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Neusely da Silva Valria Christina Amstalden Junqueira Neliane Ferraz de Arruda Silveira Marta Hiromi Taniwaki Rosana Franscisco

Siqueira dos Santos Renato Abeilar Romeiro Gomes Margarete Midori Okazaki

MANUAL DE MTODOS DE ANLISE MICROBIOLGICA DE ALIMENTOS

So Paulo LOGOMARCA VARELA 3 edio 2007

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Projeto grfico: Danclar Rossato - (55) 30284824 - e-mail: drossato@via-rs.net Capa: Danclar Rossato Reviso: autor Figuras: autor Impresso: Pallotti - SM Tiragem: ????????????????

E24

Educao inclusiva e necessidades educacionais especiais / Soraia Freitas, David Rodrigues, Ruy Krebs (orgs.). Santa Maria, Ed. UFSM, 2005. p. ISBN: 1. Educao 2. Educao especial 3. Incluso escolar 4. Incluso social 5. Portadores de necessidades especiais I. Freitas, Soraia Napoleo II. Rodrigues, David III. Krebs, Ruy Jornada CDU 376.1/.5

Ficha catalogrfica elaborada por Maristela Eckhardt CRB-10/737 Biblioteca Central - UFSM

Obra financiada pela CAPES, entidade do Governo Brasileiro voltada para a formao de Recursos Humanos.

Direitos reservados Editora da Universidade Federal de Santa Maria Prdio da Reitoria 2 andar Campus Universitrio Camobi 97105-900 Santa Maria RS Fone/fax: (055)3220.8610 e-mail: editora@ctlab.ufsm.br

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Sumrio

Captulo 1. Coleta, transporte e estocagem de amostras para anlise


1.1. Introduo ................................................................................................................................................. Lote ........................................................................................................................................................... Amostra de lote e unidade de amostra ................................................................................................. Planos de amostragem de lotes .............................................................................................................. Unidade analtica .................................................................................................................................... 1.2. Material necessrio .................................................................................................................................. 1.3. Coleta de amostras para anlise ............................................................................................................. 1.3.1. Seleo e preparao de frascos para coleta de alimentos acondicionados em embalagens no individuais ....................................................................... 1.3.2. Procedimentos para a coleta de alimentos acondicionados em embalagens no individuais ......................................................................................................... 1.3.3. Coleta de alimentos envolvidos em casos de doenas de origem alimentar (DTAs) ............ 1.3.4. Coleta de amostras de gua ......................................................................................................... 1.4. Transporte e estocagem de amostras at o momento da anlise ....................................................... 1.4.1. Transporte e estocagem de alimentos com baixa atividade de gua ...................................... 1.4.2. Transporte e estocagem de alimentos congelados .................................................................... 1.4.3. Transporte e estocagem de alimentos refrigerados .................................................................. 1.4.4. Transporte e estocagem de alimentos comercialmente estreis em embalagens hermticas ......................................................................................................... 1.4.5. Transporte e estocagem de amostras de gua ........................................................................... 1.5. Recepo de amostras para a anlise ..................................................................................................... 1.6. Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 2. Preparao de amostras para anlise


2.1. Introduo ................................................................................................................................................ 2.2. Material ncessrio .................................................................................................................................... 2.3. Homogeneizao da amostra e retirada da unidade analtica ........................................................... 2.3.1. Procedimento para a homogeneizao e retirada da unidade analtica de produtos lquidos .................................................................................................................... 2.3.2. Procedimento para a homogeneizao e retirada da unidade analtica de produtos slidos ou lquidos concentrados .......................................................................... 2.3.3. Procedimento para a retirada da unidade analtica pela tcnica do esfregao de superfcie .......................................................................................................... 2.3.3.1. Amostragem com swabs ............................................................................................... 2.3.3.2. Amostragem com esponjas .............................................................................................

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2.3.4. Procedimento para a retirada da unidade analtica pela tcnica da lavagem superficial .... 2.3.4.1. Procedimento para a lavagem de carcaas de aves ..................................................... 2.3.4.2. Procedimento para a lavagem de outros alimentos .................................................... 2.3.4.3. Procedimento para a lavagem de embalagens ............................................................ 2.3.5. Guarda de contra-amostras .......................................................................................................... 2.4. Preparo da 1 diluio da unidade analtica ........................................................................................ Diluentes para os ensaios de presena/ausncia ................................................................................. Diluentes para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra .............................. Diluentes para os ensaios gerais de quantificao ................................................................................ Como obter uma diluio inicial 1:10 (10-1) ......................................................................................... Como obter uma diluio inicial diferente de 1:10 ............................................................................. Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras lquidas ........................................ Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras slidas ou lquidos concentrados ........................................................................................................................ Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras obtidas por esfregao de superfcie ou por lavagem superficial ..................................................................... 2.5. Diluio decimal seriada da amostra ..................................................................................................... Como obter a 2 diluio (10-2) .............................................................................................................. Como obter as diluies subsequentes .................................................................................................. 2.6. Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 3. Tcnicas bsicas de contagem de microrganismos em placas


3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. Introduo ................................................................................................................................................ Plaqueamento em profundidade (pour plate) ................................................................................ Plaqueamento em superfcie (spread plate) .................................................................................... Plaqueamento em gotas (drop plate) ................................................................................................ Filtrao em membrana .......................................................................................................................... Contagem das colnias e clculo dos resultados .................................................................................. Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 4. Tcnicas bsicas de contagem de microrganismos pelo Nmero Mais Provvel


4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. Introduo ................................................................................................................................................ Teste de diluio mltipla ...................................................................................................................... Teste de diluio nica ........................................................................................................................... Clculo dos resultados ............................................................................................................................. Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 5. Tcnicas bsicas de deteco da presena/ausncia de microrganismos


5.1. Introduo ................................................................................................................................................ 5.2. Material requerido nas anlises .............................................................................................................. 5.3. Procedimento .......................................................................................................................................... a) Pr enriquecimento .......................................................................................................................... Composio de amostras a seco ........................................................................................................ b) Enriquecimento seletivo ................................................................................................................... Composio mida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento .................... c) Plaqueamento diferencial ................................................................................................................ c.1) Tcnica de inoculao por estrias de esgotamento para obter culturas puras ................... d) Seleo de colnias e repique de culturas para confirmao .......................................................

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Tcnica de repique de culturas puras a partir de colnias isoladas em placas ........................... e) Testes de confirmao ....................................................................................................................... e.1) Colorao de Gram (mtodo de Hucker) .............................................................................. e.2) Colorao de esporos (mtodo de Schaeffer-Fulton) ........................................................... e.3) Colorao de esporos (mtodo de Ashby) .............................................................................. e.4) Montagens midas para observao microscpica a fresco ................................................... 5.4. Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 6. Contagem total de microrganismos aerbios mesfilos e psicrotrficos em placas


6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. Introduo ................................................................................................................................................ Mtodo de contagem total de aerbios mesfilos em placas .............................................................. Mtodo de contagem total de aerbios mesfilos em Petrifilm ................................................... Mtodo de contagem total de aerbios psicrotrficos ......................................................................... Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 7. Contagem de bolores e leveduras


7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. Introduo ................................................................................................................................................ Mtodo de contagem de bolores e leveduras em placas ..................................................................... Mtodo de contagem de fungos psicrotrficos .................................................................................... Mtodo de contagem de bolores termorresistentes ............................................................................ Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 8. Contagem de enterobactrias


8.1. Introduo ................................................................................................................................................ Taxonomia ................................................................................................................................................ Mtodos de anlise .................................................................................................................................. 8.2. Mtodo de contagem em placas de VRBG ........................................................................................... 8.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ........................................................................................... 8.4. Mtodo do Petrifilm ....................................................................................................................... 8.5. Referncias ...............................................................................................................................................

Captulo 9. Contagem de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli


9.1. Introduo ................................................................................................................................................ Definio de coliformes totais ................................................................................................................ Defnio de coliformes termotolerantes .............................................................................................. E. coli ............................................................................................................................................... Aplicao como indicadores ................................................................................................................... Mtodos de anlise .................................................................................................................................. 9.2. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) (coliformes totais/termotolerantes/E. coli) ................. 9.3. Mtodo de plaqueamento em VRB (coliformes totais) ...................................................................... 9.4. Mtodo do ColiComplete AOAC 992.30 (Coliformes totais/E. coli) .............................................. 9.5 Mtodo do Petrifilm (coliformes totais/E. coli) ................................................................................ 9.6. Referncias ..............................................................................................................................................

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Captulo 10. Staphylococcus aureus


10.1. Introduo .............................................................................................................................................. Principais caractersticas de S. aureus ............................................................................................ Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 10.2. Mtodo de contagem direta em placas ............................................................................................... 10.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ......................................................................................... 10.4. Teste de presena/ausncia ................................................................................................................. 10.5. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 11. Bacillus cereus


11.1. Introduo .............................................................................................................................................. Grupo B. cereus ............................................................................................................................... B. anthracis ..................................................................................................................................... B. thuringiensis ................................................................................................................................ B. mycoides ...................................................................................................................................... B. pseudomycoides ............................................................................................................................. B. weihenstephanensis ....................................................................................................................... Principais caractersticas de B. cereus ............................................................................................. Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 11.2. Mtodo de contagem direta em placas ............................................................................................... 11.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ......................................................................................... 11.4. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 12. Clostrdios sulfito redutores e Clostridium perfringens


12.1. Introduo .............................................................................................................................................. Principais caractersticas de C. perfringens ...................................................................................... Clostrdios sulfito redutores a 46C ..................................................................................................... Mtodos de anlise de C. perfringens .............................................................................................. Mtodos de anlise de clostrdios sulfito redutores a 46C ............................................................... 12.2. Mtodo de plaqueamento direto (C. perfringens) ............................................................................... 12.3. Teste de presena/ausncia (C. perfringens) ....................................................................................... 12.4. Mtodo de contagem em placas (clostrdios sulfito redutores a 46C) ........................................... 12.5. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 13. Contagem de enterococos


13.1. Introduo .............................................................................................................................................. Importncia em alimentos .................................................................................................................... Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 13.2. Mtodo de contagem em placas .......................................................................................................... 13.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ......................................................................................... 13.4. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 14 Contagem de bactrias lticas


14.1. Introduo .............................................................................................................................................. Leuconostoc ...................................................................................................................................... Pediococcus .................................................................................................................... ................... Streptocccus .......................................................................................................................................

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Sumrio

Lactobacillus .................................................................................................................................... Enterococcus ...................................................................................................................................... Lactococcus ....................................................................................................................................... Carnobacterium ................................................................................................................................ Vagococcus ....................................................................................................................................... Tetragenococcus ................................................................................................................................ Weissella .......................................................................................................................................... Oenococcus ....................................................................................................................................... Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 14.2. Mtodo de contagem em placas .......................................................................................................... 14.3. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ......................................................................................... 14.4. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 15. Campylobacter


15.1. Introduo .............................................................................................................................................. Taxonomia .............................................................................................................................................. Patogenicidade ...................................................................................................................................... Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 15.2. Mtodo de presena/ausncia ISO 10272-1 (2006) ......................................................................... 15.3. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 16. Enterobacter sakazakii


16.1. Introduo .............................................................................................................................................. Taxonomia .............................................................................................................................................. Caractersticas nutricionais e de crescimento .................................................................................... Epidemiologia ........................................................................................................................................ Ecologia ................................................................................................................................................... Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 16.2. Mtodo de presena/ausncia ISO/TS 22964 (2006) ..................................................................... 16.3. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 17. Escherichia coli O157:H7


17.1. Introduo .............................................................................................................................................. Sorotipagem ........................................................................................................................................... Patogenicidade ...................................................................................................................................... Sorotipos STEC mais envolvidos em surtos ......................................................................................... E. coli O157:H7 em alimentos ............................................................................................................... Taxonomia .............................................................................................................................................. Mtodos de deteco ............................................................................................................................ 17.2. Mtodo BAM/FDA ................................................................................................................................ 17.3. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 18. Listeria monocytogenes


18.1. Introduo .............................................................................................................................................. Taxonomia .............................................................................................................................................. Patogenicidade ...................................................................................................................................... Mtodos de anlise ................................................................................................................................

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18.2. 18.3. 18.4. 18.5

Mtodo BAM/FDA ................................................................................................................................ Mtodo MLG/FSIS/USDA ................................................................................................................... Mtodo de plaqueamento direto ......................................................................................................... Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 19. Salmonella


19.1. Introduo .............................................................................................................................................. Classificao taxonmica de Salmonella ......................................................................................... Classificao sorolgica de Salmonella ............................................................................................ Caractersticas bioqumicas de Salmonella Epidemiologia ........................................................................................................................................ Mtodos tradicionais de anlise de Salmonella ............................................................................... Mtodos alternativos de anlise de Salmonella ............................................................................... Composio de amostras para a anlise ............................................................................................... 19.2. Mtodo ISO 6579 (2002)...................................................................................................................... 19.3 Mtodo BAM/FDA (2005) ................................................................................................................... 19.4. Mtodo MLG/FSIS/USDA ................................................................................................................... 19.5. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 20. Vibrios patognicos


20.1. Introduo .............................................................................................................................................. Taxonomia .............................................................................................................................................. Epidemiologia ........................................................................................................................................ V. cholerae ....................................................................................................................................... V. parahaemolyticus .......................................................................................................................... V. vulnificus ..................................................................................................................................... Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 20.2. Mtodo APHA/BAM/FDA (presena/ausncia de Vibrio cholerae) ................................................. 20.3. Mtodo APHA/BAM/FDA (NMP de Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus) ............................. 20.4. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 21. Yersinia enterocolitica


21.1. Introduo .............................................................................................................................................. Taxonomia .............................................................................................................................................. Epidemiologia ........................................................................................................................................ Mtodos de anlise ................................................................................................................................ 21.2. Mtodo APHA de deteco .................................................................................................................. 21.3. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 22. Contagem de esporos de bactrias


22.1. Introduo .............................................................................................................................................. 22.1.1. Taxonomia das bactrias esporognicas importantes em alimentos .................................... Bacillus ................................................................................................................................ Clostridium ........................................................................................................................... Sporolactobacillus ................................................................................................................... Desulfotomaculum ................................................................................................................. Alicyclobacillus ......................................................................................................................

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Sumrio

22.2. 22.3. 22.4. 22.5. 22.6. 22.7. 22.8.

Thermoanaerobacterium ......................................................................................................... Paenibacillus ......................................................................................................................... Aneurinibacillus .................................................................................................................... Brevibacillus .......................................................................................................................... Virgibacillus .......................................................................................................................... Geobacillus ............................................................................................................................ Mtodos de contagem de esporos de termfilos aerbios totais e flat sour ................................. Mtodos de deteco de esporos de termfilos anaerbios no-produtores de H2S ..................... Mtodos de contagem de esporos de termfilos anaerbios produtores de H2S .......................... Mtodos de contagem de esporos de mesfilos aerbios .................................................................. Mtodos de contagem de esporos de mesfilos anaerbios ............................................................. Mtodos para deteco ou contagem de Alicyclobacillus ................................................................ Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 23. Esterilidade comercial ou causa da deteriorao


23.1. Introduo .............................................................................................................................................. 23.1.1. Parmetros de avaliao da resistncia trmica dos microrganismos ................................... Curva de sobrevivncia e tempo de reduo decimal (valor D) .......................................... Nmero de redues decimais ................................................................................................ Curva de destruio trmica e coeficiente de temperatura (valor z) ................................. 23.1.2. Valores D e z de microrganismos de importncia em alimentos .......................................... Clulas vegetativas ...................................................................................................................... Esporos de bolores termorresistentes ...................................................................................... Esporos de bactrias ................................................................................................................... 23.1.3. Dimensionamento de processos trmicos ............................................................................... 23.1.4. Deteriorao microbiana de alimentos enlatados .................................................................. Subprocessamento ..................................................................................................................... Vazamento .................................................................................................................................. Deteriorao por termfilos estritos ........................................................................................ Multiplicao microbiana antes do tratamento trmico ........................................................ Causas no microbianas de deteriorao ................................................................................. 23.2. Teste de esterilidade comercial e determinao da causa da deteriorao de alimentos de baixa acidez ......................................................................................... 23.3. Teste de esterilidade comercial e determinao da causa da deteriorao de alimentos cidos ................................................................................................................................ 23.4. Referncias .............................................................................................................................................

Captulo 24. Cuidados na preparao de meios de cultura e reagentes para anlises microbiolgicas
24.1. Introduo 24.1.1. Ingredientes utilizados na formulao de meios de cultura ................................................. 24.1.1.1. gua para o preparo de meios e reagentes ............................................................ 24.1.1.2. Fontes de nutrientes em meios de cultura ............................................................. 24.1.1.3. Agentes seletivos ......................................................................................................... 24.1.1.4. Agentes diferenciais .................................................................................................. 24.1.1.5. Agentes redutores ...................................................................................................... 24.1.1.6. Agentes tamponantes ................................................................................................ 24.1.1.7. Substratos cromognicos e fluorognicos ............................................................... 24.1.1.8. gar .............................................................................................................................

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24.1.2. Classificao dos meios de cultura ........................................................................................... 24.2. Procedimento para a preparao de meios de cultura ..................................................................... 24.2.1. Armazenamento dos insumos para preparo de meios de cultura........................................ 21.2.2. Pesagem e rehidratao ............................................................................................................ 24.2.3. Dissoluo e disperso ............................................................................................................... 21.2.4. Verificao e ajuste do pH antes da esterilizao ................................................................... 24.2.5. Distribuio ................................................................................................................................. 24.2.6. Esterilizao pelo calor mido .................................................................................................. 24.2.7. Esterilizao por filtrao ......................................................................................................... 24.2.8. Verificao do pH depois da esterilizao .............................................................................. 24.2.9. Preparao dos suplementos para meios de cultura ............................................................. 24.2.10. Estocagem dos meios esterilizados at o momento do uso ................................................. 24.2.11. Preparao dos meios no momento do uso ......................................................................... 24.3. Referncias

Captulo 25. Preparao de material de laboratrio para anlises microbiolgicas


25.1. Descontaminao e descarte de resduos contaminados .................................................................. 25.2. Lavagem .................................................................................................................................................. 25.3. Acondicionamento ................................................................................................................................ 25.4. Esterilizao ............................................................................................................................................ 25.5. Preparo de vidraria nova ....................................................................................................................... 25.6. Controle de qualidade do material ..................................................................................................... 25.7. Referncias ............................................................................................................................................. Anexo 1. Preparo de meios e reagentes para as anlises ............................................................................ Anexo 2. Resoluo RDC No 12 de 02 de janeiro de 2001 ......................................................................... Anexo 3. Fatores que afetam o crescimento de microrganismos em alimentos.......................................

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Apresentao

Desde sua primeira edio, em 1997, este livro foi preparado para fornecer um manual de mtodos em portugus, com a metodologia recomendada pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), do Ministrio da Sade. So mtodos oficiais da American Public Health Association (APHA), Food and Drug Adminstration (FDA), Food Safety and Inspection Service do United States Department of Agriculture (FSIS/USDA), Association of Official Analytical Chemists (AOAC) e International Organization for Standardization (ISO). O texto foi preparado para atender tanto aos profissionais com formao acadmica, quanto aos tcnicos de laboratrio, sem formao de nvel superior. Acreditamos que esse objetivo foi atingido: o manual oferece um material de contedo profundo, moderno e atualizado, mas apresentado de forma didtica, com textos e esquemas que facilitam a compreenso. Nessa terceira edio, todos os mtodos foram revistos e atualizados, de acordo com as novas edies do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA, 4a Edio, 2001), Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (APHA, 21a edio, 2005), Standard Methods for the Examination of Dairy Products (APHA, 17a edio, 2004), Official Methods of Analysis of AOAC International (AOAC, 18a edio, 2005), Bacteriological Analytical Manual (FDA, atualizado por captulos, online), Microbiology Laboratory Guidebook (FSIS/USDA, atualizado por captulos, online) e ltimas edies das normas ISO. Foram introduzidos novos captulos, com tcnicas bsicas de microbiologia, que sero de grande valia para pessoal tcnico em formao. Foi introduzida, no incio de cada captulo, uma reviso extensiva da literatura, apresentando o que h de mais recente sobre o assunto tratado no captulo. Esse material oferece uma base terica slida, que ser de grande valia para a compreenso da metodologia e interpretao dos resultados. Finalmente, foram introduzidas as mudanas de nomenclatura das bactrias relevantes em alimentos, ocorridas at dezembro de 2006. Para bactrias Gram negativas, foi utilizada a classificao e nomenclatura do Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2o Ed (2005). Para bactrias Gram positivas, foi utilizada a classificao e nomenclatura do International Journal of Systematic and Evolucionary Microbiology (revista oficial do International Committee on Systematic Bacteriology), porque ainda no foram publicados os volumes do Bergeys Manual para Gram positivos.

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DOS AUTORES
Neusely da Silva Engenheira de Alimentos, com Doutorado em Cincias de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). vice diretora do Laboratrio de Microbiologia do Instituto de Tecnologia de Alimentos de Campinas (ITAL), rgo de pesquisa da Secretaria de Agricultura do Estado de So Paulo. Exerce atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I) para o setor de alimentos, com vrios livros e artigos cientficos publicado no Brasil e no exterior. Sua rea de concentrao o desenvolvimento, adequao, avaliao e validao de novos mtodos de anlise microbiolgica de gua e alimentos. Endereo eletrnico: neusely@ital.sp.gov.br. Valria Christina Amstalden Junqueira biloga, com Doutorado em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Pesquisadora do Laboratrio de Microbiologia do ITAL, concentra suas atividades no estudo da deteriorao de alimentos termoprocessados e no estudo de bactrias anaerbias patognicas de importncia em gua e alimentos, incluindo Clostridium perfringens e Clostridium botulinum. Possui uma ampla experincia de consultoria a industrias privadas processadoras de alimentos principalmente em produtos contaminados por microrganismos anaerbios patognicos e deteriorantes. Endereo eletrnico: vcaj@ital.sp.gov.br. Neliane Ferraz de Arruda Silveira biloga com Doutorado em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), na rea de higiene e legislao de alimentos. Pesquisadora do Laboratrio de Microbiologia do ITAL, concentra suas atividades no controle da qualidade microbiolgica de alimentos, com nfase em pescado marinhos de gua salgada e doce; frutas e hortalias minimamente processadas, alimentos servidos em refeies coletivas e produtos crneos. Endereo eletrnico: nferraz@ital.sp.gov.br. Marta Hiromi Taniwaki biloga, com Doutorado na Universidade de New South Wales, em Sydney-Australia. diretora do a Unidade Laboratorial de Referncia em Microbiologia do ITAL, onde exerce atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I). Expert em micologia de alimentos, membro da International Commission on Food Mycology (ICFM), presta consultoria a empresas pblicas e privadas, para o controle de fungos e micotoxinas em alimentos. Endereo eletrnico: mtaniwak@ital.sp.gov.br. Rosana Francisco Siqueira dos Santos biloga, com mestrado em Cincias de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Gerente do Laboratrio de Microbiologia do ITAL, exerce atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I). Concentra suas atividades no estudo de Enterobacter sakazakii e mtodos para sua deteco. Endereo eletrnico: rosana@ital.sp.gov.br. Renato Abeilar Romeiro Gomes Engenheiro Agrcola, com mestrado em Engenharia Agrcola pela Universidade Federal de Viosa. Diretor do Centro de Informao em Tecnologia de Alimentos (CIAL) do ITAL, concentra suas atividades na divulgao de informaes tecnolgicas para o setor de alimentos. Endereo eletrnico: rarg@ital.sp.gov.br.

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Captulo1

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1.1 INTRODUO
A maioria das recomendaes contidas nesse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foram tambm includas recomendaes da 21 Edio do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice, 2005), especficas para a anlise de gua, da 17 Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004), especficas para a anlise de produtos lcteos e de normas da International Organization for Standardization (ISO 6887-4:2003, ISO 7218:1996), recomendadas para ensaios realizados com metodologia ISO. Alguns termos utilizados ao longo do texto so oriundos da terminologia relacionada com a amostragem de lotes e devem ter seu significado corretamente compreendido:

Lote
Lote definido como uma quantidade de alimento de mesma composio e caractersticas fsicas, qumicas e sensoriais, produzida e manuseada numa mesma batelada, sob as mesmas condies. Na prtica, lote geralmente a quantidade de alimento produzida dentro de um intervalo de tempo de funcionamento de uma linha de produo, sem interrupo.

Amostra de lote e unidade de amostra


Amostra de lote uma frao do total produzido, retirada ao acaso, para avaliar as condies do lote. No caso de alimentos acondicionados em embalagens individuais, composta de n embalagens individuais. No caso de grandes massas de alimentos, no acondicionados em embalagens individuais, composta de n alquotas do produto. As embalagens ou alquotas individuais so chamadas de unidades de amostra e, para a avaliao do lote, so analisadas separadamente. A partir do conjunto de resultados da anlise das n unidades de amostra, possvel inferir as caractersticas de todo o lote, mas o resultado da anlise de uma nica unidade de amostra no pode ser tomado como representativo do lote. Nas anlises de Salmonella, cujo padro em alimentos ausncia em qualquer das unidades de amostra, comum a prtica de compor (misturar) as unidades de amostra, para realizar um nico ensaio. A presena na amostra composta inaceitvel, independente de quantas ou quais unidades de amostra estejam contaminadas. Maiores detalhes so apresentados no captulo especfico de Salmonella.

Planos de amostragem de lotes


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Sempre que se tratar da avaliao de lotes ou partidas, a tomada das n unidades de amostra dever seguir um plano de amostragem estatstico adequado. Os mais utilizados so os planos de duas ou trs classes estabelecidos pela International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF, 2002), adotados pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA). O plano de duas classes classifica os lotes em duas categorias, aceitvel ou inaceitvel, dependendo dos resultados da anlise das n unidades de amostra. So os mais aplicados no caso de ensaios de presena/ausncia, como Salmonella, por exemplo, em que ausncia aceitvel e a presena em qualquer das n unidades de amostra inaceitvel. O plano de trs classes classifica os lotes em trs categorias, aceitvel, qualidade intermediria mas aceitvel e inaceitvel. So recomendados para ensaios qualitativos, para os quais o padro no ausncia, mas sim, valores dentro de uma faixa entre m e M. Os parmetros utilizados nesses planos, para a tomada de decises a respeito dos lotes so: n: o nmero de unidades de amostras a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote, para serem analisadas individualmente. As n unidades de amostra constituem a amostra representativa do lote. Para ensaios de presena/ausncia, no quantitativos (Salmonella ou Listeria monocytogenes, por exemplo) as unidades de amostra podero ser compostas e realizada uma nica anlise, porm, na composio das amostras devem ser consultadas e obedecidas as orientaes dos captulos relacionados aos ensaios especficos em questo. m: o padro microbiolgico estabelecido para um dado microrganismo, num dado alimento. Em um plano de trs classes esse valor separa um lote aceitvel de um lote com qualidade intermediria aceitvel. M: um limite tolervel, acima do padro, que pode ser atingido por algumas (c) unidades de amostra, mas no pode ser ultrapassado por nenhuma. Em um plano de duas classes, M separa o lote aceitvel do inaceitvel. Em um plano de trs classes, separa o lote com qualidade intermediria aceitvel do lote inaceitvel. c: dentre as n unidades de amostra que constituem a amostra representativa do lote, c o nmero mximo de unidades que podem ser aceitas com contagens acima do padro m, desde que no acima do limite M. Nos casos em que o padro microbiolgico ausncia, c igual a zero e aplica-se o plano de duas classes.

Unidade analtica
A unidade de amostra geralmente contm uma quantidade de produto maior do que a necessria para a anlise, porque, ao se coletar uma unidade de amostra, h sempre o cuidado de se tomar quantidades suficientes para estocagem de contra-amostras e preveno de perdas por acidente. Unidade analtica a quantidade de alimento efetivamente utilizada na realizao de um ou mais ensaios da unidade de amostra. O nmero de unidades analticas necessrias para a anlise depende do nmero e tipos de ensaios que sero realizados na mesma unidade de amostra, sendo uma para os ensaios gerais de quantificao (contagem total de aerbios mesfilos, contagem de bolores e leveduras, contagem de coliformes totais/fecais/E. coli , contagem de S. aureus, contagem de B. cereus, contagem de C. perfringens), uma para cada ensaio de presena/ ausncia (Salmonella, Listeria monocytogenes e todos os outros que requeiram enriquecimento em caldo especfico) e uma para cada outro ensaio que requeira tratamento diferenciado da amostra (contagem de esporos de bactrias, contagem de bolores termorresistentes e outros).

