a variedade
SP80-1842 quando a praga no foi controlada. Alm da reduo da pro-
dutividade de colmos, quando em elevadas populaes, a planta atacada
apresenta menores teores de Brix e Pol do caldo e aumento do teor de fibra
dos colmos (Gonalves et al., 2003).
O outro inseto em importncia para a cultura da cana-de-acar, o
bicudo-da-cana (Sphenophorus levis) teve seu primeiro relato em cana-de-
acar no final da dcada de 1970, tendo sido detectado inicialmente em 14
municpios na regio de Piracicaba, SP (Precetti; Arrigoni, 1990). Ao longo
dos anos, S. levis migrou para regies em que no havia registros de sua pre-
sena, atingindo cerca de cinquenta municpios no ano de 2006. Nos trs
anos seguintes, atingiu uma centena de municpios, incluindo deteco nos
estados do Paran, Minas Gerais e Mato Grosso do Sul. Esse aumento da
praga na ltima dcada foi influenciado, principalmente, pela expanso da
rea cultivada de cana-de-acar, alm de uma diminuio no rigor da qua-
lidade fitossanitria das mudas transportadas para as novas reas de plan-
tio. As formas biolgicas do inseto acompanharam os colmos utilizados, o
que explica a rpida disseminao. O manejo de S. levis tem sido o desafio
nas reas de produo de cana-de-acar, pois se trata de praga de solo que
permanece protegida durante a maior parte do ciclo biolgico.
Os adultos possuem cerca de 10 mm a 15 mm de comprimento (Figura
12.3). As fmeas perfuram a base das plantas e realizam a postura endof-
tica, colocando de 60 a 70 ovos/fmea. No prazo de 7 a 12 dias, eclodem as
larvas, responsveis pela injria s plantas. As larvas escavam galerias no
interior dos caules subterrneos (rizomas), nos interndios basais e, aps
o perodo de 30 a 60 dias transformam-se em pupas no interior do colmo.
Aps 7 a 15 dias aparecem os adultos, que possuem longevidade em torno
de 200 dias (Precetti; Tern, 1983; Almeida et al., 2008).
A alimentao das larvas de S. levis causa diminuio na translocao
da seiva das plantas, originando sintomas de amarelecimento de folhas, po-
dendo evoluir para necrose, morte de perfilhos e at da touceira sob infesta-
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348 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
es severas. Como consequncia, verificam-se falhas na rebrota, diminui-
o na produtividade e possvel inviabilidade da manuteno do canavial
com baixa produtividade. Este fato pode provocar a reforma antecipada do
canavial, diminuindo a longevidade do ciclo de explorao da cultura, que
resulta em maiores custos de produo. Alm das perdas econmicas, esse
inseto-praga pode ocasionar perdas na qualidade da matria-prima, com
consequncias no rendimento industrial e na qualidade do acar e etanol
produzidos.
O conceito de que o rendimento de uma planta progressivamente re-
duzido por adversidades biticas e abiticas (estressores) amplamente co-
nhecido. No entanto, pouco se sabe sobre o que acontece entre a ao dos
estressores na planta e o rendimento (Peterson; Higley, 2001).
Figura 12.3 Cana-de-acar com sintoma tpico do ataque da larva de Sphenophorus levis.
No detalhe, os estgios da larva e adulto.
Foto: Enrico de Beni Arrigoni
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 349
Condies ambientais provavelmente influenciam o nmero de pragas
(e/ou comportamento), a resposta da planta ao ataque da praga, ou ambos
(Higley; Peterson, 1996). Isto ocorre porque os insetos-pragas e as culturas
so sistemas biolgicos independentes e os estressores externos (abiticos
ou biticos) tero influncia ou efeito em cada um, enfraquecendo ou forta-
lecendo uma posio biolgica.
A resposta de uma planta injria de um inseto-praga, ou seja, ao
de um estressor, dependente do estdio fenolgico em que se encontram
as plantas (Peterson et al., 1998) e do nmero de indivduos, ou seja, da po-
pulao de insetos-pragas que est atacando esta planta (Peterson; Higley,
2001). Partindo-se do princpio de que as plantas esto expostas aos fatores
biticos, um determinado estressor em potencial pode atuar isoladamen-
te ou em conjunto com outro estressor, numa ao combinada, perfazendo
uma interao de estressores. O significado cientfico do termo interao
o da dependncia de um fator sobre outro (Sokal; Rohlf, 1981). Nesta
perspectiva, qualquer fator que altera a resposta da planta frente a um es-
tressor representa uma interao. A resposta da planta ao ataque de dois ou
mais estressores combinados pode ser maior ou menor do que a soma das
respostas aos mesmos estressores quando estes ocorrerem individualmente
(Peterson: Higley, 2001).
Objetivando conhecer a resposta da cana-de-acar sob o ataque com-
binado de dois estressores biticos: broca-do-colmo e a cigarrinha-das-ra-
zes, estudos tm sido realizados. Neste contexto, a avaliao da capacidade
fotossinttica da planta se apresenta como importante ferramenta para elu-
cidar os mecanismos envolvidos durante o ataque destas pragas. A taxa fo-
tossinttica da cana-de-acar reduzida sob a presena e ao destes dois
estressores biticos, combinados ou isolados. Aps o final da infestao das
duas pragas, a taxa fotossinttica das plantas restabelecida (Grfico 12.1).
No caso especfico da broca-do-colmo, a formao de galerias decorren-
tes da alimentao do contedo interno do colmo pela praga pode causar
estresse na planta por causa da interrupo dos feixes vasculares. Segundo
Culy (2001), o impacto fisiolgico desta perturbao vascular na planta
similar aos efeitos do estresse hdrico, pois h reduo no transporte de gua
e de nutrientes para a expanso das folhas responsveis pela fotossntese.
Com isso, h diminuio no desenvolvimento e reduo do acmulo de
massa seca (Vaadia, 1985).
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350 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.1 Taxa fotossinttica das plantas de cana-de-acar sob ataque dos estresso-
res broca-do-colmo e cigarrinha-das-razes, isolados ou combinados. As letras maisculas
comparam pocas e as minsculas os tratamentos.
Fonte: Rossato Junior et al., 2010
As ninfas da cigarrinha-das-razes, ao sugarem os vasos condutores de
seiva, principalmente o xilema radicular, provocam fechamento desses va-
sos condutores de seiva e desencadeiam a morte de razes. Isso decorre tanto
pelo hbito alimentar como por danos mecnicos provocados pelo estilete
do inseto na alimentao (Garcia, et al., 2007). Como consequncia, ocorre
a reduo da taxa fotossinttica das plantas. Os insetos sugadores de seiva
das plantas, de um modo geral, podem remover tecidos vegetais e interrom-
per processos fisiolgicos normais das plantas (Haile, 2001). Pode ocorrer a
liberao de saliva rica em enzimas e aminocidos que auxiliam no processo
digestivo, porm de natureza txica para a planta, que resulta na morte de
tecidos radiculares, comumente conhecido por necrose (Fewkes, 1969).
A injria promovida pelo ataque de cigarrinha-das-razes resulta em
perda de rendimento por causa do impacto na fisiologia da planta, com a
reduo na fotossntese por unidade de rea foliar, e possvel interrupo
do fluxo de gua e seiva e/ou a diminuio da absoro de gua do solo.
Consequentemente, este tipo de injria pode reduzir o tamanho do dossel
das plantas, indiretamente, em funo de alteraes na fisiologia da planta
(Haile, 2001).
Dependendo do hbito alimentar do inseto, tem-se um determinado im-
pacto na fotossntese das plantas. No caso de insetos desfolhadores, comu-
mente no ocorre declnio na taxa fotossinttica das folhas remanescentes,
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 351
podendo, inclusive, levar a uma compensao, estimulando o crescimento
das plantas (Welter, 1993; Peterson; Higley, 1998), ou ser prejudicial s
mesmas resultando em reduo da rea foliar e do tecido remanescente
(Macedo et al., 2003). No entanto, para insetos sugadores com ataque res-
trito parte area das plantas, a injria e/ou remoo de clorofila, a taxa
de fotossntese pode ser reduzida (Youngman; Barnes, 1986; Welter, 1993).
Este mesmo prejuzo pode ser observado para o estressor bitico cigarrinha-
-das-razes em cana-de-acar, em que as ninfas atacam o sistema radicular
das plantas e prejudicam drasticamente a taxa fotossinttica das plantas.
Esse conhecimento da resposta fisiolgica das plantas aos estressores
fundamental para o entendimento dos mecanismos de perda de rendimen-
to. Embora a taxa fotossinttica das plantas se restabelea ao final das in-
festaes das pragas, no suficiente para compensar a perda sofrida sob os
estressores e acaba invariavelmente afetando negativamente os parmetros
biomtricos dos colmos (Rossato Junior et al., 2010).
As plantas atacadas por cigarrinha-das-razes, isoladamente ou associa-
da broca-do-colmo, sofreram redues de 10% e 8,9% no comprimento
e 7,2% e 5,6% no dimetro de colmos, respectivamente (Rossato Junior et
al., 2011). A alimentao das ninfas provoca a desidratao e desnutrio
dos colmos da cana-de-acar (Dinardo-Miranda, 2003). De modo seme-
lhante, a fotossntese contribui diretamente para o acmulo de biomassa da
planta, sendo que maiores taxas de fotossntese nas folhas resultaram em
maiores ganhos de produtividade (Haile, 2001). Desta forma, o ataque da
cigarrinha-das-razes influenciou negativamente no desenvolvimento da
planta, com reflexos diretos na produtividade da matria-prima. A redu-
o de produtividade de colmos pelo ataque da cigarrinha-das-razes foi de
17,6%, e pelo ataque da broca-do-colmo foi de 6,9%, enquanto a combina-
o dos dois estressores biticos resultou na reduo de 15,5% de colmos
(Rossato Junior et al., 2011).
Colmos desidratados e secos so comumente encontrados em reas de
cana-de-acar sob o estressor cigarrinha-das-razes (Figura 12.4). Esses
danos so considerados extremamente severos e so consequncia do re-
duzido armazenamento de acares nas folhas, provocado pela elevada de-
manda de gua e acares requeridos pela fase jovem do inseto (Mendona
et al., 1996).
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Figura 12.4 Colmo seco entre colmos aparentemente sadios em funo do ataque de ninfas
de cigarrinha-das-razes envolvidas pela espuma produzida.
Qualidade da matria-prima
A cana-de-acar manifesta a expresso de suas caractersticas gen-
ticas, durante seu desenvolvimento, em funo das condies ambientais
disponveis, tais como radiao solar, temperatura, umidade e fertilidade
dos solos. De acordo com Stupiello (1989), o conceito de cana-de-acar
com qualidade refere-se a colmos maduros, recm-cortados, sadios e livres
de impurezas. Entretanto, considerando-se as transformaes que esto
ocorrendo nos processos de corte-carregamento e transporte, atualmente
a conceituao de qualidade deve ser readequada agroindstria da cana.
Sob esta tica, a qualidade pode ser conceituada como convencional ou
motivadora. No conceito convencional, a matria-prima avaliada a par-
tir de caractersticas mnimas (Pol, Brix, Pureza, Fibra da cana, Umidade
