QBQ-0116

BIOQUMICA: ESTRUTURA DE BIOMOLCULAS e METABOLISMO

2012

pH e SISTEMAS TAMPO
01. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 1, Problema 1-19. O Ka do cido fraco HA 1,6 x 10-6. Calcular: a) O grau de ionizao do cido para uma soluo 10-3 M. b) O pH

02. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 1, Problema 1-26. a) Indicar os componentes de um tampo acetato b) Mostrar atravs de reaes como o tampo acetato resiste a mudanas de pH quando se adiciona ons OH- ou H+. 03. Quais os fatores que determinam a eficincia ou capacidade tamponante de uma soluo? 04. Dispe-se de soluo de cido actico e acetato de sdio ambas 0,1 M. Com estas duas solues, preparar os seguintes tampes acetato 0,1 M (pKa do cido actico = 4,7): a) pH = 3,7 b) pH = 5,7

08. Lehninger, Biochemistry, segunda edio, Captulo 2, Problema 8. a) Calcular a relao [HCO3-]/[H2CO3] no plasma sanguneo em pH 7,4 (pKa = 3,77), b) Calcular a relao [HPO42-]/[H2PO4-] no plasma sanguneo (pKa = 7,20), c) Qual dos dois pares cido-base conjugados o tampo mais eficiente em uma amostra de plasma sanguneo em um frasco fechado, sem espao disponvel para gases (totalmente ocupado por lquido)? 09. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 1, Problema 1-52. O plasma sanguneo contm uma reserva ("pool") total de carbonato (essencialmente HCO3- + CO2) de 2,52 x 10-2M. a) Qual a razo [HCO3-]/[CO2] e a concentrao de cada componente do tampo presente a pH 7,4? b) Qual seria o pH se for adicionado 10-2 M de H+ sob condies tais que o aumento da [CO2] no possa ser liberado? c) Qual seria o pH se for adicionado 10-2 M de H+ e o excesso de CO2 eliminado (mantendo-se assim a [CO2] original)? Considerar o pKa para o equilbrio abaixo: CO2 + H2O HCO3- + H+, como sendo 6,1.

AMINOCIDOS
01. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 1, Problema 1-45. Escreva as estruturas das vrias formas de alanina, cido asprtico e lisina que podem ser obtidas. Mostre como cada forma ioniza em gua. 02. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 1, Problema 1-46 Desenhe a curva de titulao de cloridrato de alanina com KOH. Indique o pI. So dados: pKa1 = 2,4 e pKa2 = 9,6 03. Conhecidos os valores dos pKas, discuta as curvas de titulao do cido asprtico e lisina. Indique os respectivos pIs. 04. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 2, Problema 2-2. Quais so as mobilidades eletroforticas relativas de glicina, leucina, cido asprtico, cido glutmico e lisina a pH 4,7? Dados: Aminocido Lisina Glicina Leucina cido Glutmico cido Asprtico Considere: mobilidade eletrofortica = k . P.M. 146,2 75,1 131,2 147,1 133,1
pH - pI P.M.

pI 9,74 5,97 5,98 3,22 2,98

05. Lehninger, Principles of Biochemistry, Captulo 5, Problema 3. Relao entre estrutura e propriedades qumicas dos aminocidos. Uma vez que os aminocidos servem como unidades fundamentais formadoras das protenas, o conhecimento de suas estruturas e propriedades qumicas crucial para a compreenso de como as protenas executam suas funes biolgicas. a) Escreva as estruturas das cadeias laterais (grupos R) dos seguintes aminocidos: (1) Ala, (2) Arg, (3) Asn, (4) Asp, (5) Cys, (6) Glu, (7) Gly, (8) His, (9) Lys, (10) Met, (11) Phe, (12) Pro, (13) Ser, (14) Trp, (15) Tyr e (16) Val. b) Associe compatibilizando cada estrutura com a descrio de suas propriedades fornecidas abaixo (algumas descries podem ser usadas mais de uma vez). (Associe o nmero do aminocido com a letra correspondente descrio). a) Grupo R pequeno e polar contendo um grupo hidroxila. Este aminocido importante no stio ativo de algumas enzimas. b) Provoca o menor impedimento estrico. c) O grupo R tem pKa prximo de 10,5, o que torna-o carregado positivamente no pH celular. d) O grupo R contm enxofre e neutro em todos os pHs. e) O grupo R aromtico, de natureza hidrofbica e neutro em todos os pHs. f) Hidrocarboneto saturado, importante em interaes hidrofbicas. g) O nico aminocido que possui um grupo R ionizvel com pKa prximo de 7. um grupo importante no stio ativo de algumas enzimas.

h) O nico aminocido que possui um alfa-amino grupo substitudo. Influencia o dobramento da protena forando uma curvatura na cadeia. i) O grupo R tem pKa prximo de 4 e assim est carregado negativamente em pH 7. j) Tem grupo R aromtico, capaz de formar pontes de hidrognio; tem pKa perto de 10. k) Forma ligaes cruzadas de dissulfeto (pontes de dissulfeto) entre cadeias polipeptdicas, o pKa do seu grupo funcional cerca de 8. l) O grupo R tem pKa prximo de 12, fazendo-o positivamente carregado em todos os pHs fisiolgicos. Sua carga positiva importante em algumas protenas para a ligao com grupos fosfatos negativamente carregados. m) Quando seu grupo R polar no carregado hidrolisado, este aminocido converte-se em outro que possui uma carga negativa em seu grupo R quando em pH ao redor de 7. 06.Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 2, Problema 2-2. Analisando as estruturas dos aminocidos, indique qual deles se adapta s seguintes descries: a) ______________________ altera o dobramento da cadeia polipeptdica porque no um verdadeiro aminocido. Nas cadeias polipeptdicas da mioglobina e hemoglobina nem todo dobramento tem ________________, mas todo(a) _________ produz um dobramento. (Todos os trs espaos vazios correspondem ao mesmo resduo de aminocido, o qual nico na maneira pela qual ele forma ligaes peptdicas). b) ________________ tem uma cadeia lateral no polar e interage com outros anis aromticos. (Os anis aromticos tm a tendncia a se empilhar (estaquear) com outros anis aromticos). c) ______________ pequeno(a), e no contm enxofre. Ele (ela) pode formar pontes de hidrognio internas numa protena enovelada. d) O par de eltrons solitrio em um dos nitrognios do anel no(a) ______________, o(a) torna, como metionina um ligante potencial, importante na unio dos ons de ferro na hemoglobina. e) ______________________ desempenha um papel crucial na estabilizao da estrutura de muitas protenas em virtude da habilidade de dois de tais resduos formar uma ligao covalente entre suas cadeias laterais, quando estes resduos esto presentes na mesma ou em diferentes cadeias polipeptdicas. f) Os carbonos em um aminocido so designados por letras do alfabeto grego comeando com o carbono alfa e extendendo pela cadeia lateral: beta, gama, delta, ... Se dois ou trs grupos (no tomos de hidrognio) so ligados ao carbono beta, a molcula dita ramificada no carbono beta. Dois resduos adjacentes que tm ramificaes no carbono tornam a estrutura do polipeptdeo conhecido como alfa hlice instvel. Por este critrio __________, ________ e ________ devem interromper a -hlice quando adjacentes. g) Nas protenas, sob condies fisiolgicas normais (prximo ao pH = 7), as cadeias laterais de ________ e __________ so quase totalmente positivamente carregadas, mas as cadeias laterais de __________ esto somente em parte positivamente carregadas.

PEPTDEOS
1. Baseado em Marzzoco e Torres, Bioqumica Bsica, Pgina 220, Problema 3. Para o tripeptdeo H3N+-Ala-Lys-Ser-COOa) Classifique os grupos R segundo suas polaridades. b) Diga para que tipo de ligao esses grupos poderiam contribuir na estrutura terciria de uma protena. c) Calcule o pI sabendo que:

Lys Ser Glu 2,18 2,21 2,19 pKa1 8,95 9,15 9,67 pKa2 10,53 4,25 pKa3 (grupo R) d) Para que polo migraria o tripeptdeo numa eletroforese feita a pH = 7? e) Discuta a capacidade do peptdeo de atuar como tampo. f) Refaa os tens anteriores para um tripeptdeo contendo cido glutmico no lugar de lisina. 02. Stryer, Biochemistry, 3a edio, Captulo 3, Problema 1. Os seguintes reagentes so comumente usados na Qumica de Protenas: CNBr (brometo de cianognio) Cloreto de Dabsila Uria HCl 6N Ninhidrina -Mercaptoetanol Tripsina Fenil isotiocianato cido Perfrmico Quimiotripsina Qual(is) dele(s) (so) o(s) mais adequado(s) para executar cada uma das seguintes tarefas? a) Determinao da sequncia de aminocidos de um peptdeo pequeno. b) Identificao de um resduo amino-terminal de um peptdeo (do qual dispe-se somente de menos de 10-7 g). c) Desnaturao reversvel de uma protena isenta de pontes de dissulfeto. Que outro reagente seria necessrio se elas estivessem presentes? d) Hidrlise de ligaes peptdicas no lado carboxlico de resduos com R aromtico. e) Clivagem de ligaes peptdicas no lado carboxlico de metioninas. f) Hidrlise de ligaes peptdicas no lado carboxlico de resduos de lisina e arginina. 03. Rawn, Biochemistry, Captulo 3, Problema 4. Um peptdeo tem a composio: Ala, Arg, Asp2, Glu2, Gly3, Leu, Val3. Os seguintes peptdeos foram isolados aps hidrlise cida parcial e suas sequncias determinadas: (1) Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala (2) Val-Asp-Val-Asp-Glu (3) Val-Asp-Val (4) Glu-Ala-Leu-Gly-Arg (5) Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg (6) Leu-Gly-Arg Com estes dados, indique a sequncia de aminocidos no peptdeo original. 04. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 2, Problema 2-3. A hidrlise parcial de uma protena forneceu vrios polipeptdeos. Um deles foi purificado. Deduza a sequncia de aminocidos neste polipeptdeo a partir das seguintes informaes: a) A hidrlise cida completa forneceu Ala + Arg + 2 Ser + Lys + Phe + Met + Trp + Pro. b) O tratamento com fluorodinitrobenzeno (FDNB, o reagente de Sanger) seguido da hidrlise cida completa forneceu como nicos dinitrofenil derivados (DNP derivados), a alfa- dinitrofenilalanina (alfa-DNP-Ala) e a epsilon-dinitrofenilisina (epsilon-DNP-Lys). c) Carboxipeptidase A ou carboxipeptidase B no liberaram qualquer aminocido C terminal. d) O tratamento com brometo de cianognio (CNBr) forneceu dois peptdeos. Um continha Ser + Trp + Pro. O outro continha todos os aminocidos restantes (inclusive a segunda serina). e) O tratamento com quimiotripsina forneceu trs peptdeos. Um continha somente Ser + Pro. Outro, somente Met + Trp. O terceiro Phe + Lys + Ser + Arg + Ala.

Ala 2,34 9,69

f) O tratamento com tripsina forneceu trs peptdeos. Um continha somente Ala + Arg. Outro continha somente Lys + Ser. O terceiro continha Phe + Trp + Met + Ser + Pro. Informaes: (1) FDNB reage com amino-grupos livres fornecendo DNP-aminocidos aps hidrlise; (2) Carboxipeptidase A libera todos os aminocidos C terminais, exceto Arg, Lys e Pro e Carboxipeptidase B libera somente C terminal correspondente a Arg ou Lys; (3) CNBr cliva especificamente no lado carboxlico de resduos de Met; e (4) Quimiotripsina e tripsina clivam especificamente no lado carboxlico, respectivamente, de resduos com R aromtico (Phe, Tyr e Trp) e de resduos com R de Lys e Arg.