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1.2 MATERIAL NECESSRIO


Frascos e utenslios para coleta Frascos ou bolsas plsticas estreis de capacidade variada Esptulas Facas Colheres Tesouras Pinas Caladores Amostradores verticais de tubo duplo Amostradores tipo corer Furadeira eltrica e brocas esterilizadas Caixas de isopor com gelo seco ou sachs de gelo reutilizvel em gel Reagentes e diluentes Etanol 70% Soluo de hipoclorito de sdio a 100mg/l Soluo 3% ou 10% de tiossulfato de sdio (Na2S2O3) Soluo 15% de EDTA Soluo Tamponada Glicerol Sal Equipamentos Freezer com temperatura abaixo de 20oC negativos com termmetro calibrado Refrigerador com temperatura entre 0 e 4oC com termmetro calibrado

1.3 COLETA DE AMOSTRAS PARA ANLISE


Sempre que possvel, amostras de alimentos acondicionados em embalagens individuais devem ser coletadas e encaminhadas ao laboratrio na sua embalagem comercial original, fechada e intacta. Cada embalagem unitria do produto constitui uma unidade de amostra e devem ser coletadas tantas unidades de amostra quantas forem requeridas pelo plano de amostragem. Se a embalagem unitria contiver uma quantidade de alimento insuficiente para as anlises e guarda de contra amostras, deve-se coletar vrias embalagens unitrias, como parte de uma mesma unidade de amostra. No momento da anlise, deve-se juntar o contedo dessas diversas embalagens em um nico frasco estril, misturando-se bem e retirar a unidade analtica da mistura. Se o produto no permitir mistura, deve-se tomar, de cada uma das embalagens unitrias, pores de peso aproximadamente igual, para compor a unidade analtica daquela unidade de amostra. No caso de alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens, impossveis de serem transportadas ao laboratrio, deve-se transferir pores representativas da massa total para frascos ou bolsas de coleta estreis, sob condies asspticas.

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1.3.1 SELEO E PREPARAO DE FRASCOS PARA COLETA DE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EM EMBALAGENS NO INDIVIDUAIS a) Utilizar frascos ou bolsas com tampas prova de vazamentos, de material no txico, aprovado para contato com alimentos e, de preferncia, autoclavveis ou pr-esterilizados. No recomendvel o uso de frascos de vidro devido ao risco de quebra, contaminao do ambiente de coleta com cacos de vidro e perda do contedo. b) Escolher frascos com tamanho adequado para a quantidade de alimento que ser coletada. Para definir a quantidade de amostra a ser coletada, considerar que cada unidade de amostra deve conter, no mnimo, duas vezes o nmero de unidades analticas que sero utilizadas nos ensaios, de preferncia, trs a quatro vezes esse valor, para a separao da contra-amostra e preveno de possveis perdas. Levar em conta, ainda, o fato de que os frascos de coleta no devem ser completamente preenchidos pelo alimento, sendo recomendvel utilizar, no mximo, trs quartos de sua capacidade, para facilitar a posterior homogeneizao da amostra, antes da retirada da(s) unidade(s) analtica(s). c) Os frascos e utenslios no pr-esterilizados que sero utilizados na coleta (esptulas, colheres, tesouras, pinas, caladores, etc.) devem, de preferncia, ser esterilizados individualmente em autoclave (121oC/30 minutos) ou em estufa de esterilizao (17010oC/2h). Alguns outros mtodos que podem ser utilizados como alternativa so a flambagem em chama, a imerso em etanol e combusto do lcool (no elimina esporos) e o tratamento com solues desinfetantes. Nesse ltimo caso devem ser usados desinfetantes aprovados para superfcies de contato com alimentos, aplicados conforme a orientao dos fabricantes e seguidos de 12 enxges com gua destilada estril, para a remoo dos resduos. Frascos ou bolsas no estreis que apresentem, num teste de lavagem da superfcie interna, contagem de microrganismos viveis menor do que 1 UFC/ml de capacidade, podem ser utilizados sem esterilizao prvia. 1.3.2 PROCEDIMENTOS PARA A COLETA DE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EM EMBALAGENS NO INDIVIDUAIS a) Antes de iniciar a coleta da unidade de amostra, promover uma mistura de toda a massa de alimento, para garantir que a distribuio dos microrganismos seja homognea. Retirar ento, com utenslios ou instrumentos adequados, a quantidade de produto necessria para compor a unidade de amostra. b) Se no for possvel promover a mistura da massa de alimentos antes do incio da amostragem, retirar pores de diferentes partes do contedo, at obter a quantidade de produto adequada para compor a unidade de amostra. Evitar a retirada de pores das regies prximas superfcie ou abertura do tanque ou volume. b1) Para coletar amostras de p, em diferentes partes de tanques ou grandes embalagens, podem ser utilizados caladores ou amostradores verticais de tubo duplo, com comprimento suficiente para atingir o centro da massa de alimento. Usar um amostrador estril diferente para cada unidade de amostra coletada, ou desinfetar o instrumento entre uma amostragem e outra. b2) Para compor uma unidade de amostra com pores de diferentes pontos de alimentos em grandes peas slidas, deve-se usar facas, pinas e frceps estreis para cortar pedaos menores do alimento. b3) No caso de grandes blocos de alimentos congelados, como blocos de pescados e frutos do mar, blocos de ovo lquido, etc., o mais adequado utilizar uma furadeira eltrica 16

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(com a broca previamente esterilizada) combinada com um funil estril. A broca inserida no funil (cujo dimetro de abertura inferior deve ser apenas ligeiramente maior que o dimetro da broca) e encostada no ponto do bloco que se deseja amostrar. Liga-se a furadeira e as raspas congeladas do alimento vo-se dirigindo para a superfcie, sendo coletadas no funil, de onde podem ser transferidas para um frasco de coleta adequado. b4) Quando a coleta for feita atravs de torneiras ou tubulaes, limpar a parte externa da sada com etanol 70%, flambar, se o material for resistente ao fogo, e deixar escoar uma certa quantidade do produto, antes de iniciar a coleta. Isso vai promover uma lavagem da tubulao e remover os resduos acumulados. b5) Para a amostragem de margarina e produtos similares (spreads) a ISO 6887-4 (2003) recomenda remover a camada externa (3 a 5mm) e retirar as unidades de amostra com um amostrador tipo corer, previamente esterilizado. Introduzir o instrumento na diagonal, sem atingir o fundo, rodar num crculo completo e retirar, trazendo uma poro cnica do produto. c) Lembrar que a superfcie externa dos frascos e bolsas de coleta no estril. Assim, no segurar os frascos ou bolsas diretamente acima da massa de alimento, pois podem cair ou introduzir contaminantes no produto. Da mesma forma, nunca introduzir um frasco de coleta diretamente no produto, mas sim, utilizar um utenslio adequado para retirar as unidades de amostra. d) Ao retirar o instrumento de coleta cheio com o produto coletado, no manuse-lo sobre os outros instrumentos pr-esterilizados, pois respingos do alimento podem contaminar os que sero utilizados posteriormente. e) Abrir os frascos ou bolsas de coleta apenas o necessrio para introduzir o produto e fechar imediatamente. f) No tocar a superfcie interna dos frascos ou bolsas de coleta e suas tampas. g) Alimentos contaminados podem conter microrganismos perigosos para a sade. Essas amostras devem ser coletadas por pessoal bem treinado na manipulao de microrganismos, ciente dos cuidados necessrios para sua prpria proteo. Na dvida, tratar cada amostra como se estivesse contaminada. 1.3.3 COLETA DE ALIMENTOS ENVOLVIDOS EM CASOS DE DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR (DTAS) Coletar e analisar amostras de todos os alimentos suspeitos, o mais cedo possvel. Entretanto, no adianta coletar amostras de alimentos que tenham sofrido abuso de temperatura ou que j se encontrem em estado de parcial deteriorao. Os resultados dessas anlises sero de pouca ou nenhuma utilidade para as concluses da investigao. Se no houver sobras das refeies suspeitas, pode-se tentar uma das seguintes alternativas: coletar amostras de refeies similares, preparadas posteriormente sob as mesmas condies, coletar amostras dos ingredientes e matria-prima utilizados na preparao das refeies suspeitas e coletar os vasilhames onde as refeies suspeitas se encontravam acondicionadas. 1.3.4 COLETA DE AMOSTRAS DE GUA O Captulo 60 da 4a Edio do Compendium (Kim & Feng, 2001) trata da coleta de gua engarrafada, considerada pelo Codex Alimentarius como alimento. Essas amostras devem ser coletadas na embalagem original, lacrada. Em havendo interesse ou necessidade de coletar volumes 17

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menores, a partir de embalagens de maior capacidade, deve-se homogeneizar todo o contedo, invertendo a embalagem vrias vezes, desinfetar o bocal com etanol 70% e, em condies asspticas, abrir o lacre com uma faca ou tesoura estril ou flambada. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estril adequado. Para a coleta de outros tipos de gua, a parte 9000 da 21a Edio do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice, 2005) traz as seguintes orientaes: Para coletar amostras de torneiras e tubulaes, limpar a rea externa da sada com uma soluo de hipoclorito de sdio a 100mg/l ou com etanol 70%, flambando, se o material for resistente ao fogo. Abrir totalmente a torneira e deixar a gua fluir por 2 a 3 minutos, para limpar a tubulao. Reduzir o fluxo para coletar a amostra sem respingos para fora do frasco de coleta. Para coletar amostras de gua de poo ou cisterna com bomba, bombear a gua por 5 a 10min, para estabilizar a temperatura da gua antes da coleta. Se no houver uma bomba, preparar os frascos de coleta com um peso na base e introduzir o frasco diretamente no poo. necessrio cuidado para no contaminar a amostra com material acumulado na superfcie da gua. Para coletar amostras de gua de rios, lagos ou reservatrios, segurar o frasco de coleta pela base e mergulhar abaixo da superfcie da gua, com a boca para baixo. Direcionar a boca do frasco para a corrente de gua e elevar ligeiramente, para que a gua fique retida. Se no houver corrente de gua, empurrar o frasco para frente horizontalmente, no sentido contrrio ao da mo. Amostras de gua clorada devem ter o cloro residual neutralizado imediatamente aps a coleta, para impedir a continuao do seu efeito bactericida sobre a microbiota presente. Para tanto, adicionar aos frascos de coleta, antes da esterilizao, 0,1ml de uma soluo 3% de tiossulfato de sdio (Na2S2O3), para cada 100ml de amostra que se pretende coletar. Essa quantidade suficiente para neutralizar 5mg de cloro residual por litro de amostra. Nas situaes em que a concentrao de cloro residual seja superior a 5mg/l, utilizar 0,1ml de uma soluo 10% de tiossulfato de sdio, para cada 100ml de amostra que se pretende coletar. Essa quantidade suficiente para neutralizar 15mg de cloro residual por litro de amostra. Podem tambm ser utilizadas bolsas plsticas ou frascos estreis, disponveis comercialmente j contendo o tiossulfato de sdio. Se a amostra for coletada e enviada ao laboratrio pelo prprio interessado, sem a prvia neutralizao do cloro, adicionar a soluo de tiossulfato de sdio estril imediatamente aps a chegada da amostra, sob condies asspticas. Amostras de gua com teor alto de metais (maior que 1,0mg/l), incluindo cobre e zinco, devem ser coletadas em frascos com EDTA (cido etilenodiaminotetraactico), agente quelante para reduzir a toxidade dos metais sobre os microrganismos. Isso particularmente importante se o intervalo entre a coleta e a anlise for maior do que quatro horas. Para tanto, adicionar aos frascos de coleta, antes da esterilizao, 0,3ml de uma soluo 15% de EDTA, para cada 100ml de gua a ser coletada (372mg/l). Ajustar o pH da soluo em 6,5 antes do uso. As solues de EDTA e tiossulfato podem ser adicionadas ao mesmo frasco.

1.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRAS AT O MOMENTO DA ANLISE


Como regra geral, deve-se transportar e estocar amostras de alimentos da mesma forma como o produto normalmente transportado e estocado na sua comercializao. As orientaes abaixo devem ser observadas para garantir a integridade do produto at o momento das anlises:

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1.4.1 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS COM BAIXA ATIVIDADE DE GUA Alimentos desidratados, secos ou concentrados so estveis microbiologicamente, podendo ser transportados e estocados temperatura ambiente. Devem, entretanto, ser protegidos contra a umidade. 1.4.2 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS CONGELADOS Amostras de alimentos comercializados na forma congelada devem ser transportadas e mantidas congeladas at o momento da anlise, no podendo sofrer descongelamento total ou parcial durante o transporte. O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda que a temperatura de estocagem dessas amostras no seja superior a 20C negativos. A ISO 7218 (1996) recomenda temperatura abaixo de 18oC negativos, de preferncia 242oC negativos. O transporte deve ser feito em caixas de isopor com gelo seco, porm, certos cuidados devem ser observados. O produto no deve entrar em contato com o gelo seco porque a absoro do CO2 pode alterar o pH. Se a tampa da embalagem no vedar a entrada de gases e/ou se embalagem for permevel aos gases e/ou se tornar quebradia com o frio, deve-se usar uma embalagem secundria. Geralmente um embrulho em papel grosso suficiente para prevenir esse problema. Rtulos e etiquetas usados na identificao das amostras devem ser prova dgua, para prevenir a perda dos dados. 1.4.3 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS REFRIGERADOS Amostras de alimentos comercializados na forma refrigerada devem ser transportados e mantidos sob refrigerao desde a coleta at o momento da anlise. O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda, como regra geral, estocagem entre 0 e 4,4oC e intervalo mximo de 36 horas entre a coleta e a anlise. A ISO 7218 (1996) recomenda estocagem entre 0 e 4oC (0 a 2oC para amostras altamente perecveis como pescados e midos) e intervalo mximo de 24 horas entre a coleta e a anlise. Na impossibilidade de se proceder anlise no intervalo de tempo preconizado, as amostras devem ser congeladas e mantidas nas mesmas condies descritas para amostras congeladas. O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda que o transporte seja feito em caixas de isopor com gelo, sendo recomendvel o uso de sachs de gelo reutilizvel em gel, para evitar o acmulo de lquido nas caixas. Na indisponibilidade de gelo em gel, pode ser utilizado gelo comum, desde que acondicionado em bolsas plsticas. Caixas bem fechadas, com espao amplo para gelo, suficiente para envolver todos os frascos de amostra, podem manter temperaturas de refrigerao adequadas por at 48 horas, na maioria das situaes. Como regra geral, essas amostras no devem ser congeladas, por isso, no recomendvel o uso de gelo seco nas caixas de isopor. Se o tempo de trnsito for prolongado e houver necessidade de usar gelo seco, as embalagens de amostras no devem entrar em contato direto com as embalagens de gelo seco, para evitar o congelamento. Rtulos e etiquetas usados na identificao das amostras devem ser a prova dgua, para prevenir a perda dos dados. Excees. Para certos produtos ou microrganismos as recomendaes so diferenciadas: a) No captulo especfico para bactrias lcticas o congelamento no recomendado, devido grande susceptibilidade desses microrganismos s injrias pelo congelamento.

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b) No captulo especfico para vibrios patognicos recmenda-se que as amostras sejam estocadas sob resfriamento moderado (7-10C) e analisadas o mais rapidamente possvel, porque a temperatura tima de manuteno de 15-18C e a maioria das cepas no sobrevive bem a 4C. O congelamento das amostras desaconselhado e, em caso de absoluta necessidade, deve ser feito a 80C negativos. c) No caso de C. perfringens devem ser analisadas, se possvel, imediatamente, pois a estocagem por poucos dias sob refrigerao ou congelamento pode levar a uma reduo de 3 a 5 ciclos logartmicos na contagem em placas. Na impossibilidade de se proceder anlise imediata, o Compendium (Labbe, 2001) recomenda sejam refrigeradas pelo menor tempo possvel, no devendo ser congeladas ou mantidas sob refrigerao prolongada. Havendo necessidade de estocagem por mais de 48 horas, tratar as amostras com Soluo Tamponada Glicerol Sal (na quantidade requerida para atingir a concentrao final de 10% na amostra) e estocar entre 55 e 60oC negativos. O Bacteriological Analytical Manual (Rhodehamel & Harmon, 2001) recomenda que sejam analisadas imediatamente ou refrigeradas por no mais de oito horas, temperatura prxima de 10oC. Para transporte e estocagem por perodo superior a oito horas, preparar assepticamente a amostra para o congelamento, da seguinte forma: transferir pores de 25g bolsas plsticas, adicionar 25ml da Soluo Tamponada Glicerol Sal, excluir o ar das bolsas e misturar. Para amostras lquidas, misturar pores de 25ml com igual volume da Soluo Tamponada Glicerol Sal, em concentrao dupla. Congelar imediatamente, em freezer a 20-30C negativos. Para o transporte, transferir as amostras tratadas para frascos no permeveis ao CO2 (Nalgene ou equivalente) e transportar em caixa de isopor com gelo seco. Manter as amostras congeladas at o momento da anlise, de preferncia por poucos dias. d) No captulo especfico para Campylobacter a ISO 10272-1 (2006) destaca a sensibilidade de Campylobacter ao congelamento e secagem, recomendando que as amostras no sejam congeladas e que sejam protegidas contra a perda de umidade. Indica estocagem 32oC e anlise o mais rpido possvel. O Microbiological Laboratory Guidebook (Ransom & Rose, 1998) destaca que Campylobacter sensvel ao congelamento e morre temperatura ambiente. Durante a estocagem refrigerada (indica 4oC) pode ser sobrepujado pela microbiota psicrotrfica acompanhante nas amostras, que devem ser analisadas o mais rpido possvel. Se o congelamento for inevitvel, devem ser usados agentes criopotetores (glicerol ou dimetil sulfxido na concentrao de 10% em relao quantidade de amostra). Para a estocagem congelada de swabs, indica Caldo Brucella suplementado com 10% de polivinil pirrolidina. O Bacteriological Analytical Manual (Hunt et al., 2001) destaca que Campylobacter sensvel ao ar, secagem, baixo pH, aquecimento, congelamento e estocagem prolongada, podendo sofrer injrias que dificultam a deteco. Clulas velhas ou estressadas gradualmente adquirem forma cocoide e se tornam mais difceis de cultivar. Para estocagem prolongada, C. jejuni subsp jejuni pode sobreviver duas a quatro semanas sob refrigerao (4oC), se for garantida baixa tenso de oxignio e proteo contra perda de umidade (exceto no caso de leite cru). Nas mesmas condies, tambm pode sobreviver dois a cinco meses a 20oC negativos. Outras espcies, nas mesmas condies, podem sobreviver (mas no se multiplicar) uma a trs semanas a 4oC (exceto no caso de leite cru). A populao diminui dois ciclos logartmicos a 20oC negativos, mas os sobreviventes podem ser recuperados aps mais de cinco meses. Uma vez abertos os frascos ou embalagens, a anlise deve ser feita o mais rpido possvel, porque a introduo de oxignio particularmente deletria para as clulas, j debilitadas pela estocagem prolongada.

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e) No captulo especfico para contagem de aerbios psicrotrficos, recomenda-se que as amostras sejam analisadas no intervalo de seis horas, a partir da coleta. A estocagem refrigerada permite a multiplicao dos psicrotrficos e o tempo de gerao de vrios desses microrganismos encontra-se dentro desse intervalo. O congelamento no indicado para essas amostras, porque pode provocar injria ou morte de vrios microrganismos. Se o congelamento for indispensvel considerar na avaliao dos resultados que parte da microbiota pode ter sido perdida. f) Amostras de moluscos e crustceos (ostras, mexilhes, mariscos, camares, etc. devem ser analisadas dentro de no mximo 6 horas aps a coleta, no devendo ser congeladas (Midura & Bryant, 2001). g) Amostras de ovo lquido refrigerado devem ser analisadas, se possvel, dentro de 4 horas aps a coleta, no devendo ser congeladas (Ricke et al., 2001). h) Amostras de produtos vegetais fermentados ou acidificados no comercialmente estreis devem ser estocadas sob refrigerao por no mais do que 24 horas, no devendo ser congeladas (Fleming et al., 2001). 1.4.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS COMERCIALMENTE ESTREIS EM EMBALAGENS HERMTICAS Alimentos comercialmente estreis com embalagens em condies normais, podem ser transportados e estocados temperatura ambiente, devendo ser protegidos contra exposio a temperaturas superiores a 45oC. Amostras de refrigerantes engarrafados, comercializados temperatura ambiente, tambm podem ser transportados e estocados nessas condies. Embalagens estufadas devem ser acondicionadas em bolsas plsticas devido ao perigo de vazamento de material de alto risco microbiolgico. O transporte e a estocagem devem ser feitos sob refrigerao (0 a 4C) e o intervalo entre a coleta e a anlise deve ser o menor possvel, no devendo ultrapassar 48h (ISO 7218:1996). Por outro lado, se a anlise destinar-se confirmao de suspeita de deteriorao por bactrias termfilas, a refrigerao contra-indicada, porque as clulas vegetativas desses microrganismos usualmente morrem sob efeito do frio, no sendo comum a ocorrncia de esporulao nos produtos enlatados (Denny & Parkinson, 2001). 1.4.5 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRAS DE GUA O Captulo 60 da 4a Edio do Compendium (Kim & Feng, 2001) recomenda: a) Para gua engarrafada na embalagem original, lacrada, transporte e estocagem temperatura ambiente, sem necessidade de refrigerao. b) Para embalagens abertas ou amostras transferidas para outros frascos, transporte e estocagem sob refrigerao (no especifica a temperatura) e intervalo entre coleta e anlise preferencialmente de 8h, no devendo ultrapassar 24h. Para outros tipos de gua, a parte 9000 da 21a Edio do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice, 2005) traz a seguinte orientao: a) Como regra geral, transporte e estocagem sob refrigerao (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e anlise no superior a 24h. b) Para avaliao da conformidade de gua potvel, transporte e estocagem sob refrigerao (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e anlise no superior a 30h, para quantificao de coliformes, ou 8h, para a quantificao de heterotrficos (contagem total de aerbios mesfilos em placas). c) Para a avaliao da conformidade de gua no potvel, transporte e estocagem sob refrigerao (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e anlise no superior a 8h. 21

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1.5 RECEPO DE AMOSTRAS PARA ANLISE


Na recepo de amostras para anlise no laboratrio, devem ser observadas as condies da embalagem e as condies em que foi feito o transporte, antes da aceitao do pedido de anlise. Deve ser recusada qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos estranhos ou qualquer outro tipo de defeito, bem como amostras transportadas sob condies inadequadas. Se o interessado estiver encaminhando amostra com embalagem j aberta ou com selo violado (comum no caso de amostras encaminhadas para responder a reclamaes de consumidores, por exemplo), pode-se proceder anlise, dependendo do tipo de embalagem, tipo de produto e microrganismos investigados, porm, as condies em que a amostra foi recebida devem constar da identificao da amostra e do laudo final de anlise.

1.6 REFERNCIAS
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA). Resoluo RDC 12 de 02 de janeiro de 2001 - Regulamento Tcnico Sobre Padres Microbiolgicos para Alimentos. Dirio Oficial da Unio, 10 jan.2001. Seo 1, p. 4587. DENNY, C.B. & PARKINSON, N.G. Canned foods Tests for cause of spoilage. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 62, p.583-600. DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. FLEMING, H.P., McFEETERS, R.F. & BREIDT, F. Fermented and acidified vegatables. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 51, p.521-532. HUNT, J.M., ABEYTA, C. & TRAN, T. Campylobacter. In: U S Food and Drug Administration (FDA), Bacteriological Analytical Manual Online, disponvel no site <http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html>,acesso em 23/03/06. Chapter 7, revised March 2001. HUNT, M.E. & RICE, E.W. Microbiological examination. In: EATON et al. (Eds), Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater, 21st Ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF), 2005. Part 9000, p.9.1-9.169. ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods), 2002. Microrganisms im Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety Management. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (ISBN0-306-472627). ISO 6887-4. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, and fish and fishery products, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2003. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examination, 2nd ed. The International Organization for Standardization, 1996. ISO 10272-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection and enumeration of Campylobacter Part 1: Detection Method, 1th ed. The International Organization for Standardization, 2006. KIM, H. & FENG, P. Bottled water. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 60, p.573-576. LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological

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Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises

Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 34, p.325-330. MIDURA, T.F. & BRYANT, R.G. Sampling plans, sample collection, shipment, and preparation for analysis. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 2, p.13-23. RANSOM, G.M. & ROSE, B.E. Isolation, identification, and enumeration of Campylobacter jejuni/coli from meat and poultry products. In: USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook 3rd Ed., 1998. Chapter 6, <http://www.fsis.usda.gov/ Science/Microbiological_Lab_Guidebook/index.asp>, acesso em 30/03/06. RICKE, S.C., BIRKHOLD, S.G. & GAST, R.K. Egg and egg products. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 46, p.473-481. RHODEHAMEL, E.J. & HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: US Food and Drug Administration (FDA), Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online, <http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html>, Chapter 16, reviso de janeiro de 2001. Acesso em 20/04/2006.

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Captulo 2

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2.1. INTRODUO
A maioria das orientaes contidas nesse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foram tambm includas recomendaes da 21 Edio do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Eaton et al., 2005), especficas para a anlise de gua, da 17 Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004), especficas para a anlise de produtos lcteos e de vrias normas da International Organization for Standardization (6887-1:1999, ISO 6887-2:2003, ISO 6887-3:2003, ISO 6887-4:2003, ISO 7218:1996, ISO 8261:2001, ISO 17604:2003), recomendadas para ensaios realizados com metodologia ISO. A preparao das amostras para a anlise envolve trs etapas, que so a homogeneizao do contedo e retirada da unidade analtica, a preparao da primeira diluio da unidade analtica e a preparao de diluies decimais seriadas, para inoculao nos meios de cultura. Antes de iniciar os procedimentos, a ISO 7218 (1996) recomenda-se que sejam observados os seguintes cuidados para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas: Assegurar-se de que a rea de trabalho est limpa e as portas e janelas fechadas, para evitar correntes de ar. Desinfetar todas as superfcies de trabalho com um desinfetante adequado (etanol 70%, cloreto de benzalcnio a 500ppm, hipoclorito de sdio ou outro composto de cloro a 200ppm so adequados) Assegurar-se de que todo o material necessrio esteja disponvel nas bancadas. Lavar as mos e desinfetar com um desinfetante adequado ao contato com a pele. Se requerido, colocar luvas, verificando a necessidade ou no de luvas nos captulos especficos de ensaios com patgenos. Trabalhar preferencialmente no interior de capelas de fluxo laminar vertical, para prevenir a contaminao da amostra pelo ambiente e do analista pela amostra. Na indisponibilidade de uma capela de fluxo laminar, trabalhar na regio prxima chama de um bico de Bunsen que, em bom funcionamento, deve ter a chama azulada. Evitar a formao de aerossis ao abrir tubos e/ou frascos depois de agitar, liberar o contedo de pipetas ou flambar alas de inoculao. Nunca pipetar com a boca, mas sim, usando pipetadores. Depois de usados, acomodar as pipetas e outros utenslios em bandejas de descarte, no diretamente sobre as bancadas. 25

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Todos os instrumentos e utenslios utilizados na abertura das embalagens e retirada das unidades analticas (tesouras, pinas, facas, esptulas, etc.) devem ser previamente esterilizados (em autoclave ou estufa de esterilizao) ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. Antes de abrir as embalagens, desinfetar a rea externa com etanol 70%, para remover os contaminantes presentes. No caso de embalagens flexveis, cortar com uma tesoura estril. No caso de embalagens rgidas com tampa rosquevel, desrosquear e remover a tampa assepticamente. No caso de latas com sistema de abertura tipo easy open, abrir assepticamente e remover a tampa. No caso de latas sem sistema easy open, usar um abridor de latas estril. No caso de latas, vidros, caixinhas e outras embalagens destinados ao teste de esterilidade comercial, devem ser seguidos procedimentos diferenciados, descritos no Captulo especfico. Esses procedimentos objetivam garantir a integridade da selagem, para anlises posteriores da embalagem, se necessrias. Observar e anotar qualquer anormalidade nas embalagens ou no contedo interno, como estufamento, vazamento, odor e/ou aparncia estranha, presena de corpos estranhos, etc.