do Bagao etc.) que possibilitem a melhoria e aproveitamento de recursos
disponveis, sem custos. Para o conceito motivador, a matria-prima deve
apresentar um conjunto de caractersticas que atendam ao processamento
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 353
sob dimenso mais ampla, estando diretamente ligada ao planejamento, in-
corporando servios e custos.
A qualidade motivadora a mais importante na busca de parmetros
que realmente contribuam para a melhoria da qualidade da matria-prima,
diminuindo custos, aumentando os rendimentos, as eficincias e, conse-
quentemente, a rentabilidade da empresa (Stupiello, 1993). Os parmetros
utilizados so de determinao mais complexa, entretanto possibilitam
diagnstico mais seguro da qualidade da matria-prima ou do estgio de
deteriorao. Dentre estes podem se destacar os teores de impurezas pre-
sentes na matria-prima, acidez voltil, acar total e chochamento.
A qualidade tecnolgica do caldo de cana avaliada pela composio,
que depende de fatores genticos e ambientais, dos tratos culturais, estgio
de maturao, sistema de colheita, processo de extrao do caldo, dentre
outros (Stupiello, 2001). A utilizao de matria-prima de qualidade favo-
rece o processamento rpido com elevado rendimento de acar. A situao
inversa tambm pode ser observada.
A incidncia de estresses biticos na cana-de-acar e seus efeitos sobre
a qualidade da matria-prima foram relatados em pesquisas realizadas por
Blumer (1992), avaliando matria-prima submetida ao ataque de D. sac-
charalis. Dinardo-Miranda et al. (1999), Gonalves et al. (2003) e Ravaneli
et al. (2006) verificaram comprometimento da matria-prima atacada por
M. fimbriolata.
Segundo Mutton (2003), em resposta ao ataque de insetos e patgenos
podem ocorrer reaes bioqumicas nas plantas, que desdobram os acares
produzindo lignina, polissacardeos e compostos fenlicos, com o objetivo
de proteg-las do estresse bitico. Taiz e Zeiger (2004) relatam que os com-
postos fenlicos so as mais importantes substncias de defesa produzidas
pelas plantas contra o ataque de pragas e doenas. Destacam ainda que os
principais compostos envolvidos com o mecanismo de resistncia planta-
-praga so os taninos, flavonoides, isoflavonoides e lignina. Bi et al. (1997)
citam o cido clorognico e a rutina como modelos de compostos fenlicos
utilizados em estudos envolvendo defesa anti-herbivoria em plantas.
Fontaniella et al. (2003) encontraram elevada quantidade dos cidos fe-
rlico, sirngico e clorognico em caldo de cana-de-acar infestado pela
sndrome da folha amarela (YLF). Phelps e Young (1996) enfatizam que
o cido ferlico e seus derivados conferem proteo s plantas contra o ata-
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354 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
que de insetos, fungos e vrus. Esses compostos podem influenciar negati-
vamente a qualidade da matria-prima uma vez que so responsveis pelo
escurecimento do caldo e produo de acar com maior cor (Godshall,
1999), ou ainda atuar como inibidor da fermentao alcolica, por meio da
inibio da atividade enzimtica das invertases (Polakovic et al., 1992).
Buscando avaliar os reflexos provocados pelo ataque de cigarrinha-das-
-razes sobre colmos de cana-de-acar, diversos estudos foram realizados,
evidenciando significativas redues na qualidade tecnolgica da cana. Es-
tudos de Ravaneli (2010) confirmaram que os valores de Brix, Pol, Pureza e
Acares Redutores Totais foram significativamente menores enquanto os
teores de Acares Redutores e Compostos fenlicos aumentaram sempre
que a cigarrinha-das-razes danificou as plantas (Grficos 12.2 e 12.3). Esse
comportamento ocorre tanto em funo do comprometimento do processo
fotossinttico, com reduo do acmulo de sacarose (Dinardo-Miranda et
al., 2000a; Gonalves et al., 2003; Ravaneli et al., 2006; Madaleno et al.,
2008), quanto ao consumo dos acares armazenados para produzir mol-
culas de defesa contra o ataque da praga.
Os compostos fenlicos podem influenciar negativamente a qualidade
da matria-prima destinada ao processamento industrial, uma vez que so
responsveis pelo escurecimento do caldo e produo de acar com maior
cor (Godshall, 1999), por atuar como inibidores da fermentao alcolica
(Polakovic et al., 1992), alm de comprometer a produo de etanol. Se-
melhantemente, Ravaneli et al. (2006) verificaram aumento significativo
nesses compostos quando os nveis de infestao de cigarrinha-das-razes
foi superior a duas ninfas/m. Resultados similares foram obtidos com
outras variedades de cana-de-acar, tais como IAC83-2396, RB825336
(Dinardo-Miranda et al., 2001a); IAC82-2045 (Gonalves et al., 2003) e
SP80-1816 (Ravaneli et al., 2006).
Redues significativas tambm foram verificadas para o pH do caldo
para os diversos nveis de danos (Grficos 12.4 e 12.5). Embora este par-
metro seja pouco sensvel para avaliar a deteriorao da cana, apresenta-se
mais representativo quando combinado a acidez total, voltil e cido ltico.
De modo semelhante, a dextrana e o manitol so compostos produzidos
por bactrias lticas, principalmente do gnero Leuconostoc, a partir do des-
dobramento da sacarose presente no caldo de cana (Eggleston, 2002; Eggles-
ton; Harper, 2006). Como produtos dessa degradao tambm se podem
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 355
citar o cido ltico e actico (Eggleston et al., 2004). Eggleston et al. (2007)
relatam que o manitol indicador de deteriorao mais sensvel que a dex-
trana e tambm pode ser produzido por outras espcies de bactrias lticas.
Grfico 12.2 Efeito dos danos causados por M. fimbriolata sobre parmetros tecnolgicos
da matria-prima em duas pocas de colheita na safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli, 2010
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356 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.3 Efeito dos danos causados por M. fimbriolata sobre parmetros tecnolgicos
da matria-prima nas duas pocas de colheita na safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli, 2010
Sob esse enfoque, o aumento da acidez do caldo indicativo de deterio-
rao microbiolgica, em decorrncia da contaminao bacteriana. Entre-
tanto, convm ressaltar que a relao entre nmero de bactrias e produo
de cidos pode no ser direta, uma vez que a produo desses compostos
ocorre em funo da concentrao e espcies de bactrias presentes no subs-
trato (Ventura, 2007).
O ataque de cigarrinha-das-razes provoca tambm aumento do teor de
fibra da cana, resultante do estresse hdrico causado pela ao sugadora do
inseto. Este efeito mais expressivo quando se utiliza o clculo da fibra por
meio da metodologia proposta por Tanimoto (1964) (Grfico 12.6).
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 357
Grfico 12.4 Efeito dos danos causados por M. fimbriolata sobre pH, acidez total, voltil e
cido ltico no caldo, nas duas pocas de colheita, safra 2007/08.
Fonte: Ravaneli, 2010
Grfico 12.5 Interao entre os fatores com nveis de infestao x pocas de colheita, para
pH do caldo, safra 2007/2008. Letras maisculas comparam nveis de danos dentro de po-
cas de colheita. Letras minsculas comparam pocas de colheita dentro de nveis de danos.
Fonte: Ravaneli, 2010
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358 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.6 Efeito dos danos causados por M. fimbriolata sobre a fibra da cana, nas duas
pocas de colheita, safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli, 2010
Reflexos sobre a produo de acar Fluxograma e
qualidade do acar
O processamento dos colmos de cana-de-acar para a produo de
acar atende a uma sequncia de operaes, denominada fluxograma
de produo. Os colmos maduros devem ser colhidos com os teores m-
ximos de sacarose. Aps o corte so transportados, pesados e avaliados
quanto aos parmetros de qualidade: Brix (teor de slidos solveis), Pol
(teor aparente de sacarose), teor de fibra e acares totais recuperveis
(ATR, kg/t). Os colmos acrescidos de impurezas, denominados matria-
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 359
-prima industrial, so encaminhados para o processo de extrao do caldo
por moendas ou difusores.
O caldo extrado direcionado ao processo de clarificao para retirada
das impurezas fsicas e qumicas, resultando no caldo clarificado com 16 a
18 Brix. A seguir, este encaminhado ao setor de evaporao, para retirada
de parte da gua do caldo num evaporador de mltiplo efeito, dando origem
ao xarope (soluo saturada de acar de concentrao 60-65 Brix).
O xarope ser encaminhado ao cozimento resultando em uma soluo
supersaturada de acar denominada massa cozida, que formada por uma
mistura de cristais e mel. O cozimento a etapa na qual so produzidos
os cristais, por diversos mtodos de nucleao, sendo o mais utilizado o de
sementes. Aps a etapa de cristalizao realiza-se a centrifugao da massa
cozida, para separar os cristais do mel residual.
Aps a centrifugao, o acar enviado aos processos finais de produ-
o que consistem na secagem, classificao, embalagem e armazenamento
do produto final. A qualidade do acar aferida por alguns parmetros de
qualidade que so realizados constantemente pela fbrica e que definem as
caractersticas do produto. Dentre esses se analisa a Pol, cor, cinzas, umida-
de, quantidade de amido e outros.
Clarificao do caldo de cana
Estudos realizados por Madaleno (2010), avaliando os efeitos dos danos
provocados pela cigarrinha-das-razes na cana-de-acar, sobre a clarifica-
o do caldo e reflexos sobre o acar produzido em duas pocas de colheita
da safra 2007/2008, evidenciaram que o aumento dos nveis de danos pro-
movidos pela cigarrinha-das-razes no afetou a turbidez, velocidade de de-
cantao e volume de clcio utilizado para clarificao do caldo. Entretanto,
quando se avaliou pocas (maio-junho e outubro da safra 2007/2008), ve-
rificou-se aumento na velocidade de decantao, no pH tratado, no volume
de clcio utilizado, no pH do caldo clarificado e na turbidez do caldo para a
segunda poca, pela melhor qualidade da matria-prima. O caldo de cana
apresentou reduo na acidez na colheita realizada em outubro, houve au-
mento na formao de coloides mais densos, que se precipitaram com maior
velocidade, proporcionando caldos com maior transparncia.
Naturalmente, o aumento dos cidos orgnicos ocorre da base para o
pice do colmo, onde h elevada atividade metablica pelo crescimento de
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360 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
tecidos imaturos, os quais decrescem quando a planta entra em estado de
maturao (Celestine-Myrtil-Marlin, 1990). A precipitao do fosfato
de clcio pode ser influenciada negativamente pela presena de elevada
quantidade do cido acontico, o qual possui preferncia pelo clcio dispo-
nvel em relao ao cido fosfrico (Pandey; Srinivasan, 1972), quando h
formao dos flocos primrios de decantao.
Qualidade do acar produzido