PROTENAS
01. Indique as propriedades das protenas nas quais se baseiam as seguintes tcnicas utilizadas na sua purificao: (a) Eletroforese, (b) Salting out, (c) Precipitao no pI, (d) Ultra centrifugao e (e) Dilise 02. Lehninger, Biochemistry, 2a. ed., Captulo 7, Problema 6. Para que direo, isto para o anodo (A), para o catodo (C) ou permenncia na origem (O), migraro num campo eltrico as seguintes protenas, nos pHs indicados? a) Albumina do ovo (pI = 4,6) em pH 5,0 b) -Lactoglobulina (pI = 5,2) nos pHs 5,0 e 7,0 c) Quimiotripsinognio (pI = 9,5) nos pHs 5,0, 9,5 e 11,0 03. Lehninger, Biochemistry, 2a. ed., Captulo 7, Problema 7. Em que pH ser a eletroforese mais eficiente na separao das seguintes misturas de protenas? a) Albumina srica e hemoglobina; pIs = 4,9 e 6,8, respectivamente b) Mioglobina e quimiotripsinognio; pIs = 7,0 e 9,5, respectivamente c) Albumina do ovo, albumina srica e urease, pIs = 4,6, 4,9 e 5,0, respectivamente 04. Marzzoco e Torres, Bioqumica Bsica, Pgina 220, Problema 7. Abaixo est representada a mobilidade eletrofortica em pH 8,6 da hemoglobina normal e de uma srie de hemoglobinas anormais (que possuem um aminocido substitudo): (-)______________________________________________________(+) A B Normal C D Indique a que posio A, B, C ou D corresponde cada hemoglobina anormal: HbS - Val em lugar de Glu, HbJ - Asp em lugar de Gly, HbN - Glu em lugar de Lys e HbC - Lys em lugar de cido Glu. 05. Segel, Biochemical Calculations, 2a. ed., Captulo 2, Problema 2-7. O peso molecular mdio de um resduo de aminocido 120. A densidade mdia de uma protena 1,33 g/cm3. Calcule: a) A massa de uma nica molcula de uma protena que contm 270 aminocidos, (b) O volume ocupado por uma nica molcula desta protena, e (c) Poder uma molcula desta protena adaptar-se no interior de uma membrana celular medindo 100 de espessura? Considere que esta molcula esfrica. 06. Wood et al, Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 4, Problema 4-1. Indique se as seguintes afirmaes so falsas ou verdadeiras. Justifique as que forem falsas: a) Pontes de hidrognio ocorrem entre tomos de Hidrognio na superfcie das molculas de protena em soluo.

b) A conformao termodinamicamente mais estvel de uma protena corresponde a estrutura de energia livre mais baixa. c) A formao de pontes de hidrognio internas corresponde a principal interao que direciona o dobramento da molcula de protena. d) Solventes orgnicos desnaturam protenas, principalmente por dificultar interaes inicas. e) O dobramento de uma molcula de protena hidrofbica acompanhado por um aumento na entropia do polipeptdeo. f) O termo estrutura quaternria refere-se a conformao da protena em quarta dimenso, isto , como uma funo do tempo. g) Pontes dissulfeto ligam covalentemente resduos de cistena cujas proximidades so determinadas por interaes prvias no covalentes. h) Numa alfa-hlice, os Hidrognios amdicos de todas as ligaes peptdicas esto formando pontes de Hidrognio. i) A partir da estrutura primria completa de uma protena, possvel predizer sua conformao tridimensional. 07. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 4, Problema 4-2 a) As conformaes das protenas correspondentes ao mnimo de energia livre muitas vezes so favorecidas por ligaes cruzadas covalentes entre resduos de ____________. b) As interaes hidrofbicas levam a um(a) ____________ de energia livre quando as cadeias laterais dos resduos de aminocidos no polares so removidos da fase aquosa. c) O posicionamento de cadeias laterais hidrofbicas no interior de uma protena ________________ a entropia do ambiente aquoso. d) Solventes orgnicos estabilizam (diminuem a energia livre) de grupos _______________ em meio aquoso. e) Na -hlice, as pontes de hidrognio entre os grupos C=O e N-H so bastante estveis porque os trs tomos envolvidos so __________________. 08. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 4, Problema 4-16. Suponha que foram fornecidas a voc pequenas quantidades de trs protenas desconhecidas: A, B e C. Seu instrutor de bioqumica lhe informou que uma delas forma predominantemente -hlice, outra, folha pregueada e a terceira, hlice tripla de colgeno. O laboratrio onde voc est trabalhando est equipado com um analisador de aminocido, mas infelizmente no dispe de um equipamento para R-X cristalogrfico. Voc determinou a composio de aminocidos (em porcentagem molar) para cada protena, como mostrado na tabela a seguir:

A B C A B C 29,4 5,0 10,7 0,5 6,9 2,4 Ala Leu 0,5 7,2 5,0 0,3 2,3 3,4 Arg Lys 1,3 6,0 4,5 0,5 0,8 Asp Met 11,2 0,5 2,5 1,2 Cys Phe 1,0 12,1 7,1 0,3 7,5 12,2 Glu Pro 44,6 8,1 33,0 12,2 10,2 4,3 Gly Ser 0,2 0,7 0,4 0,2 1,2 His Trp 9,4 5,2 4,2 0,4 Hypro Tyr 0,7 2,8 0,9 2,2 5,1 2,3 Ile Val Baseado nos dados da tabela, voc pode prever a estrutura secundria predominante para cada uma?

09. Lehninger, Principles of Biochemistry, Captulo 8, Problema 9. Comparao entre as hemoglobinas da me e do feto. Estudo do transporte de oxignio em mulheres grvidas mostraram que as curvas de saturao pelo oxignio do sangue materno e fetal so marcadamente diferentes quando medidas nas mesmas condies. Esta observao provm do fato de os eritrcitos fetais possuirem uma variante natural da hemoglobina A (hemoglobina F, alfa2 gama2), enquanto que os eritrcitos maternos contm a hemoglobina A (alfa2 beta2), normal em adultos.

a) Qual das hemoglobinas apresenta maior afinidade pelo oxignio nas condies fisiolgicas? Explique. b) Qual o significado fisiolgico das diferenas de afinidade? Explique. Removendo-se cuidadosamente todo DPG de amostras de hemoglobina A e F, verifica-se que as curvas de saturao pelo oxignio (e consequentemente as afinidades) so deslocadas, no grfico, para o lado esquerdo. Nesta situao, hemoglobina A passa a ter maior afinidade pelo oxignio. Recolocando-se DPG, as curvas de saturao voltam ao normal, como mostrado no grfico acima. Pergunta-se: c) Qual o efeito de DPG na afinidade da hemoglobina pelo oxignio? d) Como as informaes acima (relativas ao item c) podem explicar a razo das diferentes afinidades apresentadas pela hemoglobina fetal e materna? 10. Seguindo as instrues abaixo, faa com papel um modelo aproximado da alfa-hlice: a) Trace em papel milimetrado duas linhas paralelas separadas 1,8 cm uma da outra. b) Na linha de baixo, a partir de origem marque pontos distantes 3 cm um do outro. c) Na linha superior marque a origem 0,5 cm frente da origem correspondente na linha inferior. A partir da origem, marque pontos na linha superior distantes 3 cm um do outro. d) Una os pontos correspondentes nas linhas superior e inferior, de tal modo a obter uma srie de paralelogramos. e) Em cada paralelogramo trace trs segmentos auxiliares: (1) No lado menor da esquerda marque um ponto 0,3 cm abaixo do vrtice esquerdo superior. No lado menor direita marque um ponto 0,3 cm acima do vrtice inferior. Una estes pontos. (2) e (3) Trace segmentos paralelos aos lados menores que distem entre si 1 cm. Desta forma o paralelogramo dividido por estes segmentos em trs teros iguais. f) Escreva a letra C (Carbono) no encontro dos segmentos (1) e (2) e o N (Nitrognio) no encontro de (1) e (3). g) No centro dos lados menores escreva C. h) Una C - C - N - C - C - N - .... i) Faa C = O para cima ao longo do segmento (2) e N - H para baixo ao longo de (3).

j) Dobre a tira de papel nas posies correspondentes aos lados menores e fixe as pontes de hidrognio N - H ... O = C com pequeno pedao de fita adesiva, de tal forma a obter no conjunto uma hlice. 11. Seguindo as instrues abaixo, faa com papel um modelo aproximado de um folha pregueada beta com cadeias polipeptdicas antiparalelas: a) Numa folha de papel sulfite com seus lados maiores em posio horizontal trace as linhas auxiliares da maneira indicada abaixo. b) Trace levemente linhas verticais distantes entre si 6 cm. A primeira linha esquerda pode distar 1 cm do lado menor. c) Trace levemente pares de paralelas horizontais distantes 1,2 cm entre si. No primeiro par, a linha superior deve distar 1 cm do lado maior superior da folha de papel. A paralela inferior dista 1,2 cm da linha superior. d) Abaixo 4,2 cm da linha inferior do primeiro par de paralelas trace a linha superior do segundo par. Trace em seguida a linha inferior do segundo par. e) Da mesma forma trace o terceiro e quarto pares de paralelas. f) Com as verticais e os pares de paralelas voc obteve uma srie de retngulos medindo 1,2 cm (lado menor) por 6 cm (lado maior). g) Na primeira srie de retngulos (a srie superior) escreva C no vrtice superior esquerdo do primeiro retngulo da esquerda. No vrtice inferior direito escreva tambm C. Assim, de forma diagonalmente oposta, v escrevendo C na primeira srie de retngulos. h) Na segunda srie de retngulos (uma abaixo da srie superior) escreva C no vrtice inferior esquerdo do primeiro retngulo da esquerda. No vrtice superior direito escreva tambm C. Assim, de forma diagonalmente oposta, v escrevendo C na segunda srie de retngulos. i) Proceda com em (g) para escrever C na terceira srie de retngulos. j) Proceda como em (h) para escrever C na quarta srie de retngulos. k) Entre duas verticais (separadas de 6 cm) trace levemente duas outras verticais separadas de 2 cm. l) Agora, na primeira srie de retngulos escreva C de forma diagonalmente aposta a C. Diagonalmente oposto a C escreva N. V escrevendo C e N diagonalmente opostos. m) Tambm, na segunda srie de retngulos escreva N de forma diagonalmente oposta a C. Diagonalmente oposto a N escreva C. V escrevendo N e C diagonalmente opostos. n) Na terceira srie de retngulos escreva C e N como em (l). o) Na quarta srie de retngulos escreva N e C como em (m). p) Nos C (no em C) faa C = O (as ligaes devem estar centradas em C e a 120o). q) Nos N faa N - H (as ligaes devem estar centradas em N e a 120o). r) Estabelea as pontes de hidrognio entre as cadeias com os C = O e H - N prximos (C = O --- H - N). s) Dobre a folha de papel em zig-zag, vincando-a nas verticais que passam por C.

ENZIMAS
01. Segel, Biochemical Calculations, Captulo 4, Problema 4-18. Um extrato bruto livre de clulas contm 20 mg/ml de protena. Uma alquota de 10 l (microlitros) deste extrato em um volume total de reao standard de 0,5 ml catalisou a formao de 30 nmoles (nanomoles) do produto em 1 min sob condies timas de ensaio (fora inica e pH timos, concentraes saturantes de todos substratos, coenzimas, ativadores, etc.) a) Expresse v em termos de nmoles x ml-1 x min-1, nmoles x litro-1 x min-1, moles x litro -1 x min-1, M x min-1 b) Qual seria o valor de v se os mesmos 10 l do extrato fossem ensaiados em um volume total de 1,0 ml? c) Em termos de unidades/ml, qual a concentrao da enzima na mistura de ensaio e no extrato? d) Qual a atividade especfica da preparao? 02. Rawn, Biochemistry, Captulo 7, Problema 1. A acetilcolinesterase (uma esterase) catalisa a hidrlise da acetilcolina:
acetilcolina + H2O colina + acido acetico

a) Escreva a reao catalisada usando frmulas estruturais e indique na estrutura da acetilcolina a ligao que clivada. A enzima inativada por DFP (diisopropilfluorofosfato). b) Qual o resduo de aminocido que provavelmente est no stio ativo da esterase? c) Como poderia ser identificado o resduo modificado? d) Qual o provvel papel deste resduo no mecanismo da catlise? 03. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 7, Problema 7-7 (Resolver numericamente; no graficamente). Os dados da tabela abaixo foram obtidos para uma reao enzimtica (volume final 10 ml), usando-se o seguinte procedimento: A fim de se estudar a dependncia da velocidade de uma reao enzimtica pela concentrao de substrato, uma quantidade constante de enzima foi adicionada a uma srie de tubos contendo diferentes concentraes de substrato. As velocidades iniciais da reao foram determinadas medindo-se o nmero de moles (ou moles) de substrato consumido (ou produto formado) por minuto. A tabela a seguir mostra as velocidades iniciais fornecidas pelas respectivas concentraes de substrato: [S] (moles/litro) 5,0 x 10-2 5,0 x 10-3 5,0 x 10-4 5,0 x 10-5 5,0 x 10-6 5,0 x 10-7 Pergunta-se: (a) Qual a Vmax para esta concentrao de enzima? (b) Qual o KM desta enzima? (c) Verifique se esta reao segue uma cintica simples de Michaelis-Menten. (d) Quais sero as velocidades iniciais para: [S] = 1,0 x 10-6 M e [S] = 1,0 x 10-1 M? v (moles/min) 0,25 0,25 0,25 0,20 0,071 0,0096

(e) Calcule a quantidade total de produto formado durante os primeiros cinco minutos quando a [S] = 2,0 x 10-3 M. possvel fazer o mesmo clculo para uma [S]=2,0x10-6 M? (f) Suponha que a concentrao de enzima em cada tubo foi aumentada por um fator de 4. Quais so os valores de KM e Vmax? Neste caso, qual o valor de v para [S] = 5,0x10-6 M? 04. Stryer, Biochemistry, 2a. ed., Captulo 6, Problema 2. A penicilinase, uma enzima presente em algumas bactrias resistentes, hidrolisa penicilina tornando-a inativa. O P.M. desta enzima em Staphylococcus aureus 29.600. Mediu-se em funo da concentrao de penicilina, a quantidade deste antibitico que foi hidrolisada em 1 min em 10 ml de uma soluo que continha 10-9 g de penicilinase purificada. Considere que a concentrao de penicilina no se altera apreciavelmente durante o ensaio: Penicilina (moles/litro) 0,1 x 10-5 0,3 x 10-5 0,5 x 10-5 1,0 x 10-5 3,0 x 10-5 5,0 x 10-5 Quantidade hidrolisada (moles) 0,11 x 10-9 0,25 x 10-9 0,34 x 10-9 0,45 x 10-9 0,58 x 10-9 0,61 x 10-9