2.2.MATERIAL NECESSRIO
Reagentes e diluentes Etanol 70% Soluo de iodo Cloreto de benzalcnio a 500ppm, hipoclorito de sdio ou outro composto de cloro a 200ppm gua Peptonada 0,1% (H2Op) Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) gua Salina Peptonada (H 2Osp) gua Peptonada Tamponada (BPW) Soluo de Ringer de concentrao Tampo Fosfato Cloreto de Magnsio Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2 Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8,40,2 Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em 7,50,2 Soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em 8,40,2 Soluo de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) 2% Leite em p desnatado dissolvido em Tampo Fosfato (0,1g/100ml) Soluo de tripolifosfato (Na3O10P3) 2% Tergitol-7 Aninico ou Tween 80 Sulfito de potssio (K2SO3) Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 1N estril Soluo de cido clordrico (HCl) 1N estril Soluo alcolica de prpura de bromocresol a 0,04% Equipamentos Capela de fluxo laminar vertical Bico de Bunsen Shaker 26

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Refrigerador com temperatura abaixo de 4oC com termmetro calibrado Banho maria com temperatura regulvel na faixa de 30 a 45C, com termmetro calibrado Furadeira eltrica e brocas esterilizadas Balana calibrada Agitador magntico com barras magnticas esterilizadas Liquidificador Homogeneizador peristltico (stomacher) Agitadores tipo vortex

Instrumentos e utenslios Tesouras Pinas Facas Martelos Esptulas Bagetas de vidro Pipetas de capacidade variada Funis estreis de capacidade variada Swabs e esponjas para amostragem de superfcies Moldes para amostragem de superfcies Bandejas de descarte

2.3. HOMOGENEIZAO DA AMOSTRA E RETIRADA DA UNIDADE ANALTICA


Unidade analtica a quantidade de material retirado da amostra para ser utilizado na realizao de um ou mais ensaios. O nmero de unidades analticas que devem ser retiradas e a quantidade de material em cada unidade analtica depende do nmero e tipos de ensaios que sero realizados na mesma amostra. De maneira geral so necessrias: a) Unidades analticas para os ensaios de presena/ausncia com enriquecimento em caldo especfico. requerida uma unidade analtica para cada ensaio (Salmonella, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Campylobacter sp, Escherichia coli O157:H7, Enterobacter sakazakii, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus). A quantidade de material em cada uma dessas unidades analticas definida nos captulos especficos para esses ensaios. b) Unidades analticas para os ensaios com tratamento diferenciado da amostra. requerida uma unidade analtica para cada ensaio (esterilidade comercial, contagem de esporos de bactrias, contagem de bolores termorresistentes e outros). A quantidade de material em cada uma dessas unidades analticas tambm definida nos captulos especficos para esses ensaios. c) Unidade analtica para os ensaios gerais de quantificao. Os ensaios gerais de quantificao compreendem a contagem total de aerbios mesfilos ou psicrotrficos, a contagem de bolores e leveduras, a contagem de bactrias lcticas, a contagem de enterococos, a contagem de enterobactrias, a contagem de coliformes totais/fecais/E. coli, a contagem de S. aureus, a contagem de B. cereus e a contagem de C. perfringens. Esses ensaios so feitos com a mesma unidade analtica que, no Brasil, geralmente de 25 gramas ou mililitros da amostra. A ISO 27

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6887-1 (1999) recomenda que seja de, no mnimo, 10g para slidos ou 10ml para lquidos. O Captulo 2 do Compendium (Midura & Bryant, 2001), recomenda que seja de 50g para alimentos slidos e 10, 11 ou 50ml para produtos lquidos. Entretanto, nos captulos especficos, a quantidade recomendada na maioria dos casos de 25g ou menor. Assim, unidades analticas de 25g atendem s exigncias da ISO 6887-1 (1999) e, tambm, s do Compendium, para a maioria dos ensaios. H casos diferenciados em que a unidade analtica deve ser maior ou menor do que o especificado aqui, devendo ser consultado o Anexo 2.2, para verificar essas excees. Antes da retirada da(s) unidade(s) analtica(s), o contedo da amostra deve ser bem homogeneizado, para garantir que a poro removida seja representativa de todo o material. Os procedimentos para se conseguir uma boa homogeneizao so diferentes para produtos lquidos, produtos slidos e produtos com contaminao predominantemente superficial, conforme apresentado abaixo. 2.3.1. PROCEDIMENTO PARA A HOMOGENEIZAO E RETIRADA DA UNIDADE ANALTICA DE PRODUTOS LQUIDOS No caso de amostras lquidas (viscosidade no maior que a do leite) acondicionadas em frascos com espao suficiente para a agitao, inverter a embalagem 25 vezes. Se o frasco apresentar mais de 2/3 do espao preenchido, inverter 25 vezes num arco de 30cm, em 7 segundos. Se no houver espao livre para agitao, utilizar um segundo frasco, estril e transferir a amostra de um frasco para o outro, por 3 vezes. Se houver formao de espuma, aguardar que a espuma disperse. Se a amostra for gaseificada (refrigerantes produtos similares), transferir o contedo para um frasco estril de boca larga e, com a tampa ligeiramente aberta, agitar em shaker at a completa expulso dos gases (essa etapa pode ser dispensada se a unidade analtica for transferida diretamente para o frasco de filtrao, nos ensaios pelo mtodo da filtrao em membrana). Retirar a unidade analtica com uma pipeta, inserida numa profundidade no maior do que 2,5cm abaixo da superfcie do lquido. A medida deve ser volumtrica e o intervalo entre a homogeneizao da amostra e a retirada da unidade analtica no deve ultrapassar 3min. A O Compendium (Midura & Bryant, 2001) no estabelece limite para a incerteza da medio do volume que, segundo a ISO 6887-1 (1999), no deve ser maior que 5%. 2.3.2. PROCEDIMENTO PARA A HOMOGENEIZAO E RETIRADA DA UNIDADE ANALTICA DE PRODUTOS SLIDOS OU LQUIDOS CONCENTRADOS No caso de amostras slidas ou lquidos concentrados, seguir as orientaes do Anexo 2.1, que define os procedimentos mais adequados de homogeneizao e retirada da unidade analtica de diferentes tipos de alimentos. O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda que a incerteza da medio da massa no seja maior do que 0,1g. A ISO 6887-1 (1999) recomenda que no exceda 5%. O intervalo entre a homogeneizao e a retirada da unidade analtica no deve ultrapassar 15 minutos. Se a amostra estiver congelada, o Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda descongelar sob refrigerao (4,4oC) por no mais de 18 horas, na embalagem original. Alternativamente, podem ser usadas temperaturas mais altas, mas no superiores a 40oC e por no mais do que 15 minutos. Nesse caso, requerida a agitao freqente da amostra, para facilitar o descongelamento. O uso de um banho com temperatura controlada e agitao recomendvel. A ISO 6887-4 (2003) recomenda descongelar sob refrigerao (0 a 4oC) por no mais de 24 horas, na 28

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embalagem original. Alternativamente, podem ser usadas temperaturas mais altas (18 a 27oC) por no mais do que 3 horas. No caso de grandes blocos de alimentos congelados, que no podem ser descongelados nas condies preconizadas acima, pode ser seguido o procedimento recomendado pela ISO 6887-2 (2003) para grandes peas de carne. Utilizar uma furadeira eltrica (com a broca previamente esterilizada) combinada com um funil estril. Inserir a broca no funil (cujo dimetro de abertura inferior deve ser apenas ligeiramente maior que o dimetro da broca) e posicionar a broca no ponto do bloco que se deseja amostrar. Ligando-se a furadeira, as raspas congeladas vo-se acumulando no funil, de onde pode(m) ser retirada(s) a(s) unidade(s) analtica(s) necessria(s) para os ensaios. Se a amostra for heterognea, composta por diferentes camadas de composies distintas (bolos recheados, tortas, sobremesas e outros pratos prontos para consumo, por exemplo), compor a unidade analtica com pores das diferentes camadas, levando em conta a proporo presente no produto. Alternativamente, homogeneizar todo o contedo da amostra e retirar a unidade analtica do macerado. Se essa homogeneizao for feita em liquidificador, a ISO 6887-4 (2003) recomenda que o tempo de homogeneizao no ultrapasse 1 minuto, para evitar aquecimento excessivo. Uma terceira opo tomar unidades analticas distintas de cada camada e analisar separadamente. Se a quantidade de amostra encaminhada para a anlise for menor do que a(s) unidade(s) analtica(s) requerida(s), o Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda submeter metade anlise, reservando a outra metade como contra-amostra. Se a homogeneizao da amostra for feita em liquidificador, a quantidade de amostra mais diluente (primeira diluio 10-1) no copo do liquidificador deve ser suficiente para cobrir as facas do aparelho. Para produtos crneos, a ISO 6887-3 (2003) recomenda usar todo o material nos ensaios. 2.3.3. PROCEDIMENTO PARA A RETIRADA DA UNIDADE ANALTICA PELA TCNICA DO ESFREGAO DE SUPERFCIE A tcnica do esfregao de superfcie aplica-se aos alimentos cuja contaminao predominantemente superficial, como carcaas de bovinos, sunos, aves e peixes. Aplica-se tambm anlise de superfcies de equipamentos, mesas, utenslios e embalagens. O esfregao pode ser feito com swabs estreis ou, se a rea amostrada for grande, com esponjas estreis. Esse material pode ser adquirido em embalagens individuais, estreis. As esponjas podem ser substitudas por tampes de algodo estreis, preparados no laboratrio. Os swabs tambm podem ser preparados no laboratrio, com hastes de madeira de aproximadamente 15cm de comprimento por 3mm de dimetro e a parte absorvente em algodo com aproximadamente 2cm de comprimento por 5mm de dimetro. 2.3.3.1. Amostragem com swabs Preparar tubos ou frascos com 10ml de um diluente adequado, sendo recomendados pelo Compendium (Midura & Bryant, 2001) a gua Peptonada 0,1% (H 2Op) ou o Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) e pela ISO 6887-1 (1999) a gua Salina Peptonada (H2Osp) ou a gua Peptonada Tamponada (BPW). Retirar o swab de sua embalagem estril, segurando a haste na extremidade oposta do algodo. Umedecer o algodo no diluente, comprimindo-o contra as paredes do frasco para remover o excesso de lquido. Usando um molde estril de 50cm2, delimitar a rea a ser amostrada, segurando o molde firmemente contra a superfcie. Aplicar o swab com presso, descrevendo movimentos da esquerda para 29

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a direita e depois de baixo para cima. Rodar o swab continuamento, para que toda a superfcie do algodo entre em contato com a amostra. Aps a aplicao, transferir o swab para o tubo ou frasco de diluente, quebrando a parte manuseada da haste na borda interna do tubo ou frasco, antes de mergulhar o restante do swab no diluente. Repetir esse procedimento mais uma vez, sobre a mesma rea, usando um swab seco. Recolher o segundo swab no mesmo frasco ou tubo de diluente. O lquido de coleta dos swabs pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificao como nos ensaios de presena/ausncia, que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso, seguir as orientaes dos captulos especficos). Considerar que esse procedimento amostra uma rea de 50cm2 e cada mililitro de diluente, depois de recolhidos os swabs, corresponde a 5cm2 de superfcie. Tanto a rea amostrada quanto o volume de diluente podem variar, de acordo com a necessidade ou com as caractersticas da amostra. Para fazer o esfregao de meias carcaas de bovinos e sunos usando o mesmo procedimento, a ISO 17604 (2003) recomenda amostrar os pontos apresentados nas Figuras 2.1 e 2.2. Usar um swab para cada ponto e, entre um ponto e outro, mergulhar o molde em etanol 70% e flambar. Os swabs podem ser recolhidos em um mesmo frasco, com um volume total de diluente correspondente a 10ml para cada par de swabs.

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Figura 2.1. Pontos recomendados para a amostragem de carcaas de bovinos com swabs.

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Figura 2.2. Pontos recomendados para a amostragem de carcaas de sunos com swabs.

2.3.3.2. Amostragem com esponjas Preparar tubos ou frascos com 25ml de um dos diluente recomendados para os swabs. Abrir a bolsa plstica contendo a esponja (ou tampo de algodo) estril e adicionar uma quantidade de diluente suficiente para molhar a esponja, sem excesso de fludo visvel. Segurando a bolsa pelo lado de fora, massagear a esponja para umedecer uniformemente. Lavar bem as mos, colocar um par de luvas estreis e retirar a esponja da bolsa. Usando um molde vazado estril, de 10x10cm, delimitar a rea a ser amostrada, segurando o molde firmemente contra a superfcie. Aplicar a esponja com presso, descrevendo 10 movimentos da esquerda para a direita e 10 movimentos de baixo para cima. Aps a aplicao, colocar a esponja de volta na bolsa e adicionar o restante do diluente, completando os 25ml. O lquido de coleta das esponjas pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificao como nos ensaios de presena/ausncia que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso, seguir as orientaes dos captulos especficos). Considerar que esse procedimento amostra uma rea de 100cm2 e cada mililitro de diluente, depois de recolhida a esponja, corresponde a 4cm2 de superfcie. Tanto a rea amostrada quanto o volume de diluente podem variar, de acordo com a necessidade ou com as caractersticas da amostra. Para fazer o esfregao de meias carcaas de bovinos e sunos, usar o mesmo procedimento para cada um dos pontos recomendados pela ISO 17604 (2003), apresentados nas Figuras 2.1 e 2.2. Usar uma esponja para cada ponto e, entre um ponto e outro, mergulhar o molde em etanol 70% e flambar. As esponjas podem ser recolhidas em uma mesma bolsa, adicionando essa bolsa todas as pores restantes do volume de 25ml correspondente a cada esponja. 31

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2.3.4. PROCEDIMENTO PARA A RETIRADA DA UNIDADE ANALTICA PELA TCNICA DA LAVAGEM SUPERFICIAL A tcnica da lavagem superficial aplica-se a alimentos de contaminao predominantemente superficial, como carcaas de aves inteiras, cortes de aves, peixes, cascas de ovos, gros, sementes, castanhas, amendoins, que podem ser mergulhados em um diluente adequado, contido em uma bolsa estril. Aplica-se tambm anlise de embalagens que possam ser fechadas e agitadas com um diluente em seu interior, para lavagem e coleta da contaminao. 2.3.4.1. Procedimento para a lavagem de carcaas de aves Procedimento recomendado pelo USDA/FSIS (2004) para a anlise simultnea de Salmonella e outros microrganismos. Drenar o excesso de lquido das embalagens, transferir a carcaa para uma bolsa estril e pesar. Adicionar bolsa e na cavidade da carcaa, 400ml de um dos diluentes recomendados para swabs (o USDA/FSIS, 2004 recomenda Tampo Fosfato pH 7,2). Segurando a carcaa com uma mo e fechando a abertura da bolsa com a outra, agitar rodando o lquido na bolsa (cerca de 35rpm), de forma a lavar toda a superfcie interna e externa da carcaa. O lquido obtido na lavagem pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificao como nos ensaios de presena/ausncia que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso, seguir as orientaes dos captulos especficos). Considerar que, nesse procedimento, cada mililitro do lavado corresponde ao peso da carcaa dividido por 400. Por exemplo, se o peso da carcaa for de 1600g, cada mililitro do lavado corresponde a 4g da amostra. 2.3.4.2. Procedimento para a lavagem de outros alimentos Transferir a amostra para uma bolsa estril e pesar. Usando os mesmos diluentes recomendados para swabs, adicionar bolsa o volume de diluente requerido para diluio inicial 1:1 (1ml de diluente por grama de amostra). Fechando a abertura da bolsa com uma mo, agitar a amostra e massagear as peas com a outra mo, por fora das bolsas, com os devidos cuidados para que pontas ou outras protuberncias no venham a furar a embalagem. No caso de gros, sementes, castanhas e produtos similares, a amostra pode ser colocada em um frasco com o diluente e agitada por 10min em shaker. O lquido obtido na lavagem pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificao como nos ensaios de presena/ausncia que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso, seguir as orientaes dos captulos especficos). Considerar que, nesse procedimento, cada mililitro do lavado corresponde a 1g de amostra. O volume de diluente pode variar, de acordo com a necessidade ou com as caractersticas da amostra. 2.3.4.3. Procedimento para a lavagem de embalagens Esse procedimento recomendado para embalagens com tampa prova de vazamento. No caso de embalagens sem a tampa ou com tampas que no sejam prova de vazamento, recorrer ao mtodo do swab. Usando os mesmos diluentes recomendados para swabs, adicionar embalagem uma quantidade de diluente suficiente para lavar toda a superfcie interna, por agitao (1/5 da capacidade da embalagem, por exemplo). Fechar e, com as mos, agitar vigorosamente a embalagem, para remover os microrganismos aderidos s paredes internas. Procurar atingir todos os pontos da superfcie interna, de forma a garantir uma completa remoo dos contaminantes presentes. 32

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O lquido obtido na lavagem pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificao como nos ensaios de presena/ausncia que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso, seguir as orientaes dos captulos especficos). Considerar que, nesse procedimento, cada mililitro do lavado corresponde capacidade da embalagem dividido pelo volume de diluente. Por exemplo, se a capacidade da embalagem for de 500ml e o volume de diluente igual a 100ml, cada mililitro do lavado corresponde a 5cm3. 2.3.5. GUARDA DE CONTRA-AMOSTRAS A ISO 7218 (1996) recomenda que, depois da retirada da(s) unidade(s) analtica(s), o material remanescente seja estocado nas mesmas condies utilizadas antes da anlise, exceto as amostras perecveis, que devem ser congeladas. No caso de amostras cuja coleta da unidade analtica tenha sido feita pela tcnica do esfregao de superfcie ou da lavagem superficial, congelar como contra-amostra a parte no utilizada do diluente em que foram recolhidos os contaminantes. O tempo mnimo de guarda das contra-amostras o requerido para a obteno dos resultados dos ensaios, devendo, entretanto, ser definido a critrio do laboratrio. O descarte final das amostras pode ser feito no lixo, porm, aquelas deterioradas ou suspeitas de conter microrganismos nocivos sade devem ser descontaminadas em autoclave (121oC/30min) antes do descarte.

2.4. PREPARO DA 1O DILUIO DA UNIDADE ANALTICA


No prosseguimento da anlise a unidade analtica deve ser diluda e homogeneizada com um diluente adequado, para permitir a inoculao nos meios de cultura. Os diluentes e a diluio inicial recomendados variam em funo do tipo de amostra e do tipo de ensaio que ser realizado, conforme descrito abaixo:

Diluentes para os ensaios de presena/ausncia


Esses ensaios, definidos no item 2.3, so feitos com diluio e homogeneizao diretamente no caldo de enriquecimento, especificados nos captulos especficos.

Diluentes para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra


Para esses ensaios, definidos no item 2.3, tambm devem ser consultados os captulos especficos.

Diluentes para os ensaios gerais de quantificao


Para esses ensaios, definidos no item 2.3, so feitas as seguintes recomendaes: O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda a gua Peptonada 0,1% (H 2Op) ou o Tampo Fosfato pH 7,2 (PB). O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Davis & Hickey, 2004) recomenda, para a anlise de produtos lcteos, a Soluo de Ringer de concentrao, a gua Peptonada 0,1% (H2Op), a gua Salina Peptonada (H2Osp), o Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) (chamado de gua de Diluio Fosfato) ou o Tampo Fosfato Cloreto de Magnsio (chamado de gua de Diluio Fosfato Magnsio). O Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (Hunt & Rice, 2005) recomenda, para a anlise de gua, a gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampo Fosfato Cloreto de Magnsio, chamado de gua de Diluio. 33

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A ISO 6887-1 (1999) recomenda a gua Salina Peptonada (H2Osp) e a gua Peptonada Tamponada (BPW). H casos especiais em que o diluente recomendado diferente, devendo ser consultado o Anexo 2.2 para verificar essas excees.

Como obter uma diluio inicial de 1:10 (10-1)


A diluio inicial recomendada para a maioria das amostras de 1:10 (10-1), adicionando-se m gramas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros do diluente. Por exemplo, para 25g de amostra, adicionar 9x25ml de diluente (225ml). A ISO 6887-1 (1999) recomenda que, para evitar injrias aos microrganismos por choque trmico, a temperatura do diluente seja a mesma do ambiente. H situaes em que o diluente e a diluio inicial so diferentes, devendo ser consultado o Anexo 2.2 para verificar essas excees.

Como obter uma diluio inicial diferente de 1:10


H casos especiais em que a primeira diluio diferente de 1:10. Para definir o volume de diluente necessrio para obter uma determinada diluio 1:k da amostra, usar a relao v = [(k.m)m]. Por exemplo, para obter a diluio 1:50 de uma unidade analtica de 10g, adicionar [(50x10)-10] mililitros do diluente (490ml). Para obter a mesma diluio com uma unidade analtica de 20g, adicionar [(50x20)20] mililitros do diluente (980ml).

Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras lquidas


No caso de alimentos lquidos, transferir a unidade analtica diretamente para os tubos ou frascos contendo a quantidade de diluente necessria para a diluio 1/10. H casos especiais em que a diluio inicial diferente, devendo ser consultado o Anexo 2.2 para verificar essas excees. Homogeneizar amostra com o diluente por agitao, invertendo a embalagem 25 vezes. Para permitir a homogeneizao, utilizar tubos ou frascos com tampa de rosca. O tamanho deve ser suficiente para que no mais do que 2/3 da capacidade seja preenchida pela unidade analtica + diluente.

Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras slidas ou lquidos concentrados


No caso de alimentos slidos ou lquidos concentrados, transferir a unidade analtica para frascos ou bolsas de homogeneizao estreis, previamente tarados. Adicionar amostra a quantidade de diluente necessria para a diluio 1:10. H casos especiais em que a diluio inicial diferente, devendo ser consultado o Anexo 2.2 para verificar essas excees. Homogeneizar a unidade analtica com o diluente, o que pode ser feito por agitao com as mos, invertendo o frasco em arco de 30cm em 7s (lquidos concentrados, ps solveis), em homogeneizador peristltico (stomacher) por 1 a 2min (alimentos moles, pastosos, modos, ps pouco solveis) ou em liquidificador (alimentos duros). Na homogeneizao em liquidificador o Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda usar alta rotao nos primeiros segundos e baixa (8000rpm) no tempo restante, que no deve ultrapassar 2min. Se for necessrio uma homogeneizao mais prolongada, importante prevenir o excessivo aquecimento do material. Para isso, o Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda resfriar o diluente em banho de gelo, antes de usar, enquanto a ISO 6887-4 (2003) recomenda no homogeneizar por mais do 2,5min de cada vez. 34

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Procedimento para o preparo da primeira diluio de amostras obtidas por esfregao de superfcie ou por lavagem superficial O diluente no qual foi recolhida a contaminao coletada com swabs, esponjas ou lavagem superficial j a primeira diluio da amostra. O tratamento subsequente de diluio decimal seriada feito a partir dessa suspenso. Como a diluio inicial no padro de 1:10, considerar essa diferena no clculo final dos resultados, conforme descrito nos Captulos 3 e 4.

2.5. DILUIO DECIMAL SERIADA DA AMOSTRA


A preparao e inoculao de diluies seriadas da amostra requerida nos ensaios quantitativos, para reduzir o nmero de microrganismos por unidade de volume, permitindo a contagem. Essa srie de diluies geralmente decimal, para facilitar o posterior clculo dos resultados. O nmero de diluies necessrias depende do nvel de contaminao esperado e deve ser tal que permita, na contagem em placas, a obteno de placas com nmero de colnias entre 25 e 250 (vide Captulo 3) ou 15 e 150 na contagem de bolores e leveduras. Na contagem pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) deve ser tal que permita a obteno de tubos positivos nas menores diluies e negativos nas maiores (vide Captulo 4). No procedimento geral descrito pelo Compendium (Swanson et al., 2001), a segunda diluio iniciada logo aps o trmino da primeira e a durao do procedimento completo, desde a preparao da primeira diluio at que todos os meios de cultura estejam inoculados, no deve exceder 15 minutos (exceto quando especificado nos captulos especficos). No captulo especfico de bolores e leveduras (Beuchat & Cousin, 2001), o Compendium recomenda que alimentos de umidade intermediria sejam mantidos de molho no diluente por um certo perodo de tempo, antes da preparao da segunda diluio, para amolecer o produto e facilitar a liberao dos microrganismos presentes. No captulo especfico de enterococos (Hartman et al., 2001), o Compendium recomenda uma diluio inicial de 1:1, com um perodo de repouso de uma hora sob refrigerao, antes de completar a diluio a 1:10 e as subseqentes. No procedimento geral descrito pela ISO 6887-1 (1999), a durao do procedimento completo no deve exceder 45 minutos e o intervalo entre o fim do preparo da primeira diluio e o incio da segunda e subseqentes no deve exceder 30 minutos (exceto quando especificado em procedimentos especficos). A ISO 6887-4 (2003) recomenda que, no caso de alimentos desidratados (exceto leite em p, ovo em p e fermento vivo em p), a primeira diluio seja mantida em repouso por 305min, temperatura ambiente (no maior que 25oC), antes de transferir o volume para a segunda diluio, para recuperao de injrias ou stress provocados pelo processamento. Analogamente, a ISO 8261 (2001) recomenda que, no caso de produtos lcteos submetidos a tratamento trmico ou acidificao, a primeira diluio seja mantida em repouso por 45min, temperatura ambiente (entre 20 e 25oC), antes de transferir o volume para a segunda diluio. Em todas as transferncias de volumes, a incerteza da medio no deve exceder 5% (ISO 6887-1, 1999). Utilizar pipetas com capacidade no mximo 10 vezes superior ao volume que vai ser coletado, uma pipeta diferente para cada diluio. Caso a ponta venha a tocar qualquer superfcie no estril, descartar e substituir por outra. No flambar as pipetas. Encher completamente a pipeta e descarregar o volume a partir da marca superior, com a ponta encostada na parede interna do tubo ou frasco, de forma que o lquido escorra pela parede.

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Como obter a segunda diluio (10-2)


Transferir asspticamente 1ml da primeira diluio (10-1) para 9ml de diluente. Os diluentes so os mesmos recomendados no Item 2.4 para a primeira diluio. Na segunda diluio no h casos especiais em que o diluente recomendado seja diferente. No mergulhar a pipeta numa profundidade superior a 1cm ao pipetar o volume da primeira para a segunda diluio (ISO 6887-1, 1999). Se a primeira diluio no contiver partculas em suspenso, o material pode ser agitado antes de transferir o volume da primeira para a segunda diluio. Se houver partculas em suspenso a ISO 6887-1 (1999) recomenda no agitar e aguardar que sedimentem no fundo do frasco, antes de transferir o volume. No caso de amostras viscosas, que aderem parede interna da pipeta, a ISO 8261 (2001) recomenda descarregar o volume e depois lavar a pipeta com o diluente, aspirando e liberando o lquido vrias vezes, para garantir que todo o material seja transferido para a segunda diluio.

Como obter as diluies subseqentes


Proceder de maneira similar, transferindo-se 1ml da diluio anterior para 9ml de diluente. Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar vigorosamente o tubo, invertendo 25 vezes em arco de 30cm (em 7s) ou com o auxlio de um agitador tipo vortex (15s).