Estudos de Madaleno (2010) evidenciaram que o aumento dos danos
provocados pela cigarrinha-das-razes reduziu a qualidade do acar. Hou-
ve elevao da cor e do teor de compostos fenlicos totais, cinzas e umidade
dos cristais com a diminuio na qualidade da matria-prima que entrou no
processo de produo. Considerando-se as pocas de colheita dos colmos,
observou-se a maior cor, teor de fenis, cinzas, umidade e fator de seguran-
a quando os colmos eram processados em maio-junho, enquanto a Pol foi
maior na colheita de outubro. Esses resultados podem estar relacionados
com a melhor clarificao ocorrida na segunda poca quando o caldo apre-
sentava caractersticas que facilitaram este processo. A melhor remoo de
compostos fenlicos resultou em cristais de acar com menor colorao,
com teores de Pol mais elevados, resultando em produto final com melho-
res caractersticas, possibilitando maior preo de comercializao.
O aumento da cor pode estar relacionado com o incremento nos com-
postos fenlicos totais (Grfico 12.7). A etapa fundamental para a forma-
o de cor a partir dos compostos fenlicos a oxidao de monofenis para
difenis e de o-difenis para quinonas, pelas enzimas fenoloxidases, cujo
principal substrato o cido clorognico (Chen; Chou, 1993).
O processamento de colmos maduros na colheita realizada em outubro
resultou em menor cor do acar e reduzido teor de compostos fenlicos
totais em relao colheita de maio, medida que incrementaram os danos
promovidos pela praga. A clarificao em outubro removeu a maioria dos
fenis presentes no caldo. Em maio/junho, como a acidez do caldo estava
mais elevada, houve dificuldade para obter a formao de complexos coloi-
dais mais densos, o que deixou o caldo clarificado com turbidez mais elevada.
Os compostos fenlicos remanescentes, aps o cozimento, provavelmente
permaneceram includos no cristal de acar alterando negativamente a cor,
pois tornou-os mais escuros (Grficos 12.8 e 12.9 e Figura 12.5).
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 361
Grfico 12.7 Correlao entre a Cor do acar (ICUMSA 420nm) e o teor de compostos
fenlicos totais (mg kg
-1
) a partir de cana com danos promovidos pela cigarrinha-das-razes
em diferentes pocas de colheita, (safra 2007/2008).
Fonte: Madaleno, 2010
A clarificao do caldo na primeira poca no foi adequada quando se
utilizou colmos com 30% de danos (Madaleno, 2010). Foi observado au-
mento de 41% nos teores de compostos fenlicos no acar que, conse-
quentemente, elevaram a cor do produto final em 39%. Sendo esse acar
comercializado, sofreria reduo acentuada no preo em comparao ao
tratamento com 0% de danos. Segundo Chen e Chou (1993), os contratos
para comercializao penalizam o preo do acar em funo de aumento
de umidade, cinzas, dextrana e cor do produto.
Grfico 12.8 Variao no teor de Compostos fenlicos totais (mg kg
-1
) do acar produzido
em funo da percentagem de danos promovidos pela cigarrinha-das-razes, em duas pocas
de colheita (safra 2007/2008).
Fonte: Madaleno, 2010
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362 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.9 Variao na Cor do acar (ICUMSA 420nm) produzido em funo da
percentagem de danos promovidos pela cigarrinha-das-razes, em duas pocas de colheita
(safra 2007/2008).
Fonte: Madaleno, 2010
Figura 12.5 Cor do acar produzido em funo da percentagem de danos promovidos
pela cigarrinha-das-razes, em duas pocas de colheita (safra 2007/2008).
Fonte: Madaleno, 2010
A presena de maior nvel de danos de cigarrinha-das-razes resultou
na produo de cristal com maior teor de cinzas (Madaleno, 2010), sendo
esse efeito menor em outubro, em razo do melhor desempenho da clarifi-
cao do caldo nessa poca (Grfico 12.10). O teor de cinza elevado no a-
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 363
car VHP, que destinado ao refino, aumenta o efeito melassignico se seu
constituinte principal for o potssio, implicando em perda de sacarose no
mel final, porm, se a maior quantidade for de on clcio poder haver ten-
dncia de aumento de incrustaes nos aparelhos que realizam o cozimento
do acar refinado. A partir de 30% de danos nos colmos houve incremen-
to de 29% nas cinzas no acar da cana colhida em maio-junho (Grfico
12.10). Estas cinzas podem ser originadas de traos de fosfatos de clcio
e magnsio, slica, sesquixidos, Ca-organatos e outros, em suspenso no
caldo clarificado e no xarope (Chen; Chou, 1993). A maior acidez do caldo
extrado na primeira poca pode ter interferido negativamente na formao
e precipitao dos coloides, resultando em resduos do on Ca que perma-
neceram no caldo clarificado e, posteriormente, no acar.
Grfico 12.10 Variao para o teor de Cinzas (% m v
-1
) do acar produzido em funo da
percentagem de danos promovidos pela cigarrinha-das-razes, em duas pocas de colheita
(safra 2007/2008).
Fonte: Madaleno, 2010
Os danos promovidos pelas cigarrinha-das-razes em 30% resultaram em
aumento na umidade final do acar em 22% na poca maio-junho (Grfico
12.11). Entretanto, para o armazenamento tambm deve ser considerado o
teor de Pol nesse acar. A umidade o fator que determina a velocidade
de deteriorao do acar, principalmente no armazenamento do produto.
O aumento do teor de gua, que envolve os cristais de sacarose, pode ser
apropriado para o crescimento da contaminao microbiolgica. Sob estas
condies de armazenamento, os cristais apresentam aumento de cor, de
duas a trs vezes do que quando submetido a secagem (Chen; Chou, 1993).
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364 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Apesar da umidade do acar ter variado entre a composio de danos,
o fator de segurana permaneceu em valor mdio de 0,17 abaixo do exigido
para o armazenamento do acar, que de 0,25 para as indstrias brasilei-
ras. O fator de segurana utilizado pela indstria para determinar a rela-
o de no acares (no Pol) e a umidade no filme de mel que envolve os
cristais e no pode exceder um tero dos no Pol, sendo que nesses valores a
presso osmtica elevada e h inibio na propagao de microrganismos
que deterioram os cristais (ibidem).
Os teores de amido no acar no foram alterados pelos danos promovi-
dos pela cigarrinha-das-razes ou pelas pocas de colheita. Provavelmente,
esse polissacardeo, que responsvel pela diminuio da cristalizao no
xarope e perda na remoo de sacarose do mel, caracterize melhor as di-
ferenas entre variedades de cana-de-acar, como relatam Simioni et. al.
(2006), do que a alterao pelo aumento de danos nos colmos promovidos
por insetos.
Os resultados indicaram que o controle eficiente desse inseto, alm de
proporcionar maior produtividade ao canavial, pode facilitar a recupera-
o do acar produzido durante o processamento industrial, com refle-
xos positivos na qualidade do produto. A poca de colheita tambm deve
ser observada, pois o estdio de maturao da planta influi diretamente na
qualidade da clarificao, que, se no for realizada em condies adequadas
de amadurecimento, pode evidenciar os danos promovidos pelo inseto no
produto final.
Grfico 12.11 Variao no teor de Umidade (%) do acar produzido em funo da percen-
tagem de danos promovidos pela cigarrinha-das-razes, em duas pocas de colheita (safra
2007/2008).
Fonte: Madaleno, 2010
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 365
Reflexos sobre o processo fermentativo e produo
de etanol Caractersticas importantes para o processo
fermentativo
A fermentao alcolica a principal etapa do processo de produo de
lcool, pois nela o acar e outros componentes do mosto so transformados
em lcool etlico, gs carbnico e compostos secundrios. Participam desse
processo, alm da levedura, que o principal agente, outros microrganismos
que so introduzidos involuntariamente no sistema. Tais microrganismos so
indesejveis e responsveis pela reduo do rendimento alcolico e depre-
ciao na qualidade do produto final. Sendo um organismo vivo, a levedura
apresenta, para seu desempenho, certas exigncias que lhe permitem desen-
volver o metabolismo de maneira adequada e, consequentemente, a obteno
de produto final com caractersticas que atendam s exigncias do mercado
(Novaes, 1992).
As leveduras de panificao possuem baixa taxa de permanncia nas
fermentaes industriais (Basso et al., 1993). Sendo assim, a matria-prima
e as condies operacionais podem influenciar sensivelmente a estabilidade
e o desempenho das leveduras durante a fermentao. Mutton e Mutton
(2002) ressaltam a importncia do estudo do comportamento da microbiota
fermentativa frente ao mosto proveniente de cana danificada, uma vez que
a eficincia do processo fermentativo pode ser diretamente influenciada
pelos componentes do caldo. Alm da qualidade da matria-prima, outros
fatores afetam o processo fermentativo, tais como pH, acidez, temperatura,
concentrao de acares do meio, etanol, disponibilidade de nutrientes e
presena de microrganismos contaminantes.
As leveduras so clulas eucariticas altamente tolerantes s variaes do
pH do meio, sendo por isso denominadas acidfilas. Contudo, o pH ideal
para um eficiente desempenho fermentativo est na faixa de 4,0 a 4,5. A cor-
reo do pH importante tanto para a multiplicao como para o processo
fermentativo e, na prtica, feita com a aplicao de cido sulfrico (Ange-
lis, 1992). Chaves e Pvoa (1992) afirmam que a acidez natural verificada
no caldo de cana praticamente suficiente quando consideramos os valores
requeridos para a fermentao adequada. Embora algumas vezes o trata-
mento cido se mostre estressante para a levedura, esse fator reduz a multi-
plicao das bactrias minimizando a contaminao (Amorim et al., 1996).
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366 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Segundo Narendranath et al. (2001), os principais cidos encontrados
na fermentao alcolica so o actico e o ltico, inibidores do crescimento
das leveduras. O cido actico formado em pequenas quantidades na fer-
mentao, enquanto o cido ltico o principal metablito produzido pelas
bactrias lticas. A presena de cidos orgnicos, como o actico e ltico,
resultam em aumento no consumo de ATP pela levedura. Nessas condi-
es, parte do ATP que seria utilizado para crescimento ou fermentao
desviado para manuteno do pH interno.
Ao mesmo tempo, a temperatura ideal para o metabolismo das levedu-
ras durante a fermentao deve estar entre 28C e 34C. As temperatu-
ras inferiores a 30C-32C prolongam o tempo de fermentao, enquanto
temperaturas elevadas inibem o crescimento celular, especialmente na pre-
sena de elevados teores de etanol (Stupiello; Horii, 1981). De acordo com
Angelis (1992), sob temperaturas abaixo da faixa ideal, as leveduras gas-
tam mais energia para completar o ciclo celular, enquanto em temperaturas
muito elevadas, acima de 40C, a maioria deixa de se multiplicar, perde a
viabilidade, favorecendo o desenvolvimento de bactrias.