(a) Projete 1/v versus 1/[S] para estes dados. H indicao de que a penicilinase segue uma cintica de Michaelis-Menten? Em caso afirmativo, qual o valor de KM? (b) Qual o valor de Vmax? (c) Qual o valor do nmero de transformao (turnover) da penicilinase nestas condies experimentais? (Considere um centro ativo por molcula de enzima) 05. Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH, admitindo-se que a enzima seja estvel de pH 3 a 12, o substrato no contm grupos ionizveis e a catlise depende da presena no centro ativo de: (a) uma carboxila (pKa = 5) desprotonada, (b) um grupo amina (pKa = 9) protonado, e (c) uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo amina (pKa = 9) protonado. 06. Stryer, Biochemistry, 2a. ed., Captulo 6, Problema 3. Foram efetuadas medidas cinticas para uma enzima na ausncia e na presena de inibidor ([I] = 2 x 10-3 M, fixa). As velocidades iniciais correspondentes s vrias concentraes de substrato esto indicadas na tabela abaixo: [S] M 0,3 x 10-5 0,5 x 10-5 1,0 x 10-5 3,0 x 10-5 9,0 x 10-5 Pergunta-se: (a) Quais so os valores de Vmax e KM na ausncia de inibidor? E na sua presena? (b) Qual o tipo de inibio? (c) Qual a constante de dissociao do complexo enzimainibidor? Compare com o valor de KM. Velocidade (mol/min) sem inibidor com inibidor 10,4 4,1 14,5 6,4 22,5 11,3 33,8 22,6 40,5 33,8

07. Stryer, Biochemistry, 2a ed., Captulo 6, Problema 4. Foram efetuadas medidas cinticas para a enzima discutida no exerccio anterior na presena de um inibidor diferente ([I] = 10-4 M, fixa): [S] M 0,3 x 10-5 0,5 x 10-5 1,0 x 10-5 3,0 x 10-5 9,0 x 10-5 Pergunta-se: (a) Quais so os valores de Vmax e KM na presena deste inibidor? (b) Qual o tipo de inibio? (c) Qual a constante de dissociao do complexo enzima-inibidor? Velocidade (u mol/min) sem inibidor com inibidor 10,4 2,1 14,5 2,9 22,5 4,5 33,8 6,8 40,5 8,1

CARBOIDRATOS
01. Stryer, Biochemistry, 3a ed., Captulo 14, Problema 1. Indique se cada um dos seguintes pares consiste de anmeros, epmeros ou par aldose-cetose: a) D-gliceraldeido e dihidroxiacetona b) D-glicose e D-manose c) D-glicose e D-frutose d) -D-glicose e -D-glicose e) D-ribose e D-ribulose f) D-galactose e D-glicose 02. Gumport et al., Students Companion to Stryers Biochemistry, Captulo 14, Self-Test, Problema 3. Examine as cinco seguintes estruturas de acares.

Indique atravs das letras representativas os acares que: a) contm ou so pentoses b) contm ou so cetoses c) contm os mesmos monossacardeos monossacardeos d) fornecem diferentes acares por hidrlise enzimtica ou qumica da ligao glicosdica d o nome destes

e) so redutores f) contm um carbono anomrico g) sofrem mutarrotao h) sacarose i) correspondem aos que so liberados na digesto do amido

03. Lehminger, Principles of Biochemistry, Captulo 11, Problema 1. Interconverso das formas de D-galactose. Uma soluo recm-preparada da forma (1g/ml em um tubo polarimtrico de 1 dm) mostra uma rotao ptica de + 150,7o. Quando deixada em repouso por um longo perodo de tempo a rotao decresce gradualmente at atingir um valor de equilbrio igual a + 80,2o. Em contraste, uma soluo recm-preparada (1g/ml) da forma mostra rotao tica de apenas +52,8o . Quando esta soluo deixada em repouso por vrias horas a rotao aumenta at o valor de equilbrio igual a +80,2o , valor idntico quele observado para a -D-galactose. a) Escreva as frmulas de projeo de Haworth das formas e da D-galactose. Qual caracterstica distingue as duas formas? b) Por que a rotao de uma soluo recm-preparada da forma decresce gradualmente com o tempo? Explique por que solues das formas e (de concentraes iguais) atingem o mesmo valor de rotao ptica no equilbrio? Explique. c) Calcule a composio percentual das duas formas de galactose no equilbrio. 04. Van Eikeren, Guide to Lehningers Principles of Biochemistry, Captulo 11, Structure and Properties of Monosaccharides, Study Questions and Problems, Problema 7. Frutose, o principal acar do mel, comumente usada como adoante de alimento. Este acar na forma -D-piranose provavelmente a substncia mais doce conhecida. A forma -Dfuranose muito menos doce. Quais so as estruturas da -D-frutopiranose e -D-frutofuranose? A doura do mel diminui ao deix-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando a temperatura. Explique. 05. Van Eikeren, Guide to Lehningers Principles of Biochemistry, Captulo 11, Covalently Bonded Monosaccharides: Disaccharides and Polysaccharides, Study Questions and Problems. Problema 1. Conhecendo-se as frmulas de projeo de Haworth da maltose, lactose e sacarose, identifique em cada uma delas a ligao glicosdica. Quais so os produtos quando cada dissacardeo hidrolisado em presena de cido? Escreva as estruturas dos monossacardeos.

06. Van Eikeren, Guide to Lehningers Principles of Biochemistry, Captulo 11, Covalently Bonded Monosaccharides: Disaccharides and Polysaccharides, Study Questions and Problems. Problema 2. Uma amostra de dissacardeo corresponde ou lactose ou sacarose. A amostra fornece resultado negativo no teste para se verificar se o dissacardeo redutor. Entretanto, o mesmo teste d resultado positivo se a amostra antes tratada com cido diludo e aquecida. A amostra desconhecida corresponde a lactose ou a sacarose? Explique. 07. Lehninger, Principles of Biochemistry, Captulo 11. Problema 7. Comparao entre celulose e glicognio. A Celulose, praticamente pura obtida das fibras que envolvem as sementes do algodo, resistente, fibrosa e completamente insolvel em gua. Diferentemente, o glucognio extrado de fgado ou msculo dispersa-se facilmente em gua quente formando uma soluo turva. Embora eles tenham propriedades fsicas marcadamente diferentes, as duas substncias so compostas por molculas de D-glicose polimerizadas atravs de ligaes 1 4 e tm pesos moleculares comparveis. Quais caractersticas estruturais so responsveis por estas propriedades to diferentes dos dois polissacardeos? Quais as vantagens biolgicas de suas respectivas propriedades fsicas? 08. Van Eikeren, Guide to Lehningers Principles of Biochemistry, Captulo 11, Glycoproteins: Hybrid Molecules of Carbohydrate and Protein, Problema 1. A figura abaixo mostra uma unidade repetitiva da molcula de uma glicoprotena.

Escreva a frmula de projeo de Haworth desta unidade, assumindo-se que os monossacardeos so ligados por ligao glucosdica 1 4. 09. Van Eikeren, Guide to Lehningers Principles of Biochemistry, Captulo 11, Self-Test, Problema 13. A poro de natureza sacardica de algumas glicoprotenas pode servir como stio de reconhecimento celular. Para desempenhar esta funo, os oligossacardeos ou glicoprotenas devem ter a capacidade de formar um grande nmero de diferentes estruturas. Qual dos dois pode produzir uma maior variedade de estruturas: oligopeptdeos compostos de cinco resduos de diferentes aminocidos ou oligossacardeos compostos de cinco resduos de diferentes monossacardeos? Explique. 10. Stryer, Biochemistry, 3a ed. Captulo 14, Problema 7. Supe-se que uma unidade trissacardica de uma glicoprotena de uma superfcie celular desempenha um papel crtico em promover a adeso clula-clula em um determinado tecido. Planeje um experimento simples para testar esta idia.

LIPDEOS e MEMBRANAS
01. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 12, Problema 1. Ponto de fuso dos cidos graxos. Os pontos de fuso de uma srie de cidos graxos de 18 tomos de carbono so: cido esterico (69,9oC), cido olico (13,4oC), cido linolico (-5oC) e cido linolnico (-11oC). Que aspecto estrutural destes cidos graxos de 18 carbonos

pode ser correlacionado com o ponto de fuso? Fornea uma explicao molecular para esta tendncia do ponto de fuso. 02. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 12, Problema 13. Fluidez e funo da membrana. Uma hiptese central, na rea da pesquisa de membranas, que os lipdeos de membrana devem ser fludos (em oposio a "congelados") a fim de que a membrana possa desempenhar suas funes. O apoio para esta hiptese fornecido pela observao de que a composio de cido graxo das membranas pode ser alterada pelas condies nas quais a bactria cresce. Por exemplo, se a bactria est crescendo em temperatura menor que a normal, as quantidades observadas de cidos graxos insaturados (relativas ao contedo de cido graxo saturado) esto acima do normal. Contrariamente, se a bactria est crescendo em temperatura acima da normal, as quantidades observadas de cidos graxos insaturados nos lipdeos da membrana (relativas aos cidos graxos saturados) esto abaixo do normal. (a) Sugira razes por que o contedo lipdico na membrana bacteriana deve ser fluido para que a membrana intacta opere apropriadamente. (b) Explique como a alterao observada nos nveis dos cidos graxos insaturados relativa aos nveis dos cidos graxos saturados, em diferentes temperaturas de crescimento, apia a hiptese da fluidez da membrana. 03. Rawn, Biochemistry, Captulo 9, Problema 1. Seja uma bicamada lipdica sinttica formada apenas de fosfatidato, na qual as duas cadeias hidrofbicas correspondem ao cido graxo saturado C18, cido esterico. Considere que a esta bicamada foram impostas as seguintes mudanas: (a) substituio de metade das cadeias hidrofbicas por outras cadeias hidrofbicas derivadas de C18, nas quais ocorrem uma insaturao de configurao cis (entre C9 e C10). (b) Adio de ons Ca2+ soluo que contm a bicamada. Em ambos os casos, faa uma previso a respeito da temperatura de transio de fase. 04. Stryer, Biochemistry, 2a. ed., Captulo 10, Problema 1 Quantas molculas de fosfolipdeo 2 existem em 1 m da regio da membrana em bicamada de fosfolipdeo? Considere que a molcula de fosfolipdeo ocupa 70 2 de rea. 05. Rawn, Biochemistry, Capitulo 9, Problema 3. Qual a fora ("driving force") que dirige a formao de bicamadas fosfolipdicas? 06. Lehninger, Principles of Biochemistry, Captulo 4, Problema 9. O pH e a absoro de drogas. A droga aspirina, intensamente receitada, um cido fraco com um pKa de 3,5. a) Escreva por frmulas estruturais a ionizao reversvel da aspirina. A aspirina absorvida para o sangue atravs das clulas de revestimento do estmago e do intestino delgado. Para uma substncia ser absorvida ela deve atravessar facilmente a membrana celular. A passagem atravs da membrana celular determinada pela polaridade da molcula: molculas inicas (carregadas) e molculas altamente polares passam lentamente, enquanto aquelas neutras e hidrofbicas passam rapidamente. Como o pH do suco gstrico cerca de 1 e o pH no intestino delgado, cerca de 6, pergunta-se: b) Onde a aspirina mais absorvida para a corrente sangunea, no estmago ou no intestino delgado? Justifique claramente a sua escolha. 07. Rawn, Biochemistry, Captulo 9, Problema 2. Fornea uma explicao termodinmica para o fato de que molculas de fosfolipdeo difundem rapidamente no plano da bicamada, mas muito lentamente mudam de uma face oposta.

08. Stryer, Biochemistry, 3a. ed., Captulo 12, Problema 5. R.D. Kornberg e H.M. McConnell (1971) pesquisaram a difuso transversa (flip-flop) de fosfolipdeos em uma membrana em bicamada usando um anlogo paramagntico da fosfatidilcolina chamado fosfatidilcolina marcada com marcador de spin. (Procure a frmula estrutural deste marcador de spin no Stryer). O grupo nitrxido (NO) em uma fosfatidilcolina marcada com marcador de spin fornece um espectro de ressonncia paramagntica eletrnica caracterstico. Este espectro desaparece quando nitrxidos so transformados em hidroxilaminas por agentes redutores, tal como o ascorbato. Vesculas de lipdeos contendo fosfatidilcolina (95%) e o anlogo marcado (5%) foram preparadas por sonicao e purificadas por cromatografia de filtrao em gel. O dimetro externo destes lipossomos mediu cerca de 25. A amplitude do espectro de ressonncia paramagntica eletrnica decresceu a 35% do seu valor inicial em poucos minutos aps a adio de ascorbato. No houve nenhuma mudana detectvel no espectro poucos minutos aps a adio de uma segunda alquota de ascorbato. Entretanto, a amplitude do espectro residual decai exponencialmente com uma meia-vida de 6,5 h. Como voc interpreta estas mudanas na amplitude do espectro paramagntico? 09. Campbell, Biochemistry, Captulo 16, Problema 15. Por que, ao invs de na forma livre, o colesterol transportado na corrente sangunea na forma empacotada? (Ler no Campbell, no Captulo 11, o tpico "Receptores de Membrana" e, no Captulo 16, o tpico "O Papel do Colesterol em Doenas do Corao". Ler no Stryer, no Captulo 23, os tpicos "Colesterol e outros Lipdeos so transportados a Alvos Especficos por Lipoprotenas", "O Receptor da Lipoprotena de Baixa Densidade (LDL) desempenha um papel importante no controle do Metabolismo do Colesterol", "O Receptor da LDL uma Protena Transmembrnica com cinco domnios funcionalmente diferentes" e "A ausncia do Receptor de LDL leva a Hipercolesterolemia e a Aterosclerose"). 10. Campbell, Biochemistry, Captulo 11, Problema 8. Que tipo de resduos de aminocidos mais provvel se encontrar no stio de ligao do receptor da LDL? D uma razo para sua resposta.