2.6. REFERNCIAS
BEUCHAT, L.R. & COUSIN, M.A. Yeasts and molds. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th Ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 20, p.209-215. DAVIS, G.L. & HICKEY, P.J. Media and dilution water preparation. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 4, p.93-101. DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. DUNCAN, S.E., YAUN, B.R., SUMNER, S.S. Microbiological Methods for Dairy Products. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 9, p.249-268. EATON, A.D., CLESCERI, L.S., RICE, E.W. & GREENBERG, A.E. (Eds). Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater, 21st Ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF), 2005. FRANK, J.F. & YOUSEF, A.E. Tests for groups of microrganisms. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 8, p.227-248. GRAY, R.J.H. & PINKAS, J.M. Gums and spices. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 52, p.533-540. HALL, P., LEDENBACH, L., FLOWERS, R. Acid producing microorganisms. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 19, p.201-207.

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HARTMAN, P.A., DEIBEL, R.H. & SIEVERDING, L.M. Enterococci. In: DOWNES, F. P. & K. ITO (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 9, p.83-87. HUNT, M.E. & RICE, E.W. Microbiological examination. In: EATON et al. (Eds), Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater, 21st Ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF), 2005. Part 9000, p.9.1-9.169. ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions, 1st ed. The International Organization for Standardization, 1999. ISO 6887-2. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2003. ISO 6887-3. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 4: Specific rules for the preparation of fish and fishery products, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2003. ISO 6887-4. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, and fish and fishery products, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2003. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examination, 2nd ed. The International Organization for Standardization, 1996. ISO 8261/IDF 122. Milk and milk products General guidance for the preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination 2nd ed. The International Organization for Standardization, 2001. ISO 17604. Microbiology of food and animal feeding stuffs Carcass sampling for microbiological analysis, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2003. LAIRD, D.T., GAMBREL-LENARZ, S.A., SCHER, F.M. et al. Microbiological count methods. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 6, p.153-186. MIDURA, T.F. & BRYANT, R.G. Sampling plans, sample collection, shipment, and preparation for analysis. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 2, p.13-23. RICKE, S.C., BIRKHOLD, S.G. & GAST, R.K. Egg and egg products. In: DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 46, p.473-481. SMITTLE, R.B. & CIRIGLIANO, M.C. Salad dressings. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 53, p.541-544. SWANSON, K.M.J, PETRAN, R.L. & HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of microrganisms. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 6, p.53-67. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE/FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE. Microbiology Laboratory Guidebook, Chapter 4.03, October 2004. Disponvel no site: http://www.fsis.usda.gov/Science/ Microbiological_Lab_Guidebook/index.asp (acesso em 21/09/05). WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.). Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004.

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ANEXO 2.1 PROCEDIMENTOS PARA HOMOGENEIZAO DO CONTEDO E RETIRADA DA UNIDADE DE AMOSTRA DE DIFERENTES TIPOS DE ALIMENTOS
Produtos em p Homogeneizar a amostra agitando e invertendo a embalagem com as mos, at misturar bem (ISO 6887-4, 2003) ou revolvendo o contedo com uma esptula ou bagueta estril (Midura & Bryant, 2001). Se a embalagem no tiver espao livre para uma homogeneizao, transferir todo o contedo para um frasco maior e proceder da mesma forma (ISO 8261, 2001). Retirar a unidade analtica com uma esptula estril. Produtos pastosos ou modos Revolver o contedo com uma esptula ou bagueta estril, para homogeneizar. Retirar a unidade analtica com uma esptula estril ((Midura & Bryant, 2001). Iogurtes com pedaos de frutas Para iogurte com pedaos de frutas, o Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al., 2004) recomenda homogeneizar todo o contedo da unidade de amostra em liqidificador, por 1min, antes de retirar a unidade analtica. Queijos O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al., 2004) recomenda macerar todo o contedo da unidade de amostra (com uma esptula estril) e retirar a unidade analtica da mistura. Produtos muito duros A ISO 6887-4 (2003) recomenda colocar em uma bolsa plstica estril e fragmentar em pequenas partes com um martelo estril. Misturar bem a amostra fragmentada e retirar a unidade analtica com uma esptula estril. Peas de alimentos slidos A ISO 6887-4 (2003) recomenda usar um instrumento adequado (faca, tesoura estril) para quebrar ou cortar pedaos menores (de diversos pontos da pea), at obter a quantidade requerida para a anlise. Ovos em casca Para a anlise do contedo interno o Captulo 46 do Compendium (Ricke et al., 2001) recomenda lavar a casca com escova, gua e sabo, drenar o excesso de lquido, mergulhar em etanol 70% por 10min e flambar. Com luvas estreis, abrir os ovos asspticamente e colocar o contedo interno num frasco ou bolsa estril, separando a clara da gema, se a anlise assim o exigir. Misturar bem e retirar a unidade analtica da mistura. A ISO 6887-4 (2003) recomenda trs procedimentos, dependendo da finalidade do ensaio: Para analisar apenas a contaminao externa, pode ser usado o procedimento da lavagem superficial. Alternativamente, quebrar os ovos, desprezar o contedo interno, colocar as cas38

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cas em uma bolsa estril, quebrar as cascas, misturar bem e retirar a unidade analtica da mistura. Para analisar a contaminao externa e interna, quebrar os ovos, colocar as cascas e o contedo interno em um frasco ou bolsa estril, misturar bem e retirar a unidade analtica da mistura. Para analisar apenas o contedo interno, limpar a casca com gaze molhada, secar com papel absorvente, mergulhar em soluo de iodo e, com luvas estreis, remover asspticamente os ovos da soluo, deixando secar. Com luvas, abrir os ovos asspticamente e colocar o contedo interno num frasco ou bolsa estril, separando a clara da gema, se a anlise assim o exigir. Misturar bem e retirar a unidade analtica da mistura. Cortes de carne para anlise de contaminao no superficial Para a anlise de contaminao profunda de carcaas ou cortes de carne, a ISO 6887-2 (2003) recomenda expor uma rea de aproximadamente 5x5cm, usando uma faca ou tesoura estril para remover a pele (se presente) e uma camada superficial de aproximadamente 2mm. Cauterizar a superfcie exposta com fogo a chama de um maarico e, com outra faca ou tesoura estril, remover uma segunda camada de aproximadamente 1mm de profundidade e 4x4cm de rea. A partir dessa regio exposta, retirar a(s) unidade(s) analtica(s) requerida(s) para os ensaios. Moluscos bivalves (ostra, mexilho, lingueiro, berbigo, conquilha, ameijoa) A ISO 6887-3 (2003) recomenda esfregar as conchas com uma escova abrasiva estril, sob gua corrente (potvel). Drenar o excesso de gua, colocar sobre uma superfcie estril e cobrir com papel absorvente estril. Abrir asspticamente com as conchas e ento recolher os organismos (pelo menos seis) e o lquido que escorre do interior das conchas em um frasco ou bolsa plstica estril. Lavar e desinfetar bem as mos antes de iniciar o procedimento. Moluscos gastrpodes (caracol, caramujo, bzio, lapa, apa, lesma) A ISO 6887-3 (2003) recomenda esfregar as conchas com uma escova abrasiva estril, sob gua corrente (potvel). Desinfetar com lcool 70%, colocar sobre uma superfcie estril e cobrir com papel absorvente estril. Quebrar a concha com um martelo estril e retirar a carne asspticamente, recolhendo em uma bolsa ou frasco estril. Lavar e desinfetar bem as mos antes de iniciar o procedimento. Moluscos cefalpodes (polvo, lula) A ISO 6887-3 (2003) recomenda remover a pele e retirar a unidade analtica dos msculos dorsais e dos tentculos. Caranguejos e lagostas A ISO 6887-3 (2003) recomenda quebrar a casca com um martelo estril e remover o mximo da carne na retirada da unidade analtica. Ourios do mar A ISO 6887-3 (2003) recomenda lavar os organismos em gua corrente (potvel), abrir o lado ventral e retirar toda a carne e fludo internos com uma esptula.

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Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos

ANEXO 2.2 CASOS ESPECIAIS EM QUE H VARIAES NA UNIDADE ANALTICA E/OU DILUIO E/OU DILUENTES RECOMENDADOS PARA A PREPARAO DA PRIMEIRA DILUIO DE AMOSTRAS DE DIFERENTES TIPOS DE ALIMENTOS
Lquidos com baixa contaminao Nos ensaios quantitativos de amostras lquidas com baixa contagem microbiana, comum inocular uma alquota da amostra diretamente nos meios de cultura, sem diluio. Nesse caso, a primeira diluio pode ser feita inoculando-se 1ml da amostra em 9ml do diluente. Tambm so comuns os ensaios usando a tcnica de filtrao em membrana, inoculando-se um volume maior da amostra, sem qualquer diluio. Alimentos gordurosos Para esses alimentos o Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda suplementar o diluente com 1% (P/V) de Tergitol-7 Aninico ou equivalentes (Tween 80, por exemplo) e homogeneizar em liquidificador por 2min, em baixa rotao (8000rpm). A ISO 6887-4 (2003) recomenda suplementar o diluente com 1 a 10g/l de Tween 80, dependendo do teor de gordura. Para produtos com 40% de gordura, por exemplo, suplementar com 4g/l de Tween 80. Esse procedimento no se aplica a margarina e spreads. Para margarina e spreads a ISO 6887-4 (2003) recomenda unidade analtica de 40g e o seguinte procedimento: adicionar unidade analtica um volume de diluente (sem suplementos) proporcional ao teor de gordura da margarina. Por exemplo, para margarinas com 82% de gordura e unidade analtica de 40g, adicionar 40 x 0,82 = 33ml de diluente. Colocar o frasco em banho maria com temperatura controlada a 45oC, at a fuso do material. Esse perodo no deve exceder 20min. Misturar com um agitador magntico at formar uma emulso homognea, o que pode levar de 2 a 5min, dependendo do tipo de produto. Deixar descansar temperatura ambiente at a completa separao das fases aquosa (inferior) e gordurosa superior). Continuar a anlise com a fase aquosa, na qual 1ml corresponde a 1g de margarina. Preparar ento a diluio 10-1 adicionando, para cada m mililitros de fase aquosa, 9m mililitros de diluente. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004) recomenda, para margarina e spreads, o mesmo procedimento descrito para manteiga. Espessantes ou produtos com antimicrobianos naturais Para espessantes e outros produtos que aumentam de viscosidade em gua (gomas, pectina, celulose, condimento desidratados em folhas, como organo) o Compendium (Gray & Pinkas, 2001) e a ISO 6887-1 (1999) recomendam trabalhar com diluio inicial maior do que 1:10, podendo ser 1/20, 1/50, 1/100 ou outra adequada viscosidade do material. Para produtos que contm compostos antimicrobianos naturais, como condimentos (alho, cebola, cravo, canela, organo, pimenta) e certos chs e caf, recomenda-se que a primeira diluio seja maior do que 1:10 (1:100 para organo e canela, 1:1000 para cravo). Alternativamente, pode-se adicionar 0,5% sulfito de potssio (K2SO3) ao diluente e trabalhar com a diluio inicial normal.

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A unidade analtica pode ser de 10g e a diluio inicial utilizada deve ser levada em conta no clculo dos resultados. Se as contagens esperadas so baixas, deve-se manter, se possvel, a inoculao de 0,1g nos meios de cultura. Para isso, seguir as orientaes dos Captulos 3 e 4. Produtos cidos A ISO 6887-4 (2003) recomenda que o pH da primeira diluio seja neutralizado com NaOH estril. Para facilitar essa etapa, pode-se adicionar ao diluente (gua Salina Peptonada), 0,1ml/l de uma soluo alcolica de prpura de bromocresol a 0,04%. Na adio do NaOH, a elevao do pH pode ser acompanhada pela alterao de cor do meio que, muda de amarelo para roxo em pH 6,8 (neutro). A concentrao do NaOH (01M ou 1M, por exemplo) a ser usada depende da acidez da amostra e deve ser tal que a quantidade adicionada no altere significativamente a proporo 1 + 9 entre amostra e diluente. Uma segunda opo usar diluentes tamponados mas, mesmo assim, a adio de NaOH freqentemente necessria, para aumentar a capacidade tamponante do meio. O Captulo 2 do Compendium (Midura & Bryant, 2001) no faz meno a procedimentos diferenciados para essas amostras, para os ensaios gerais de quantificao. Entretanto, para amostras de maionese e outros molhos para saladas, o Captulo 53 (Smittle & Crigliano, 2001) recomenda que sejam neutralizadas para a contagem de coliformes e S. aureus. Vide tambm as recomendaes especficas para produtos lcteos fermentados. Farinhas, cereais, rao animal A ISO 6887-4 (2003) recomenda adicionar o diluente unidade analtica, manter em repouso por 20 a 30min temperatura ambiente e ento homogeneizar. Se a viscosidade da suspenso aumentar muito, dificultando a homogeneizao e a transferncia de volumes, adicionar uma quantidade adicional de diluente, at diluio 1:20. Considerar essa alterao da diluio inicial no clculo dos resultados. Chocolate em barras, bombons A ISO 6887-4 (2003) recomenda pr aquecer o diluente a 40oC, adicionar unidade analtica e misturar por agitao manual. Manter em repouso por 20-30min temperatura ambiente, at a fuso do material, homogeneizando ento em stomacher. Clara de ovos O Compendium (Midura & Bryant, 2001, Ricke et al., 2001) no faz meno a procedimentos diferenciados para essas amostras. A ISO 6887-4 (2003) recomenda que a primeira diluio seja 1:40, em gua Peptonada Tamponada (BPW), para reduzir a inibio causada pela lisozima natural sobre os microrganismos. A diluio inicial utilizada deve ser levada em conta no clculo dos resultados. Produtos fermentados contendo microrganismos vivos destinados quantificao da microbiota contaminante (exceto probiticos) A ISO 6887-4 (2003), para a determinao de outros microrganismos que no os responsveis pela fermentao (os contaminantes), recomenda usar como diluente a gua Salina Peptonada suplementada com 0,1ml/l de uma soluo alcolica de prpura de bromocresol a 0,04%. Se a cor do diluente na primeira diluio indicar pH cido (cor amarela), adicionar 40g/l 41

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de hidrxido de sdio, para retornar ao pH neutro (viragem para roxo). Se os microrganismos responsveis pela fermentao forem leveduras, adicionar ao meio de cultura onde ser feita a contagem um agente antifngico com a cicloeximida (50mg/Kg), a nistatina (50mg/Kg) ou a anfotericina (10mg/Kg). Para outros microrganismos responsveis pela fermentao, adicionar um outro antibitico, que seja adequado para inibir essa microbiota. Essas modificaes no procedimento, se usadas, devem ser relatadas no laudo de resultados. Produtos lcteos em p (leite, soro de leite, creme de leite, lactose, frmulas infantis) A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analtica de 10g e que o p seja adicionado ao diluente, no o diluente ao p (para facilitar a hidratao). A homogeneizao pode ser manual (inverter o frasco em arco de 30cm em 7 segundos) ou em stomacher. So recomendados os seguintes diluentes, que devem ser pr aquecidos a 45oC antes do uso: Para soro de leite doce, creme de leite, lactose e frmulas infantis 90ml de gua Peptonada 0,1% (H2Op), gua Peptonada Tamponada (BPW) ou gua Salina Peptonada (H2Osp). Para soro de leite cido 90ml de soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8,40,2 Para leite em p (secagem em rolo) 90ml de soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2 ou soluo de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) 2%. Para ps com baixa solubilidade o Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004) recomenda soluo de citrato de sdio 2% com pH ajustado abaixo de 8,0. Manteiga A ISO 8261 (2001) recomenda pesar uma unidade analtica de 10g em um frasco estril, transferir para um banho-maria regulado a 45oC, aguardar a fuso da amostra, adicionar 90ml de gua Peptonada 0,1% e homogeneizar em stomacher. O Captulo 6 da 17a Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004) recomenda fundir a amostra em banho a 401C, por no mais de 15min. Pr aquecer o diluente a 40-45C e pipetar o diluente vrias vezes, retornando ao frasco, para aquecer a pipeta. Pipetar ento 11ml da amostra fundida (evitar a separao das fases aquosa e gordurosa), transferir para 99ml do diluente aquecido e agitar, invertendo o frasco em arco de 30cm, 25 vezes em sete segundos. Preparar e inocular as diluies seriadas imediatamente, com os tubos de diluente tambm aquecidos. Produtos lcteos congelados A ISO 8261 (2001) recomenda pesar uma unidade analtica de 10g em um frasco estril, transferir para um banho-maria regulado a 30oC, aguardar a fuso da amostra, adicionar 90ml de gua Peptonada 0,1% e homogeneizar por agitao ou em stomacher. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al., 2004) recomenda, para sorvetes e outras sobremesas lcteas congeladas, pesar uma unidade analtica de 11g em um frasco estril, adicionar 99ml de Tampo Fosfato pH 7,2 (PB), transferir para um banho-maria regulado a 40oC, aguardar a fuso da amostra (no mais do que 15min) e homogeneizar por agitao ou em stomacher.

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Queijos A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analtica de 10g e, como diluente, 90ml de soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2 ou de soluo de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) 2%. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004) recomenda unidade analtica de 11g e, como diluente, 99ml de soluo de citrato de sdio 2%, pr aquecida a 40-45oC. Produtos lcteos fermentados A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analtica de 10g e, como diluente, 90ml de soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2. Homogeneizar em stomacher. Para produtos destinados contagem de bactrias lcticas, o Captulo 19 do Compendium (Hall et al., 2001) e o Captulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) destacam que no deve ser utilizado Tampo Fosfato na preparao das amostras, porque pode causar injrias s clulas. O diluente recomendado, de maneira geral, a gua Peptonada 0,1%. Para leites e creme fermentados, em particular, o Captulo 9 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al., 2004) recomenda unidade analtica de 11g e, como diluente, 99ml de gua destilada estril ou soluo de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) 2%, pr aquecidas a 40-45o. Para iogurte e outros produtos fermentados ou acidificados (exceto leite e creme), recomenda unidade analtica de 10g e, como diluente, 90ml de leite em p desnatado dissolvido em Tampo Fosfato (0,1g/100ml). Casena e caseinatos A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analtica de 10g e 90ml dos seguintes diluentes: Caseinatos - soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2. Casena lctica ou cida - soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8,40,2 e suplementado com anti espumante. Paracasena (obtida por coagulao com renina) - soluo de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2 e suplementado com anti espumante. Adicionar o diluente amostra, misturar bem, deixar descansar por 15min temperatura ambiente e homogeneizar em stomacher por 2min. Deixar descansar por mais 5min antes de preparar as diluies subsequentes. Paracasena com problemas de solubilidade A ISO 8261 (2001) recomenda moer aproximadamente 20g da amostra, retirar uma unidade analtica de 5g, transferir para um frasco com prolas de vidro e adicionar 95ml de soluo de tripolifosfato (Na3O10P3) 2% pr aquecida a 37o. Agitar em shaker por 15min, transferir para um banho-maria regulado a 37oC e manter no banho por mais 15min, agitando periodicamente para facilitar a homogeneizao. Moluscos (bivalves e gastrpodes) e ourios do mar Para moluscos bivalves (ostra, mexilho, lingueiro, berbigo, conquilha, ameijoa) e moluscos gastrpodes (caracol, caramujo, bzio, lapa, apa, lesma) e ourios do mar (Echinoidae), a ISO 6887-3 (2003) recomenda unidade analtica de seis organismos inteiros e diluio inicial de 43

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1:2, adicionado uma parte da amostra para 2 partes de diluente (gua Peptonada 0,1%, gua Salina Peptonada ou gua Peptonada Tamponada). Homogeneizar em liquidificador por 30s a 2min, transferir para uma bolsa estril e completar a diluio at 1:10 com o mesmo diluente, homogeneizando em stomacher. Pepinos do mar(Holothuroidea) e tunicados ou ascdias (Ascidiacea) A ISO 6887-3 (2003) recomenda cortar os organismos em pequenos pedaos, preparar uma diluio inicial de 1:2, adicionado uma parte da amostra para 2 partes de diluente (gua Peptonada 0,1%, gua Salina Peptonada ou gua Peptonada Tamponada), homogeneizar em liquidificador por 30s a 2min, transferir para uma bolsa estril e completar a diluio at 1:10 com o mesmo diluente.

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Captulo 3

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3.1. INTRODUO
A maioria das orientaes contidas nesse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Swanson et al., 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foram tambm includas orientaes das normas ISO 6887-1 (1999) e ISO 11133-1 (2000), recomendadas para ensaios realizados com metodologia da International Organization for Standardization. A anlise microbiolgica de alimentos predominantemente cultural, objetivando a deteco ou a enumerao de microrganismos vivos. Em funo da multiplicidade de grupos, gneros e espcies que podem estar presentes, um grande nmero de ensaios so utilizados, que podem ser de dois tipos: ensaios qualitativos, que verificam a presena ou ausncia do(s) microrganismo(s) alvo em uma dada quantidade da amostra, sem quantificar, e ensaios quantitativos, que determinam a quantidade do(s) microrganismo(s) alvo na amostra, geralmente por unidade de massa ou volume. Cada um desses ensaios segue procedimentos diferenciados, que dependem do(s) microrganismo(s) alvo, mas a maioria deles utiliza as mesmas tcnicas culturais bsicas de microbiologia. Essas tcnicas so a deteco da presena/ausncia (Captulo 5), a contagem do Nmero Mais Provvel (NMP) (Captulo 4) e a contagem padro em placas, descrita nesse captulo. A contagem padro em placas utilizada tanto para a quantificao de grandes grupos microbianos, como os aerbios mesfilos, os aerbios psicrotrficos, os bolores e leveduras, os clostrdios sulfito redutores, os enterococos e as bactrias lcticas, como tambm para gneros e espcies em particular, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens. O procedimento bsico a inoculao da amostra homogeneizada (e suas diluies) em um meio slido (com gar), contido em placas de Petri, seguida da incubao das placas at crescimento visvel. A versatilidade da tcnica decorrente do princpio envolvido na contagem, baseado na premissa de que, quando fixada em um meio de cultura slido adequado, cada clula microbiana presente na amostra ir formar uma colnia isolada. Variando-se o tipo de meio de cultura (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio seletivo-diferencial) e as condies de incubao (temperatura e atmosfera), possvel selecionar o grupo, gnero ou espcie que se deseja contar. Como as clulas microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, ttrades, cachos, cadeias, etc.), no possvel estabelecer uma relao direta entre o nmero de colnias e o nmero de clulas. Essa correlao feita entre o nmero de colnias e o nmero de Unidades Formadoras de Colnias (UFC), que podem ser tanto clulas individuais como agrupamentos caractersticos de certos microrganismos. Para a homogeneizao da amostra e preparo das diluies, so utiliza-

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dos os procedimentos descritos no Captulo 2. Para a inoculao no meio de cultura, chamada de plaqueamento, podem ser utilizados quatro procedimentos bsicos: a) o plaqueamento em profundidade (pour plate), b) o plaqueamento em superfcie (spread plate), c) o plaqueamento em gotas (drop plate) ou d) a filtrao em membrana.

3.2. PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE (POUR PLATE)


O procedimento padro de plaqueamento em profundidade, descrito abaixo, tem limite de deteco de 10 UFC/g para produtos slidos ou 1 UFC/ml para produtos lquidos. Esse procedimento pode ser adaptado, se necessrio, para limite de deteco de 1 UFC/g para produtos slidos. Suas principais aplicaes so os ensaios de contagem total de aerbios mesfilos, contagem de clostrdios sulfito redutores, contagem de enterobactrias, contagem de enterococos e contagem de bactrias lcticas. Apresenta algumas limitaes, a principal delas sendo a necessidade de fuso do meio de cultura antes do uso. Alguns meios, suplementados com componentes sensveis ao calor depois da esterilizao, no podem ser reaquecidos para fuso do gar antes do uso. 3.2.1. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES Material para preparao da amostra e diluies seriadas, descritos no Captulo 2 Meio de cultura recomendado para o ensaio a ser realizado, descrito nos captulos especficos Placas de Petri de 20 x 100mm estreis vazias Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado, descrito nos captulos especficos 3.2.2. PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento, observar os cuidados descritos no Captulo 2, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os tubos e placas que sero inoculados, com o cdigo da amostra, a diluio e a sigla do meio de cultura contido. Fundir os meios de cultura em banho com gua fervente, mantendo a fervura apenas o tempo necessrio para a fuso do gar. Resfriar imediatamente em gua fria e manter temperatura de 44 a 46oC at o momento do uso (em banho ou estufa com temperatura controlada). a) Preparao das amostras e diluies seriadas. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Inoculao. Geralmente a inoculao feita para vrios ensaios simultaneamente. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido, selecionar trs diluies adequadas da amostra (vide notas abaixo) e inocular 1ml de cada diluio em placas de Petri separadas, estreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar ou prximo chama de um bico de Bunsen. Depositar o inculo fora do centro da placa, pois isto facilitar a posterior mistura com o meio de cultura. Posicionar a pipeta em em ngulo de aproximadamente 45o e tocando o fundo da placa. Utilizar uma pipeta diferente para cada diluio, com capacidade de, no mximo, 10ml. A incerteza da medio dos volumes no deve exceder 5% (ISO 6887-1, 1999). Observar criteriosamente se a placa utilizada corresponde amostra e diluio que esto sendo inoculadas. Mudar as placas de posio, medida que sejam inoculadas, para no inocular a mesma placa mais de uma vez ou deixar alguma placa sem inocular.

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Nota b.1) Selecionar as diluies em funo do nvel de contaminao estimado da amostra, de forma a obter placas com 25 a 250 colnias. Se o nvel de inculo esperado estiver na faixa de 2.500 a 25.000 UFC/g ou ml, por exemplo, as diluies recomendadas so a 10-1, 10-2 e 10-3, que correspondem a 0,1 0,01 e 0,001g ou ml da amostra. Se a contaminao esperada estiver acima dessa faixa, deve-se inocular diluies mais altas. Se estiver abaixo, no caso de produtos lquidos possvel inocular 1ml da amostra sem diluio e 1ml das duas diluies subseqentes. No caso de produtos slidos no possvel inocular a amostra sem diluio, mas pode-se inocular at 2ml da diluio inicial em uma mesma placa, ou um volume maior, distribudo em vrias placas (2ml/placa). Caso no seja possvel estimar previamente o nvel de contaminao da amostra, recomendase inocular mais do que trs diluies, partindo-se da diluio inicial. Nota b.2) Na anlise de alguns alimentos, a diluio inicial recomendada maior do que 1:10 (vide Captulo 2). Se as contagens esperadas nesses produtos so baixas, deve-se aumentar o volume inoculado da diluio inicial, da mesma forma descrita na Nota b.1. Utilizando essa tcnica, deve-se manter, se possvel, a inoculao de 0,1g de produtos slidos ou 1ml de produtos lquidos. Nota b.3) Para aumentar a preciso das contagens recomenda-se inocular duas placas por diluio (duplicata) e no utilizar pipetas com capacidade maior do que 2ml.

c) Adio do meio de cultura. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido, retirar o meio de cultura do banho ou estufa a 44-46oC e, se o frasco estiver molhado, secar com papel toalha, para evitar respingos nas placas, no momento do plaqueamento. Evitar agitao e movimentos bruscos do frasco, para no formar bolhas. Verter 12 a 15ml do meio nas placas inoculadas, observando criteriosamente se a identificao das placas corresponde ao meio de cultura utilizado. Misturar o meio com o inculo, movimentando suavemente as placas, numa superfcie plana, em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares, oito a dez vezes no sentido horrio e oito a dez vezes no sentido anti-horrio. A movimentao das placas deve ser feita cuidadosamente, para evitar respingos de meio nas bordas ou nas tampas. Para facilitar esta etapa do trabalho, utilizar preferencialmente placas altas (20 x 100mm). As placas podem ser empilhadas durante a adio do meio e a homogeneizao com o inculo, mas, em seguida, devem ser distribudas numa bancada fria, para acelerar o resfriamento e a solidificao do meio.
Nota c.1) Quando vrios ensaios estiverem sendo conduzidos simultaneamente, as atividades e o trabalho em equipe devem ser programados de forma a obedecer as seguintes condies, estabelecidas pelo Compendium (Swanson et al., 2001): o tempo decorrido entre o depsito do inculo em uma placa e a adio do meio de cultura no deve ultrapassar 10 minutos, para evitar o ressecamento e aderncia do inculo s placas. A mistura do meio de cultura com o inculo deve ser feita imediatamente aps a adio do meio, para no haver risco de solidificao do gar. Alm disso, na recomendao do Compendium a durao do procedimento completo, desde a preparao da primeira diluio at que todos os meios de cultura estejam inoculados, no deve exceder 20 minutos. Na recomendao da ISO 6887-1 (1999), a durao do procedimento completo no deve exceder 45 minutos. Nota c.2) Alguns alimentos contendo partculas (farinhas, por exemplo) podem dificultar a visualizao das colnias na primeira diluio, confundidas com as partculas. Para evitar esse problema, pode-se adicionar TTC (2,3,5 cloreto de trifeniltetrazlio) ao meio de cultura, pois a maioria das bactrias formam colnias vermelhas na presena do TTC. Para cada 100ml de meio, adicionar 0,5ml da soluo aquosa 1% de TTC, previamente esterilizada por filtrao.

d) Incubao. Aguardar a completa solidificao do meio de cultura, inverter as placas e incubar nas condies de temperatura, tempo e atmosfera especificadas para cada ensaio. O meio de cultura deve atingir a temperatura de incubao no intervalo mximo de 2 horas. Evitar o 47

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empilhamento excessivo das placas e no encher demasiadamente as estufas incubadoras, para garantir a distribuio homognea da temperatura. Num intervalo de 48h de incubao, as placas no podem perder mais do que 15% do seu peso por ressecamento. Umidade excessiva tambm indesejvel, porque aumenta o risco de espalhamento. Dependendo da temperatura, o controle da umidade nas estufas pode ser necessrio. e) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Seguir as orientaes do item 3.6.1.