Segundo Stokes (1971), o etanol tem efeito inibidor sobre as leveduras,
paralisando o crescimento celular quando em concentraes relativamente
baixas e a fermentao quando em concentraes mais elevadas. Halls-
worth (1998) relata que concentraes de etanol prximas a 5% limitam o
crescimento e as atividades metablicas das leveduras, afetando o controle
osmtico, induzindo o estresse hdrico.
A concentrao de acares pode afetar tanto a produo da biomassa
celular da levedura como o processo fermentativo (Angelis, 1992). Segun-
do Stupiello e Horii (1981), as clulas de leveduras em presena de teores
elevados de acares, mesmo na presena de oxignio, tm a respirao re-
primida e tendem a fermentar pela inibio da atividade de enzimas res-
piratrias e consequente inatividade das mitocndrias, no chamado efeito
Crabtree.
Elevadas concentraes de acares nos mostos resultam em elevados
teores alcolicos, podendo comprometer a viabilidade das clulas ou ainda
favorecer fermentaes lentas e incompletas, com formao de subprodu-
tos, reduzindo o rendimento alcolico e a viabilidade celular da levedura,
favorecendo as contaminaes (Angelis, 1992). Neste contexto, o preparo
do mosto, a concentrao de acar total deve ser compatvel com a na-
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 367
tureza e composio da matria-prima, levedura empregada e processo de
conduo da fermentao (Stupiello; Horii, 1981).
Do ponto de vista nutricional, o nitrognio, fsforo, potssio, enxofre,
magnsio, mangans, zinco e o clcio so elementos considerados funda-
mentais para as leveduras, considerando-se sua estrutura celular, o desdo-
bramento de acares e os processos metablicos vitais (Amorim, 1985). A
exigncia nutricional depende da concentrao desses elementos no meio,
estando diretamente ligados linhagem da levedura utilizada no processo.
O enxofre, potssio, mangans e cobalto so especialmente importantes por
facilitarem as atividades enzimticas (Amorim et al., 1996).
O caldo de cana constitui um timo substrato para o crescimento de
microrganismos, graas aos elevados teores de nutrientes, de gua, pH e
temperatura favorveis (Gallo, 1992). A presena de microrganismos con-
taminantes, carreados com a matria-prima do campo, por ocasio das ope-
raes de corte-carregamento-transporte e o processo de extrao podem
apresentar-se muito elevados, resultando em infeces da fermentao
(Stupiello; Horii, 1981).
Dentre os microrganismos responsveis pela reduo no rendimento
da fermentao alcolica destacam-se as bactrias pertencentes aos gne-
ros Acetobacter, Clostridium, Aerobacter, Streptococus (Amorim; Oliveira,
1982), Pseudomonas, Enterobacter, Klebsiella, Micrococcus, Arthrobacter,
Corynebacterium, Streptomices, Actinomyces, Leuconostoc, Bacillus e Lacto-
bacillus (Bevan; Bond, 1971) e os fungos (leveduras e bolores) como Saccha-
romyces, Torula, Pichia, Penicillium, Aspergillus, Cladosporium (ibidem) e
Candida (Cabrini; Gallo, 1999).
As bactrias deterioram rapidamente a cana colhida e provocam altera-
es desfavorveis s leveduras durante o processo fermentativo, tais como
floculao e perda do fermento, consumo de sacarose e outros nutrientes do
mosto, comprometendo o rendimento alcolico (Gallo, 1992).
Segundo Amorim e Oliveira (1982), bactrias do gnero Leuconostoc e
Bacillus quebram a sacarose, formando polmeros de alto peso molecular,
que so constitudos por resduos de glicose ou frutose. Estes polmeros
entopem trocadores de calor e canalizaes, aumentando a viscosidade do
vinho, entupindo as centrfugas. As bactrias do gnero Acetobacter e Glu-
conobacter oxidam o lcool etlico em cido actico, aumentando a acidez
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368 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
voltil e fixa nos vinhos. As dos gneros Lactobacillus, Leuconostoc, Lacto-
coccus e Pediococcus produzem grande quantidade de cido ltico a partir da
glicose, enquanto as do gnero Clostridium so responsveis pela formao
dos cidos butrico, frmico e actico (Yokoya, 1995).
Influncias sobre o mosto e processo fermentativo
Estudos realizados tm confirmado reduo significativa nos teores
de Acares Redutores Totais (ART) presentes no mosto com o aumen-
to de danos causados pela cigarrinha-das-razes (Tabela 12.1 e Grfico
12.12). Com relao s pocas de avaliao (maio/junho e outubro da safra
2007/2008), Ravaneli (2010) verificou aumento nos teores de ART e redu-
o da acidez total quando a colheita dos colmos foi realizada no final de safra.
Os compostos fenlicos atuam como inibidores do metabolismo das le-
veduras (Polakovic et al., 1992; Stupiello, 2002), refletindo em significati-
vas perdas no rendimento alcolico e alteraes na composio do destilado
(Ravaneli, 2005). Com o maior nvel de danos promovidos por M. fimbrio-
lata verificou-se discreto aumento nos compostos fenlicos totais no mosto
(Tabela 12.1), principalmente a partir de 30% de dano nos colmos. Estes
resultados corroboram observaes de Godshall (1999), relatando que o
processo de clarificao do caldo no remove o excesso dessas biomolcu-
las. Em muitas unidades produtoras para o preparo do mosto realizado
o processo de clarificao branda (at pH 6, no processo de caleagem) no
caldo, com o objetivo de retirar impurezas na matria-prima utilizada para
a produo do mosto.
Avaliao dos nutrientes do caldo e do mosto
Garcia et al. (2007) relataram que as ninfas da M. fimbriolata sugam
as razes da cana-de-acar afetando o xilema e o floema da planta. Gar-
cia (2009) observou que o ataque da praga no afetou as quantidades de
nutrientes absorvidos pela planta e presentes na massa seca do colmo, no
caldo e no mosto (Tabelas 12.2, 12.3 e 12.4). Verificou-se que grande parte
do fsforo, potssio, magnsio, clcio, mangans, ferro e zinco contidos na
massa seca, apenas o nitrognio e o enxofre foram exportados em maiores
quantidades para o caldo extrado.
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 369
Tabela 12.1 Resultado da anlise de varincia (teste de F) e comparao de mdias pelo teste de
Tukey (5% de probabilidade) para parmetros tecnolgicos do mosto: acares redutores totais
(ART), acidez total e compostos fenlicos totais
Causas de variao
ART Acidez total Comp. Fenlicos Totais
% gH
2
SO
4
/L g/mL
Nveis de danos (A)
0% 12,71A 1,39A 230,01A
15% 12,47A 1,36A 233,41A
30% 12,39AB 1,43A 249,74A
60% 11,94B 1,48A 254,52A
Teste F (A) 6,09** 1,16
ns
3,21*
DMS (Tukey) 0,48 0,17 24,79
pocas (B)
maio/junho 11,55B 1,73A 245,96A
Outubro 13,20A 1,10B 237,88A
Teste F (B) 164,61** 181,08** 1,44
ns
DMS (Tukey) 0,25 0,09 13,29
Teste F (A x B) 1,24
ns
0,39
ns
0,06
ns
CV (%) 5,71 17,94 15,19
Mdias seguidas de letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
ns = no significativo; * = significativo ao nvel de 5%; ** = significativo ao nvel de 1%
Fonte: Garcia, 2009
Grfico 12.12 Efeito dos danos causados por M. fimbriolata sobre os acares redutores
totais do mosto (%), nas duas pocas de colheita.
Fonte: Ravaneli, 2010
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O caldo extrado foi submetido ao processo de clarificao com a finali-
dade de remover impurezas; entretanto, constatou-se que houve remoo
de alguns nutrientes, como nitrognio, fsforo, mangans, ferro e zinco que
apresentaram menores quantidades no mosto (Tabelas 12.3 e 12.4), corro-
borando informaes de Amorim (2005). Os teores de magnsio e clcio
aumentaram em funo da utilizao de hidrxido de clcio na forma de
leite de cal para a clarificao, com a funo de corrigir o pH. Ocorreu tam-
bm aumento do enxofre como resultado do uso do cido sulfrico para
ajustar o pH do mosto.
Considerando-se que a clarificao remove nutrientes, deve-se reali-
zar suplementao de fsforo mangans e zinco no mosto a ser utilizado
para que o processo fermentativo seja otimizado. Stupiello e Horil (1981)
e Amorim (2005) recomendam valores entre 125 ppm a 150 ppm de P
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de 1 a 5 mg/L de mangans e zinco no mosto.
As quantidades de nutrientes presentes nos colmos, no caldo e no mos-
to, no final da safra, foram significativamente menores em relao ao do
incio da safra (Tabelas 12.2, 12.3 e 12.4). Entre o incio e o final da safra,
a cultura passou por um perodo de estresse hdrico, que interferiu na taxa
de absoro de gua e de nutrientes. Deve-se considerar ainda que a planta
apresentou consumo para manuteno de suas atividades fisiolgicas.
Comportamento microbiolgico
A microbiota presente no caldo apresenta caractersticas bastante va-
riadas, uma vez que a cana-de-acar abriga em seu ecossistema elevada
diversidade de microrganismos prprios, que constituem fonte natural de
contaminantes no momento em que as operaes de colheita e processa-
mento so realizadas. Segundo Mutton e Mutton (2002), o reflexo direto da
qualidade da matria-prima pode ser observado no processo fermentativo,
uma vez que diretamente afetado pelos componentes do caldo. Portanto,
de grande importncia o conhecimento do comportamento das leveduras
fermentadoras quando inoculadas em mosto proveniente de canas estressa-
das ou injuriadas.
Ravaneli (2005), estudando diferentes nveis de infestao de M. fim-
briolata, observou maior nmero de colnias de leveduras selvagens no
Miolo_Bioenergia_(GRAFICA).indd 373 07/12/2012 21:50:14
374 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
caldo e mosto com o aumento dos danos, o que tambm foi observado por
Ravaneli (2010), conforme Grfico 12.13.
No caldo foi observado aumento no nmero de colnias de bactrias l-
ticas com o aumento dos danos causados pela praga (Grfico 12.14). Este
resultado pode ser confirmado por meio do aumento na acidez voltil do
caldo, indicando que as bactrias presentes nos tratamentos com maiores
danos consumiram parte da sacarose presente, produzindo cidos org-
nicos. Pde-se observar que, apesar das fermentaes terem iniciado com
inculo prensado, houve o desenvolvimento de outras leveduras, em fun-
o da microbiota presente na cana.
Grfico 12.13 Contagem de colnias de leveduras no caldo e mosto nas duas pocas de
colheita, safra 2007/2008. (A) colheita de maio/junho; (B) colheita de outubro.
Fonte: Ravaneli, 2010
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 375
Grfico 12.14 Contagem de colnias de bactrias no caldo e mosto nas duas pocas de
colheita, safra 2007/2008. A: colheita de maio/junho; B: colheita de outubro.
Fonte: Ravaneli, 2010
A microbiota fermentadora foi influenciada diretamente pela presena
de biomolculas de defesa, tais como os compostos fenlicos. Segundo Ra-
vaneli (2010), estes so proporcionais ao aumento dos nveis de danos causa-
dos por M. fimbriolata, independentemente da poca de colheita realizada.
De modo semelhante, Ravaneli et al. (2011) observaram reduo da
viabilidade de brotos viveis das leveduras de 98,9% (na inoculao), para
93,4% aps 50 minutos de processo. Ao final da fermentao observou-se