TERMODINMICA APLICADA S REAES BIOQUMICAS

01. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 9, Problema 9-4. O Go para a hidrlise do ATP a ADP + Pi -7,3 Kcal/mol. a) Calcule a constante de equilbrio para esta reao. No equilbrio h mais ADP que ATP ou o inverso?. b) Na clula, esta reao est no equilbrio? 02. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Captulo 9, Problema 9-5. No interior da clula , em geral, o G' para a hidrlise do ATP mais negativo ou menos negativo que o Go? Por qu? 03. Stryer, Biochemistry, 3a edio, Captulo 13, Problema 5. A formao de Acetil CoA a partir de Acetato um processo dependente de ATP: Acetato + ATP + CoA Acetil CoA + AMP + PPi a) Calcular o Go' da reao acima, sabendo-se que os Go' de hidrlise do Acetil CoA a Acetato -7,5 Kcal/mol e do ATP a AMP e PPi -7,3 Kcal/mol.

b) Sabendo que nas clulas o PPi formado rapidamente hidrolisado a 2Pi por uma pirofosfatase inorgnica (Go'= -8 Kcal/mol), discuta o efeito da hidrlise do PPi na formao de Acetil CoA a partir de Acetato. 04. Stryer, Biochemistry, 3a edio, Captulo 13, Problema 4. Dados os Go' de hidrlise de glicose-6-fosfato e glicose-1-fosfato, respectivamente -3,3 Kcal/mol e -5,0 Kcal/mol, calcule: a) O Go' da isomerizao de glicose-6-fosfato a glicose-1-fosfato. b) No equilbrio, qual a razo entre as concentraes de glicose-6-fosfato e de glicose-1fosfato? c) Em que condies celulares a isomerizao referida no item (a) poderia produzir continuamente e em alta velocidade a glicose-1-fosfato? 05. Stryer, Biochemsitry, 3a edio, Captulo 13, Problema 1. Discuta em que sentido ocorrem as reaes abaixo, quando os reagentes esto presentes inicialmente em quantidades equimolares a) ATP + creatina creatinafosfato + ADP b) ATP + glicerol glicerol-3-fosfato + ADP c) ATP + piruvato fosfoenolpiruvato + ADP d) ATP + glicose glicose-6-fosfato + ADP Go' de hidrlise creatinafosfato -10,3 Kcal/mol glicerol-3-fosfato - 2,2 Kcal/mol fosfoenolpiruvato -14,8 Kcal/mol glicose-6-fosfato - 3,3 Kcal/mol ATP a ADP - 7,3 Kcal/mol 06. Van Eikeren, quide to Lehninger's Principles of Biochemistry, Captulo 14, Self-Test, Problema 1. Considere um ecossistema que consiste de um ovo e uma chocadeira. A clara e a gema do ovo contm protenas, carboidratos e lipdeos. Se fertilizado, o ovo transforma-se de uma simples clula em um organismo complexo. Discuta este processo irreversvel em termos de variaes de entropia que se verificam no sistema, vizinhanas e universo. Esteja certo de que, antes de mais nada, voc tenha definido claramente o sistema e as vizinhanas.

INTRODUO AO METABOLISMO
01. Considerar o mapa metablico simplificado apresentado em classe e responder: (a) Quais so os passos irreversveis que aparecem no mapa? (b) Qual o primeiro composto comum que aparece na degradao de protenas, lipdeos e carboidratos? (c) Animais de laboratrio foram submetidos a dietas compostas exclusivamente de carboidratos, ou lipdeos, ou protenas. Analisar em que caso haveria sobrevivncia, verificando se possvel sintetizar: cido graxo a partir de glicose protena a partir de glicose glicose a partir de cido graxo protena a partir de cido graxo glicose a partir de protena cido graxo a partir de protena

Em cada caso afirmativo, indicar a via utilizada

02. Que compostos um indivduo deve obrigatoriamente receber na dieta? Utilizar apenas as informaes do mapa metablico simplificado. 03. Glicose utilizada como fonte de energia para a clula, ou organismo com a finalidade de produzir ATP. O excesso de glicose pode ser convertido em gordura. O esquema simplificado abaixo mostra estas duas possibilidades:

Discuta: a) Neste esquema, quais so as possveis reaes catalisadas por enzimas alostricas? b) Como funciona o esquema acima quando h disponibilidade de muita glicose? c) O substrato B pode dar origem a dois produtos diferentes. Faa os grficos de velocidade em funo da concentrao de B para cada uma das enzimas. d) Quando houver pouca disponibilidade de B qual seu caminho preferencial? Por qu? 04. Lehninger, Principles of Biochemistry, Captulo 13, Problema 5. Comparao entre via catablica e via anablica. A interconverso de glicose a frutose-1,6-difosfato, uma srie muito importante de etapas no metabolismo de carboidratos, mostrada abaixo. A quebra da glicose constitui a via catablica, enquanto a biossntese de glicose a partir de frutose-1,6-difosfato corresponde a via anablica. Ambas as vias usam as mesmas hexoses monofosfato intermedirias. Embora estas vias tenham semelhanas, elas apresentam diferenas bsicas. A finalidade deste exerccio reconhec-las.

a) Esquematize a reao balanceada para cada passo na via catablica. Escreva a equao lquida que resulta quando soma-se os passos individuais. b) Repita o item (a) para a via anablica. c) Baseado nas equaes lquidas, quais so as diferenas que podem ser notadas entre as vias catablica e anablica? As duas vias so simplesmente o reverso uma da outra? d) O que assegura o sentido das reaes individuais no catabolismo da glicose? Ou seja, o que impede que no catabolismo da glicose passe a ocorrer por vias reversas? e) Nas vias catablica e anablica, a interconverso de glicose e glicose-6-fosfato poderia ser catalisada pela mesma enzima? Explique. A interconverso de glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato nas vias catablica e anablica poderia ser catalisada pela mesma enzima? Explique

GLICLISE
01. Stryer, Biochemistry 3a edio, Captulo 15, Problema 3. Escreva a equao balanceada para a converso da Glicose a Lactato. a) Calcule a variao de energia livre padro desta reao usando os dados apresentados na tabela 15-2 do captulo 15 do Stryer (3a edio) e levando em conta que o Go' para a reao Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+, igual a -6 Kcal/mol b) Qual a variao de energia livre (G', no Go) para esta reao quando as concentraes de reagentes e produtos so: Glicose Lactato ATP 5 mM 0,05 mM 2 mM ADP Pi 0,2 mM 1 mM

02. Stryer, Biochemistry, 3a edio, Captulo 15, Problema 2. Glicose marcada com 14C em C-1 incubada com as enzimas da gliclise e os cofatores necessrios. Qual a distribuio de 14C no Piruvato que formado? (Considerar que a interconverso entre Gliceraldedo 3-fosfato e Dihidroxiacetona fosfato muito rpida comparada com o passo subsequente). 03. Discutir a regulao da via glicoltica em funo da relao ATP/ADP. 04. Em relao a via glicoltica: a) Verificar os compostos que apresentam ligaes tipo: fosfoenol, anidrido fosfrico e ster fosfrico e identificar aqueles que so compostos ricos em energia b) Indicar as reaes de oxidorreduo c) Dizer como regulada a via glicoltica e citar as enzimas e seus moduladores d) Mostrar os passos irreversveis que fazem parte do mapa e) Determinar quantas molculas de cido Pirvico se formam a partir de uma molcula de hexose 05. Rawn, Biochemistry, Captulo, 12, Problema 14. Uma pessoa incapaz de executar exerccios fsicos intensos e prolongados teve suas enzimas analisadas. Todas as enzimas da via glicoltica estavam em concentrao normal, com excesso da fosfoglicerato mutase muscular.

a) Como ser afetada a produo de energia metablica em uma clula que apresenta baixos nveis desta enzima? b) Como ser afetada a produo de Lactato na ausncia desta enzima? [Referncia: Di Mauro, S.; Miranda, A.F.; Kahn, S.; Gitlin, K. - Human muscle phosphoglycerate mutase deficiency Science 212: 1277-1279, 1981].

-OXIDAO DE CIDOS GRAXOS

01. Carnitina amplamente distribuda nos tecidos, mas atinge concentrao elevada no msculo. O que sugere este dado? 02. Cite os compostos que devem ser fornecidos para a manuteno da espiral de Lynen. 03. Compare a oxidao de 3 Glicose Acetil-CoA, com a oxidao de cido Lurico (12C) a Acetil-CoA, quanto a: a) Nmero de molculas de Acetil-CoA formadas b) Liberao de CO2 c) Gasto em ATP d) Saldo de ATP e) Nmero de molculas de NADH ou FADH2 formadas f) Coenzimas e vitaminas envolvidas g) Localizao celular 04. Indique o caminho percorrido pelos carbonos do Glicerol na sua transformao a Acetil CoA.

CICLO DE KREBS
01. Quando uma preparao de mitocndrias (convenientemente tratada) incubada com Acetil-CoA, verifica-se que para cada mol de Acetil-CoA adicionado formam-se dois moles de CO2 e que a velocidade de formao de CO2 (l de CO2/min) tem um valor A qualquer. a) Quando se adiciona Acetil-CoA + Succinato, observa-se que a velocidade da produo de CO2 aumenta e o aumento de CO2 produzido excede a quantidade de Succinato adicionado, ou seja, o efeito do Succinato cataltico. Discuta as observaes acima. b) O que aconteceria se a incubao fosse feita na presena de Acetil-CoA + Succinato + Malonato? 02. Como os intermedirios do ciclo de Krebs poderiam ser repostos se houvesse intensa sntese de cido Asprtico e Glutmico s custas dos intermedirios do ciclo de Krebs? 03. A carboxilase pirvica estimulada alostericamente por Acetil-CoA. Discuta a importncia deste fato para o metabolismo energtico. 04. Mostre como o ciclo de Krebs e a gliclise podem ser reguladas pela isocitrato desidrogenase.

05. Por que um esquim com dieta deficiente em carboidratos estaria nutricionalmente melhor comendo alimentos com lipdeos contendo cidos graxos com nmero mpar de tomos de Carbono ao invs de nmero par?

CADEIA RESPIRATRIA
01. A relao entre energia livre de uma reao e o potencial redox : Go' = -nFEo' onde n o nmero de eltrons transferidos F a constante de Faraday (F = 23.060 cal V-1) Eo' o potencial padro da dupla redox. Utilizar esta relao para calcular os pontos da cadeia respiratria onde a energia "liberada" na reao de transferncia de eltrons poderia ser usada para a sntese de um composto rico em energia, aproximadamente +7300 cal/mol. 02. A uma soluo 1 M de NAD+, NADH, Piruvato e Lactato, adicionou-se lactato desidrogenase: Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+ Eo' (NAD+/NADH) = -0,32 V Eo' (Piruvato/Lactato) = 0,19 V a) Em que sentido a reao ocorrer? b) medida que a reao ocorre, como variam esses potenciais redox? c) Quando a reao atingir o equilbrio? Qual o valor do potencial redox (E) nessa situao? 03. Citar as consequncias dos seguintes fatores para o funcionamento da cadeia respiratria e da fosforilao oxidativa: a) Presena de KCN ou CO b) Carncia de Pi c) Carncia de ADP d) Presena de DNP (dinitrofenol) e) Carncia de Pi e/ou ADP em presena de DNP f) Presena de oligomicina g) Presena de oligomicina + DNP 04. Uma droga X inibe o consumo de O2 e a sntese de ATP em uma suspenso de mitocndrias. Que tipo de droga deveria ser adicionada para se determinar o modo de ao da droga X? 05. Calcular o nmero de molculas de ATPs formadas na oxidao total de: I. glicose (uma molcula) II. cido palmtico (16C) (uma molcula) a) Qual seria o destino da energia no armazenada sob a forma de ATP? b) Qual seria o resultado na presena de dinitrofenol? 06. Discutir o funcionamento do ciclo de Krebs, beta-oxidao e via glicoltica em uma suspenso de clulas hepticas na presena dos seguintes compostos:

antimicina, oligomicina, dinitrofenol, antimicina + dinitrofenol e oligomicina + dinitrofenol. Justificar. 07. A membrana externa da mitocndria permevel maioria dos solutos de baixo peso molecular. A membrana interna, entretanto, possui seletividade, sendo impermevel por exemplo a coenzimas, nucleotdeos, etc. De posse dessas informaes responder as seguintes indagaes: a) Como os acil-CoA produzidos aps ativao dos cidos graxos podem ser degradados na -oxidao? b) Como o NADH produzido na via glicoltica pode ser reoxidado na cadeia respiratria? c) Como o ATP produzido na cadeia respiratria pode ser utilizado nas biossnteses que ocorrem no citoplasma? 08. Um microorganismo aerbico facultativo cultivado em meio lquido glicosado com aerao e sem aerao. Em qual das duas culturas o consumo de glicose pelas clulas maior? Justificar a resposta em termos de regulao metablica. 09. Aceita-se que a oxidao de NADH ao nvel de cadeia respiratria produz, em mdia, 3 ATP. conhecido que existem "stios" de produo de ATP (quais?). Discutir a relao estequiomtrica e a existncia de "stios" luz da teoria do acoplamento quimiosmtico.