3.3. PLAQUEAMENTO EM SUPERFCIE (SPREAD PLATE)


A principal diferena do plaqueamento em superfcie, em relao ao plaqueamento em profundidade, que a amostra e/ou suas diluies so inoculadas diretamente na superfcie do meio slido, j distribudo em placas. A inoculao superficial considerada vantajosa sob alguns aspectos, pois no expe os microrganismos ao calor do meio fundido, permite a visualizao de caractersticas morfolgicas e diferenciais de colnias, facilita a transferncia de colnias, permite a utilizao de meios que no podem ser fundidos depois de prontos e no exige que os meios sejam translcidos. Sua principal desvantagem que o volume inoculado limitado capacidade de absoro de lquido pelo meio de cultura, que no permite a inoculao de mais do que 0,5ml por placa. O procedimento padro a inoculao de 0,1ml/placa de cada diluio, com limite de deteco de 100 UFC/g para produtos slidos ou 10 UFC/ml para produtos lquidos. Esse procedimento pode ser adaptado, se necessrio, para limite de deteco de 10 UFC/g para produtos slidos ou 1 UFC/ml para produtos lquidos. Suas principais aplicaes so os ensaios de contagem total de aerbios psicrotrficos, contagem de bolores e leveduras, contagem de S. aureus e contagem de B. cereus. 3.3.1. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES Material para preparao da amostra e diluies seriadas, descritos no Captulo 2 Placas de Petri contendo o meio recomendado para o ensaio, descrito nos captulos especficos Ala de espalhamento (ala de Drigalski) mergulhada em etanol 70% Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado, descrito nos captulos especficos 3.3.2. PROCEDIMENTO Assim como recomendado no plaqueamento em profundidade, observar os cuidados descritos no Captulo 2, antes de iniciar o procedimento, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os tubos e placas que sero inoculados, com o cdigo da amostra, a diluio e a sigla do meio de cultura contido. Preparar previamente as placas e secar em capela de fluxo laminar (30-60min, com as tampas parcialmente abertas) ou em estufa (50oC/1,5-2h ou 25-30oC/18-24h). a) Preparao das amostras e diluies seriadas. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Inoculao. Geralmente a inoculao feita para vrios ensaios simultaneamente. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido, selecionar trs diluies adequadas da amostra para a inoculao (vide nota b.1). Com uma pipeta de no mximo 1ml (divises de 0,1 em 0,1ml), inocu48

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lar 0,1ml de cada diluio na superfcie das placas previamente preparadas. Observar criteriosamente se a placa utilizada corresponde amostra e diluio que esto sendo inoculadas e se contm o meio de cultura correto. Mudar as placas de posio, medida que sejam inoculadas, para no inocular a mesma placa mais de uma vez ou deixar alguma sem inocular. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar ou prximo chama de um bico de Bunsen. O mais rpido possvel, espalhar o inculo por toda a superfcie do meio, com uma ala de Drigalski, at que o excesso de lquido seja absorvido. Usar uma ala para cada placa ou fazer o espalhamento da placa de maior para a placa de menor diluio, flambando a ala com etanol 70%, entre uma placa e outra. Resfriar a ala na parte interna da tampa da placa antes de coloc-la em contato com o inculo
Nota b.1) Assim como no plaqueamento em profundidade, selecionar as diluies em funo do nvel de contaminao estimado da amostra, de forma a obter placas com 25 a 250 colnias. Considerar, entretanto, que o volume inoculado dez vezes menor. Para amostras com nvel baixo de contaminao pode-se inocular um volume maior da primeira diluio, distribuindo esse volume por vrias placas. A distribuio mais comumente utilizada trs placas com 0,3ml e uma placa com 0,1ml. No espalhamento das placas com 0,3ml, o tempo requerido para a absoro do lquido maior, exigindo cuidados para que no permaneam filmes de umidade na superfcie, com a conseqente formao de zonas de espalhamento. Nota b.2) Na anlise de alguns alimentos, a diluio inicial recomendada maior do que 1:10 (vide Captulo 2). Se as contagens esperadas nesses produtos so baixas, deve-se aumentar o volume inoculado da diluio inicial, da mesma forma descrita na Nota b.1. Utilizando essa tcnica, deve-se manter, se possvel, a inoculao de 0,01g de produtos slidos ou 0,1ml de produtos lquidos. Nota b.3) Quando vrios ensaios estiverem sendo conduzidos simultaneamente, as atividades e o trabalho em equipe devem ser programados de forma a obedecer as seguintes condies, estabelecidas pela APHA (2001): a durao do procedimento completo, desde a preparao da primeira diluio at que todos os meios de cultura estejam inoculados, no deve exceder 20 minutos e o espalhamento do inculo na superfcie do meio deve ser iniciado imediatamente aps a inoculao das trs diluies da amostra. Na recomendao da ISO 6887-1 (1999), a durao do procedimento completo no deve exceder 45 minutos. Nota b.4) Para aumentar a preciso das contagens recomenda-se inocular duas placas por diluio (duplicata) e utilizar pipetas de no mximo 1ml para a transferncia do inculo de 0,1ml.

c) Incubao. Seguir as mesmas orientaes descritas para o plaqueamento em profundidade. d) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Seguir as orientaes do item 3.6.2.

3.4. PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE)


O plaqueamento em gotas uma tcnica de inoculao em superfcie, com as mesmas vantagens do plaqueamento em superfcie. A principal diferena que o inculo no espalhado, mas sim, depositado no meio de cultura, em gotas de 0,01ml. Como as gotas ocupam um espao mnimo, possvel inocular, numa mesma placa, trs diluies em triplicata, trs gotas por diluio. Isso torna a tcnica extremamente econmica, com limite de deteco de 1.000 UFC/g de produtos slidos ou 100 UFC/ml de produtos lquido. No uma tcnica rotineiramente utilizada

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na anlise de alimentos, mas pode ser muito til em situaes que exijam a inoculao de um nmero grande de diluies. 3.4.1. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES Material para preparao da amostra e diluies seriadas, descritos no Captulo 2 Pipetas graduadas de 0,1ml estreis ou pipetadores de ponteiras descartveis, para liberao das gotas Placas de Petri contendo o meio recomendado para o ensaio, descrito nos captulos especficos Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado, descrito nos captulos especficos 3.4.2. PROCEDIMENTO Assim como recomendado no plaqueamento em profundidade, observar os cuidados descritos no Captulo 2, antes de iniciar o procedimento, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os tubos e placas que sero inoculados, com o cdigo da amostra, a diluio e a sigla do meio de cultura contido. Preparar previamente as placas com os meios de cultura e secar em estufa por 24 horas a 25-30oC. a) Preparao das amostras e diluies seriadas. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2, porm, preparar o diluente suplementado com 0,1% de gar, para facilitar a posterior fixao das gotas na superfcie do meio de cultura. b) Inoculao. Dividir a placa em 9 setores, marcando o fundo com caneta vidrogrfica (trs linhas horizontais e trs linhas verticais). Para cada ensaio que estiver sendo conduzido, selecionar trs diluies adequadas da amostra para a inoculao (vide nota b.1 abaixo). Antes de coletar o volume de cada diluio, para a inoculao nas placas, no esquecer de agitar vigorosamente os tubos de diluio, invertendo 25 vezes em arco de 30cm, ou com o auxlio de um agitador tipo vortex. Utilizando pipetas graduadas de 0,1ml (divises de 0,01 em 0,01ml) ou pipetadores de ponteiras descartveis, depositar trs gotas de 0,01ml de cada diluio em trs quadrados adjacentes da placa (triplicata). Esse procedimento deve ser feito com cuidado, para que as gotas no escorram para fora dos respectivos quadrados. No espalhar as gotas. Mantendo as placas numa superfcie plana, aguardar que o lquido seja absorvido pelo meio de cultura, o que requer aproximadamente 30 minutos.
Nota b.1) Selecionar as diluies em funo do nvel de contaminao estimado da amostra, de forma a obter gotas com 30 colnias, no mximo. Considerar, entretanto, que o plaqueamento em gotas no se aplica a amostras com nvel de contaminao abaixo de 1.000 UFC/g ou 100 UFC/ml. A primeira razo desta limitao o pequeno volume inoculado e a segunda a capacidade da pipeta, que no permite a transferncia de lquidos viscosos ou com slidos em suspenso, comum nas duas primeiras diluies de alimentos slidos. Pode, entretanto, ser utilizado para amostras com nvel mais baixo de contaminao, se a finalidade do ensaio no for quantificar, mas sim, comprovar que a contagem encontra-se abaixo desse limite.

c) Incubao. Aguardar a completa absoro do lquido das gotas pelo meio de cultura e incubar nas mesmas condies recomendadas para o plaqueamento em profundidade. d) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Seguir as orientaes do item 3.6.3. 50

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3.5. FILTRAO EM MEMBRANA


O procedimento de filtrao em membrana limitado analise de amostras lquidas lmpidas, sem slidos em suspenso, que possam ser filtradas atravs de uma membrana de poro 0,45mm. Sua principal vantagem que permite a inoculao de maiores volumes da amostra, concentrando na membrana os microrganismos presentes na quantidade inoculada. O limite de deteco de 1 UFC por volume inoculado, sendo indicado para amostras com contagens abaixo do limite de deteco dos outros procedimentos. Suas principais aplicaes so os ensaios de contagem total de aerbios mesfilos, contagem de bolores e leveduras, contagem de bactrias lcticas, contagem de enterococos e contagem de coliformes totais/fecais/E. coli em gua, refrigerantes, outros produtos lquidos e produtos slidos que possam ser transformados numa soluo lmpida, como sal e acar, por exemplo. 3.5.1. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES Material para preparao da amostra e diluies seriadas, descritos no Captulo 2 Proveta de 100 ou 200ml estril, para medio de volumes de amostra Conjunto de filtrao previamente esterilizado Bomba de vcuo Membranas de 47mm de dimetro, porosidade de 0,45mm, brancas e quadriculadas Pinas para transferncia das membranas, mergulhadas em etanol Placas de Petri contendo o meio recomendado para o ensaio, descrito nos captulos especficos Placas estreis vazias e almofadas estreis (pads) opcionais para uso dos meios na forma de caldo Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado, descrito nos captulos especficos 3.5.2. PROCEDIMENTO Assim como recomendado no plaqueamento em profundidade, observar os cuidados descritos no Captulo 2, antes de iniciar o procedimento, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os tubos e placas que sero inoculados, com o cdigo da amostra, a diluio e a sigla do meio de cultura contido. a) Preparao do conjunto de filtrao. O conjunto de filtrao composto de um porta filtro, um kitasato e um copo de filtrao. O porta filtro um tipo de funil cuja parte superior plana, para acomodar o filtro membrana e, sobre essa, o copo de filtrao, preso por uma presilha. A parte inferior do porta filtro acoplada ao kitasato que, conectado uma bomba de vcuo, recolhe o lquido filtrado. Antes do incio das anlises o porta filtro deve ser acoplado ao kitasato, embrulhado em papel kraft e esterilizado em autoclave (121oC/30min). Os copos de filtrao devem ser embrulhados separadamente em papel kraft e tambm esterilizados em autoclave (121oC/30min). Alternativamente podem ser utilizados copos descartveis estreis, muito teis quando o nmero de amostras para filtrar alto. No momento do uso as duas partes devem ser desembrulhadas em uma cmara de fluxo laminar ou, na indisponibilidade desta, prximo chama de um bico de Bunsen. O conjunto preparado ajustando-se a membrana estril no porta filtro (com a face quadriculada para cima) e o copo de filtrao sobre a membrana. Conecta-se ento o kitasato bomba de vcuo, para proceder filtrao. Podem tambm ser utilizados manifolds, que tm vrios porta filtros e permitem filtrar vrias amostras simultaneamente.
Nota a1) Entre uma amostra e outra, antes de posicionar uma nova membrana, o porta filtro deve ser flambado com lcool e o copo de filtrao deve ser substitudo. A cada 10 amostras recomenda-se filtrar no conjunto 100ml de um dos diluentes recomendados

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no Captulo 2, estril, incubando essa membrana para verificar possvel contaminao cruzada entre as amostras. Aps a filtrao de 30 amostras o conjunto deve ser novamente esterilizado em autoclave, reiniciando uma nova srie de filtraes. Se o intervalo entre uma filtrao e outra for maior do que 30min e o conjunto estiver sendo utilizado fora da capela de fluxo laminar, ento recomenda-se autoclavar todo o conjunto novamente, mesmo que no tenha sido atingido o limite de 30 amostras.

b) Preparao das placas. Na contagem pelo mtodo de filtrao em membrana as placas mais comumente utilizadas so as de 50mm de dimetro e 9mm de altura. Se for utilizado meio slido, devem ser preparadas previamente, da mesma forma recomendada para o plaqueamento em superfcie, distribuindo-se pores de 5ml do meio de cultura. Tambm comum a prtica de se utilizar o meio na forma de caldo, situao em que no necessria a preparao prvia das placas. No momento da anlise, deve-se colocar uma almofada absorvente (pad) estril no interior das placas tambm estreis e embeber a almofada com pores de 2ml do mesmo meio, na forma lquida. c) Homogeneizao da amostra e retirada da unidade analtica. Homogeneizar a amostra seguindo os procedimentos descritos no Captulo 2. Medir 100ml numa proveta estril e verter cuidadosamente no copo do conjunto de filtrao, evitando respingos. Se o copo do conjunto de filtrao for graduado e a escala contiver a marcao de volume requerida, o volume da amostra pode ser medido diretamente, sem a utilizao da proveta. d) Diluio seriada da amostra. Como o mtodo de filtrao uma tcnica de concentrao dos microrganismos em amostras com baixas contagens, geralmente no so feitas diluies seriadas da amostra. O procedimento usual a filtrao de 100ml, que podem ser fracionados em duas pores de 50ml, 4 pores de 25ml ou 3 pores de 70, 25 e 5ml, respectivamente. A seleo do volume a ser filtrado, entretanto, depende da contaminao estimada na amostra, de forma a resultar em placas com contagens na faixa de 20 a 200 colnias. Se for necessrio o preparo de diluies, utilizar o mesmo procedimento descrito no Captulo 2. e) Filtrao. Ligar a bomba de vcuo e proceder filtrao. Aps a passagem da amostra, ainda com a bomba ligada, enxaguar as paredes do copo com 20 a 30ml de um dos diluentes recomendados no Captulo 2, para recolher eventuais contaminantes aderidos. Repetir esse procedimento mais uma vez. Desligar a bomba de vcuo antes que a membrana seque excessivamente. Quando o volume a ser filtrado for menor do que 20ml, adicionar ao copo do conjunto de filtrao cerca de 20-30ml de diluente, antes da adio da amostra. No necessria uma medida exata do volume de diluente, cuja funo aumentar o volume a ser filtrado, facilitando uma melhor distribuio dos microrganismos na membrana. f) Transferncia e incubao da membrana. Retirar o copo e, com uma pina flambada e resfriada, transferir a membrana para a placa com o meio de cultura, com a face quadriculada para cima. Ao colocar a membrana no meio de cultura importante que toda a superfcie fique completamente aderida ao meio, para que haja contato dos microrganismos com os nutrientes. Se houver formao de bolhas, deve-se levantar a borda da membrana mais prxima da(s) bolha(s) e recoloc-la de forma a eliminar a(s) bolha(s). Incubar as placas nas condies recomendadas pelo ensaio (descrita nos captulos especficos), invertidas e, preferencialmente, acondicionadas em sacos ou bandejas com papel toalha ou papel de filtro mido, para evitar desidratao. g) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Seguir as orientaes do item 3.6.4. 52

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3.6. CONTAGEM DAS COLNIAS E CLCULO DOS RESULTADOS


As instrues apresentadas nesse item so aplicveis aos ensaios em que todas as colnias desenvolvidas nas placas, aps o perodo de incubao, so contadas e consideradas no clculo. No caso de ensaios que utilizam meios diferenciais, para distinguir o(s) microganismo(s) alvo da microbiota acompanhante (outros microganismos que podem crescer nas mesmas condies), apenas as colnias tpicas so contadas e consideradas no clculo. Esse o caso da contagem de enterococos e enterobactrias, que seguem as orientaes dos captulos especficos. Da mesma forma, no caso dos ensaios que exigem a confirmao das colnias, apenas a porcentagem de colnias confirmadas considerada no clculo. Esse o caso da contagem de bactrias lcticas, clostrdios sulfito redutores, C. perfringens, S. aureus e B. cereus, que tambm seguem as orientaes dos captulos especficos. 3.6.1. PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE Para a contagem, selecionar as placas sem espalhamento, com nmero de colnias entre 25 e 250. Contar as colnias com o auxlio da lupa de um contador de colnias, para facilitar a visualizao. Utilizar um contador de colnias que tenha o fundo quadriculado em cm2, como guia para a contagem. Se no houver placas nessas condies ideais, seguir as orientaes das regras 5 a 12, para a contagem. Para calcular os resultados, h duas situaes a considerar. A primeira situao padro, em que unidade analtica uma massa ou volume da amostra, homogeneizada com o diluente. A segunda a situao em que as amostras foram preparadas pelas tcnicas do esfregao de superfcie ou da lavagem superficial. Em todas as situaes, usar notao exponencial na apresentao dos resultados, com apenas uma casa decimal depois da vrgula e aproximando para cima quando a segunda casa decimal for igual a cinco ou maior. A aproximao deve ser feita no nmero final obtido, depois de efetuados todos os clculos. 3.6.1.1. Clculo dos resultados na situao padro A situao padro aquela em que unidade analtica uma massa ou volume da amostra, homogeneizada com o diluente. As regras para o clculo dos resultados so: Regra 1 - Se a contagem foi feita numa placa inoculada com a amostra sem diluio, sem duplicata, o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) igual ao nmero de colnias (Exemplos 1 e 2). Se foi feita duplicata, o nmero de UFC igual mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata (Exemplos 3 e 4).
No colnias na(s) placa(s) da diluio sem diluio (100) 10-1 10-2 Sem duplicata 1 199* 8 0 2 245* 22 2 Com duplicata Exemplo 3 4 62* - 57* 123*- 136* 6-5 12 - 10 0-0 Contagem UFC/ml 199 = 2,0 x 10 2 245 = 2,5 x 10 2 (62 + 57)/2 = 59,5 = 6,0 x 101 (123 + 136)/2 = 129,5 = 1,3 x 102

*Contagens efetivamente utilizadas no clculo do resultado.

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Regra 2 - Se a contagem foi feita numa placa inoculada com a diluio 10-1 ou maior, sem duplicata, calcular o nmero de UFC/g ou ml multiplicando o nmero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. O inverso da diluio 10-1 101, o inverso da 10-2 102 e assim por diante (Exemplos 5 e 6). Se foi feita duplicata, considerar como nmero de colnias a mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata e multiplicar pelo inverso da diluio (Exemplos 7 e 8).
Exemplo Sem duplicata 5 6 Com duplicata 7 8 No colnias na(s) placa(s) da diluio 10-1 10-2 10-3 199* Inc Inc - Inc Inc - Inc 18 245* 62* - 57* Inc - Inc 2 22 6-5 239*- 242* Contagem UFC/g ou ml 199 x 101 = 2,0 x 103 245 x 102 = 2,5 x 104 [(62 + 57)/2]x 10 2 = 59,5 x 102 = 6,0 x 10
3 3 3

*Contagens efetivamente utilizadas no clculo do resultado. Inc = Incontvel

[(239 + 242/2] x 10 = 135,5x 10 = 1,4 x 105

Regra 3 Se o volume inoculado da primeira diluio (ou da amostra sem diluio) foi diferente de 1ml e a contagem foi feita na placa inoculada com esse volume, valem as regras anteriores mas o nmero de colnias deve ser dividido pelo volume inoculado, para calcular o resultado (Exemplos 9, 10, 11 e 12).
Exemplo Sem duplicata 9 10 Com duplicata 11 12 No colnias na(s) placa(s) da diluio (volume inoculado) 10-1 (2ml) 10-2 (1ml) 10-3 (1ml) 199* 123* 62* - 57* 27* - 35* 18 2 6-5 3-3 2 0 0-0 0-0 Contagem UFC/g ou ml

(199/2) x 101 = 1,0 x 103 (123/2) x 101 = 6,2 x 102 [(62 + 57)/2)]/2 x 101 = 29,75 x 101 = 3,0 x 102 [(27 + 35)/2)]/2 x 101 = 15,5 x 101 = 1,6 x 102

*Contagens efetivamente utilizadas no clculo do resultado.

Regra 4 Se a diluio inicial no foi decimal (1:20, 1:50, 1:200, etc.), valem as regras 2 e 3 mas necessrio inserir nos clculos a diluio inicial aplicada. Considerando uma unidade analtica de m gramas ou mililitros, diluda em v mililitros de diluente, a diluio inicial igual a m/(m+v), ou seja, unidade analtica dividida pelo volume total (diluente + unidade analtica). As diluies decimais subseqentes so a inicial multiplicada por 10-1 (1 decimal), a inicial multiplicada por 10-1 (2o decimal) e assim por diante. Por exemplo, para uma unidade analtica de 50g preparada com 950ml de diluente, a diluio inicial de 50/(50+950) = 50/1.000 = 1/20 (1:20). A 1o decimal 10-1/20, a 2o decimal 10-2/20 e assim por diante. O clculo dos resultados ainda feito multiplicando-se o nmero de colnias pelo inverso da diluio mas, nesse caso, o inverso da diluio a frao invertida: inverso da diluio 1/20 = 20/1, inverso da 10-1/20 = 20x101, inverso da 10-2/20 = 20x102 e assim por diante (Exemplos 13, 14, 15, 16, 17 e 18)

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Exemplo 13 14 15 Com duplicata 16 17 18 Unidade analtica 10g 25g 25 Volume diluente 490ml 350ml 975ml 475ml 490ml 290ml Diluio inicial No colnias na(s) placa(s) da diluio 2o decimal Inicial 1o decimal 199* 280 Inc 18 30* Inc 2 133* 2-1 6-5 239*- 242* 2 UFC/g ou ml amostra 199 x 50 = 1,0x104 133x40x102 = 5,3x105 [(237+229)/2] x 20 = 4,7x10 3 [(62+57)/2] x 50x10 1 = 3,0x10 4 [(239+242)/2] x 30x10 2 = 7,2x10 5 30x15x101 = 4,5x10 3

Sem duplicata 10/500 = 1/50 25/1.000 = 1/40 25/500 = 1/20 10/500 = 1/50 10/300 = 1/30 25/375 = 1/15

25 10g 10g

237*-229* Inc - Inc Inc - Inc

21 - 20 62* - 57* Inc - Inc

*Contagens efetivamente utilizadas no clculo do resultado. Inc = Incontvel

Os exemplos acima so de clculos em condies ideais, com nmero de colnias na faixa de 25 a 250, em placas da mesma diluio, sem espalhamento. Mas so bastante freqentes as situaes em que as placas no se apresentam em condies to ideais, sendo aplicadas algumas regras bsicas para o clculo dos resultados. Essas regras so apresentadas a seguir, com exemplos no Quadro 3.1. Regra 5 Uma placa da duplicata com contagem acima ou abaixo da faixa de 25-250 colnias. Se a outra placa apresenta contagem na faixa de 25 a 250, considerar o nmero de colnias de ambas as placas no clculo do resultado (Exemplo 30 do Quadro 3.1) Regra 6 - Duas diluies consecutivas com 25-250 colnias. Calcular o nmero de UFC de cada diluio e comparar os resultados.
6.a. Se um dos resultados for maior do que o dobro do outro, considerar apenas o menor (Exemplos 19 e 31 do Quadro 3.1) 6.b. Se um dos resultados no ultrapassar o dobro do outro, ento considerar ambos os resultados, apresentando a mdia como resultado final (Exemplos 20 e 32 do Quadro 3.1).

Regra 7 - Nenhuma placa atingiu 25 colnias. Contar as colnias nas placas com nmero mais prximo de 25, calcular o nmero de UFC (Exemplos 21 e 33 do Quadro 3.1) e apresentar o resultado como contagem estimada (est). Regra 8 - Nenhuma placa com crescimento. Considerar o nmero de colnias na 1 diluio inoculada como sendo 1 e calcular o resultado de acordo com as regras 1, 2, 3 ou 4. Relatar o resultado final como menor do que o valor obtido no clculo, valor estimado. Se nenhuma placa houvesse apresentado crescimento nos exemplos 1 a 4 da Regra 1, o resultado final seria <1/ml (est). Nos exemplos 5 a 8 da regra 2 seria <10/g ou ml (est). Nos exemplos 9 a 12 da regra 3 seria <5/g ou ml (est). Nos exemplos 13 a 18 da regra 4 seria: <50, <15, <40, <20, <50 e <30 UFC/g ou ml, respectivamente. Regra 9 - Todas as placas com mais de 250 colnias. Nestes casos h quatro alternativas para estimar o nmero de UFC/g ou ml. Em todos os casos, o resultado deve ser apresentado como contagem estimada (est).
9.a. Se for possvel contar todas as colnias da placa, contar e calcular o nmero de UFC a partir da contagem obtida (Exemplos 23 e 35 do Quadro 3.1). 9.b. Se no for possvel contar todas as colnias da placa, mas o nmero de colnias/cm2 estiver abaixo de 10, contar as colnias em 12 quadrados de 1cm2, 6 quadrados consecu-

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tivos na horizontal e 6 quadrados consecutivos na vertical, utilizando os quadrados demarcados no contador de colnias como guia. Calcular o nmero mdio de colnias/ cm2 e, a partir da mdia, determinar o nmero total de colnias na placa, multiplicando a mdia pela rea total da placa. Lembrar que a rea total da placa igual a pd2/4, onde d o dimetro interno. Por exemplo, placas de 100mm tem dimetro interno por volta de 9cm e rea total de aproximadamente 65cm2. Utilizar este nmero total de colnias para calcular o nmero de UFC (Exemplo 24 do Quadro 3.1). 9.c. Se o nmero de colnias/cm2 for maior do que 10, contar as colnias em quatro quadrados representativos da distribuio das colnias nas placas e calcular o nmero de UFC da mesma forma utilizada no caso de 12 quadrados (Exemplo 25 do Quadro 3.1). 9.d. Se o nmero de colnias/cm2 for maior do que 100, apresentar o resultado como maior do que rea total da placa x inverso da diluio (Exemplo 26 do Quadro 3.1).