reduo da viabilidade celular que foi proporcional ao nvel de dano so-
frido pela matria-prima (Grfico 12.15). A queda na viabilidade celular
est associada a diversos fatores, tais como disponibilidade de nutrientes
e presena de contaminantes, decorrentes da matria-prima deteriorada.
Resultados semelhantes foram observados em estudos desenvolvidos por
Gonalves (2003) e Ravaneli et al.(2006).
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376 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.15 Interao entre nveis de danos e pocas de colheita para viabilidade celular
de leveduras no final da fermentao. Letras maisculas comparam nveis de danos dentro
de pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de nveis de danos. Os resultados
correspondem s mdias de dez ciclos fermentativos.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
Deve-se considerar ainda que a conduo do processo fermentativo
realizada de modo contnuo, por ciclos sucessivos, com a reutilizao do
inculo. Quando a matria-prima empregada para a composio do mosto
est comprometida, verifica-se reduo da viabilidade celular no decorrer
dos ciclos fermentativos, tanto no incio quanto no final do processo (Gr-
ficos 12.16 e 12.17). A queda na viabilidade ao longo dos ciclos decorrente
do estresse acumulado pela levedura, em funo da presena das biomol-
culas inibidoras do processo fermentativo, tais como compostos fenlicos e
cidos, alm da presena dos contaminantes.
A porcentagem de clulas e brotos viveis durante a fermentao de
extrema importncia para a manuteno da populao de leveduras, sendo
o monitoramento peridico imprescindvel. Alm de metablitos indese-
jveis contidos na matria-prima, deve-se considerar ainda a presena de
compostos txicos s leveduras que so produzidos durante a fermentao
acarretando perdas da viabilidade, com consequente reduo da eficincia
industrial (Okolo et al., 1987). Ravaneli (2010) observou diferena sig-
nificativa na viabilidade de brotos para nveis de infestao no incio da
fermentao (t = 50 minutos), com tendncia similar no final do processo
(Grfico 12.18), e maior porcentagem de brotos viveis foi observado para
a colheita realizada no final de safra.
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 377
Grfico 12.16 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para viabilidade
celular de leveduras no incio da fermentao. Letras maisculas comparam ciclos fermenta-
tivos dentro de pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de ciclos fermentativos.
Os resultados correspondem s mdias dos quatro nveis de danos causados pela M. fimbrio-
lata, na safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
Grfico 12.17 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para viabilidade
celular de leveduras no final da fermentao. Letras maisculas comparam ciclos fermenta-
tivos dentro de pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de ciclos fermentativos.
Os resultados correspondem s mdias dos quatro nveis de danos causados pela M. fimbrio-
lata, na safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
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378 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.18 Interao entre nveis de danos e pocas de colheita para viabilidade de bro-
tos de leveduras no final da fermentao, na safra 2007/2008. Letras maisculas comparam
nveis de danos dentro de pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de nveis de
danos.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
De maneira geral, os maiores ndices de viabilidade celular e de brotos
de leveduras so observados no incio da fermentao. A reduo no nme-
ro de clulas vivas no final do processo est relacionada ao aumento na con-
centrao de metablitos como etanol, CO
2
e cidos e reduo na quanti-
dade de acar e nutrientes do substrato (Stokes, 1971; Hallsworth, 1998).
Considerando-se que as leveduras so reutilizadas em ciclos fermentativos
posteriores, de extrema importncia a presena de clulas e brotos viveis
ao final da fermentao para manter a porcentagem de fermento estvel na
dorna (Amorim et al., 1996).
Quanto presena de contaminantes, nas fermentaes verificou-se au-
mento significativo na concentrao de bactrias com a elevao dos nveis
de dano (Grfico 12.19), indicando que a qualidade da matria-prima em-
pregada no processo contribuiu para o incremento da populao de conta-
minantes na fermentao.
As bactrias contaminantes da fermentao alcolica competem com
as leveduras pelo mesmo substrato, consomem acares e etanol, produ-
zem cidos e gomas, diminuindo a viabilidade de leveduras e rendimen-
to do processo (Amorim; Oliveira, 1982). As bactrias lticas dos gneros
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 379
Lactobacillus e Leuconostoc so os principais contaminantes da fermentao
alcolica (Narendranath, 2003), sendo que Lactobacillus adaptada s con-
dies de fermentao, enquanto Leuconostoc mais sensvel ao etanol e ge-
ralmente no persiste por longo perodo no processo fermentativo (Oliva-
-Neto; Yokoya, 2001). As bactrias lticas tambm so responsveis pela
floculao das leveduras (Yokoya; Oliva-Neto, 1991), levando ao assenta-
mento das leveduras no fundo das dornas, o que dificulta a converso do
acar em etanol (Rose et al., 1980, citado por Ludwig et al., 2001).
Grfico 12.19 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para concentrao
de bactrias contaminantes no incio e final da fermentao. Letras maisculas comparam
ciclos fermentativos dentro de pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de ciclos
fermentativos. Os resultados correspondem s mdias dos quatro nveis de danos causados
pela M. fimbriolata, safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
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380 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Avaliao do vinho
O aumento da populao de bactrias contaminantes ao final da fermen-
tao resultou em reduo no pH dos vinhos (Grfico 12.20). Constatou-
-se tambm aumento dos Acares Redutores Residuais Totais nos vinhos,
quando houve maior comprometimento dos colmos pelo ataque da praga
(Grfico 12.21), em virtude de a matria-prima empregada apresentar ele-
vada acidez e maiores teores de compostos fenlicos. Ravaneli (2005) veri-
ficou interferncia destes compostos sobre o metabolismo das leveduras,
com redues de 7,2% no teor alcolico dos vinhos quando o nvel de infes-
tao da cigarrinha-das-razes era superior a 2,5 ninfas/m. De acordo com
Narendranath et al. (2001) e Polakovic et al. (1992), os compostos fenlicos
atuam como inibidores do metabolismo das leveduras, comprometendo o
processo de degradao dos acares e produo de etanol, aumentando o
tempo de fermentao, reduzindo o consumo de acares do mosto.
Grfico 12.20 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para pH dos vi-
nhos. Letras maisculas comparam ciclos fermentativos dentro de pocas. Letras minscu-
las comparam pocas dentro de ciclos fermentativos. Os resultados correspondem s mdias
dos quatro nveis de danos causados pela M. fimbriolata, safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 381
Grfico 12.21 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para acares redu-
tores residuais totais. Letras maisculas comparam ciclos fermentativos dentro de pocas.
Letras minsculas comparam pocas dentro de ciclos fermentativos. Os resultados corres-
pondem s mdias dos quatro nveis de danos causados pela M. fimbriolata, safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
Neste contexto, os resultados obtidos por Ravaneli (2010) para teor
alcolico e eficincia fermentativa (Grfico 12.22) indicam redues de
13,82% no teor alcolico dos vinhos e 8,4% na eficincia da fermentao
quando colmos com 60% de danos causados pelo ataque de cigarrinha-das-
-razes foram utilizados. Verificou-se ainda que as redues foram maiores
ao longo dos ciclos fermentativos, utilizando-se da mesma matria-prima,
sobretudo nos tratamentos com maior porcentagem de danos (Grficos
12.23, 12.24 e 12.25). Resultados semelhantes foram relatados por Gon-
alves (2003), destacando que menores danos na matria-prima proporcio-
nam maiores teores de acares, melhorando a eficincia fermentativa.
As fermentaes realizadas no incio da safra apresentaram menor teor
alcolico do vinho, embora com maior eficincia da fermentao (Grfico
12.22). Nessa poca, os colmos foram caracterizados com danos menos evi-
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382 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
denciados, menores nveis de contaminantes e maiores nveis de leveduras
selvagens e teores de compostos fenlicos. Sob estas condies o mosto ob-
tido continha os constituintes necessrios, possibilitando que as leveduras
metabolizassem maior quantidade de acar para produzir etanol.
Grfico 12.22 Efeito dos danos causados por M. fimbriolata sobre teor alcolico dos vinhos
e eficincia da fermentao nas duas pocas de colheita, safra 2007/2008. Os resultados cor-
respondem s mdias dos dez ciclos fermentativos.
Fonte: Ravaneli et al., 2011
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 383
Grfico 12.23 Interao entre nveis de danos e ciclos fermentativos para teor alcolico
dos vinhos. Letras maisculas comparam nveis de danos dentro de ciclos fermentativos.
Letras minsculas comparam ciclos fermentativos dentro de nveis de danos. Os resulta-
dos correspondem s mdias dos quatro nveis de danos causados pela M. fimbriolata, safra
2007/2008.
Fonte: Ravaneli, 2010
Grfico 12.24 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para teor alcolico
dos vinhos, safra 2007/2008. Letras maisculas comparam ciclos fermentativos dentro de
pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de ciclos fermentativos.
Fonte: Ravaneli, 2010
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384 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Considerando-se a realizao de ciclos fermentativos, as duas pocas
apresentaram comportamento semelhante (Grfico 12.25), reduzindo os
teores alcolicos medida que se reutilizou o fermento e mosto proveniente
de matria-prima danificada. Para a colheita realizada em final de safra, o
teor alcolico do vinho foi maior e a eficincia da fermentao foi menor,
confirmando que o comprometimento da matria-prima favoreceu a inibi-
o das leveduras, que apesar de terem apresentado maior viabilidade nessa
poca, no foram capazes de metabolizar parte dos acares para produzir
lcool.
Grfico 12.25 Interao entre nveis de danos e ciclos fermentativos para eficincia da
fermentao. Letras maisculas comparam nveis de danos dentro de ciclos fermentativos.
Letras minsculas comparam ciclos fermentativos dentro de nveis de danos. Os resultados
correspondem s mdias das duas pocas de colheita, safra 2007/2008.
Fonte: Ravaneli, 2010
Nem todo acar presente no mosto transformado em lcool e gs car-