VIA DAS PENTOSES

01. Pode-se considerar, para efeito de melhor compreenso, que a via das pentoses constituise de um ramo oxidativo (transformao irreversvel de glicose-6-fosfato a pentoses) e de um ramo no oxidativo (transformao reversvel de pentoses a frutose-6-fosfato e gliceraldedo-3-fosfato). Partindo-se de glicose-6-fosfato e considerando-se estes dois ramos, pede-se indicar como podem ser obtidos os seguintes intermedirios quando uma determinada clula deles necessite em grandes quantidades: a) ribose-5-fosfato b) ribose-5-fosfato e NADPH c) NADPH 02. Experimentos com glicose-6-fosfato marcada com istopo radioativo (14C) no C1 ou no C6 indicam quanto do substrato inicial metabolizado pela via das pentoses e quanto metabolizado pela ao combinada da gliclise e ciclo de Krebs. Uma alquota do homogenato do tecido em estudo incubada com glicose-6-fosfato com 14C no C1 e outra, com o mesmo substrato com 14C no C6. Que resultado deve ser esperado, em termos de produo de 14CO2 em funo do tempo, se o homogenato metaboliza glicose-6-fosfato: a) Somente pela ao combinada da gliclise e ciclo de Krebs, b) Somente pela via das pentoses, e c) Pelas duas vias simultaneamente 03. Discutir as condies em que dever haver predomnio de uma das vias (gliclise ou via das pentoses) no metabolismo da glicose. Citar os tecidos onde a via das pentoses mais ativa. 04. Esquematizar o catabolismo da glicose na hemcia enfatizando:

a) O destino do lactato b) A funo do NADPH A hemcia uma clula aerbica? Ela utiliza o oxignio transportado pela hemoglobina? 05. Ler o Stryer, no cap. referente a Via das Pentoses, o tpico: "A deficincia de glicose-6fosfato desidrogenase causa anemia hemoltica induzida por droga".

BIOSSNTESE DE CIDOS GRAXOS

01. Escrever a equao de sntese de cido palmtico (16C) a partir de Acetil-CoA. 02. Comparar a beta-oxidao com a biossntese de cidos graxos no complexo multienzimtico quanto a: a) Localizao celular b) Coenzimas envolvidas e suas vitaminas c) Carregador de grupo acila d) Forma em que as unidades de carbono so removidas ou adicionadas 03. Comparar a degradao de cido palmtico at acetil-CoA com sua sntese a partir de acetil-CoA quanto a necessidade de: a) ATP b) Coenzimas 04. Discutir a regulao da sntese de cidos graxos em funo da relao ATP/ADP 05. A sntese de triglicerdeos requer glicerol-3-fosfato, mas o tecido adiposo no possui a enzima glicerol quinase. Como os adipcitos obtm esse composto essencial para a estocagem de cidos graxos ? 06. Verificar em quais das seguintes situaes haver estmulo da formao de corpos cetnicos: a) Dieta rica em carboidratos e normal em lipdeos b) Jejum c) Dieta rica em lipdeos e normal em carboidratos d) Diabetes 07. Em caso de jejum prolongado o crebro passa a oxidar tambm corpos cetnicos, alm de glicose, como fonte de energia. Citar as enzimas que o crebro deve sintetizar nessa adaptao metablica. 08. Citar as vias de produo e de utilizao de acetil-CoA pela clula. 09. Explicar com base na regulao de enzimas alostricas o fato de uma dieta rica em carboidratos promover o acmulo de lipdeos.

NEOGLICOGNESE
01. O hepatcito pode reverter a transformao de glicose em piruvato apesar de haver trs reaes irreversveis na gliclise. Em cada uma dessas etapas, comparar as reaes no

sentido glicose piruvato e piruvato glicose, quanto s enzimas, reagentes, produtos e coenzimas. 02. Lactato produzido pelo msculo e pelas hemcias pode ser utilizado pelo fgado para convert-lo novamente em glicose. Calcular o nmero de molculas de ATP, por molcula de glicose, necessrio a essa converso. 03. Lehninger, Princpios de Bioqumica. Captulo, 20, Problema 4. Quais so os efeitos de concentrao crescente de ATP e AMP nas atividades catalticas de frutose difosfatase e fosfofrutoquinase? Quais so as consequncias destes efeitos do ATP e AMP no fluxo relativo dos metabolitos atravs da neoglicognese e da gliclise? 04. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 20, Problema 5. Um procedimento comum para determinao da efetividade de compostos como precursores da glicose colocar um animal em jejum at que os estoques de glicognio do fgado sejam depletados e ento administrar o substrato em questo. Um substrato que leva a um aumento lquido no glicognio heptico chamado de glicognico pois ele deve primeiro ser convertido em glicose-6-fosfato. Mostre por meio de reaes enzimticas conhecidas quais das seguintes substncias so glicognicas: (a) succinato, (b) glicerol, (c) acetil CoA, (d) piruvato e (e) butirato. Escreva as frmulas estruturais das substncias relacionadas de (a) a (e). 05. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 20, Problema 6. As concentraes de lactato no plasma sanguneo, antes, durante e depois de uma corrida de 400 metros sero mostradas no grfico concentrao de lactato sanguneo versus tempo, a ser fornecido durante a aula. (Ver no livro). (a) O que provoca a rpida elevao na concentrao do lactato? (b) O que provoca o declnio do nvel do lactato depois do trmino da corrida? Por que o declnio ocorre mais lentamente de que a elevao? (c) Por que a concentrao do lactato no zero durante o estado de repouso?

SNTESE E DEGRADAO DO GLICOGNIO

01. Esquematizar simplificadamente a estrutura da molcula do glicognio indicando os terminais no redutores, redutor e pontos de ramificao e mostrar as aes das seguintes enzimas envolvidas na degradao do polissacardeo a glicose-6-fosfato: (a) fosforilase, (b) transferase (enzima de desramificao), (c) -1,6-glicosidase, (d) fosfoglicomutase 02. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 20, Problema 9. Escrever a sequncia e a reao global requeridas para calcular o custo em nmero de molculas de ATPs necessrias para a converso de glicose-6-fosfato citoplasmtica em glicognio e deste de volta a glicose-6-fosfato. Que frao do nmero mximo de ATPs, que disponvel do catabolismo completo da glicose-6-fosfato, este custo representa? 03. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 20, Problema 10. Uma amostra de tecido de fgado foi obtida "post-mortem" do corpo de um paciente, o qual acreditava-se ser geneticamente deficiente em uma das enzimas do metabolismo de carboidratos. Um homogenato da amostra do fgado mostrou as seguintes caractersticas: 1. Degradou glicognio a glicose-6-fosfato 2. Foi incapaz de sintetizar glicognio a partir de qualquer acar mais simples, ou utilizar galactose como fonte de energia, e 3. Sintetizou glicose-6-fosfato a partir de lactato.

Qual das trs enzimas seguintes deficiente? (a) glicognio fosforilase, (b) frutose difosfatase, (c) UDP-glicose pirofosforilase Fornecer razes para sua escolha 04. Nvel alto de insulina no sangue indica que o organismo est bem nutrido (perodo logo aps a refeio). Nvel baixo, por outro lado denota estado de jejum. Glucagon age de maneira oposta de insulina. Adrenalina tem ao semelhante do glucagon. Relacionar estas afirmaes com o papel destes hormnios na sntese e degradao do glicognio. 05. Existem vrias doenas relacionadas com alteraes no metabolimo do glicognio. Nestas doenas certas enzimas so produzidas em forma defeituosa, ou em quantidade deficientes ou mesmo no so produzidas. Indicar, nos casos assinalados, na sequncia das reaes metablicas, o passo que afetado e o que isto implica na sntese e/ou degradao do glicognio. nome da doena enzima deficiente Von Gierke glicose-6-fosfatase Cori -1,6-glicosidase McArdle fosforilase de msculo Andersen enzima ramificadora

METABOLISMO DE AMINOCIDOS
01. Esquematizar as reaes que permitem a sntese da maioria dos aminocidos a partir de NH3, alfa-cetoglutarato e alfa-cetocidos correspondentes. Discutir as implicaes da reversibilidade das reaes. 02. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 19, Problema 6. Os trs tomos de carbono no lactato e alanina tem estados de oxidao idnticos, e animais podem usar qualquer um deles como combustvel metablico. Comparar o rendimento lquido de ATP (moles de ATP por mol de substrato) para a oxidao completa (a CO2 e H2O) de lactato versus alanina quando o custo de excreo de nitrognio como uria includo. 03. A alanina desempenha um papel importante no transporte de amnia para o fgado, numa forma no txica. A amnia produzida no msculo e outros tecidos, principalmente pela degradao de aminocidos, torna-se o alfa-amino grupo da alanina e desta forma transportada do msculo (e outros tecidos) para o fgado atravs da corrente sangunea. No fgado, a alanina perde o amino grupo que eliminado como uria. O esqueleto carbnico da alanina convertido em glicose, que volta atravs da corrente sangunea ao msculo. Esta interrelao entre msculo e fgado chamada ciclo da alanina-glicose. Esquematize o ciclo da alanina-glicose. Identifique as vias metablicas envolvidas em clulas de msculo e fgado. 04. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 9, Problema 4. Uma criana de dois anos de idade foi levada ao hospital. Sua me indicou que ela vomitava frequentemente, especialmente aps as refeies. O peso da criana e o seu desenvolvimento fsico eram abaixo do normal. Seus cabelos, embora escuros, continham pores de cabelos brancos. Uma amostra de urina tratada com cloreto frrico (FeCl3) apresentou cor verde caracterstica da presena de cido fenilpirvico. A anlise quantitativa de amostras de urina apresentou os resultados mostrados na tabela abaixo: Substncia Paciente Normal (mmol/l) (mmol/l) Fenilalanina 7,0 0,01

Fenilpiruvato 4,8 0 Fenilactato 10,3 0 a) Sugerir a enzima que possa estar deficiente. Propor um tratamento para esta condio. b) Por que a fenilalanina aparece na urina em grandes quantidades? c) Qual a fonte de fenilpiruvato e do fenilactato? Por que estas vias (normalmente no funcionais) entram em ao quando a concentrao de fenilalanina se eleva? d) Por que o cabelo da paciente apresenta pores brancas? 05. Analisar as consequncias, para o metabolismo geral, de uma dieta calrica normal e contendo protenas de baixo valor biolgico (protena com baixo contedo em aminocidos essenciais). Definir balano de nitrognio. O que significa balano de nitrognio negativo, zero e positivo?

AO HORMONAL
01. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 25, Problema 3. Baseados nas suas propriedades fsicas, os hormnios caem em duas categorias; aqueles que so muito solveis em gua mas relativamente insolveis nos lipdeos, por exemplo, a adrenalina, e aqueles que so relativamente insolveis em gua mas altamente solveis nos lipdeos, por exemplo, os hormnios esterodicos. Na sua funo de reguladores da atividade celular, a maioria dos hormnios hidrossolveis no penetram no interior das clulas dos tecidos-alvo. Os hormnios lipossolveis, por outro lado, penetram nas clulas-alvo e finalmente atuam no ncleo. Qual a base para a correlao entre solubilidade, a localizao dos receptores e o modo de ao destas duas categorias de hormnios? 02. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 25, Problema 4. Na dcada de 50, Earl Sutherland e seus colegas realizaram experimentos pioneiros para elucidar o mecanismo de ao da adrenalina e do glucagon. luz da nossa atual compreenso da ao hormonal interprete cada um dos seus experimentos descritos abaixo. Identifique os componentes e indique o significado dos resultados. a) A adio da adrenalina a um homogeneizado ou preparao de clulas rompidas do fgado normal resulta num aumento da atividade da glicognio fosforilase. Entretanto, se o homogeneizado for primeiro centrifugado numa alta velocidade e a adrenalina ou o glucagon adicionados frao sobrenadante lmpida, nenhum aumento na atividade da sua fosforilase observado. b) Quando a frao particulada, sedimentada de um homogeneizado do fgado por centrifugao preparada e tratada com adrenalina, uma nova substncia produzida. Esta substncia foi isolada e purificada. Ao contrrio da adrenalina, esta substncia ativa a glicognio fosforilase quando adicionada frao sobrenadante do homogeneizado. c) A substncia formada pela frao particulada era estvel ao calor; isto o tratamento com calor no impedia sua capacidade de ativar a glicognio fosforilase (Dica: seria este o caso se a substncia fosse uma protena?). A substncia era idntica a um composto obtido quando ATP puro era tratado com hidrxido de brio. 03. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 25, Problema 7. Durante uma situao de "lutar ou correr", a liberao de adrenalina promove a degradao do glicognio no fgado, corao e msculo esqueltico. O produto da degradao do glicognio no fgado a glicose. Ao contrrio, o glicognio do msculo esqueltico degradado pela gliclise:

a) Por que produtos diferentes so observados na degradao do glicognio nestes dois tecidos diferentes? b) Qual a vantagem para o organismo durante uma condio de "lutar ou correr", de se ter estas vias especficas de degradao do glicognio? 04. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 25, Problema 8. Certos tumores malignos do pncreas provocam uma excessiva produo de insulina pelas clulas B. Tais pacientes apresentam calafrios e tremores, fraqueza e fadiga, sudorese e fome. Se esta condio se prolongar ocorre leso cerebral. Qual o efeito do hiperinsulinismo no metabolismo dos carboidratos, aminocidos e lipdeos do fgado? Quais so as causas dos sintomas observados? Sugira por que esta condio, se prolongada leva a leso cerebral?