Regra 10 Nmero de colnias acima de 250 numa diluio e abaixo de 25 na seguinte. Se numa diluio o nmero de colnias ficou acima de 250 e na seguinte ficou abaixo, selecionar as placas com contagem mais prxima de 250, contar como indicado na regra 5 e calcular o nmero de UFC a partir da contagem obtida (Exemplos 27 e 36 do Quadro 3.1). Regra 11 - Placas com espalhamento. H dois tipos distintos de espalhamento. O primeiro resultante da desintegrao de agrupamentos de clulas, durante a mistura do inculo com o meio de cultura. O segundo resultante da inadequada mistura do inculo com o meio, levando formao de filmes de umidade na superfcie do meio ou entre o meio e o fundo da placa. A distino entre os dois tipos facilmente visualizada, porque no espalhamento do primeiro tipo sempre se pode observar crescimento de colnias individuais, enquanto no outro, a massa de crescimento contnua, no h ocorrncia de colnias individuais. As placas com espalhamento podero ser contadas nas seguintes condies: se nenhuma das zonas de espalhamento individuais tiver tamanho superior a 25% da rea da placa e, ainda, se a rea total coberta por zonas de espalhamento no ultrapassar 50% da placa. Em caso contrrio, reportar o resultado como acidente de laboratrio e repetir o ensaio. Se o laboratrio observar ocorrncia de espalhamento do segundo tipo, com tamanho superior a 25%, em mais de 5% das placas preparadas num perodo de trabalho, devem ser tomadas medidas preventivas para minimizar esse problema. Para contar placas com zonas de espalhamento do primeiro tipo, cada zona deve ser contada como uma nica UFC, no contando as colnias individualmente dentro dessas zonas. Para contar placas com zonas de espalhamento do segundo tipo, selecionar uma regio da placa, livre de espalhamento e contar as colnias em diversos quadrados de 1cm2. Calcular a mdia de colnias/cm2, multiplicar pela rea total da placa (65cm2 no caso de placas com dimetro externo de 100mm) e utilizar este valor estimado para calcular o nmero de UFC. Apresentar o resultado como contagem estimada (est) (Exemplos 28 e 37 do Quadro 3.1). Regra 12 - Placas em que o crescimento proporcionalmente maior nas maiores diluies. Esta situao pode ser decorrente da contaminao acidental da amostra durante o plaqueamento, de erro na identificao da diluio nas placas ou da presena de substncias inibidoras na amostra. Considerar o resultado como acidente de laboratrio e repetir o ensaio. Se a suspeita de presena de substncias inibidoras na amostra for alta, utilizar na repetio um procedimento adequado para suprimir ou reduzir a influncia desses componentes no resultado (vide Quadro 2.2. do Captulo 2) (Exemplo 29 do Quadro 3.1).

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Tcnicas Bsicas de Contagem de Microrganismos em Placas

Quadro 3.1. Exemplos do clculo dos resultados do plaqueamento em profundidade em condies no ideais.
Exemplo Sem duplicata 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Com duplicata 30 31 32 33 34 35 36 5 6a 6b 7 8 9a 10, 9a Inc - Inc 138*- 162* 228*- 240* 18*- 16* 0-0 Inc - Inc 287*- 263* Inc - Inc 42 - 30 28*- 26* 2-0 0-0 Inc - Inc 23 - 19 239*- 328* 1-2 2-2 0-0 0-0 320*- 295* 2-2 [(239+328)/2]x103 = 283,5x103 = 2,8 x105 [(138+162)/2]x101 = 150x101 = 1,5 x103 [(228+240)/2]x101 + [(28+26)/2]x102 = 2.520 = 2,5 x 103 [(18+16)/2]x101 = 17x101 = 1,7 x 102 <10 [(320+295)/2]x103 = 307,5x103 = 3,1 x 105 [(287+263)/2]x101 = 275x101 = 2,8 x 103 6.a 6.b 7 8 9a 9b 9c 9d 10, 9a 11 12 Inc Inc 18* 0 Inc Inc Inc Inc Inc Inc 27 140* 243* 2 0 Inc Inc Inc Inc 325* 243* Esp 215 32 34* 0 0 370* 8/cm *
2

Regras usadas

No colnias na(s) placa(s) da diluio 10-1 10-2 10-3

Contagem UFC/g ou ml ***

140x102 = 1,4 x 104 [(243x102)+(34x103)]2 = 2,9 x 104 18x101 = 1,8 x 102 est < 1x101 = <10 est 370x103 = 3,7 x 105 est 8x65x103 = 520x103 = 5,2 x 105 est 21x65x103 = 1.365x103 = 1,4 x 106 est > 100x65x103 = > 6,5 x 106 est 325x102 = 3,3 x104 est 243x102 = 2,4 x104 Acidente de Laboratrio
2

21/cm * >100/cm *
2

20 Esp 20

37 11, 6a Inc - Inc 224*- 180* 28*-Esp [(224+180)/2]x102 + 28x103 = 24.100 = 2,4 x 104 *Contagens efetivamente utilizadas no clculo do resultado. Inc = Incontvel, Esp = Espalhamento, Est = Estimada.

3.6.1.2. Clculo dos resultados para amostras preparadas pela tcnica do esfregao de superfcie (swabs ou esponjas) Os resultados devem ser expressos em UFC por cm2 de amostra. Inicialmente, deve-se calcular o nmero de UFC por mililitro do diluente onde foram recolhidos os swabs. Para tanto, considerar essa suspenso como se fosse uma amostra sem diluio e, em funo das diluies inoculadas dessa suspenso, calcular o resultado, da mesma forma descrita para o plaqueamento utilizado (profundidade, superfcie, gotas ou filtrao em membrana). Em seguida, deve-se converter a contagem de UFC/ml da suspenso para UFC/cm2 da amostra. Para tanto, calcular a quantos cm2 corresponde cada mililitro da suspenso. No procedimento padro descrito no Captulo 2 para amostragem com swabs, que amostra uma rea de 50cm2 e recolhe os swabsem 10ml de diluente, cada mililitro de diluente corresponde a 5cm 2 de superfcie. Essa relao, entretanto, pode ser alterada a critrio do laboratrio, dependendo do tipo de amostra e objetivo da amostragem. recomendvel trabalhar sempre com volumes de diluente mltiplos das reas amostradas, para facilitar os clculos. No caso acima, a contagem em UFC/cm2 ser igual ao valor obtido por ml de suspenso, dividido por cinco. No procedimento descrito no Captulo 2 para amostragem com esponjas, que amostra 100cm2 e recolhe as esponjas em 25ml de diluente, cada mililitro de diluente corresponde a 4cm2 de superfcie. Nesse caso, a contagem em UFC/cm2 ser igual ao valor obtido por ml de suspenso, dividido por quatro. Numa outra situao, em que um esfregao de 100cm2 de rea fosse suspendido em 10ml de diluente, por exemplo, cada ml de suspenso corresponderia a 10cm2 de rea e o nmero de UFC/cm2 seria igual ao valor obtido por ml de suspenso, dividido por dez.
UFC/cm2 = UFC/ml da suspenso x rea amostrada Volume de diluente de coleta

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3.6.1.3. Clculo dos resultados para amostras preparadas pela tcnica da lavagem superficial No caso de alimentos, os resultados devem ser expressos em UFC/g de amostra. Inicialmente, deve-se calcular o nmero de UFC por mililitro do diluente de lavagem. Para tanto, considerar essa suspenso de lavagem como se fosse uma amostra sem diluio e, em funo das diluies inoculadas dessa suspenso, calcular o resultado da mesma forma descrita para o plaqueamento utilizado (profundidade, superfcie, gotas ou filtrao em membrana). Em seguida, deve-se converter o nmero de UFC/ml da suspenso de lavagem para UFC/g de amostra, em funo da diluio inicial utilizada na lavagem (peso de amostra: volume de diluente). Se a diluio foi 1:1, cada ml de lavado corresponder a 1g de amostra e o nmero de UFC/g ser igual ao valor obtido por ml. Se a diluio for diferente de 1:1, deve-se primeiro calcular a quantos gramas de amostra corresponde 1ml de lavado, que igual ao peso da amostra lavada dividido pelo volume de diluente usado. Por exemplo, se uma carcaa de frango de 1,6kg for lavada com 400ml de diluente, cada ml de lavado corresponder a 4g de amostra. Neste caso, o nmero de UFC/g de amostra ser igual ao nmero de UFC/ml de lavado, dividido por quatro.
Volume de diluente usado na lavagem Peso de amostra lavada

UFC/g = UFC/ml da suspenso x

No caso de embalagens, os resultados podem ser expressos em UFC/cm3 da embalagem ou em UFC por embalagem. Inicialmente, deve-se calcular o nmero de UFC por mililitro de gua de lavagem, da mesma forma indicada para a anlise de alimentos. Em seguida, deve-se converter o nmero de UFC/ml de gua de lavagem para UFC/cm3, em funo do volume de diluente usado na lavagem. Para isso, deve-se primeiro calcular a quantos cm3 da embalagem corresponde 1ml de lavado. Esse valor igual capacidade da embalagem dividida pelo volume de diluente usado, ou seja se uma embalagem de 500ml foi lavada com 100ml de diluente, cada mililitro de lavado corresponder a 5cm3. Neste caso, o nmero de UFC/cm3 ser igual ao nmero de UFC/ml de lavado dividido por cinco.
UFC/cm3 = UFC/ml da suspenso x Volume de diluente usado na lavagem Capacidade da embalagem

Para determinar o nmero de UFC por embalagem, basta multiplicar o nmero de UFC/cm3 pela capacidade da embalagem.
UFC/embalagem = UFC/cm3 x Capacidade da embalagem

3.6.2. PLAQUEAMENTO EM SUPERFCIE Assim como no plaqueamento em profundidade, as recomendaes apresentadas nesse item so aplicveis aos ensaios em que todas as colnias desenvolvidas nas placas, aps o perodo de incubao, so contadas e consideradas no clculo. A contagem das colnias e o clculo dos resultados so feitos da mesma forma descrita para o plaqueamento em profundidade, seguindo as mesmas regras. Entretanto, o resultado final deve 58

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ser multiplicado por 10 (dez), para levar em conta o volume 10 vezes menor inoculado. Se foi feita a distribuio de 1ml da primeira diluio em vrias placas, o nmero de colnias dessa diluio a soma de todas as placas. Se o clculo do resultado for feito com a contagem dessa diluio, ento no necessrio multiplicar por 10. 3.6.3. PLAQUEAMENTO EM GOTAS Assim como no plaqueamento em profundidade, as recomendaes apresentadas nesse item so aplicveis aos ensaios em que todas as colnias desenvolvidas nas placas, aps o perodo de incubao, so contadas e consideradas no clculo. Contar as colnias das gotas com no mximo 30 colnias. Para calcular o nmero de UFC/g ou ml, tirar a mdia do nmero de colnias nas trs gotas da diluio inoculada, multiplicar pelo inverso da diluio e em seguida por 100, para considerar o volume inoculado (UFC/g ou ml = No Colnias X 100/diluio). 3.6.4. FILTRAO EM MEMBRANA Assim como no plaqueamento em profundidade, as recomendaes apresentadas nesse item so aplicveis aos ensaios em que todas as colnias desenvolvidas nas placas, aps o perodo de incubao, so contadas e consideradas no clculo. Proceder contagem das colnias com o auxlio de um microscpio estereoscpico, com aumento de 10 a 15 vezes e, para facilitar a visualizao posicionar as placas de forma a obter uma iluminao perpendicular ao plano da membrana. Selecionar para contagem placas com 20 a 200 colnias. Seguir as regras abaixo para contagem e clculo do nmero de UFC/ml: Regra 1. Se o nmero de colnias por quadrcula da membrana for menor ou igual a 2, contar todas as colnias presentes e dividir pelo volume filtrado, para obter o nmero de UFC/ml. Regra 2. Se o nmero de colnias por quadrcula estiver na faixa de 3 a 10, contar 10 quadrculas e tirar a mdia por quadrcula. Multiplicar esse valor por 100 e dividir pelo volume filtrado, para obter o nmero de UFC/ml. Se o nmero de colnias por quadrcula estiver na faixa de 10 a 20, contar apenas 5 quadrculas para tirar a mdia e calcular o nmero de UFC/ml da mesma forma. Regra 3. Se o nmero de colnias por quadrcula for maior do que 20, expressar o resultado como maior do que 2000 dividido pelo volume filtrado. Regra 4. Se foi feita a filtrao de uma soluo obtida de amostra slida (sal ou acar, por exemplo), valem as regras 1, 2 e 3 mas o valor deve ser convertido para UFC/g em funo quantidade de amostra na soluo. Exemplo: Dissolvidas 25g de acar em 225ml de gua peptonada 0,1% (diluio 1:10), filtrados 100ml da soluo e contadas 120 colnias na membrana. Cada mililitro da soluo eqivale a 0,1g de amostras, portanto, em 100ml foi filtrada uma quantidade equivalente a 10g da amostra slida. Ento: UFC/100ml de soluo = UFC/10g de amostra = 120 UFC/g = 120/10 = 12

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3.7. REFERNCIAS
ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions, 1st ed. The International Organization for Standardization, 1999. ISO/TS 11133-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 1: General Guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory, 1st ed. The International Organization for Standardization, 2000. SWANSON, K.M.J, PETRAN, R.L. & HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 6, p.53-67.

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Captulo 4

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4.1. INTRODUO
A maioria das orientaes contidas nesse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Swanson et al., 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium foram tambm includas orientaes do Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online (Blodgett, 2003) e da norma ISO 6887-1 (1999), recomendada para ensaios realizados com metodologia da International Organization for Standardization. A tcnica do nmero mais provvel um mtodo de anlise quantitativo que permite determinar o nmero mais provvel (NMP) do(s) microrganismo(s) alvo na amostra, atravs da inoculao de alquotas dessa amostra em uma srie de tubos, contendo um meio de cultura lquido adequado ao seu crescimento. A determinao do nmero de microrganismos baseada no princpio de que, subdividindo a amostra em alquotas, algumas alquotas vo conter microrganismos e outras no, dependendo da quantidade dos microrganismos na amostra. O nmero de alquotas com microrganismos (tubos com crescimento positivo aps a incubao) e alquotas sem microrganismos (tubos com crescimento negativo aps a incubao) permite estimar, por clculo de probabilidade, a densidade original dos microrganismos na amostra. Essa aplicao da teoria da probabilidade depende de que os microrganismos estejam distribudos ao acaso e homogeneamente por toda a amostra. No caso de amostras lquidas, essa condio pode ser atingida sem dificuldade, atravs da cuidadosa agitao do material. No caso de amostras slidas, pode ser atingida no preparo e homogeneizao da primeira diluio, tomando-se as alquotas a partir dessa diluio. H situaes em que as alquotas da amostra slida so inoculadas diretamente no caldo de cultura. A inoculao direta das amostras slidas, entretanto, menos comum e depende do tipo de amostra. Como a inoculao feita em meios lquidos, a tcnica do NMP apresenta algumas vantagens em relao contagem padro em placas. Uma delas a possibilidade de inocular quantidades maiores da amostra, aumentando-se proporcionalmente o volume de meio de cultura. Isso confere tcnica uma sensibilidade maior do que a da contagem em placas e uma grande flexibilidade no estabelecimento do limite de deteco. Outra vantagem que permite a introduo de etapas de recuperao de injrias, utilizando um meio no seletivo para a inoculao inicial, mais favorvel aos microrganismos injuriados, e depois transferindo a cultura para meios seletivos.

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A tcnica do NMP bastante verstil, permitindo a enumerao de diferentes grupos ou espcies de microrganismos, variando-se o meio de cultura e as condies de incubao. Suas principais aplicaes so a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E. coli em gua e alimentos. Pode tambm ser utilizada em outros ensaios quantitativos, quando a contaminao esperada na amostra est abaixo do limite de deteco do plaqueamento ou quando partculas do alimento interferem na contagem em placas. Uma outra aplicao a adaptao de mtodos qualitativos para quantitativos, como a contagem de Salmonella, Listeria monocytogenes e outros microrganismos tradicionalmente analisados por mtodos de presena/ausncia. Para a homogeneizao da amostra e preparo das diluies, so utilizados os procedimentos descritos no Captulo 2. Para a inoculao, a tcnica do NMP apresenta dois formatos, dependendo de como as alquotas so distribudas. Um o formato do teste de diluio mltipla, no qual trs, cinco ou dez alquotas de uma diluio so inoculadas numa srie de trs, cinco ou dez tubos e, depois, uma nova srie de trs, cinco ou dez alquotas, da diluio subseqente, so inoculadas em outra srie de tubos e assim por diante. Quanto maior o nmero de diluies e de tubos por diluio, maior a preciso da contagem. Para a maioria das situaes encontradas na anlise de alimentos, trs diluies com trs tubos por diluio so suficientes para uma boa estimativa do NMP. O outro formato o do teste de diluio nica, no qual todas as alquotas inoculadas (geralmente cinco a dez) so de uma mesma diluio, com igual quantidade da amostra.

4.2. TESTE DE DILUIO MLTIPLA


O teste de diluio mltipla o mais verstil dos formatos da tcnica do NMP, porque permite abranger uma faixa ampla de concentraes dos microrganismos na amostra, variandose as diluies inoculadas. O procedimento padro a inoculao de trs diluies decimais seqenciais da amostra, trs alquotas por diluio ou, mais raramente, cinco alquotas por diluio e/ou cinco diluies. A tcnica, entretanto, permite procedimentos no to comuns, como a inoculao de um nmero maior de diluies decimais, um nmero maior de alquotas por diluio ou, mesmo, diluies no decimais. Nesses casos o procedimento analtico o mesmo, mas varia a forma de clculo dos resultados. O procedimento padro apresenta a vantagem de ter os resultados tabelados em Tabelas de NMP, enquanto os no padro requerem o uso de frmulas para o clculo. A seleo das diluies depende da contaminao estimada da amostra, de forma a obter tubos positivos nas menores diluies (maiores alquotas da amostra) e tubos negativos nas maiores diluies (menores alquotas da amostra). Para orientao, as diluies recomendadas para amostras com contaminao na faixa de 3 a 1.000/g ou ml, so a 10-1, 10-2 e 10-3. Se a contaminao esperada estiver acima dessa faixa, deve-se inocular diluies mais altas. Caso no seja possvel estimar previamente o nvel de contaminao da amostra, deve-se inocular mais do que trs diluies (pelo menos cinco), partindo-se da diluio inicial. Se a contaminao estimada estiver abaixo dessa faixa, pode-se inocular volumes maiores da amostra sem diluio (no caso de lquidos) ou da primeira diluio (no caso de slidos), aumentando proporcionalmente o volume de meio de cultura. A proporo entre o volume inoculado e o volume de meio de cultura recomendado pelo Compendium (Swanson et al., 2001) : uma parte da amostra ou diluio adicionada a dez partes do caldo. Uma prtica bastante comum, que mantm essa proporo, a inoculao de 10ml das amostras lquidas, sem diluio, em 10ml do meio de cultura em concentrao dupla. Essa prtica tambm muito utilizada na inoculao da primeira diluio de amostras slidas. Para orientao na seleo das diluies pode ser consultado o Quadro 2.2, que apresenta a 62

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quantidade de amostra presente nas alquotas de vrias combinaes de diluies, com o limite de deteco da tcnica em cada combinao. Outras combinaes so possveis, particularmente no caso de amostras lquidas, que podem ser adicionadas diretamente no caldo, como a combinao decimal 100 10 1ml ou a no decimal 500 50 5, por exemplo. No caso de amostras slidas as opes so mais restritas, porque, como j mencionado anteriormente, nem todos os produtos apresentam distribuio de microrganismos homognea para inoculao direta. Nos casos em que isso ocorre, podem ser utilizadas as mesmas combinaes dos produtos lquidos. A seleo do meio de cultura mais adequado para a inoculao das alquotas varia para cada ensaio, em funo do(s) microrganismo(s) alvo, sendo descrita nos captulos especficos. A verificao da presena do(s) microrganismo(s) alvo nas alquotas inoculadas aps a incubao, para clculo do NMP, tambm varia para cada ensaio, sendo descrita nos captulos especficos. Na maioria dos ensaios essa verificao inclui no s a ocorrncia de crescimento, mas tambm o desenvolvimento ou no de caractersticas tpicas do(s) microrganismo(s) alvo no meio utilizado. Alm disso, a maioria dos ensaios exige ainda uma ou mais etapas de confirmao, que feita transferindo-se a cultura obtida no primeiro meio inoculado, para outros meios de confirmao. Por exemplo, em um dos mtodos de ensaio de coliformes totais, as alquotas so inoculadas em Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), incubadas a 35oC/24h e verificada a ocorrncia ou no de crescimento com produo de gs. As culturas obtidas nos tubos positivos para essas duas caractersticas so transferidas para o caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB), que um meio seletivo para coliformes totais. Aps a incubao a 35oC/24h, novamente verificada a ocorrncia ou no de crescimento com produo de gs. Apenas as culturas positivas para essas duas caractersticas, em VB, so confirmadas como coliformes totais. O caldo LST permite o crescimento de uma srie de outros microrganismos produtores de gs que, no Caldo VB, so inibidos ou diferenciados dos coliformes totais. A inoculao no feita diretamente em VB porque a presena de agentes seletivos pode inibir os coliformes injuriados. A etapa inicial no LST garante a recuperao das injrias, permitindo o crescimento posterior em condies seletivas. 4.2.1. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES Material para preparao da amostra e diluies seriadas, descritos no Captulo 2 Meios de cultura recomendados para o ensaio a ser realizado, descritos nos captulos especficos Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s) pelo ensaio a ser realizado, descrita(s) nos captulos especficos 4.2.2. PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento, observar os cuidados descritos no Captulo 2, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os tubos que sero inoculados, com o cdigo da amostra, a diluio e a sigla do meio de cultura contido. a) Preparao das amostras e diluies. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Inoculao. Seguindo as orientaes apresentadas acima, selecionar trs ou mais diluies decimais seqenciais da amostra para a inoculao. Inocular trs alquotas de cada diluio em tubos do caldo de cultura, selecionando o caldo de acordo com o ensaio a ser realizado (nos captulos especficos). Em alguns ensaios recomenda-se utilizar uma srie de cinco alquotas por diluio, sendo essa recomendao tambm mencionada nos captulos especficos.Utilizar uma pipeta diferente para cada diluio, com capacidade no maior do que 10ml. A incerteza da medio dos volumes no deve exceder 5% (ISO 6887-1, 1999). Observar criteriosamente se os tubos utilizados correspondem amostra e diluio que esto sendo inoculadas. Mudar os tubos de 63

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posio, medida que sejam inoculadas, para no inocular o mesmo tubo mais de uma vez ou deixar algum tubo sem inocular. c) Incubao. Incubar os tubos nas condies especificadas para o ensaio, nos captulos especficos. d) Verificao da presena do(s) microrganismo(s) alvo nos tubos. A definio das caractersticas a serem consideradas como indicao da presena do(s) microrganismo(s) alvo nos tubos so definidas nos captulos especficos. Essas caractersticas podem ser: d.1) Crescimento. O crescimento verificado pela turvao do meio de cultura, desde que no provocada pela prpria amostra. Nesse segundo caso, pode ser necessrio um procedimento alternativo para confirmar o crescimento. Um dos mais usados transferir uma alada do caldo suspeito para um novo tubo do mesmo meio e verificar a turvao, confirmativa do crescimento no primeiro. d.2) Produo de gs. A produo de gs pode ser verificada pela formao de bolhas em tubos invertidos (tubos de Durhan), colocados nos tubos de caldo antes da esterilizao. Na utilizao dessa tcnica importante verificar, previamente, se no houve formao de pequenas bolhas nos tubos de Durhan, durante a estocagem do meio em geladeira. Essas bolhas so provocadas pelo ar dissolvido no lquido e, se presentes, o tubo deve ser descartado e substitudo por outro. Outra alternativa utilizada para verificar a produo de gs cobrir a superfcie do caldo com vaspar ou gar selo, depois da inoculao, verificando seu deslocamento para cima, quando h formao de gs. d.3) Produo de cido ou base. A produo de cido ou base pode ser verificada pela viragem de um indicador de pH adicionado ao caldo de cultura (prpura de bromocresol, vermelho de fenol e outros). Outra alternativa usada medir o pH ou a acidez titulvel do meio depois da incubao. d.4) Alterao do potencial redox. A alterao do potencial de xido reduo verificada pela viragem de aceptores de eltrons como a rezarzurina, o azul de metileno e o cloreto de trifeniltetrazlio. e) Transferncias. A maioria dos ensaios que utilizam a tcnica do NMP exige a transferncia da cultura obtida nos tubos inoculados, para confirmao da presena do(s) microrganismo(s) alvo. Apenas os tubos contendo culturas confirmadas so considerados como positivos no clculo do NMP. As transferncias requeridas em cada ensaio encontram-se descritas nos captulos especficos.