bnico. Parte utilizada para a multiplicao do fermento na dorna, bem
como para a formao de carboidratos como a trealose e produtos secun-
drios, como glicerol, cidos, aldedos, steres, lcoois superiores, dentre
outros (Amorim, 2005).
Segundo Yokoya (1995), a formao de lcoois superiores maior quan-
do o fermento apresenta atividade fraca, ocasionando demora no proces-
so fermentativo. Os resultados obtidos por Ravaneli (2010) indicam que
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 385
no houve alteraes nas concentraes de acetaldedo, lcool isobutlico e
isoamlico nos destilados (Grficos 12.26, 12.27 e 12.28, respectivamente).
Considerando-se a formao dos lcoois superiores, este comportamento
pode ser decorrente do processo de clarificao do caldo, pela remoo dos
aminocidos, precursores desses compostos.
Grfico 12.26 Interao entre nveis de danos e pocas de colheita para acetaldedo nos
destilados, safra 2007/2008. Letras maisculas comparam nveis de danos dentro de pocas.
Letras minsculas comparam pocas dentro de nveis de danos.
Fonte: Ravaneli, 2010
Grfico 12.27 Interao entre nveis de danos e pocas de colheita para lcool isobutlico
nos destilados, safra 2007/2008. Letras maisculas comparam nveis de danos dentro de
pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de nveis de danos.
Fonte: Ravaneli, 2010
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386 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.28 Interao entre ciclos fermentativos e pocas de colheita para lcool isoa-
mlico nos destilados, safra 2007/2008. Letras maisculas comparam ciclos fermentativos
dentro de pocas. Letras minsculas comparam pocas dentro de ciclos fermentativos.
Fonte: Ravaneli, 2010
Quanto aos compostos secundrios formados durante a fermentao, o
glicerol o mais abundante. Sua formao decorrente da competio pela
utilizao do poder redutor do NADH na via de obteno do etanol, sendo
inversamente proporcional a sua produo (Amorim et al., 1996). A produ-
o de glicerol est relacionada ao tipo de levedura utilizada e ao ambiente
de fermentao (Amorim, 2005).
Resultados obtidos por Garcia (2009) no evidenciaram diferenas sig-
nificativas para produo de glicerol em relao aos nveis de danos, da
mesma forma, para os ciclos fermentativos (Grfico 12.29).
Nas leveduras do gnero Saccharomyces, a trealose acumulada durante
perodos de crescimento reduzido como, por exemplo, na falta de nitrog-
nio, enxofre e fsforo, assim como durante a fase estacionria de crescimen-
to em glicose (Lillie; Pringle, 1980; Franis et al., 1991).
A trealose um carboidrato de reserva produzido pelas leveduras prin-
cipalmente em situaes de estresses, garantindo reservas para sobrevivn-
cia (Alcarde; Basso, 1997). Quando se analisam os dados em funo dos
danos, verifica-se que no houve diferenas no acmulo de trealose em re-
lao aos nveis de comprometimento dos colmos (Grfico 12.29). Isso su-
gere que a cigarrinha-das-razes no induz a levedura a acumular trealose,
mas observando-se os valores obtidos com a anlise dos ciclos, nota-se que,
ao longo da reutilizao destes, a levedura acumula mais trealose tanto no
incio quanto no final da fermentao (Grfico 12.30).
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 387
Grfico 12.29 Teores de glicerol nos vinhos: nveis de danos, ciclos fermentativos e pocas,
safra 2007/2008. Mdias iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey (P0,05).
Fonte: Garcia, 2009
O estresse causado pela reciclagem do fermento juntamente com os com-
postos e metablitos liberados pelos processos promovem o acmulo deste
carboidrato na clula de levedura. Com relao a pocas, somente se obser-
vou resultado significativo no incio da fermentao na qual a primeira poca
de avaliao apresentou maior quantidade de trealose acumulada. Ao final do
processo fermentativo observou-se que a quantidade de trealose era menor,
pois o meio no qual se encontra a levedura est pobre em substratos, princi-
palmente os acares, ento esta mobiliza suas reservas (trealose) iniciando
a degradao do carboidrato de reserva. Esta degradao to maior quanto
maior for a temperatura e o teor alcolico do meio (Amorim et al., 1996).
Estudos avaliando a fermentao endgena de S. cereviseae demonstraram
a reduo nos valores de trealose quando a levedura foi exposta a meio com
altos teores alcolicos e temperaturas elevadas (Ferreira et al., 1999).
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388 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.30 Valores de trealose no incio e final da fermentao: nveis de danos, ciclos
fermentativos e pocas, safra 2007/2008. Mdias iguais no diferem entre si pelo teste de
Tukey (P=0,05).
Fonte: Garcia, 2009
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 389
A presena de contaminantes na matria-prima prejudica o processo
fermentativo pelo consumo de acares e nutrientes presentes no meio,
liberando compostos. Este fato pode estar relacionado com o acmulo de
trealose pela levedura em funo do estresse causado.
Identificao de genes relacionados resistncia varietal
O ataque de cigarrinha-das-razes reduz a produtividade de colmos e a
qualidade da cana, entretanto poucas pesquisas tm sido dedicadas inte-
rao pragacana-de-acar, alm da resistncia varietal de cana-de-acar
s cigarrinhas. Diversos estudos abordaram os controles qumico (Dinar-
do-Miranda et al., 2000b; 2001a; 2001b; 2002; 2006a), biolgico (idem,
2000b; Garcia et al., 2006) e cultural (idem, 2000b).
Guimares (2007) avaliou a resistncia varietal da cana-de-acar M.
fimbriolata em trs gentipos, dois dos quais j relatados como suscetveis
(Dinardo-Miranda et al., 1999; Dinardo-Miranda, 2004; Silva et al., 2005), e
um que tem apresentado baixos nveis de infestao no campo (Dinardo-Mi-
randa, 2003). Alm disso, comparou-se os perfis de expresso gnica de ge-
ntipos de cana-de-acar com diferentes reaes M. fimbriolata por meio
de um experimento de cDNA-AFLP. A identificao de genes envolvidos
na interao da cana-de-acar com a cigarrinha-das-razes pode permitir a
caracterizao de mecanismos de defesa que seriam teis ao desenvolvimen-
to de novas estratgias de controle e ao melhoramento gentico da cultura.
A durao da fase ninfal (Grfico 12.31A) foi significativamente maior
para a variedade SP83-5073. A literatura evidencia que a durao da fase
ninfal ou adulta maior em gentipos resistentes, possivelmente por meca-
nismos de antibiose ou deterrncia alimentar (Boia Jr. et al., 1999; Gervsio
et al., 1999; Caetano; Boia Jr., 2000; Suinaga et al., 2004). Os resultados
da taxa de mortalidade das ninfas (Grfico 12.31B) reforam essa hiptese,
uma vez que a variedade SP83-5073 apresentou mdias significativamente
maiores.
Diversas substncias txicas ou que causam deterrncia alimentar, tais
como inibidores de proteinase, compostos fenlicos e terpenos esto envol-
vidos nos mecanismos de defesa das plantas. Alguns desses compostos so
constitutivos, enquanto outros necessitam de estmulos externos para se-
rem produzidos (Buchanan et al., 2000).
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390 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Grfico 12.31 Taxa de mortalidade de ninfas e durao da fase ninfal em trs variedades. M-
dias seguidas por diferentes letras diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Fonte: Guimares, 2007
Frana et al. (2001) identificaram genes relacionados ao metabolismo
secundrio na cana-de-acar e o padro de expresso de enzimas regulat-
rias. Relataram que as vias de metabolismo de isopropanoides e fenilpropa-
noides foram ativadas em diferentes estgios de desenvolvimento, tecidos e
situaes de estresse.
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 391
As principais vias envolvidas na sntese de compostos de defesa so a
do cido chiqumico, responsvel pela produo de compostos fenlicos
e indiretamente pela produo de compostos secundrios nitrogenados,
a do cido mevalnico, produtora de alguns compostos fenlicos e ter-
penos, e a do metil-D-eritritol 4-P (MEP), produtora de terpenos (Taiz;
Zeiger, 2004).
A infestao de cigarrinhas afetou a massa seca e fresca de colmos, o di-
metro e altura de colmos (Tabelas 12.5 e 12.6; Grficos 12.32C e 12.32D).
Este resultado corrobora trabalhos anteriores (Dinardo-Miranda et al.,
1999; Dinardo-Miranda et al., 2002; De La Cruz Llanas et al., 2005; Di-
nardo-Miranda et al., 2006a) que relatam perdas significativas de produ-
tividade de colmos em cana-de-acar atacada por cigarrinhas. As ninfas
de cigarrinha-das-razes alimentam-se principalmente de seiva do xilema,
o que possivelmente resulta em deficincia hdrica e de nutrientes e con-
sequentemente, em distrbios metablicos generalizados (Fewkes, 1969;
Gallo et al., 2002; Dinardo-Miranda et al., 2004). Alm disso, sob dficit
hdrico, a taxa fotossinttica reduzida dramaticamente, comprometendo
o crescimento e desenvolvimento da planta (Taiz; Zeiger, 2004). Com a in-
festao, as plantas secam e morrem (Gallo et al., 2002).
A anlise de crescimento demonstrou diferenas varietais. As meno-
res mdias para massa fresca e altura de colmos foram encontrados na
variedade RB72454 e colmos mais finos foram encontrados na variedade
SP80-1816.
Todos os parmetros de crescimento apresentaram aumento ao longo
do tempo, que uma consequncia do crescimento das plantas. No foi
detectada variao no dimetro de colmos ao longo das pocas, provavel-
mente porque a primeira coleta foi realizada quando as plantas j tinham
quase 100 dias de idade. Embora no haja interao significativa entre a
infestao de M. fimbriolata e as pocas de coleta, a reduo na massa fresca
e seca de folhas aos 68 DAI pode ser por causa do estresse hdrico causado
pela alimentao das ninfas, limitando a taxa fotossinttica.
As menores mdias de massa fresca e seca de razes observadas na varie-
dade SP83-5073 (Tabelas 12.5 e 12.6) provavelmente no esto envolvidas
na maior durao da fase ninfal e taxa de mortalidade nessa variedade, uma
vez que, no momento da infestao, quando a massa fresca de razes era em
mdia 114 g, as ninfas foram capazes de alimentar-se e desenvolver-se.
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392 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Silva et al. (2005) demonstraram que as ninfas foram capazes de desen-
volver-se normalmente e produzir fortes sintomas em plantas mais jovens,
as quais provavelmente possuam menor massa de razes. Entretanto, a
existncia de diferenas morfolgicas nessa variedade que possa afetar
a alimentao de M. fimbriolata no pode ser descartada. Apesar das evi-
dncias de mecanismos de antibiose da SP83-5073 contra a cigarrinha-
-das-razes, pode existir uma combinao com a morfologia das razes que
refora a resistncia.
Tabela 12.5 Teste de Tukey para massa fresca (g) de colmos, folhas e razes e dimetro de colmos
(mm)
Causas da variao
Massa fresca (g)
Dimetro de colmos (mm)
Colmos Folhas Razes
V
a
r
i
e
d
a
d
e
s