INTEGRAO METABLICA
01. Os nutrientes absorvidos no trato intestinal passam diretamente ao fgado (com excesso de uma grande parte de triacilgliceris). Por este grande centro de distribuio, acares, aminocidos e aluguns lipdeos so processados e distribudos aos outros rgos e tecidos. Propor um mapa metablico unificado, integrando as principais vias destes nutrientes neste rgo. 02. Ao contrrio do msculo esqueltico, o msculo cardaco deve trabalhar constante e ritmicamente. O que torna possvel, a nvel de metabolismo e caractersticas da clula cardaca, esta adaptao para o trabalho constante? 03. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 24, Problema 14. O glicerol-3-fosfato um intermedirio chave na biossntese dos triacilgliceris. As clulas adiposas, que so especializadas na sntese e degradao dos triacilgliceris, no podem usar o glicerol diretamente devido falta da gliceroquinase, que catalisa a reao: Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfato + ADP Como o tecido adiposo obtm o glicerol-3-fosfato necessrio para a sntese do triacilglicerol? Explicar. 04. Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 24, Problema 20. Pacientes com deficincia de tiamina exibem um conjunto de sinais neurolgicos caractersticos: perda dos reflexos, estado de ansiedade e confuso mental. Sugira uma razo por que a deficincia de tiamina manifestada na funo cerebral. 05. A tabela (a ser fornecida na sala de aula) indica vrios efeitos da deficincia de insulina (Diabetes mellitus) no metabolismo. Para cada um dos tens compare com uma situao em que o organismo foi submetido a jejum severo. (Ver tabela 25-6 do Lehninger, Princpios de Bioqumica, Captulo 25). 06.Van Eikeren , Guide to Lehningers Principles of Biochemistry, Captulo 26 (Nutrio Humana), Challenge Problems, Problema 19. Acidose lctica e hipoglicemia em dependentes de lcool. Pessoas que consomem muita bebida alcolica desenvolvem nveis sangneos no normal e baixo em glicose (hipoglicemia), maior do que o normal de cido lctico (acidose lctica suave) e ainda apresentam cetose. Explique.

QBQ-211

BIOQUMICA: ESTRUTURA DE BIOMOLCULAS e METABOLISMO

1996

LABORATRIOS: I, II, III, IV, V e VI

QBQ-211 - 1996 - LABORATRIO I TITULAO E CROMATOGRAFIA DE AMINOCIDOS

Identificao de um aminocido atravs de cromatografia em papel e de titulao. OBJETIVOS 01. Execuo de cromatografia em papel e de titulao 02. Identificao de um aminocido atravs de seu Rf e de seus pKas 03. Comparao da curva de titulao de um aminocido com a de um cido fraco monoprtico 04. Verificao do pH de diversos fluidos biolgicos mais comuns (de origem vegetal e animal) e no biolgicos, conforme mostrado na figura 2-15 do Rawn, Biochemistry, pg 39 e na figura 4-9 do Lehninger, Principles of Biochemistry, pg 77.

FUNDAMENTOS As unidades constituintes das protenas so os L -aminocidos. Como o prprio nome indica, estes compostos em suas molculas apresentam pelo menos um grupo amina (-NH2) e um grupo carboxlico (-COOH). Em consequncia deste fato, ao serem dissolvidos em gua, os aminocidos apresentam carter anfotrico, ou seja comportam-se como cido e como base. Os grupos amina e carboxila podem sofrer protonaes e desprotonaes reversveis, isto comportam-se como eletrlitos fracos. Se os considerarmos em suas formas de cidos conjugados: -NH+3 e -COOH, veremos que cada um deles apresentar um valor de pKa. Assim, um aminocido apresenta pelo menos dois valores de pKa e dependendo da natureza ionizvel ou no do grupo R ligado ao carbono alfa, pode ocorrer ou no um terceiro valor de pKa.

Em pH 7,0 e no estado slido, o amino grupo apresenta-se protonado (forma cida) e o grupo carboxila desprotonado (forma bsica). Neste experimento utilizaremos um processo de separao de aminocidos baseado na polaridade dos grupos R de cadeia lateral e que determina a preferncia do aminocido por uma fase lquida polar ou apolar, isto sua partio entre duas fases. A gua que hidrata a celulose, principal constituinte do papel, constitui a fase polar, neste caso a fase estacionria, enquanto que o solvente orgnico que migra pelo papel por capilaridade constitui a fase apolar, neste caso a fase mvel. Assim, quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidde do aminocido com a fase mvel e o seu Rf maior . O Rf dado pela

relao entre a distncia percorrida pelo aminocido no papel e a distncia percorrida pela fase mvel. A Tabela I apresenta valores de Rf de alguns aminocidos. Atravs da cromatografia em papel identificaremos um aminocido desconhecido em comparao com quatro outros conhecidos e por isso denominados de aminocidos-padro. Com ajuda da Tabela I e dos valores de pKa obtidos na titulao, confirmaremos a identidade do aminocido. TABELA I Rf de vrios aminocidos determinados nas seguintes condies: solvente de Partridge, n-butanol/cido actico glacial/gua (4:1:1), papel Whatman no 1 e temperatura 20oC Aminocido Rf Aminocido Rf Cys 0,08 Ala 0,38 Lys 0,14 Pro 0,43 His 0,20 Tyr 0,45 Arg 0,20 Trp 0,50 Asp 0,24 Met 0,55 Gly 0,26 Val 0,60 Ser 0,27 Phe 0,68 Glu 0,30 Ile 0,72 Thr 0,35 Leu 0,73

TABELA II Aminocido Glu pKa 2,19 4,25 9,67 2,18 8,95 10,53 2,34 9,6 1,82 6,0 9,17 1,71 8,33 10,78 2,62 10,43 2,02 8,80 2,30 9,70 2,36 9,60 1,99 10,60

Lys

Gly His

Cys

Thr Asn Ala Leu Pro

PROCEDIMENTO 1. CROMATOGRAFIA EM PAPEL Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman no 1 e fazer um trao a lpis ao longo do comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a operao. Deixar uma margem de 1,5cm de cada lado.Marcar seis pontos sobre essa linha que distem 4 cm um do outro e numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem ser aplicadas nos pontos numerados com auxlio de um capilar de tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possvel. Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A amostra desconhecida aplicada no nmero 5. Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades superiores com clip. Colocar 25 ml de solvente de Partridge (n- butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1) em uma placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa. Cobrir o sistema com um bquer de 2 litros e deixar o solvente migrar 10 cm. Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente. Secar o papel na capela, mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80oC-100oC) por alguns minutos. Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel. Determinar o Rf dos padres e do aminocido desconhecido.

2. TITULAO Colocar 50 ml da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 ml at atingir pH 11,0. Colocar 50 ml de cido actico 0,15 M em outro bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 0,5 ml at pH 12,0.

ANLISE DOS RESULTADOS E DISCUSSO CROMATOGRAFIA E TITULAO 01. Comparar seus valores de Rf para os aminocidos padro com os valores da TABELA I. Discutir a respeito das possveis causas de discrepncias. 02. Fazer um grfico de titulao do aminocido com base. Estimar os valores de pKas e comparar estes valores obtidos para o aminocido desconhecido com aqueles da TABELA II. Fazer o grfico de titulao do cido actico. Comparar as curvas de titulao do aminocido e do cido fraco. 03. Identificar seu aminocido desconhecido, escrever sua estrutura e suas sucessivas ionizaes verificadas ao se aumentar o pH.

MEDIDA DO pH DE ALGUNS FLUDOS BIOLGICOS OU NO E COMPARAO DOS VALORES OBTIDOS COM AQUELES APRESENTADOS NA FIGURA 2-15 DO LIVRO DO RAWN OU FIGURA 4-9 DO LIVRO DO LEHNINGER

Selecionar alguns fluidos, com os quais no haja problemas de manipulao e medir seu pH. Eventualmente com auxlio de uma pipeta Pasteur adicionar uma vez, HCl gota a gota e outra vez, KOH. Observar a resistncia ou no variao do pH.

QBQ-211 - 1996 - LABORATRIO II ELETROFORESE EM PAPEL E DOSAGEM COLORIMTRICA DE PROTENAS

Identificao de protenas atravs da eletroforese em acetato de celulose e eletroforese de protenas do soro humano na mesma matriz em tampo barbital-Tris pH = 8,6. Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa atravs da colorimetria.

OBJETIVOS Execuo de uma eletroforese em fita de acetato de celulose. Identificao eletrofortica de protenas e identificao das classes de protenas do soro humano. Previso da direo de migrao proteica em base aos pIs e ao pH da soluo. Montagem de um protocolo para construo de uma curva padro para determinao da concentrao de protenas pelo Mtodo do Biureto.

FUNDAMENTOS (I) ELETROFORESE A eletroforese abrange todas as operaes nas quais as molculas carregadas migram num campo eltrico atravs de solues. Dependendo da ausncia ou presena de uma matriz rgida que sirva como suporte soluo submetida a um campo eltrico, podem existir dois tipos de eletroforese: Eletroforese em soluo - O seu uso limitado. Consiste em se efetuar a operao em tampo aquoso na ausncia matriz-suporte. Esse sistema vulnervel s pertubaes mecnicas (choques, correntes de conveco) o que leva mistura das bandas em migrao e consequente perda da resoluo. As modificaes introduzidas para a estabilizao mecnica do sistema no se constituem em refinamentos que possam permitir larga aceitao deste mtodo. Eletroforese de zona - Os mtodos eletroforticos aqui englobados so mais utilizados. Consiste basicamente em efetuar a operao com a soluo mantida em uma matriz rgida que a suporta (exemplos de matriz: papel, acetato de celulose, gel de poliacrilamida, gel de agarose (poligalactose) e outras). Aqui o termo zona quer indicar que a amostra submetida eletroforese migra delimitando uma pequena regio ou zona no suporte (papel, fita de acetato de celulose ou gel). As perturbaes mecnicas, neste caso no afetam o sistema. Os dois tipos de eletroforese so governados pela expresso:

constante Mobilidade =

(voltagem aplicada) (carga lquida) (frico molecular)

Assim a mobilidade de uma molcula numa soluo aumenta com o aumento da voltagem ou carga da molcula e diminui com o aumento da fico. Esta ltima depende do tamanho e da forma da molcula. Macromolculas, como as protenas, podem ter suas mobilidades eletroforticas preditas pela expresso acima. Porm, efetuar esta previso pode no ser muito simples porque a forma da molcula influencia na frico (molculas filamentosas - um eixo prepondera sobre o outro - tm menos mobilidade que molculas esfricas). Tambm, a carga de macromolculas bastante afetada pela presena de outros ons, alm do H+. Estes fatores ligados a forma e a carga podem dificultar a previso da mobilidade para macromolculas. Protenas do soro humano - Quando se permite que uma amostra de sangue coagule, obtem-se por centrifugao uma soluo denominada soro. Plasma a soluo obtida por centrifugao do sangue total na presena de anticoagulante. A diferena entre plasma e soro reside no fato de que o primeiro contm, alm das protenas do soro, fibrinognio, fibrina e fatores de coagulao. Estas trs ltimas protenas, no plasma esto em soluo. As protenas do plasma so classificadas em base ao comportamento eletrofortico, em seis categorias: Classe Porcentagem em relao ao total de protenas 55 Funo/Natureza Mantm a presso osmtica. Transportadora de nions orgnicos (ex. nion dos cidos graxos, de frmacos (ex. aspirina). Glicoprotenas e lipoprotenas HDL. Transportadoras de hemoglobinas livre no plasma (haptoglobina), de Cu2+, (ceruloplasmina) e Lipoprotenas VDL. Transportadores de Fe2+ (transferrina) e Lipoprotenas LDL Formador do cogulo Imunoglobulinas

Albumina

1-Globulinas 2-Globulinas

5 9

-Globulinas

13

Fibrinognio -Globulinas

7 11

A eletroforese de protenas do soro efetuada em papel de acetato de celulose embebido de tampo barbital-Tris (as extremidades da fita mergulhadas no mesmo tampo) em pH 8,6. Este pH maior que os pIs de todas as protenas normais (albumina e globulinas) de tal forma que elas se apresentam negativamente carregadas e migram em direo ao anodo (polo positivo). A albumina a mais negativa e a -globulina, a menos negativa das protenas. pH < pI macromolcula com carga positiva pH > pI macromolcula com carga negativa

pI

As -globulinas so sintetizadas por uma classe especial de linfcitos e as outras protenas plasmticas so produzidas pelo fgado. Desta forma, a anlise do resultado da eletroforese pode indicar uma possvel doena heptica. De fato, a eletroforese de protenas do soro constitui-se numa anlise clnica importante. Para maiores esclarecimentos, inclusive fotos de fita onde foi corrida uma eletroforese e sua respectiva densitometria, consultar o Biochemistry: a case-oriented approach (The C.V. Mosby Company) 5a ed. autores: Montagomery, Conway e Spector (pag. 67).

DOSAGEM DE PROTENA POR COLORIMETRIA A fotometria frequentemente usada para se determinar a concentrao de um composto que absorve luz monocromtica que est presente em soluo. A lei de Lambert e Beer permite afirmar que: A = abc ou seja, ao atravessar uma soluo transparente, a frao de luz absorvida A proporcional a uma constante a (absortividade molar), distncia b atravessada pela luz na soluo e concentrao molar c. Modificando-se convenientemente a constante, a absorbncia A pode ser relacionada com a concentrao em g/l. A equao derivada da lei de Lambert e Beer indica que a projeo de A versus c, mantida constante a distncia b atravessada pela luz na soluo, uma reta que passa pela origem. Dispondo-se de tal projeo possvel, a partir de valores de A, determinar graficamente as concentraes correspondentes. Neste procedimento o grfico A versus c chamado curva padro. O Mtodo do Biureto faz uso da propriedade de ons de Cu2+ em meio alcalino de formar ligaes com o nitrognio das ligaes peptdicas. Desta reao (reao de biureto) resulta uma colorao prpura intensa. Este fato pode ser explorado para se determinar colorimetricamente a quantidade de protenas em soluo. O Mtodo do Biureto mais apropriado para protenas cujas solues so incolores, ou seja para protenas no conjugadas (simples). A cor desenvolvida numa reao de ons de Cu2+ em meio alcalino com estas protenas deve-se unicamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a quantidade de tais ligaes. Deve-se lembrar que a quantidade de ligaes peptdicas proporcional massa da protena em soluo. Reforando o que foi dito acima, pode-se afirmar que esta reao, especfica para nitrognios peptdicos, ocorre em igual extenso para uma dada massa proteica qualquer que seja a natureza da protena em soluo.