4.3. TESTE DE DILUIO NICA


O teste de diluio nica mais utilizado para amostras com baixo nvel de contaminao, para as quais no h necessidade nem se justifica a preparao de diluies. Uma de suas principais aplicaes so a contagem de coliformes em gua tratada e em sucos e refrigerantes. O procedimento padro a inoculao de cinco ou dez alquotas de 10ml das amostras lquidas em 10ml do caldo de cultura em concentrao dupla (50 a 100ml no total), ou cinco ou dez alquotas da primeira diluio das amostras slidas em 10ml do caldo em concentrao dupla (5 a 10g no total). Essas quantidades podem variar dependendo da contaminao esperada na amostra, podendo ser inoculadas cinco ou dez pores de 100ml em 100ml de caldo em concentrao dupla, para amostras com nvel mais baixo de contaminao, ou cinco ou dez pores de 1ml em 10ml de 64

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caldo em concentrao simples, para amostras com nvel mais alto de contaminao. A inoculao de cinco ou dez alquotas com quantidades mltiplas de dez apresentam a vantagem de ter os resultados tabelados em Tabelas de NMP. Pode, entretanto, ser inoculado qualquer nmero de alquotas, de qualquer quantidade, desde que todas sejam iguais e que a diluio seja de uma parte da amostra adicionada em dez partes de caldo. Nesses casos, o clculo dos resultados utiliza frmulas, em vez das tabelas. Assim como no teste de diluio mltipla, a seleo do meio de cultura e a forma de verificao da presena do(s) microrganismo(s) alvo nas alquotas inoculadas encontra-se descrita nos captulos especficos. Dependendo da complexidade dos testes de confirmao subseqentes, o formato de cinco alquotas pode ser mais vantajoso para amostras com baixa contaminao, do que o de dez alquotas ou o teste de diluio mltipla. Por exemplo, na determinao do NMP de E. sakazakii em frmulas infantis (Captulo 16), a FDA recomenda a inoculao de trs pores de 100g, trs pores 10g e trs pores de 1g da amostra, adicionadas diretamente no caldo de enriquecimento, na diluio 1:10. Essa combinao permite detectar a presena em 333g da amostra. No formato de cinco pores poderiam ser inoculadas cinco alquotas de 100g, permitindo detectar a presena em 500g da amostra. Na srie de trs, se todas as alquotas apresentarem crescimento (teste presuntivo), nove pores seguiro para confirmao. No formato de cinco pores iguais, alm da maior sensibilidade do ensaio, se todas apresentarem crescimento, sero apenas cinco para confirmao. 4.3.1. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES Material para preparao da amostra, descritos no Captulo 2 Meios de cultura recomendados para o ensaio a ser realizado, descritos nos captulos especficos Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s)pelo ensaio a ser realizado, descrita(s) nos captulos especficos 4.3.2. PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento, observar os cuidados descritos no Captulo 2, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os tubos que sero inoculados, com o cdigo da amostra e a sigla do meio de cultura contido. a) Preparao das amostras. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Inoculao. Seguindo as orientaes apresentadas acima, selecionar as quantidades mais adequadas da amostra para a inoculao. Inocular cinco ou dez alquotas da amostra em cinco a dez tubos ou frascos do caldo de cultura, adicionando uma parte da alquota para dez partes do caldo. Selecionar o caldo de acordo com o ensaio a ser realizado (nos captulos especficos). A incerteza da medio dos volumes no deve exceder 5% (ISO 6887-1, 1999). Mudar os tubos ou frascos de posio, medida que sejam inoculadas, para no inocular o mesmo tubo/frasco mais de uma vez ou deixar algum tubo/frasco sem inocular. c) Incubao. Incubar os tubos nas condies especificadas para o ensaio, descritas nos captulos especficos. d) Verificao da presena do(s) microrganismo(s) alvo nos tubos. Seguir as mesmas orientaes do teste de diluio mltipla. e) Transferncias. Seguir as mesmas orientaes do teste de diluio mltipla. 65

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Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos

4.4. CLCULO DOS RESULTADOS


A combinao de tubos positivos e negativos na tcnica do NMP permite estimar, por clculo de probabilidade, a densidade do(s) microrganismo(s) alvo na amostra. Os clculos podem ser feitos usando vrias frmulas, mas, para as para as combinaes de tubos positivos e negativos que ocorrem com maior freqncia, os valores j foram calculados e tabulados em tabelas de NMP, no sendo necessrio o uso de frmulas. As combinaes que ocorrem com menor freqncia so omitidas na tabulao e, nesses casos, o clculo do resultado pode ser feito atravs das frmulas, mas recomendvel repetir antes o ensaio, para confirmar a ocorrncia da combinao. 4.4.1. CLCULO DOS RESULTADOS DO TESTE DE DILUIO MLTIPLA 4.4.1.1. Clculo usando as tabelas de NMP (para diluies decimais) A Tabela NMP-1 do Anexo 4.1, retirada do Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003), apresenta os resultados de uma srie de trs tubos inoculados com alquotas de 0,1 0,01 e 0,001g ou ml da amostra. A Tabela NMP-2 do Anexo 4.1, retirada da mesma fonte, apresenta os resultados de uma srie de cinco tubos inoculados com as mesmas alquotas. Para outras alquotas, so usadas as mesmas tabelas, com um fator de converso para multiplicar ou dividir o valor lido, em funo do tamanho das alquotas inoculadas. Observar que as diluies so decimais e que as tabelas utilizam a quantidade da amostra nas alquotas, no a diluio inoculada. Assim, para facilitar o uso, o Quadro 4.1 apresenta a correspondncia entre diluies inoculadas e quantidade de amostra nas alquotas, bem como o fator de converso do resultado quando as alquotas so diferentes das tabeladas. Alm da estimativa do NMP/g ou ml da amostra, as tabelas de NMP tambm apresentam, para cada combinao de tubos positivos e negativos, o limite superior e o limite inferior da estimativa do NMP, ao nvel de 95% de confiana. Esse intervalo em que se encontra a contagem verdadeira (mas desconhecida) dos microrganismos na amostra, em 95% das vezes.
Quadro 4.1. Orientao para o uso das tabelas de NMP, em funo da quantidade de amostra presente nas alquotas e das diluies inoculadas, com o limite de deteco da contagem e a regra para converso do resultado.
Quantidade de amostra nas alquotas (g ou ml) 100 10 1 10 1 0,1 1 0,1 0,01 1 0,1 0,01 0,1 0,01 0,001 0,01 0,001 0,0001 0,001 0,0001 - 0,00001 Limite de deteco (por g ou ml da amostra) 0,003 0,03 0,3 0,3 3 30 300 Fator de converso do resultado na Tabela dividir por 1.000 dividir por 100 dividir por 10 dividir por 10 direto multiplicar por 10 multiplicar por 100

Combinao de diluies* 1 2 3 4 5 6 S/D (100ml) - S/D (10ml) - SD (1ml) S/D (10ml) - S/D (1ml) - 10-1 (1ml) S/D (1ml) - 10-1 (1ml) - 10-2 (1ml) 10-1 (10ml) 10-1 (1ml) 10-2 (1ml) 10-1 (1ml) 10-2 (1ml) 10-3 (1ml) 10 (1ml) 10 (1ml) - 10 (1ml) 10-3 (1ml) - 10-4 (1ml) - 10-5 (1ml)
-2 -3 -4

*Entre parnteses o volume inoculado da diluio, onde SD = sem diluio (combinao restrita amostras lquidas).

As regras para o clculo dos resultados, com exemplos no Quadro 4.2 so: Regra 1. Se as trs diluies inoculadas correspondem s alquotas tabeladas, o resultado lido diretamente na linha correspondente combinao de tubos positivos obtida (Exemplos 1 e 8 do Quadro 4.2). Regra 2. Se as trs diluies inoculadas no correspondem s alquotas tabeladas, o resultado lido na linha correspondente combinao de tubos positivos deve ser convertido segundo o fator de converso do Quadro 4.2 (Exemplos 2 e 9 do Quadro 4.2). 66

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Regra 3. Se mais de trs diluies foram inoculadas, valem as regras um e dois, mas apenas trs diluies consecutivas so consideradas.
3.a. Se mais de uma diluio apresentar todos os tubos positivos, a combinao considerada deve conter a maior diluio (menor alquota) com todos os tubos positivos e as duas consecutivas (Exemplos 3, 4, 10 e 11 do Quadro 4.2). 3.b. Se nenhuma das diluies apresentou todos os tubos positivos, considerar as trs primeiras consecutivas que tenham os tubos positivos na do meio (Exemplos 5 e 12 do Quadro 4.2). 3.c. Se uma diluio apresentar nmero de tubos positivos maior ou igual ao da diluio anterior, somar esse nmero ao da diluio anterior, desconsiderando a posterior (Exemplos 6 e 13 do Quadro 4.2). 3.d. Se todas as diluies apresentarem todos os tubos positivos, considerar as trs ltimas diluies consecutivas (maiores diluies, menores alquotas) (Exemplos 7 e 14 do Quadro 4.2).
Quadro 4.2. Exemplos de clculo dos resultados usando as tabelas de NMP.
Exemplo Regra utilizada Nmero de tubos positivos nas alquotas (g ou ml) 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 Combinao considerada Resultado

Srie de trs tubos (Tabela NMP-1) 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3a, 2 3a, 2 3b, 2 3c, 2 3d, 2 3 NI* 3 3 0 3 3 2 3 3 3 0 3 3 0 2 2 3 1 2 3 NI* 0 0 2 0 1 3 NI* NI* 0 0 0 1 3 3-2-0 3-2-0 3-2-0 3-2-0 0-1-0 3-2-2 3-3-3 93 = 9,3x101 93x10 = 9,3x102 93x10 = 9,3x102 93x100 = 9,3x103 3x10 = 3,0x101 210x10 = 2,1x103 >1.100x100 = >1,1x105

Srie de cinco tubos (Tabela NMP-2) 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3a, 2 3a, 2 3b, 2 3c, 2 3d, 2 5 NI* 5 5 0 5 5 2 5 5 5 0 5 5 0 2 2 5 1 3 5 NI* 0 0 2 0 1 5 NI* NI* 0 0 0 1 5 5-2-0 5-2-0 5-2-0 5-2-0 0-1-0 5-3-2 5-5-5 49 = 4,9x101 49 x 10 = 4,9x10 2 49 x 10 = 4,9x10 2 49 x 100 = 4,9x10 3 2 x10 =2,0x101 140x10 = 1,4x103 >1.600x100 = >1,6x105

*NI = No inoculado

4.4.1.2. Clculo usando a frmula de Thomas (para diluies no decimais) Thomas (1942) publicou uma frmula simplificada de clculo do NMP, que pode ser utilizada para calcular os resultados de amostras inoculadas em diluies no decimais. Pode ser tambm utilizada para amostras inoculadas com diluies decimais, porm, cujos resultados foram omitidos das tabelas de NMP. O clculo pela frmula permite considerar todas as diluies inoculadas, no apenas trs. Os resultados podem no concordar exatamente com os da frmula de Halvorson & Ziegler (1933), mais usada na construo de tabelas de NMP, mas a diferena pequena e sem conseqncias praticas. A frmula a seguinte: 67

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NMP/g ou ml = P /

NT

P = Nmero de tubos positivos N = Som a da quantidade de amostra inoculada em todos os tubos negativos T = Soma da quantidade de amostra inoculada em todos os tubos

Exemplo 1. Considere as alquotas e a combinao de tubos positivos e negativos na srie de trs tubos abaixo:
Alquota No de tubos positivos em 3 0,1g 0 0,01g 2 0,001g 0

P=2 N = (3 x 0,1) + (3 x 0,001) = 0,303g T = (3 x 0,1) + (3 x 0,01) + (3 x 0,001) = 0,333g NMP/g = 2 / (0,303) x (0,333) = 6,3 Exemplo 2. Considere as alquotas e a combinao de tubos positivos e negativos na srie de cinco tubos abaixo:
Alquota No de tubos positivos em 5 0,1g 0 0,01g 2 0,001g 0

P=2 N = (5 x 0,1) + (5 x 0,001) = 0,505g T = (5 x 0,1) + (5 x 0,01) + (5 x 0,001) = 0,555g NMP/g = 2 / (0,505) x (0,555) = 3,8 Exemplo 3. Considere as alquotas de diluies 1:2 e a combinao de tubos positivos e negativos na srie de cinco tubos abaixo:
Alquota No de tubos positivos em 5 8g 5 4g 4 2g 2 1g 0 0,5g 1 0,25g 0

P = 5 + 4 + 2 + 1 = 12 N = (1 x 4) + (3 x 2) + (5 x 1) + (4 x 0,5) + (5 x 0,25) = 18,25g T = (5 x 8) + (5 x 4) + (5 x 2) (5 x 1) + (5 x 0,5) (5 x 0,25) = 78,75g NMP/g = 12 / (18,25) x (78,75) = 0,32

4.4.1.3. Clculo dos resultados para amostras preparadas pela tcnica do esfregao de superfcie ou da lavagem superficial feito da mesma forma descrita para a contagem em placas, porm, onde se l UFC devese substituir por NMP e, onde se l contagem em placas substituir por contagem pela tcnica do NMP. 4.4.2. CLCULO DOS RESULTADOS DO TESTE DE DILUIO NICA Para a distribuio de dez alquotas de 10g ou ml da amostra, pode ser utilizada a Tabela NMP-3 do Anexo, retirada do Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003). Considerando que o teste de diluio nica aplicvel principalmente para amostras lquidas com baixa 68

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contaminao, a tabela apresenta o resultado em NMP/100ml da amostra. No h, entretanto, restrio ao seu uso para amostras slidas, se foram inoculadas as mesmas alquotas (10 x 100ml da diluio 10-1 em 100ml de caldo concentrao dupla, por exemplo), ou inoculao direta de 10 x 10g da amostra no caldo (se aplicvel). Para outras distribuies pode ser utilizada a frmula abaixo, retirada da mesma fonte.
NMP/g ou ml = (1/z) x 2,303 x Log 10 (t/n) z = peso ou volume de amostra por alquota t = nmero total de alquotas inoculadas n = nmero de alquotas negativas

Regras para o clculo usando a Tabela NMP-3


Regra 1. Para determinar o NMP/100ml ou g, na inoculao de 10 x 10ml ou g, basta ler o valor na linha correspondente ao nmero de tubos positivos obtido.
Exemplo 1. Inoculados 10 x 10ml da amostra e obtidos cinco tubos positivos NMP/100ml = 6,9 Exemplo 2. Inoculadas 10 x 10g da amostra e obtidos trs tubos positivos NMP/100g = 3,6

Regra 2. Para determinar o resultado da inoculao de dez alquotas com quantidade diferente de 10g ou ml, mas ainda mltiplas de dez, basta multiplicar (se a quantidade for menor que dez) ou dividir (se a quantidade for maior que dez) o valor lido na Tabela NMP-3.
Exemplo 3. Inoculadas 10 x 1g da amostra e obtidos nove tubos positivos NMP/100g = 23x10= 2,3x102 Exemplo 4. Inoculadas 10 x 100g da amostra e obtidos nove frascos positivos NMP/100g = 23/10 = 2,3

Regra 3. Para converter o resultado de NMP/100ml ou g para NMP/ml ou g, basta dividir o valor por 100.
Exemplo 5. Inoculados 10 x 1ml da amostra e obtidos nove tubos positivos NMP/100ml = 23x10 = 2,3x102 e NMP/ml = 2,3

Clculo pela frmula


O clculo muito simples, conforme exemplo abaixo:
Exemplo 6. Inoculadas cinco alquotas de 25g e obtidos dois frascos positivos z = 25, t = 5, n = 3 NMP/g = (1/25) x 2,303 x Log10(5/3) = 0,02 ou NMP/100g = 2

Clculo para amostras preparadas pela tcnica do esfregao de superfcie ou da lavagem superficial
Para calcular os resultados de amostras preparadas pela tcnica do esfregao de superfcie ou da lavagem superficial, seguir a mesma orientao do teste de diluio mltipla.

4.5 REFERNCIAS
GETT, R., 2003. Appendix 2 - Most Probable Number from Serial Dilutions. In: US FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA), Bacteriological Analytical Manual Online, Revision July 2003. Disponvel no site: http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html (acesso em 05/04/2006).

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HALVORSON, H.O. & ZIEGLER, N.R., 1933. Application of statistics to problems in bacteriology. Journal of Bacteriology 25:101-121. ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions, 1st ed. The International Organization for Standardization, 1999. SWANSON, K.M.J, PETRAN, R.L. & HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of microrganisms. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 6, p.53-67. THOMAS, H.A., 942. Bacterial densities from fermentation tube tests. Journal of The American Water Works Association 34:572-576.

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ANEXO 4.1 TABELAS DE NMP


Tabela NMP-1. Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana a nvel de 95% de probabilidade, para diversas combinaes de tubos positivos em srie de trs tubos. Quantidade inoculada da amostra: 0,1 - 0,01 e 0,001g ou ml.

Combinao de tubos + 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-1-1 0-2-0 0-3-0 1-0-0 1-0-1 1-0-2 1-1-0 1-1-1 1-2-0 1-2-1 1-3-0 2-0-0 2-0-1 2-0-2 2-1-0 2-1-1 2-1-2

NMP/g ou ml <3,0 3,0 3,0 6,1 6,2 9,4 3,6 7,2 11 7,4 11 11 15 16 9,2 14 20 15 20 27

Intervalo de confiana Intervalo de Combinao NMP/g ou ml confiana (95%) (95%) de tubos + Mnimo Mximo Mnimo Mximo 0,15 0,15 1,2 1,2 3,6 0,17 1,3 3,6 1,3 3,6 3,6 4,5 4,5 1,4 3,6 4,5 3,7 4,5 8,7 9,5 9,6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 2-2-0 2-2-1 2-2-2 2-3-0 2-3-1 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-1-3 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-2-3 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1.100 >1.100 4,5 8,7 8,7 8,7 8,7 4,6 8,7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1.000 1.000 2.000 4.100 -

Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003).

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Tabela NMP-2. Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana a nvel de 95% de probabilidade, para diversas combinaes de tubos positivos em srie de cinco tubos. Quantidade inoculada da amostra: 0,1 - 0,01 e 0,001g ou ml.
Intervalo de confiana Intervalo de Combinao NMP/g ou ml confiana (95%) (95%) de tubos + Mnimo Mximo Mnimo Mximo 0-0-0 <1,8 6,8 4-0-3 25 9,8 70 0-0-1 1,8 0,09 6,8 4-1-0 17 6 40 0-1-0 1,8 0,09 6,9 4-1-1 21 6,8 42 0-1-1 3,6 0,7 10 4-1-2 26 9,8 70 0-2-0 3,7 0,7 10 4-1-3 31 10 70 0-2-1 5,5 1,8 15 4-2-0 22 6,8 50 0-3-0 5,6 1,8 15 4-2-1 26 9,8 70 1-0-0 2 0,1 10 4-2-2 32 10 70 1-0-1 4 0,7 10 4-2-3 38 14 100 1-0-2 6 1,8 15 4-3-0 27 9,9 70 1-1-0 4 0,7 12 4-3-1 33 10 70 1-1-1 6,1 1,8 15 4-3-2 39 14 100 1-1-2 8,1 3,4 22 4-4-0 34 14 100 1-2-0 6,1 1,8 15 4-4-1 40 14 100 1-2-1 8,2 3,4 22 4-4-2 47 15 120 1-3-0 8,3 3,4 22 4-5-0 41 14 100 1-3-1 10 3,5 22 4-5-1 48 15 120 1-4-0 11 3,5 22 5-0-0 23 6,8 70 2-0-0 4,5 0,79 15 5-0-1 31 10 70 2-0-1 6,8 1,8 15 5-0-2 43 14 100 2-0-2 9,1 3,4 22 5-0-3 58 22 150 2-1-0 6,8 1,8 17 5-1-0 33 10 100 2-1-1 9,2 3,4 22 5-1-1 46 14 120 2-1-2 12 4,1 26 5-1-2 63 22 150 2-2-0 9,3 3,4 22 5-1-3 84 34 220 2-2-1 12 4,1 26 5-2-0 49 15 150 2-2-2 14 5,9 36 5-2-1 70 22 170 2-3-0 12 4,1 26 5-2-2 94 34 230 2-3-1 14 5,9 36 5-2-3 120 36 250 2-4-0 15 5,9 36 5-2-4 150 58 400 3-0-0 7,8 2,1 22 5-3-0 79 22 220 3-0-1 11 3,5 23 5-3-1 110 34 250 3-0-2 13 5,6 35 5-3-2 140 52 400 3-1-0 11 3,5 26 5-3-3 180 70 400 3-1-1 14 5,6 36 5-3-4 210 70 400 3-1-2 17 6 36 5-4-0 130 36 400 3-2-0 14 5,7 36 5-4-1 170 58 400 3-2-1 17 6,8 40 5-4-2 220 70 440 3-2-2 20 6,8 40 5-4-3 280 100 710 3-3-0 17 6,8 40 5-4-4 350 100 710 3-3-1 21 6,8 40 5-4-5 430 150 1.100 3-3-2 24 9,8 70 5-5-0 240 70 710 3-4-0 21 6,8 40 5-5-1 350 100 1.100 3-4-1 24 9,8 70 5-5-2 540 150 1.700 3-5-0 25 9,8 70 5-5-3 920 220 2.600 4-0-0 13 4,1 35 5-5-4 1.600 400 4.600 4-0-1 17 5,9 36 5-5-5 >1.600 700 4-0-2 21 6,8 40 Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003). Combinao de tubos + NMP/g ou ml

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Tcnicas Bsicas de Contagem de Microrganismos pelo Nmero mais Provvel (NMP)

Tabela NMP-3. Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana a nvel de 95% de probabilidade, para diversas combinaes de tubos positivos e negativos na inoculao de 10 alquotas de 10g ou ml da amostra por tubo.

Nmero de tubos positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

NMP/100ml <1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12,0 16 23 >23

Intervalo de confiana (95%) Mnimo 0,05 0,37 0,91 1,6 2,5 3,3 4,8 5,9 8,1 12 Mximo 3,3 5,9 8,1 9,7 13 15 19 24 33 53 -

Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003).

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Captulo 5

Tcnicas Bsicas de Deteco da Presena/Ausncia de Microrganismos

5.1. INTRODUO
As orientaes contidas nesse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas nos Captulos 4 e 5 da 4 Edio do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Bier et al., 2001, Sperber et al., 2001). Vrios ensaios utilizados na anlise de alimentos so qualitativos (presena/ausncia), incluindo os de Salmonella, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Campylobacter sp, Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus. Todos utilizam as mesmas tcnicas microbiolgicas bsicas, que so o enriquecimento em um ou mais caldos especficos e o posterior isolamento em meios slidos. A principal razo para que esses ensaios sejam qualitativos a etapa de enriquecimento, que dificulta a quantificao, embora seja possvel, se indispensvel, utilizar a tcnica do NMP nesses casos. Para tanto, necessrio repetir o mesmo ensaio de presena/ ausncia para vrias alquotas da mesma amostra, sendo pelo menos nove, num teste de diluio mltipla ou cinco, num teste de diluio nica. Em funo disso, a quantificao se torna excessivamente trabalhosa e dispendiosa, no sendo necessria e nem justificvel, na maioria das situaes.

Enriquecimento
O enriquecimento uma etapa crtica nos ensaios de presena/ausncia, por trs razes. A primeira que a populao dos patgenos nas amostras normalmente baixa (muito abaixo do limite de deteco da contagem em placas), sendo necessrio elevar o nmero de clulas a quantidades detectveis. No incomum produtos com populao menor do que uma clula por 100g e h casos de deteco de quantidades to baixas como uma clula por 500g do produto. A segunda razo que, na maioria dos alimentos industrializados, as clulas do microrganismo alvo esto injuriadas pelo processamento, sendo necessria a recuperao das injrias. Clulas injuriadas exigem um perodo de tempo em condies timas de crescimento, para reativao das vias metablicas responsveis pela multiplicao. A terceira razo que, normalmente, a microbiota competidora nas amostras se encontra em nmero muito maior do que o microrganismo alvo, sendo necessrio inibir o crescimento dessa populao, para que o alvo tenha oportunidade de se multiplicar. O enriquecimento pode incluir uma ou mais etapas, dependendo do microrganismo alvo. Nos ensaios de Salmonella e Listeria monocytogenes, por exemplo, feito em duas etapas. Nos ensaios de Vibrio cholerae e Yersinia enterocolitica feito em apenas uma. Quando h duas etapas comum 75

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chamar a primeira de pr enriquecimento ou enriquecimento primrio e a segunda de enriquecimento seletivo. O pr enriquecimento tem por objetivo a reparao de clulas injuriadas, oferecendo condies para a sua recuperao, porm, sem favorecer demasiadamente a microbiota competidora. De maneira geral, clulas injuriadas no crescem em condies altamente seletivas, por isso, os caldos de pr enriquecimento normalmente so no seletivos ou moderadamente seletivos. O pH do meio deve estar na faixa tima de crescimento do alvo e, aps a inoculao de produtos cidos, deve ser ajustado para retornar ao timo, se houver alterao. Para microrganismos que tm pH timo fora da faixa neutra (Vibrio cholerae, por exemplo, com timo na faixa alcalina), o pH do caldo pode oferecer uma vantagem competitiva em relao microbiota acompanhante. A temperatura de incubao tambm deve estar na faixa tima, mas o tempo de incubao deve ser apenas o suficiente para a recuperao das injrias. Durante a fase de recuperao, a multiplicao das clulas injuriadas mnima e, se a incubao for prolongada alm do necessrio, a populao competidora pode aumentar demasiadamente, dificultando ou impedindo a posterior deteco do alvo. O enriquecimento seletivo objetiva inibir a microbiota competidora presente nas amostras, favorecendo a multiplicao do microrganismo alvo. Isso conseguido atravs da utilizao de agentes seletivos e/ou condies restritivas para a microbiota competidora, que podem ser: o pH do meio de cultura, a temperatura e/ou atmosfera de incubao, a adio de antibiticos (polimixina B, ampicilina, moxalactam, novobiocina, D-cicloserina, oxitetraciclina, vancomicina, trimethiprima, cicloeximida) e a adio de compostos qumicos (verde brilhante, selenito de sdio, sais biliares, telurito de potssio, lauril sulfato de sdio). A composio nutricional do meio deve ser tima e, se possvel, conter nutrientes utilizados preferencialmente pelo alvo, como fontes de carbono no comuns (D-manose, sorbitol, citrato de sdio), por exemplo. Nem sempre os caldos de enriquecimento seletivo conseguem um balanceamento ideal entre a necessidade de inibir os competidores sem inibir o microrganismo alvo. Eventualmente, algumas cepas do alvo podem ser sensveis s condies seletivas presentes e, nesses casos, comum a utilizao de mais de um meio de enriquecimento seletivo. Esse o caso, por exemplo, do ensaio para Salmonella, que utiliza dois caldos.

Isolamento em meios slidos (plaqueamento diferencial)


Uma vez conseguida a multiplicao no(s) caldo(s) de enriquecimento, necessrio diferenciar e separar o microrganismo alvo da microbiota competidora. Isso feito na etapa de isolamento em meios slidos, que permite tambm a obteno de culturas puras, para utilizao em testes de confirmao da identidade. De maneira geral, os meios de isolamento so seletivos e diferenciais, para suprimir parte da microbiota competidora e distinguir o alvo da remanescente. Os agentes seletivos usados em meios slidos so os mesmos usados nos meios lquidos de enriquecimento, selecionados em funo do ensaio. Os agentes diferenciais mais usados so os indicadores de pH, para diferenciar os microrganismos que produzem dos que no produzem cido ou base durante o crescimento. Os indicadores de pH mudam de cor em determinadas faixas de pH e os mais utilizados em meios de cultura so o vermelho de fenol e o prpura de bromocresol. Os indicadores de sulfeto de hidrognio (H2S) tambm so bastante usados, para diferenciar microrganismos que produzem dos que no produzem esse composto no metabolismo de aminocido sulfurados. Os indicadores de H2S so compostos de ferro como o citrato frrico, o citrato frrico amoniacal ou o sulfato frrico amoniacal. Ao reagir com o H2S, produzindo sulfeto 76

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de ferro, um composto preto e solvel que se difunde e provoca o escurecimento do meio de cultura. Outros agentes diferenciais so a gema de ovo, para diferenciar os microrganismos que produzem dos que no produzem enzimas lipolticas, a esculina, para diferenciar os microrganismos que hidrolizam dos que no hidrolizam esse composto e o sangue, para diferenciar os microrganismos que produzem dos que no produzem hemlise. Assim como no enriquecimento seletivo, algumas cepas do alvo podem ser sensveis s condies seletivas dos meios de plaqueamento. Nesses casos, comum a utilizao de mais de um meio, como o caso do ensaio de Salmonella, por exemplo, que utiliza dois ou trs.