(
V
)
1. SP80-1816 111,50 AB 58,53 A 191,37 A 15,64 B
2. RB72454 103,40 B 63,32 A 189,85 A 15,85 AB
3. SP83-5073 122,53 A 61,60 A 145,27 B 16,95 A
Teste F (V) 5,89
**
1,57
ns
7,16
**
4,11
*
DMS Tukey 5% 13,53 6,64 33,47 1,18
N

v
e
i
s

d
e

i
n
f
e
s
t
a

o

(
I
)
1. Testemunha 122,53 A 62,31 A 165,89 A 16,82 A
2. 10 ninfas por planta 102,42 B 59,98 A 185,11 A 15,48 B
Teste F (I) 19,40
**
1,08
ns
2,89
ns
11,25
**
DMS Tukey 5% 9,19 4,50 22,73 0,80

p
o
c
a
s

d
e

a
m
o
s
t
r
a
g
e
m

(
E
)
1. 8 DAI 51,37 C 58,24 BC 113,92 C 16,50 A
2. 17 DAI 111,30 B 69,44 A 124,60 C 16,45 A
3. 39 DAI 138,43 A 62,93 AB 176,99 B 15,60 A
4. 68 DAI 148,80 A 53,98 C 286,48 A 16,03 A
Teste F (E) 91,57
**
8,75
**
48,81
**
1,13
ns
DMS Tukey 5% 17,19 8,43 42,55 1,50
V x I 4,27
*
1,37
ns
0,69
ns
1,67
ns
V x E 6,31
**
0,81
ns
1,16
ns
2,69
*
I x E 13,09
**
1,15
ns
0,35
ns
5,69
**
V x I x E 4,25
**
0,25
ns
1,06
ns
1,08
ns
CV % 17,23 15,55 27,32 10,50
DAI = Dias aps a infestao; Letras maisculas comparam medias verticalmente pelo teste de Tukey;
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; ns = no significativo.
Fonte: Guimares, 2007
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 393
Tabela 12.6 Resultado e teste de Tukey para massa seca (g) de colmos, folhas e razes e altura
de colmos (cm)
Causas de variao
Massa seca (g)
Altura de Colmos (cm)
Colmos Folhas Razes
V
a
r
i
e
d
a
d
e
s

(
V
)
1. SP80-1816 12,83 A 14,35 A 47,61 A 69,31 A
2. RB72454 14,06 A 15,96 A 47,30 A 63,11 B
3. SP83-5073 12,67 A 14,47 A 33,75 B 73,33 A
Teste F (V) 0,95
ns
1,62
ns
6,42
**
9,99
**
DMS Tukey 5% 2,66 2,41 10,68 5,57
N

v
e
i
s

d
e

i
n
f
e
s
t
a

o

(
I
)
1. testemunha 14,66 A 16,11 A 41,47 A 71,81 A
2. 10 ninfas por planta 11,71 B 13,74 B 44,30 A 65,35 B
Teste F (I) 10,84
**
8,51
**
0,61
ns
11,83
**
DMS Tukey 5% 1,80 1,63 7,25 3,78