PROCEDIMENTO (1) Eletroforese Retirar uma fita de acetato de celulose do banho de tampo (barbital-Tris pH 8,6). (Ateno: No manusear a fita, usar pina). Sec-la entre duas folhas de papel de filtro. Marcar com lpis o polo positivo e a partir dos pontos mdios dos lados maiores demarcar a origem com um trao muito leve. (Unir os pontos mdios dos lados maiores). Retornar a fita para o banho. Mergulhar, retirar e sec-la novamente.

Em seguida aplicar num ponto da origem uma pequena quantidade de mistura de citocromo c e albumina bovina. Sobre um outro ponto da origem, aplicar a amostra de soro humano. CUIDADO: as amostras de soro humano no esto testadas em relao a presena de microorganismos patognicos. USAR LUVA DE POLIETILENO PARA APLICAR AS AMOSTRAS. Montar as fitas no suporte da cuba de eletroforese com todos os polos positivos do mesmo lado. Fechar a cuba de correr a eletroforese com 5mA/fita durante 60 minutos. Desligar a corrente, mergulhar as fitas no corante Ponceau por 10 minutos e descorar com cido actico 5%.

Cuidados especiais - No tocar as fitas com a fonte da corrente contnua ligada. - Prestar ateno para o fato de que uma das faces da fita de acetato de celulose apresenta-se mais brilhante. Esta face, correspondente as costas da fita, contm uma pelcula de plstico no absorvente sobre o qual assenta-se a verdadeira matriz que suporta o tampo e as amostras, o acetato de celulose. As amostras devem ser aplicadas na parte opaca (face de acetato de celulose). - Antes de levar a fita com as aplicaes cuba, fazer uma pequena marca que a identifique como pertencente a um determinado grupo. A mistura de protenas contm: pI P.M. Albumina de soro bovino 4,7 66.500 Citocromo c 10,7 13.000 Com base a estes dados prever a posio de cada uma dessas protenas na fita ao final da operao. Justificar. Examinar o eletroforetograma das protenas do soro humano. Compar-lo com o resultado final da eletroforese de soro apresentado na literatura (p. ex. Biochemistry: A case-oriented approach, The C.V.Mosby Company, 5a ed., autores: Montgomery, Conway, e Spector, pg. 67).

3. DOSAGEM DE PROTENA PELO MTODO DO BIURETO Elaborar um protocolo para construir uma curva padro, para a qual se utilizar uma soluo estoque de Albumina de concentrao conhecida (8mg/ml) e 2,5 ml de Reagente de Biureto, num volume final de 4,0ml por tubo. Aps a adio do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 minutos a 37oC. Ler as absorbncias a 550 nm. Construir um tubo a partir de 1,0ml de Albumina de concentrao desconhecida, adicionar Biureto, completar o volume final a 4,0ml, medir a Absorbncia e determinar a concentrao desconhecida. Agradecimento: As amostras de soro humano foram cedidas pelo Laboratrio de Anlises Clnicas da FCFUSP. Agradecemos aos responsveis por este Laboratrio e em especial Profa.Dra. Ana Campa.

BIBLIOGRAFIA

01. Biochemistry: A Case-Oriented Approach, Montgomery, Conway e Spector, 5a ed., 1990. The C.V. Mosby Company (Ver pg. 65). 02. Biochemistry for Medical Sciences, Danishlfsky, 1980. Little, Brown and Company (Ver pgs. 34, 40 e 469). 03. Experimental Biochemistry, Clark e Switzer, 2a ed., 1977. W.H. Freeman and Company. 04. Outlines of Biochemistry, Conn e Stumpf, 4a ed., 1976. John Wiley & Sons, Inc. (Ver ltimas pgs. do livro, pgs. 587 a 609 - Apndice 2).

QBQ-211 - 1996 - LABORATRIO III CINTICA ENZIMTICA

OBJETIVO Estudar as influncias das concentraes de enzima e de substrato na velocidade de uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas, obter alguns parmetros cinticos (Km e Vmax) e discutir seus valores e importncia. INFORMAES GERAIS A enzima escolhida para este estudo a invertase de levedura que catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose. C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6 sacarose glicose frutose A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs da dosagem dos acares redutores formados (glicose e frutose). A dosagem baseiase na reao entre o cido 3,5 dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540 nm. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em moles de sacarose hidrolisada por minuto. Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (moles) de acares redutores formada, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (moles) de sacarose hidrolisada. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter os tubos em gelo durante a adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos, com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37oC para reagir. Transcorrido o tempo determinado , os tubos devem voltar todos juntos, simultaneamente, para o gelo. A a reao pra.

PROCEDIMENTO 1) Curva Padro Ateno: A curva padro ser fornecida na forma de um xerox do grfico A540 versus moles de sacarose hidrolisada. A finalidade da curva padro relacionar valores de absorbncia a 540 nm com moles de sacarose hidrolisada. Para construir a curva padro utiliza-se seis tubos (180 x 20 mm), conforme indicado abaixo, contendo volumes crescentes de soluo padro redutora (glicose 5,5 mM mais frutose 5,5 mM), completando o volume em cada tubo para 2,0 ml com tampo. Como no ocorrer hidrlise de sacarose nos tubos de 1 a 5, pode-se acrescentar logo em seguida ao tampo, o reagente DNS.

Tubos B 1 2 3 4 5

Sol. padro redutora(ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Sol. tampo pH 4,77(ml) 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0

Reagente DNS (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

A540 0,000

Sacarose hidrolisada (moles)

0,00

Aps a adio do DNS, colocar os tubos em banho-maria fervente por dez minutos. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 ml de gua destilada. HOMOGENEIZAR e ler as absorbncias a 540 nm (A540) contra o branco (tubo B). Construir um grfico A540 versus moles de sacarose hidrolisada (curva padro). 2) Efeito da CONCENTRAO DA ENZIMA Numerar sete tubos de ensaio (180 x 20 mm) e adicionar os reagentes segundo o protocolo abaixo: TUBOS NO GELO
Tubos

B 1 2 3 4 5 6

Sacarose 5% em tampo 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Tampo pH 4,77 (ml)

Sol. Enzima (ml)

Conc. de Enzima Micromolar

A540

Sacarose hidrolisada por min(moles/min)

1,0 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1 -

0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0

0,00

0,000

0,00

Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos de uma temperatura de 0oC e coloc-los simultaneamente em banho-maria a 37oC. MARCAR o tempo inicial. Incubar a 37oC por 5 minutos. Transcorrido este tempo, os tubos devem voltar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao pra. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 ml de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima em pH muito alto, pra de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 minutos. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 ml de gua destilada em cada tubo. AGITAR com inverso da posio na vertical (3 vezes). Ler as absorbncias a 540 nm. Fazer um grfico colocando a concentrao da enzima microM nas abcissas e nas ordenadas a velocidade de hidrlise expressa em moles de sacarose hidrolisada por minuto. Durante a aula de laboratrio ser fornecido valor da concentrao da enzima (microM) na soluo estoque.

3) Efeito da CONCENTRAO DE SUBSTRATO Numerar sete tubos de ensaio (180 x 20 mm) e adicionar os reagentes segundo o protocolo a seguir:

TUBOS NO GELO
Tubos

B 1 2 3 4 5 6

Sacarose 5% em tampo 0,05 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0

Tampo pH 4,77 (ml)

Sol. Enzima (ml)

Conc. de Substrato Milimolar

A540

Sacarose hidrolisada por min(moles/min)

1,5 1,45 1,40 1,20 1,0 0,8 0,5

0.5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,00

0,000

0,00

Proceder EXATAMENTE como no caso do estudo do efeito da concentrao da enzima (tem anterior). Fazer um grfico da velocidade (moles de sacarose hidrolisada/min.) versus concentrao inicial do substrato (mM de sacarose). Estimar os valores de Vmax e Km. Fazer o grfico de Lineweaver e Burk e calcular os valores de Vmax e Km. Comparar o valor de Km com o encontrado na literatura.

ANLISE DOS RESULTADOS E DISCUSSO

1). Discutir curvas obtidas para: a) efeito da concentrao da enzima b) efeito da concentrao de substrato 2). Elaborar um protocolo para estudar o efeito do pH sobre a atividade enzimtica.

Consultar na biblioteca: 1. The enzymes, Boyer (editor) (1971) vol. 5, cap. 10 2. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica, Villela, Bacila e Tastaldi, (1973) cap. 4, pags 222 a 232. 3. Asare-Brown, E. and Bullock, C., Simple Practical Investigations Using Invertase, Biochem.Educ. (1988), 16, 98-100.

QBQ 211 - 1996 - LABORATRIO IV LIPOSSOMOS e LIPOPEROXIDAO EM UM MODELO DE MEMBRANA

OBJETIVOS 1. Ilustrar o uso de lipossomos como modelo de membrana. 2. Incorporar um marcador colorido (azul de metileno, AM) em lipossomos de asolecitina e separar AM incorporado de AM extralipossomal por dilise. 3. Observar um dos efeitos deletricos da lipoperoxidao em membranas.

FUNDAMENTOS Lipossomos Membranas biolgicas cumprem inmeras funes: organizam molculas em diferentes compartimentos, limitam microambientes adequados para funes vitais e controlam o transporte de vrias substncias. Visando uma simplificao estrutural e qumica das membranas naturais foram propostos diversos sistemas-modelo de membrana. Lipdeos extrados de membranas podem ser utilizados para a preparao de diversos sistemas reconstitudos que permitem reproduzir, de forma selecionada e simplificada, alguns dos fenmenos que ocorrem em membranas naturais (1). Lipossomos so constitudos por mltiplas bicamadas concntricas de fosfolipdeos (2) e podem ser formados por simples agitao de lipdeos em soluo aquosa. Tm sido utilizados para se medir permeao passiva de vrios ons e molculas (3). Como a maior parte do lipdeo est presente na forma multilamelar, o volume sequestrado por mol de lipdeo (eficincia de incorporao) relativamente baixo em comparao com aquele de uma populao constituda por vesculas. Neste experimento, vamos primeiramente incorporar o azul de metileno (AM) em lipossomos de asolecitina. Estimaremos a porcentagem de incorporao usando a propriedade do azul de metileno de absorver luz visvel (660nm). Para isso eliminaremos a turbidez das partculas lipossomais micelizando-as com um detergente. Numa segunda etapa, como a asolecitina extrada de soja especialmente rica em lipdeos com cadeias insaturadas (4), os lipossomos de asolecitina sero utilizados para se observar um dos efeitos deletrios da lipoperoxidao, o aumento de permeao do AM. Lipoperoxidao Vrias evidncias recentes sugerem que radicais livres (e/ou espcies ativas de oxignio) tm um importante papel em vrios processos fisiolgicos e patolgicos (5,6). Dentre esses pode-se citar a atividade microbicida das clulas do sistema imune, o envelhecimento, a carcinognese, a artrite reumatide, as injrias decorrentes de processos de isquemia e reperfuso, a catarata, os efeitos teraputicos e colaterais de drogas, etc (6). Alguns dos efeitos deletrios de radicais livres parecem envolver lipoperoxidao das membranas biolgicas. Essas so frequentemente ricas em lipdeos insaturados e esto banhadas por fludos que contm metais de transio e oxignio. Tais condies favorecem a peroxidao de lipdeos porque os ons metlicos ajudam a quebrar a regra da conservao do spin que torna lenta as reaes entre o oxignio e molculas orgnicas. A peroxidao de lipdeos um processo radicalar constitudo por uma cadeia de reaes com trs estgios: Iniciao, Propagao e Terminao. Iniciao LH L + H (1)

Propagao Terminao

L + O2 LOO LOO + LH LOOH + L LOO + L LOOL LOO + LOO LOOL + O2, etc

(2) (3) (4) (5)

A iniciao da lipoperoxidao pode ser promovida por enzimas ou agentes qumicos. Dentre esses, esto os agentes redutores como a vitamina C (cido ascrbico) em presena de metais de transio, como Fe(III). O mecanismo pelo qual ascorbato e Fe(III) complexado iniciam a peroxidao no est completamente elucidado mas parece envolver a formao do radical hidroxila, uma espcie extremamente reativa (6). Obviamente, processos enzimticos que geram o radical hidroxila tambm podem iniciar a lipoperoxidao. O radical hidroxila, ou outros radicais livres, podem abstrair um tomo de hidrognio da cadeia de cido graxo, iniciando a cadeia de reaes (eq 1-5) que resulta em consumo de oxignio, rearranjo das duplas nos lipdeos insaturados e, eventualmente, destruio dos lipdeos com produo de uma srie de produtos menores tais como aldedos, lcoois e hidrocarbonetos (Esquema 1). O malondialdedo, apesar de corresponder a apenas 5% do total de produtos dos lipdeos, tem sido um importante indicador de lipoperoxidao em membranas biolgicas porque forma um produto colorido com o cido tiobarbitrico (TBA) que absorve intensamente a 535nm ( = 1.56 x 105 M-1 cm-1) (Esquema 1).

Esquema 1: Representao esquemtica da lipoperoxidao e de mtodos analticos utilizados para detect-la.