p
o
c
a
s

d
e

a
m
o
s
t
r
a
g
e
m

(
E
)
1. 8 DAI 5,87 C 15,96 A 40,55 B 58,15 C
2. 17 DAI 12,60 B 17,07 A 40,04 B 63,94 BC
3. 39 DAI 14,39 B 15,20 A 39,76 B 67,64 B
4. 68 DAI 19,89A 11,48 B 67,19 A 84,61 A
Teste (E) 41,54
**
8,88
**
24,87
**
36,60
**
DMS Tukey 5% 3,38 3,06 13,57 7,07
V x I 3,08
ns
3,62
*
0,08
ns
1,43
ns
V x E 1,29
ns
1,42
ns
1,99
ns
5,38
**
I x E 4,03
*
0,57
ns
0,29
ns
6,71
**
V x I x E 1,48
ns
0,91
ns
0,73
ns
3,19
*
CV (%) 28,86 23,10 35,66 11,63
DAI = Dias aps a infestao; Letras maisculas comparam medias verticalmente pelo teste de Tukey;
* = p < 0,05; ** = p < 0,01; ns = no significativo.
Fonte: Guimares, 2007
A menor massa fresca de colmos das variedades SP80-1816 e RB72454
pode ser decorrente do ataque da praga (Figura 12.37A), uma vez que es-
sas variedades j foram relatadas como suscetveis (Dinardo-Miranda et al.,
1999; Dinardo-Miranda, 2004; Silva et al., 2005). O Grfico 12.32A tambm
indica que o ataque de M. fimbriolata no teve efeito sobre a massa fresca de
colmos na variedade SP83-5073, corroborando os indcios de resistncia for-
necidos pela mortalidade de ninfas e durao da fase ninfal (Grfico 12.30).
Dinardo-Miranda (2004) relata que, em condies de campo, a varie-
dade RB72454 apresenta menor infestao que a SP80-1816. Essa menor
infestao pode ser devida a no preferncia da cigarrinha por esse gen-
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394 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
tipo. Experimentos com chance de escolha so necessrios para confirmar
essa hiptese.
O Grfico 12.32B mostra que a massa fresca da variedade SP83-5073
superou as demais ao longo do tempo quando submetida infestao de
M. fimbriolata, o que pode ser resultado de mecanismos de antibiose ou
morfologia de razes, que inibiram a alimentao e crescimento das ninfas.
Houve uma tendncia de diminuio da altura e dimetro de colmos na
SP80-1816 e RB72454 ao longo do tempo, provavelmente por causa da in-
festao de M. fimbriolata, enquanto o oposto foi observado para a SP83-
5073 (Grficos 12.33A e 12.33B), o que tambm caracteriza que essa varie-
dade resistente cigarrinha-das-razes.
Ao longo do tempo, a altura e dimetro de colmos foram significativa-
mente afetados pela praga, corroborando com os sintomas de desidratao,
colmos finos e chochos e morte da planta descritos por Macedo e Macedo
(2004) e Gallo et al. (2002).
Grfico 12.32 Massa fresca e seca de colmos. A Efeito dos nveis de infestao dentro de
variedades; B Efeito de variedades dentro das pocas; C, D Efeito dos nveis de infesta-
o dentro das pocas. Mdias seguidas por diferentes letras diferem entre si pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade. Letras maisculas comparam medias dentro dos tratamentos
e letras minsculas comparam mdias dentro de tratamentos.
Fonte: Guimares, 2007
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 395
Guimares (2007) utilizou cDNA-AFLP (Bachen et al., 1998), para
estudar a expresso gnica diferencial por sua simplicidade e custo relati-
vamente baixo, se comparada a microarranjos de cDNA. Das 64 combi-
naes possveis de iniciadores, utilizaram-se oito que apresentavam maior
polimorfismo para cana-de-acar em ensaios anteriores, das quais quatro
foram escolhidas (Tabela 12.7).
Grfico 12.33 Altura e dimetro de colmos. A, B Efeito da poca dentro de variedades;
C, D efeito dos nveis de infestao dentro de pocas. Letras maisculas comparam mdias
dentro dos tratamentos e letras minsculas comparam mdias entre os tratamentos.
Fonte: Guimares, 2007
Tabela 12.7 Combinaes de iniciadores selecionadas (LI-COR)
Combinao Iniciador MseI Iniciador marcado IRDye (TaqI)
I GAT GAG TCC TGA GTA ACA GAT GAG TCC TGA CCG AGA
II GAT GAG TCC TGA GTA ACT GAT GAG TCC TGA CCG AGA
III GAT GAG TCC TGA GTA AAC GAT GAG TCC TGA CCG AGT
IV GAT GAG TCC TGA GTA AAG GAT GAG TCC TGA CCG AGT
Fonte: Guimares, 2007
Poucos fragmentos diferencialmente expressos foram observados, mas,
na Figura 12.6, podem ser observadas bandas de aproximadamente 389 pb
que foram expressas no gentipo resistente (combinao de iniciadores I)
quando submetido infestao de cigarrinha (poos 5 e 6, setas vermelhas).
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396 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
Essas bandas foram expressas somente na variedade SP83-5073, 24 e 48
horas aps a infestao, o que indica que esses fragmentos podem estar en-
volvidos em mecanismos de defesa do gentipo resistente. Uma vez que
foram expressos pouco tempo aps a infestao, possvel que esses frag-
mentos codifiquem protenas relacionadas patognese. Essas protenas
esto relacionadas com mecanismos de interao planta-praga, e muitas
vezes produzem resposta de defesa na planta hospedeira.
Figura 12.6 Foto do gel de cDNA-AFLP (combinao de iniciadores I) mostrando
fragmentos (setas vermelhas) de 389 pb que foram diferencialmente expressos na variedade
SP83-5073 atacada pela cigarrinha-das-razes aos 24 e 48 horas aps a infestao.
Descrio: 1 SP80-1816 antes da infestao; 2 SP80-1816 1 dia aps a infestao (teste-
munha); 3 SP80-1816 1 dia aps a infestao (infestada); 4 SP83-5073 antes da infesta-
o; 5 SP83-5073 1 dia aps a infestao (infestada); 6 SP83-5073 2 dias aps a infestao
(infestada).
Fonte: Guimares, 2007
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 397
Parece improvvel que o fragmento de aproximadamente 389 pb identi-
ficado neste experimento seja um falso positivo, uma vez que duas plantas
foram utilizadas para cada condio, e cada reao foi corrida ao menos oito
vezes para confirmar a expresso. Entretanto, outros estudos so necess-
rios para confirmar/validar este resultado.
Em funo dos fortes indcios de resistncia observados na anlise de
crescimento, mortalidade do inseto e longevidade de ninfas, h a possibili-
dade de que este fragmento possa de fato estar envolvido com a resistncia
gentica, ainda que outros mecanismos possam estar envolvidos na resis-
tncia como, por exemplo, a morfologia das razes.
A sequncia de nucleotdeos do fragmento poderia fornecer alguma in-
formao sobre a provvel funo da protena codificada pelo mesmo, visto
que foi proveniente de sequncia gnica expressa (cDNA). Quando 96 clo-
nes recombinantes provenientes da ligao do fragmento isolado do gel de
agarose foram clonados e sequenciados, obtiveram-se 93 sequncias vlidas
(de boa qualidade), as quais foram ento analisadas por meio do programa
phredPhrap aps a remoo das sequncias do vetor e as sequncias Fasta
foram clusterizadas pelo programa crossmatch. O resultado da clusteriza-
o foi a obteno de 2 Contigs, um com duas sequncias e contendo 363
nucleotdeos (Contig1 Figura 12.7) e outro com 91 sequncias e contendo
355 nucleotdeos (Contig2 Figura 12.8). Aps o alinhamento das sequn-
cias consenso dos dois Contigs usando o programa Clustalw,
1
verificou-
-se que os dois Contigs apresentaram homologia total de 71%, sendo que
a homologia nas pores 3 e 5 de 100%, estando a diferena na poro
intermediria (Figura 12.9). Portanto, parece tratar-se de duas isoformas, e
a do Contig2 predominante (91 sequncias versus 2).
Aps utilizar a ferramenta Blastn do banco de dados do NCBI e fazer
pesquisa contra o banco de sequncias EST (dbEST) utilizando-se das
sequncias apresentadas nas Figuras 12.7 e 12.8, verificou-se que as mes-
mas apresentam alta homologia com sequncias de outras espcies vegetais
associadas com mecanismos de defesa e associao simbitica.
O primeiro hit (e-28) foi com uma sequncia de cDNA encontrada
em uma cultivar de soja, Sinpaldalkong 2, e que estaria relacionado com a
via de transduo de sinais relacionada simbiose de plantas de soja com
1 Ver: <http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html>
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398 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
bactrias do gnero Rhizobium nas razes (Lestari et al., 2006). possvel
que, na presente pesquisa, o fragmento encontrado tenha algum papel na
interao da cana-de-acar com a cigarrinha-das-razes, talvez no reco-
nhecimento da praga pela planta.
O segundo hit (e-27) foi uma sequncia de cDNA encontrada em
plantas de arroz submetidas a estresse por frio. Apesar de o trabalho ainda
no ter sido publicado, os responsveis pelo depsito da sequncia (Morsy
Figura 12.7 Sequncia Fasta consenso do Contig1, o qual composto por 2 sequncias. A
sequncia sombreada em amarelo foi utilizada nas anlises feitas com a ferramenta Blast do
NCBI. As letras minsculas representam bases sem qualidade.
Fonte: Guimares, 2007
Figura 12.8 Sequncia Fasta consenso do Contig2, o qual composto por 91 sequncias. A
sequncia sombreada em amarelo foi utilizada nas anlises feitas com a ferramenta Blast do
NCBI. As letras minsculas representam bases sem qualidade.
Fonte: Guimares, 2007
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ESTRESSORES BITICOS EM CANA-DE-ACAR 399
et al., University of Arkansas) relatam que a sequncia semelhante a uma
quitinase da classe III presente em Sphenostylis stenocarpa. A quitinase est
relacionada resistncia de plantas a pragas e algumas doenas, uma vez que
degrada o exoesqueleto de insetos e a quitina produzida por alguns fungos.
Outra sequncia que tambm apresentou alta similaridade com as deste
estudo (e-27) est envolvida com a resposta de plantas de nabo injria
mecnica. Uma anlise com a ferramenta Genevestigator indicou que esse
fragmento de 228 pb tambm seria induzido por patgenos e insetos em um
fragmento homlogo de Arabidopsis. De acordo com os autores da pesquisa
(Sarosh; Meijer, 2007), a sequncia que corresponde desse estudo apre-
sentou baixa homologia com outras presentes em bancos de dados.
No trabalho de Sarosh e Meijer (2007), de modo geral os genes de respos-
ta a patgenos foram elicitados em perodos maiores aps a injria mecnica
ou infestao da traa. E diversos genes envolvidos em vias de resistncia
a doenas mostraram ser induzidos tambm em Arabidopsis submetida a
ferimentos (Cheong et al., 2002). O aumento na expresso de possveis me-
Figura 12.9 Resultado do alinhamento dos Contigs 1 e 2, demonstrando a homologia entre
os mesmos. As pores 5 e 3 apresentam a mesma sequncia de nucleotdeos.
Fonte: Guimares, 2007
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400 PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
canismos de resistncia durante a infestao do inseto e injria mecnica
indica a ampla existncia de cross-talk em diversas formas de estresses bi-
ticos em que aes antagonistas aos cidos jasmnico e saliclico foram des-
critas. Alm disso, genes induzidos pela infestao de nematoides e afde-
os foram identificados entre os ortlogos induzidos por estresses biticos.
Os resultados do confronto do fragmento encontrado nesse estudo com
o banco de dados do NCBI por meio da ferramenta Blastn indicam que
a sequncia pode estar relacionada com algum mecanismo de defesa. No
entanto, foi encontrada alta homologia com fragmentos que foram identifi-
cados recentemente e que apresentariam diferentes funes. Ser necessrio
comparar as sequncias genmicas de arroz, milho e sorgo e verificar a exis-
tncia de isoformas/splincing alternativo destas sequncias.
Com os resultados obtidos at o momento no possvel afirmar que a
sequncia identificada est realmente correlacionada com a maior resistn-
cia da variedade SP83-5073 cigarrinha M. fimbriolata. Estudos adicionais
so necessrios para confirmar ou no essa associao.
Alm disso, estudos morfolgicos so necessrios para apontar se a anti-
biose o nico fator de resistncia na variedade SP83-5073, uma vez que pode
haver uma combinao com a morfologia das razes que refora a resistncia.
Os resultados obtidos confirmam a suscetibilidade das variedades
SP80-1816 e RB72454 M. fimbriolata, e fornecem fortes indcios de que
a variedade SP83-5073 resistente praga por meio de um mecanismo de
antibiose. A banda diferencialmente expressa na variedade SP83-5073,
identificada por cDNA-AFLP, pode estar relacionada com a defesa cigar-
rinha-das-razes. A clonagem e o sequenciamento do DNA presente nesta
banda revelou a presena de duas sequncias, possivelmente isoformas, que
possuem homologia com sequncia de cDNAs de outras plantas e que pa-
recem estar relacionadas com mecanismos de defesa contra estresse bitico
e abitico e com associao simbitica.
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