PROCEDIMENTO (7) 1) Determinao da porcentagem de incorporao. Lipossomos 10mM sero obtidos por vortexao de asolecitina (L--fosfatidilcolina de soja tipo IV - S, Sigma Chemical Company, grau comercial) em soluo 0.2mM de azul de metileno (AM). Quatro alquotas de lipossomos com azul de metileno (LAM) de 1.0 ml cada sero submetidas a um processo de dilise em tubos de celofane contra gua (2 l) sob agitao constante com barra magntica (0.5h). Como controle, simultaneamente ser dialisada uma soluo de azul de metileno 0.2mM (AM) (1.0 ml). Aps a dilise, uma das quatro tripas contendo lipossomos (LAM) ser rompida para determinao da porcentagem da incorporao, que dada por: A2c A2 % incorporao = 100. , onde, A1c A1 A1 e A2 so as absorbncias a 660nm de uma alquota de 0.2ml de LAM adicionada a 2ml de gua e 1 ml de TRITON X-100 (1%) antes e depois da dilise, respectivamente. A1c e A2c so as absorbncias a 660nm de uma alquota de 0.2ml da soluo de azul de metileno 0.2mM (AM) adicionada a 2ml de gua e 1ml de TRITON X-100 (1%) antes e depois da dilise, respectivamente. Os dados a serem obtidos esto sumarizados na Tabela I. TABELA I Dilise e determinao da porcentagem de incorporao de AM em lipossomos de asolecitina AMOSTRAS* ABSORBNCIA 660nm % DE INCORPORAO ANTES DA APS A DILISE DILISE LAM A1 = A2 = AM A1c = A2c = *Note bem que as leituras de absorbncias a 660nm so feitas em 0.2ml de amostra, 2ml de gua e 1ml de TRITON X-100. Como branco pode-se usar 3ml de gua destilada 2) Determinao da permeao de AM induzida pela lipoperoxidao Para induzir a lipoperoxidao, utilizaremos o sistema cido ascrbico/Fe3+/EDTA. Em um tubo CONTROLE I (CI) adicionaremos uma das trs tripas dialisadas contendo lipossomos (LAM) e 9.0ml de gua. Em outro tubo CONTROLE II (CII) adicionaremos outra das trs tripas, 7.0ml de gua e 2.0ml de cido ascrbico (AA) 10mM. No terceiro tubo TESTE (T), coloca-se a terceira tripa, 5.0ml de gua, 2.0ml de AA 10mM e 2.0ml de Fe3+/EDTA 1mM. Os trs tubos sero ento incubados durante 0.5h a 40oC sob agitao. Aps esse perodo de incubao, ser feita a leitura de absorbncia a 660nm de alquotas de 3ml de cada uma das solues externas s tripas em CI, CII e T. As leituras de absorbncia a 660nm devem preencher a Tabela II. Uma vez feitas as leituras, as alquotas da soluo externa devem ser devolvidas aos respectivos tubos de origem e as tripas arrebentadas. O contedo interno das tripas recolhido junto com a soluo externa.

Para determinar a extenso de lipoperoxidao, alquotas de 1ml de CI, CII e T sero adicionadas a 2ml do reagente TBA. Como BRANCO , ser usado 1ml de gua adicionados a 2ml de TBA. As quatro amostras assim obtidas sero incubadas a 100oC durante 15min. Aps esfriar, sero lidas as absorbncias a 535nm. Essas leituras permitem preencher a Tabela III. TABELA II Permeao do azul de metileno induzida pela lipoperoxidao SOLUES EXTERNAS S TRIPAS APS INCUBAO A660 CONTROLE I (CI) (gua + LAM) CONTROLE II (CII) (gua + c. ascrbico + LAM) TESTE (T) (gua + c. ascrbico + Fe3+/EDTA + LAM)

TABELA III Lipoperoxidao em lipossomos de asolecitina induzida pelo sistema cido ascrbico/Fe3+/EDTA. VOLUME DA TBA* AMOSTRA A535 LIPOPEROXIDAO (%) AMOSTRA (ml)
(ml)

gua (BRANCO) 9.0 ml gua + tripa c/ 1.0ml de LAM (CONTROLE I) (CI) 7.0 ml gua + tripa c/ 1.0ml de LAM + 2.0ml de AA 10mM (CONTROLE II) (CII) 5.0 ml gua + tripa c/ 1.0ml de LAM + 2.0ml de AA 10mM + 2.0 ml de Fe3+/EDTA 1mM (TESTE) (T)

1 1 1

2 2 2

*TBA uma soluo contendo 1% do agente micelizante TRITON X-100, HCl 0.25M e 0.375% de cido tiobarbitrico.

ANLISE DOS RESULTADOS E DISCUSSO

01. Calcule a porcentagem de incorporao do AM em lipossomos de asolecitina. Use a expresso fornecida. 02. O que se pode dizer da permeabilidade dos lipossomos de asolecitina ao azul de metileno com os seus dados de dilise? 03. Calcule a porcentagem de lipoperoxidao de seus lipossomos nas diferentes condies experimentais (CI, CII e T) s quais foram submetidos. Considere que o malondialdeido corresponde a apenas 5% da lipoperoxidao total. 04. Discuta o efeito da lipoperoxidao sobre a permeao do azul de metileno atravs das membranas lipossomais.

BIBLIOGRAFIA

01. Gomperts, D.D. (1977) - "The Plasma Membrane: Models for Structure and Function", Academic Press (London). 02. Bangham, A.D.; Standish, M.M. e Watkins, J.C. (1965) - J. Mol. Biol. 13, 238. 03. Bangham, A.D.; de Gier, J. e Greville, G.D. (1967) - Chem. Phys. Lipids 1, 225. 04. Kagawa, Y. e Racker, E. (1966) - J. Biol. Chem. 241, 2467. 05. Meneghini, R. (1987) - A toxicidade do oxignio, Cincia Hoje, 5, 57. 06. Halliwell, B. e Gutteridge, J.M.C. (1985) - Free Radicals in Biology & Medicine, Claredon Press, Oxford. 07. Augusto, O. e Carmona-Ribeiro, A.M. (1989) - Introducing Model Membranes and Lipoperoxidation, Biochemical Education 17(4), 209.

QBQ-211 - 1996 - LABORATRIO V

I - FRACIOAMENTO CELULAR E VERIFICAO DA ATIVIDADE DA SUCCINATO DESIDROGENASE.
Fracionamento celular - Sacrificar um rato por concusso cerebral. Remover o fgado, mergulh-lo em 20 ml de uma soluo de sacarose 0,25 M, previamente resfriada a 0o C e pic-lo bem com tesoura. Decantar a sacarose adicionar outros 20 ml e tornar decantar. Adicionar 20 ml sacarose 0,25 M, tambm gelada. Homogeneizar o fgado e centrifugar a 800 x g (4.000 rpm) por 10 minutos. Decantar o sobrenadante e centrifug-lo a 10.000 x g (10.000 rpm) por 30 minutos. Decantar este precipitado. Recolher o sobrenadante em tubo de ensaio e conserv-lo no gelo. Esta ser a frao celular I.

VERIFICAO DA ATIVIDADE DA SUCCINATO DESIDROGENASE O azul de metileno pode apresentar-se na forma oxidada (azul) ou reduzida (incolor). A reduo do azul de metileno pode ser obtida a partir da oxidao do succinato, catalisada pela succinato desidrogenase. Seguir o protocolo 1. Para verificar a oxidao do succinato, as fraes devem ser incubadas a 37oC, por 10 minutos. Antes de iniciar a experincia, o grupo deve: 1. escrever a reao que est sendo analisada; 2. discutir as funes de succinato, sacarose, azul de metileno e leo mineral; 3. planejar o controle da experincia.

II - INIBIO DA SUCCINATO DESIDROGENASE POR MALONATO

Sabendo em que frao celular se encontra a atividade da succinato desidrogenase, observe a inibio competititva da enzima por malonato, um processo historicamente importante na elucidao das etapas de ciclo de Krebs. Voc utilizar a reduo do MTT via succinato desidrogenase: o MTT amarelo quando oxidado e violeta quando reduzido, no sendo reoxidado pelo O2 do ar. Seguir o protocolo 2. Deixe os tubos 10 minutos temperatura ambiente e compare suas cores. Se a reao estiver lenta (isto depender da sua preparao mitocondrial), aquea os tubos a 37oC por 5 minutos e os compare novamente. NO ESQUEA, a inibio competitiva, existe o fator cintico e voc dever fazer as comparaes ATENTAMENTE A CURTOS INTERVALOS DE TEMPO.

III - DETERMINAO DO PONTO DE AO DE DROGAS NA CADEIA DE TRANSPORTE DE ELTRONS. Esta determinao deve ser feita com o uso de aceptores e doadores artificiais de eltrons: a escolha dos aceptores e doadores artificiais de eltrons deve ser feita consultando as tabelas que se seguem. Os aceptores e doadores so fornecidos na forma oxidada, com exceo do reagente p-fenilenodiamina.

PAR REDOX NADH / NAD+ Succinato / Fumarato FADH2 / FAD Azul de Metileno red/ox Cit b (Fe2+) / Cit B (Fe3+) Cit c1 (Fe2+) / Cit c1 (Fe3+) Cit c (Fe2+) / Cit c (Fe3+) Cit a-a3 (Fe2+) / Cit a-a3 (Fe3+) H2O / 1/2 O2 ACEPTORES E DOADORES ARTIFICIAIS Piocianina red/ox 2,6-diclorofenolindofeno (DCPI) red/ox Benzil Violgeno red/ox Ferricianeto Fe(CN)64-/Fe (CN)63p. fenilenodiamino (p-FDA) red/ox

Eo' -0,32 -0,03 0,00 0,01 0,06 0,22 0,25 0,40 0,82 Eo' -0,34 0,20 -0,36 0,36 0,27

COR DOS ACEPTORES E DOADORES ARTIFICIAIS NAS FORMAS REDUZIDA E OXIDADA. REDUZIDO Piocianina 2,6-diclorofenolindolenol (DCPI) Benzil violgeno Ferricianeto p-fenilenodiamino (p-FDA) incolor incolor incolor incolor incolor OXIDADO azul azul violeta amarelo violeta VOLUME UTILIZADO 0,1 0,3 0,3 0,2 0,5

Seguir o protocolo 3 Incubar os tubos a 37oC por 10 minutos e discutir o resultado com os colegas, identificando a droga A e B.

PROTOCOLO 1
TUBO Tampo A Sacarose 0, 7 M Succinato 0,5 M Azul de Metileno gua Destilada Frao Celular Nujol 1 0,3 ml 1,0 ml 0,1 ml 1,5 ml 0,1 (I) 0,5 cm 2 0,3 ml 1,0 ml 0,1 ml 1,5 ml 0,1 (II) 0,5 cm 3 0,3 ml 1,0 ml 0,2 ml 0,1 ml 1,3 ml 0,1 (I) 0,5 cm 4 0,3 ml 1,0 ml 0,2 ml 0,1 ml 1,3 ml 0,1 (II) 0,5 cm 5 0,3 ml 1,0 ml 0,2 ml 0,1 ml 1,4 ml 0,5 cm

QBQ-211 - 1996 - LABORATRIO VI TRANSAMINAO

OBJETIVO: Verificar a reao de transaminao em homogenato de fgado. INTRODUO A transaminao consiste na transferncia reversvel do grupo amino de um aminocido a um cetocido sem que o grupo -NH2 ou -NH+3 fique livre no meio aquoso. O aminocido perde o grupo amino e se converte no cetocido correspondente e o cetocido que ganha o grupo amino se converte no aminocido respectivo. As transaminases se econtram na maioria dos tecidos animais. Todos os aminocidos que fazem parte das protenas participam em transaminaes enzimticas, com exceo da lisina Nesta experincia se identificaro os produtos de uma reao de transaminao por meio de cromatografia em papel. MTODO Uma alquota de um homogenato de fgado ser incubada com um aminocido e um cetocido. A identificao dos produtos da reao ser feita por cromatografia em papel. PREPARAO DO HOMOGENATO DE FGADO DE RATO O Fgado de um rato picado e lavado 2 vezes com 20 ml de tampo fosfato 0,05 M, pH 7,4 e em seguida homogeneizado com 10 ml deste tampo fosfato. Este homogenato centrifugado a 800 x g por 15 minutos para eliminar clulas no destrudas e ncleos. O sobrenadante decantado em um tubo de ensaio mantido em gelo e esta frao consiste na preparao enzimtica. Notar que no necessria a enzima pura para que esta catalise a reao. REAO DE TRANSAMINAO O sistema completo de reao composto por um aminocido, um cetocido, a preparao enzimtica, arsenito de sdio (NaAsO2) e um tampo. O arsenito empregado com a finalidade de evitar a oxidao posterior dos cetocidos pelo sistema enzimtico presente no hepatcito. MISTURA DE REAO -cetoglutarato 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 ml Alanina 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 ml Prep. enzimtica - 0,2 ml Tampo fosfato 0,05 M, pH 7,4 - 0,2 ml Arsenito de Sdio 0,2 M - 0,2 ml Incubar a 37o C por 30 minutos. Em seguida colocar em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar por 10 minutos em centrfuga Eppendorf. Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padres adequados.

CROMATOGRAFIA Em um papel de filtro Whatman no 1 (10x20 cm) traar com lpis uma linha a 2,5 cm da origem e marcar pontos com 2,5 cm de distncia entre si. Colocar padres de alanina, glutamato, piruvato e -cetoglutarato, mistura de reao, branco* e 2,4-dinitrofenilhidrazina. Sobre os pontos onde foram aplicados o -cetoglutarato, piruvato e mistura de reao, adicionar uma aplicao capilar de 2,4-dinitrofenilhidrazina. O solvente utilizado para a cromatografia ser n-Butanol/Etanol/NH4OH (0,5N). (70:20:30). Aps o solvente chega a 1 cm do final do papel, marcar a frente do solvente, secar o papel, marcar as manchas amarelas dos produtos de reao da 2,4-dinitrofenilhidrazina e os -cetocidos, e revelar o cromatograma com ninhidrina.
*

branco: mistura de apenas alanina e -cetoglutarato.