Confirmao
Essa etapa objetiva confirmar a identidade da cultura isolada, atravs de testes que verificam caractersticas tpicas do(s) microrganismo(s) alvo. As caractersticas mais usadas na confirmao so as morfolgicas, as bioqumicas e as sorolgicas. As caractersticas morfolgicas incluem principalmente forma das clulas (cocos, bastonetes retos, bastonetes curvos, helicoidais), o arranjo das clulas (isoladas, em pares, em ttrades, em cadeias, em cachos, em filamentos) a colorao de Gram, a motilidade e a formao de esporos. As caractersticas sorolgicas incluem principalmente a verificao da presena dos antgenos somticos O da parede celular e dos antgenos flagelares H. As caractersticas bioqumicas dependem do microrganismo alvo e so apresentadas nos captulos especficos. Os testes mais utilizados so os descritos abaixo (Silva, 1996): Teste de catalase. Objetiva verificar se a bactria capaz de produzir a enzima catalase, responsvel pela decomposio do perxido de hidrognio (H2O2). O perxido de hidrognio (gua oxigenada) um metablito formado durante a utilizao aerbica dos carboidratos. txico e pode provocar a morte das clulas se no for rapidamente decomposto. A decomposio desse material ocorre atravs da ao das enzimas classificadas como hidroperoxidases, que incluem a peroxidase e a catalase (perxido de hidrognio redutase). A maioria das bactrias aerbias e anaerbias facultativas que contm citocromo tambm apresentam catalase. A maioria das bactrias anaerbias, como Clostridium sp, por exemplo, possuem peroxidase em lugar da catalase. As bactrias que no apresentam catalase ou peroxidase no so capazes de decompor o perxido de hidrognio, tendo seu crescimento inibido pelo acmulo desse produto do seu prprio metabolismo. Teste de citrato. Objetiva verificar se a bactria capaz de utilizar o citrato como nica fonte de carbono para crescimento. No teste, a nica fonte de carbono disponvel no meio de cultura o citrato. Se a bactria dispe do aparato metablico necessrio assimilao do citrato, ocorrer multiplicao. O crescimento pode ser observado visualmente, pelo acmulo de massa celular ou por viragem de indicador de pH. Em caso negativo, no haver crescimento. Testes de descarboxilao de aminocidos. Objetivam verificar se a bactria capaz de descarboxilar aminocidos formando aminas, com a conseqente alcalinizao do meio de cultura. A descarboxilao dependente da disponibilidade de enzimas de descarboxilao, especficas para cada aminocido. Apenas os aminocidos que apresentam pelo menos um grupo qumico ativo, alm dos grupos amina e carboxila, so passveis de descarboxilao A disponibilidade de uma ou mais descarboxilases varia entre as espcies e representa uma caracterstica til na diferenciao. As descarboxilases mais utilizadas em testes de identificao so a arginina, lisina e ornitina descarboxilases, enzimas indutveis produzidas pelas bactrias apenas na presena dos respectivos aminocidos e em condies cidas. O metabolismo de descarboxilao um processo 77

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anaerbio que resulta em cadaverina e CO2 a partir da lisina e putrescina e CO2 a partir da ornitina. O metabolismo da arginina mais complexo e envolve duas vias metablicas que podem operar simultnea ou separadamente: a via da arginina descarboxilase e a via da arginina deidrolase. Na via da descarboxilase, a arginina inicialmente degradada a agmatina que, por sua vez, ser posteriormente degradada a putrescina e uria, pela enzima agmatinase. Nas bactrias urease positivas, a uria ainda ser degradada a duas molculas de amnia. Na via da deidrolase, a arginina inicialmente degradada a L-citrulina que, por sua vez, ser posteriormente degradada a L-ornitina, CO2 e NH3, pela enzima citrulina ureidase. Independente de qual via seja utilizada pela bactria no metabolismo da arginina, os produtos finais do processo sero alcalinos e produziro o mesmo resultado no teste. Teste de fenilalanina deaminase. Objetiva verificar se a bactria capaz de desaminar o aminocido fenilalanina. A desaminao ocorre na presena de oxignio, sob a ao de uma aminocido oxidase, flavoprotena que catalisa a converso de uma molcula de fenilalanina em uma molcula de cido fenilpirvico e uma molcula de amnia. O cido fenilpirvico pode ser detectado no meio de cultura atravs da adio do cloreto frrico, que reage com o cido fenilpirvico formando um produto colorido, a fenilhidrazona. Testes de fermentao de carboidratos. Objetivam verificar se a bactria capaz de fermentar determinados carboidratos, produzindo cido com ou sem gs. Vias metablicas de fermentao de diferentes carboidratos so caractersticas das espcies, sendo um dos caracteres de fentipo mais utilizados na identificao de bactrias. Os processos fermentativos so seqncias de reaes de xido-reduo que transformam a glucose em um ou mais compostos de carbono, gerando energia no final. O tipo(s) de produto(s) final(ais) da oxidao da glucose, ou seja, o tipo de fermentao, varia de espcie para espcie bacteriana, incluindo cidos, lcoois, CO2 e H2. A entrada de um carboidrato diferente da glucose nos processos fermentativos depende da capacidade de cada espcie para introduzir o carboidrato na clula, convert-lo em glucose e ento realizar a fermentao. O termo carboidratos, de maneira geral, inclui os compostos abaixo, alm do inositol, que um composto no-derivado de carboidratos, porm, tambm testado nos ensaios de fermentao: Monossacardeos: Eritritose (tetrose), Ribose, Xilose, Arabinose (pentoses), Glucose, Frutose, Galactose (hexoses) Dissacardeos: Maltose (glucose + glucose), Sacarose (glucose + frutose), Lactose (glucose + galactose) Trissacardeos: Rafinose Polissacardeos: Amido, Inulina Acares-lcool: Adonitol, Dulcitol, Manitol, Sorbitol Teste de indol. Objetiva verificar se a bactria capaz de desaminar o aminocido triptofano. A desaminao do triptofano depende da disponibilidade pelas bactrias do complexo enzimtico triptofanase, que desamina o triptofano resultando em indol, cido pirvico, amnia e energia. O indol liberado para o meio de cultura pode ser detectado por uma reao qumica com o aldedo presente no reagente de Kovacs para teste de indol (p-dimetilamino benzaldedo), que resulta em produtos de condensao coloridos. Esses compostos, de cor vermelho-violeta, ficam concentrados na fase alcolica do reagente, formando um anel na superfcie do meio de cultura lquido. Teste de malonato. Objetiva verificar se a bactria capaz de utilizar o malonato de sdio como fonte de carbono para crescimento, com resultante alcalinizao do meio de cultura. O 78

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malonato um composto que apresenta a caracterstica de inibir a atividade da enzima succinato desidrogenase, essencial atividade metablica das bactrias para a produo de energia. Dependendo da concentrao do malonato presente, a multiplicao dos microrganismos pode ser parcial ou completamente inibida, a menos que as clulas sejam capazes de utilizar o prprio malonato como fonte de carbono e energia. Quando uma bactria capaz de utilizar o malonato, tambm capaz de utilizar o sulfato de amnia como nica fonte de nitrognio, gerando como produto final de metabolismo o hidrxido de sdio. Assim, adicionando-se sulfato de amnia ao meio de cultura, as bactrias malonato-positivas provocaro uma elevao do pH do meio, pelo acmulo de hidrxido de sdio. Essa alcalinizao pode ser detectada pelo azul de bromotimol, um indicador de pH com ponto de viragem em 7,6. Teste de oxidao/fermentao (O/F). Objetiva verificar o tipo de metabolismo de carboidratos utilizado pela bactria ou a no utilizao de carboidratos. A utilizao de carboidratos para produo de energia nas bactrias pode ocorrer por dois processos, o oxidativo (respirao celular) e o fermentativo. O metabolismo oxidativo um processo aerbio para a maioria das bactrias, isto , s ocorre na presena do oxignio como aceptor final de eltrons, embora algumas espcies sejam capazes de crescer substituindo o oxignio por compostos inorgnicos como o nitrato e o sulfato (respirao anaerbia). O metabolismo fermentativo, ao contrrio, um processo anaerbio e no depende da disponibilidade de oxignio. As bactrias que utilizam o metabolismo oxidativo dependente do oxignio so chamadas de aerbias estritas, uma vez que seu crescimento s ocorre na presena de O2. As bactrias que utilizam tanto o metabolismo oxidativo quanto o fermentativo so chamadas de anaerbias facultativas, porque podem crescer tanto na presena quanto na ausncia de O2. O carboidrato normalmente adicionado aos meios teste de oxidao fermentao a glucose, porque utilizado pela maioria das bactrias. Se o metabolismo da glicose for estritamente oxidativo ou oxidativo e fermentativo, o dos demais tambm ser, no havendo necessidade de testar um a um. Por outro lado, algumas bactrias so incapazes de utilizar a glicose, embora possam utilizar outros carboidratos. Tambm h bactrias que so incapazes de utilizar qualquer tipo de carboidrato, como o Campylobacter, por exemplo, que deriva sua energia de aminocidos ou de cidos intermedirios do ciclo do cido tricarboxlico. Teste de oxidase. Objetiva verificar a presena da enzima citocromo C, uma das oxidases que participam do processo oxidativo de respirao celular. O metabolismo de respirao celular nas bactrias aerbias e anaerbias facultativas apresenta, como etapa final do processo, o sistema de transporte de eltrons. Esse sistema uma seqncia de reaes de xido reduo, em que eltrons so transferidos de um substrato para outro, com a produo de energia. No final da cadeia, o aceptor final de eltrons, que se oxida para manter o sistema funcionando, o oxignio, que recebe os eltrons transportados pelos substratos anteriores. Para que a transferncia de eltrons para o oxignio possa ocorrer necessria a participao de um grupo especial de enzimas de transporte de eltrons, as citocromo oxidases, presentes em todas as bactrias que utilizam o metabolismo respiratrio. O tipo e o nmero de citocromo oxidases presentes na cadeia de transporte de eltrons de diferentes bactrias uma caracterstica das espcies, utilizada como carter de identificao. O teste de oxidase detecta especificamente uma dessas oxidases, a citocromo C oxidase, que no se encontra presente em todas as bactrias capazes de utilizar o metabolismo respiratrio. No teste, o reagente utilizado sempre um agente redutor artificial que atua como aceptor final dos eltrons transferidos pela citocromo oxidase C. Esses reagentes apresentam a caracterstica de mudar de cor ao passar do estado reduzido para o oxidado, de forma que, ao receber os eltrons, oxidam-se, provocando uma reao colorida visvel. 79

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Teste de reduo do nitrato. Objetiva verificar se a bactria capaz de reduzir o nitrato a nitrito ou a gs nitrognio livre. A reduo do nitrato (NO3-) um processo usualmente anaerbio e o produto final da reduo varia em funo da espcie bacteriana, podendo incluir o nitrito(NO2-), a amnia (NH3), o gs nitrognio (N2), o xido ntrico (NO), o xido nitroso (N2O) e a hidroxilamina (R-NH-OH). Os mais comuns so o nitrito e, no caso das bactrias tambm capazes de reduzir o nitrito, o gs nitrognio resultante dessa reduo. A reduo completa do nitrato a gs nitrognio (via nitrito ou xido nitroso) chamada denitrificao. Os produtos da reduo podem ser utilizados ou no no metabolismo das bactrias, dependendo das condies ambientais. Quando no utilizados so excretados para o meio de cultura, onde podem ser detectados. O nitrito pode ser detectado atravs de uma reao colorida com os reagentes para teste de nitrato, uma mistura de -naftilamina e cido sulfanlico, que reagem com o nitrito formando um composto diaznico colorido. Alternativamente, se o meio estiver isento de produtos da reduo do nitrato, a ocorrncia do processo pode ser comprovada pela ausncia do nitrato originalmente acrescentado ao meio de cultura. Essa verificao feita com zinco, capaz de provocar uma reao colorida com qualquer nitrato presente no meio, indicativa de no reduo. No ocorrendo reao, pode-se concluir que o nitrato foi reduzido. Teste de urease. Objetiva verificar se a bactria produz a enzima urease, responsvel pela decomposio da uria em amnia. A urease uma enzima do grupo das amidases, que catalisam a hidrlise de amidas como a uria, uma diamida do cido carbnico ou carbamida. A hidrlise de cada molcula de uria resulta em duas molculas de amnia, que elevam o pH do meio de cultura e podem ser detectadas pelo vermelho de fenol, um indicador de pH com ponto de viragem em pH 8,4. Teste de vermelho de metila (VM). Objetiva verificar se o metabolismo fermentativo da bactria do tipo cido misto. A fermentao da glicose pelas bactrias pode resultar em diferentes produtos finais de fermentao, sendo o tipo de metabolismo fermentativo uma caracterstica das espcies. Na fermentao cido mista, o produto final uma mistura de cidos (2 glicose + 1 H2O 2 cido ltico + 1 cido actico + 2 cido frmico + 1 etanol) que reduzem o pH do meio para menos de 4,5. Essa reduo acentuada do pH, que supera a capacidade tamponante do tampo fosfato presente, pode ser detectada adicionando-se cultura algumas gotas de soluo de vermelho de metila, um indicador de pH com ponto de viragem abaixo de 4,5. Teste de Voges-Proskauer (VP) . Objetiva verificar se a bactria produz butilenoglicol (butanodiol) como produto final de fermentao da glicose. Na fermentao butilenogliclica, o produto final precedido por um precursor intermedirio, a acetona (acetilmetilcarbinol), convertida em butilenoglicol pela ao da diacetil redutase. A acetona pode ser detectada no teste de VP, atravs da adio dos reagentes Barrit para teste de VP. Primeiramente uma soluo alcolica 5% de -naftol, que atua como catalisador para a reao com o reagente seguinte, uma soluo concentrada de hidrxido de potssio ou sdio, que atua como agente oxidante para a oxidao da acetona a diacetil. O diacetil reage com os ncleos guanidina da peptona do meio, formando um produto de condensao avermelhado que, medida em que formado, combinase com o -naftol, acelerando a reao e intensificando a cor.

5.2. MATERIAL REQUERIDO NAS ANLISES


Material para preparao da amostra, descritos nos captulos especficos Meios de cultura recomendados para o ensaio a ser realizado, descritos nos captulos especficos

Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s) pelo ensaio a ser realizado, descrita(s) nos captulos especficos 80

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5.3. PROCEDIMENTO
Antes de iniciar o procedimento, observar os cuidados descritos no Captulo 2, para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies asspticas. Identificar todos os frascos, tubos e placas que sero inoculados, com o cdigo da amostra e a sigla do meio de cultura contido. a) Pr enriquecimento Nos ensaios que utilizam uma nica etapa de enriquecimento, essa etapa no de pr enriquecimento, mas sim, de enriquecimento seletivo. Para a inoculao da amostra, seguir as orientaes dos captulos especficos para cada ensaio. A maioria deles utiliza os mesmos procedimentos de preparao de amostras descritos no Captulo 2, substituindo o diluente pelo caldo de pr enriquecimento. A diluio padro da amostra no caldo de 1:10 (uma parte da amostra para nove partes de caldo). Para a incubao do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo, seguir as orientaes dos captulos especficos. Composio de amostras a seco. Na anlise de diversas unidades de amostra de lotes, comum a prtica de compor as amostras, coletando-se uma unidade analtica de cada e juntando todas numa nica amostra composta. A essa amostra composta adiciona-se o caldo de prenriquecimento, na quantidade necessria para diluio 1:10. Como esse volume normalmente grande, recomenda-se que a temperatura do caldo, no momento da inoculao, seja a mesma da incubao. Esse cuidado evita que a amostra inoculada permanea por muito tempo nas estufas antes de atingir a temperatura de incubao. Para alimentos que no permitam a obteno de uma amostra composta homognea, pode-se fazer a composio mida, descrita no item abaixo. b) Enriquecimento seletivo Esse item aplica-se apenas aos ensaios que utilizam duas etapas de enriquecimento. Agitar cuidadosamente o frasco de pr enriquecimento e transferir uma alquota para o caldo de enriquecimento seletivo. A proporo entre o volume da alquota e o volume do caldo de uma parte para dez, na maioria dos ensaios, mas h excees, devendo ser consultados os captulos especficos. Se mais de um caldo for utilizado no ensaio, transferir uma alquota para o segundo caldo de maneira similar. Para a incubao do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo, seguir as orientaes dos captulos especficos. Se foi feita a composio a seco de vrias amostras no pr enriquecimento, o volume da alquota de caldo de pr enriquecimento a ser transferida para o(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo deve ser multiplicada pelo nmero de unidades de amostra compostas. O volume do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo tambm deve ser multiplicado pelo nmero de unidades de amostras compostas, para manter a proporo. Composio mida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento. Se no foi feita a composio a seco, nessa etapa pode ser feita a composio mida de vrias amostras pr enriquecidas, compondo os caldos de pr enriquecimento obtidos. Para tanto, uma alquota de cada caldo de pr enriquecimento transferida para um mesmo frasco de caldo de enriquecimento seletivo. Nesse caso, o volume do caldo de enriquecimento seletivo deve ser suficiente para manter a proporo recomendada de pr enriquecimento a ser transferido. Para a prtica de transferir 1ml do caldo de pr enriquecimento para 10ml do caldo de enriquecimento seletivo, por exemplo, so necessrios 100ml do caldo de enriquecimento seletivo para compor 10 amostras. Se, no caso de presena, for importante determinar qual unidade de amostra est contaminada, possvel preservar cada unidade pr enriquecida sob refrigerao e analisar individualmente depois. 81

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Composio mida em ensaios com uma nica etapa de enriquecimento. Nesse caso, transferir uma alquota de 1ml de cada caldo enriquecido para um mesmo tubo estril vazio, homogeneizar bem em um agitador tipo vortex e utilizar essa amostra composta na etapa de plaqueamento diferencial subsequente. c) Plaqueamento diferencial Nos ensaios de duas etapas de enriquecimento, o plaqueamento diferencial feito a partir do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo. Nos ensaios de uma nica etapa, feita a partir do nico caldo de enriquecimento. A partir de cada tubo ou frasco de caldo enriquecido, estriar uma alada na superfcie do meio de cultura seletivo diferencial recomendado para o ensaio, nos captulos especficos. Se mais de um meio de plaqueamento for recomendado para o ensaio, repetir esse procedimento em cada meio utilizado. A inoculao deve ser feita por estrias de esgotamento, conforme descrito abaixo, para obter culturas puras em colnias isoladas. A incubao das placas deve ser feita da forma recomendada para o ensaio, nos captulos especficos.
c.1) Tcnica de inoculao por estrias de esgotamento para obter culturas puras. As estrias so feitas da seguinte forma: com uma ala de inoculao, transferir uma alada da cultura para um ponto da superfcie do meio, bem prximo parede da placa. A partir desse ponto, puxar a ala em movimentos de vai-e-vem, fazendo linhas bem prximas umas das outras, em metade da placa, conforme mostrado na Figura 5.1. As linhas no devem encostar umas nas outras, sendo mantido um pequeno ngulo entre uma e outra. Atingida a metade da placa, flambar a ala, aguardar resfriar e tocar em um ponto da metade inoculada, prximo parede da placa. A partir desse ponto, puxar o inculo para fora da metade inoculada e descrever novas linhas, ocupando um quarto da placa. As novas linhas no devem tocar as primeiras. Flambar novamente a ala, aguardar esfriar e, a partir da segunda srie de estrias, puxar novamente o inculo para o ltimo quarto no inoculado da placa, descrevendo novas linhas em toda a rea restante. No tocar nenhuma das estrias feitas anteriormente. A cada srie de estrias o inculo menor, porque foi sendo esgotado na srie anterior. Assim, no ltimo quadrante inoculado, provvel a obteno de colnias isoladas.

d) Seleo de colnias e repique de culturas para confirmao A confirmao feita a partir das colnias com caractersticas tpicas do microrganismo alvo, descritas nos captulos especficos. Na ausncia de colnias tpicas, o ensaio dado como concludo e o resultado como ausncia, mesmo que outros tipos de colnias estejam presentes. H excees em que se recomenda utilizar colnias atpicas, na ausncia das tpicas. Essas excees so apresentadas nos captulos especficos. Havendo colnias tpicas, deve ser feito o isolamento da cultura, transferindo-se uma pequena parte da massa de clulas para um ou mais meios de isolamento. O nmero de colnias que devem ser isoladas para a confirmao varia com o ensaio, assim como os meios de isolamento, devendo ser seguidas as orientaes dos captulos especficos. De maneira geral, pelo menos duas colnias tpicas de cada meio de plaqueamento diferencial so submetidas confirmao, para aumentar a chance de isolar uma que seja do microrganismos alvo. Para o isolamento, a placa deve conter colnias isoladas, pelo menos no ltimo quarto inoculado. Se isso no ocorrer, uma alada da cultura na placa deve ser novamente inoculada por estrias de esgotamento, em outra placa do mesmo meio. Esse procedimento deve ser repetido tantas vezes quantas necessrias, at obter placas com colnias isoladas. Utilizar a tcnica descrita abaixo para a repicar a cultura das colnias nos meios de isolamento, de forma a transferir culturas puras. 82

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Placa de Petri com meio de cultura

Ala de inoculao

Figura 5.1. Tcnica de inoculao por estrias de esgotamento.

Tcnica de repique de culturas puras a partir de colnias isoladas em placas. As placas normalmente contm colnias tpicas e, tambm, colnias atpicas de vrios tipos, que so da microbiota competidora. Para garantir que a cultura tomada de uma colnia tpica esteja pura, a retirada do inculo deve ser feita com agulhas, nunca com alas de inoculao. Com a ponta da agulha, tocar levemente o centro da colnia, em sua parte mais alta, de forma a retirar uma quantidade mnima da massa de clulas. No tocar qualquer outra regio da colnia ou do meio de cultura em redor, porque isso aumenta o risco de carregar os contaminantes. Nunca remover toda a colnia. Uma quantidade mnima de inculo, mesmo que no possa ser vista, suficiente para inocular vrios meios de isolamento. Os meios normalmente esto contidos em tubos, podendo ser slidos (inclinados ou no), semi-slidos ou lquidos. Os meios semi-slidos e os slidos no inclinados so inoculados por picada, sem atingir o fundo do tubo. Os meios slidos inclinados so inoculados fazendo-se uma picada, sem atingir o fundo e, depois, estrias na rampa. Os meios lquidos so inoculados introduzindo-se a agulha at uma profundidade prxima do fundo e agitando levemente (h excees, apresentadas nos captulos especficos). Na inoculao de vrios tubos, no flambar a agulha nem tomar um novo inculo entre um tubo e outro. Incubar os tubos nas condies descritas para o ensaio, nos captulos especficos. e) Testes de confirmao Os testes requeridos na confirmao so definidos nos captulos especficos. Os captulos tambm apresentam o procedimento para a realizao dos testes, exceto os procedimentos bsicos de colorao de Gram, colorao de esporos e preparao de montagens midas, apresentados abaixo. e.1) Colorao de Gram (mtodo de Hucker). Preparar um esfregao da cultura da seguinte forma: Se a cultura estiver em meio slido, colocar uma gota de soluo salina (NaCl 0,85%) sobre uma lmina de vidro limpa e seca e emulsionar uma alada da cultura com a soluo salina. Se a cultura estiver em caldo, agitar o caldo e colocar uma alada sobre 83

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a lmina de vidro. Aguardar que o lquido seque naturalmente e, ento, fixar o esfregao pelo calor, passando rapidamente a lmina pela chama do bico de Bunsen, por trs vezes. Corar da seguinte forma: Cobrir o esfregao com Soluo de Cristal Violeta de Hucker e manter em contato por um minuto. Lavar em gua corrente (fluxo de gua bem leve) e cobrir com Soluo de Iodo (Lugol) por um minuto. Lavar em gua corrente e secar com leno de papel ou papel de filtro, tocando levemente, sem esfregar. Lavar em seguida com etanol, at que no haja mais desprendimento de corante (30 segundos). Lavar em gua corrente e cobrir com Soluo de Safranina por 30 segundos. Lavar em gua corrente e secar com papel absorvente (leno de papel ou papel de filtro, sem esfregar, apenas tocando o esfregao com o papel). Observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso. As clulas das bactrias Gram positivas vo ficar coradas de roxo e as das Gram negativas de vermelho, podendo tambm ser observadas a morfologia e o arranjo das clulas. e.2) Colorao de esporos (Mtodo de Schaeffer-Fulton). Preparar um esfregao da cultura, da mesma forma indicada para a colorao de Gram. Corar da seguinte forma: Cobrir o esfregao com Soluo de Verde Malaquita 5% aquosa e corar a quente durante cinco minutos. Para aquecer a soluo de verde de malaquita, segurar a lmina sobre um banho ou frasco com gua sob fervura. Aps o tempo de contato recomendado, lavar em gua corrente e cobrir com Soluo de Safranina 0,5% aquosa por 30 segundos. Lavar em gua corrente e secar com leno de papel ou papel de filtro (sem esfregar, apenas tocando o esfregao com o papel). Observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso. Os esporos vo ficar corados de verde e as clulas vegetativas de vermelho. e.3) Colorao de esporos (Mtodo de Ashby). Preparar um esfregao da cultura, da mesma forma indicada para a colorao de Gram. Corar da seguinte forma: Segurar a lmina sobre um banho ou frasco com gua sob fervura, at observar gotas de gua condensada na parte de baixo da lmina. Cobrir o esfregao com Soluo de Verde Malaquita 5% aquosa e corar durante um a dois minutos. Lavar em gua corrente e cobrir com Soluo de Safranina 0,5% aquosa por 20 a 30 segundos. Lavar em gua corrente e secar com papel de filtro. Observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso. Os esporos vo ficar corados de verde e as clulas vegetativas de vermelho. e.4) Montagens midas para observao microscpica a fresco. Se a cultura estiver em meio slido, colocar uma gota de soluo salina sobre uma lmina de vidro limpa e seca e emulsionar uma alada da cultura com a soluo salina. Se a cultura estiver em caldo, agitar o caldo e colocar uma alada sobre a lmina de vidro. Cobrir o lquido com uma lamnula e observar imediatamente ao microscpio, antes que o material seque. A melhor 84

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Tcnicas Bsicas de Deteco da Presena/Ausncia de Microrganismos

visualizao obtida em microscpio de contraste de fase, mas, na falta deste, tambm pode ser feita em microscpio ptico, com objetiva de imerso. A observao a fresco permite verificar a motilidade, a forma e o arranjo das clulas.

5.2. REFERNCIAS
BIER, J.W., SPLITTSTOESSER, D.F., TORTORELLO, M.L. Microscopic methods. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 4, p.37-44. SILVA, N. Testes Bioqimicos para Identificao de Bactrias em Alimentos. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos, 1996. SPERBER, W.A., MOORMAN, M.A. & FREIER, T.A. Cultural methods for the enrichment and isolation of microrganisms. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. Chapter 5, p.45-51.

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Captulo 6

Contagem total de Aerbios Mesfilos e Psicrotrficos em Placas

6.1. INTRODUO
A maioria das orientaes desse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foram tambm includas recomendaes da 17a Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004) e da 21a Edio do Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (Eaton et al., 2005).

Significado da contagem total de aerbios mesfilos


A contagem Total de Aerbios Mesfilos em placas, (Aerobic Plate Count), tambm denominada Contagem Padro em Placas, o mtodo mais utilizado como indicador geral de populaes bacterianas em alimentos. No diferencia tipos de bactria, sendo utilizado para se obter informaes gerais sobre a qualidade de produtos, prticas de manufatura, matrias primas utilizadas, condies de processamento, manipulao e vida de prateleira. No um indicador de segurana, pois no est diretamente relacionado presena de patgenos ou toxinas. Dependendo da situao, pode ser til na avaliao da qualidade, porque populaes altas de bactrias podem indicar deficincias na sanitizao ou falha no controle do processo ou dos ingredientes. Os produtos fermentados, ao contrrio, apresentam populaes naturalmente altas de mesfilos, sem qualquer relao com a qualidade. A utilizao da contagem total de aerbios mesfilos como indicador de qualidade deve ser criteriosa. Por exemplo, aplicada ingredientes, deve levar em conta a diluio e o efeito no produto final. Aplicada a alimentos desidratados, pode indicar se o controle da umidade est sendo corretamente aplicado ao processo de secagem. Nas Tabela 6.1 so apresentadas as contagens tpicas em algumas mercadorias no comrcio internacional. Na Tabela 6.2 as especificaes da FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization) para a contagem total de aerbios mesfilos em alguns alimentos. Na Tabela 6.3 as especificaes apresentadas pelo Standard Methods for the Examination of Dairy Products da APHA para a contagem total de aerbios mesfilos em produtos lcteos.

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Tabela 6.1. Contagem total de aerbios mesfilos tpica em mercadorias no comrcio internacional (Morton, 2001).
Produto Arroz no beneficiado Arroz beneficiado Amndoas Nozes Massas frescas refrigeradas ou congeladas Pes, bolos, doces e salgados assados Protena de soja Massas Misturas de cereais secos Cereias matinais Cacau Vegetais congelados Leite cru Saladas mistas (frango, ovos, batatas, camares) Carne moda fresca Cortes de frango Batatas congeladas Contagem total de aerbios mesfilos mxima (UFC/g) 1,8x106 1,4x103 3,0 a 7,0x105 3,1x104 a 2,0x106 1,0x102 a 1,0x106 1,0x101 a 1,0x103 1,0x102 a 1,0x105 1,0x103 a 1,0x105 1,0x103 a 1,0x105 0 a 1,0x102 1,0x104 1,0x103 a 1,0x106 8,0x102 a 6,3x105 1,0x104 a 1,0x105 1,0x105 1,0x105 1,0x103 a 1,0x105

Tabela 6.2. Especificaes da FAO/WHO para contagem total de aerbios mesfilos em alimentos (Morton, 2001).
Produto Ovo integral em p ou congelado Produtos instantneos em p Produtos desidratados consumidos aps adio de lquido com emprego de calor Camaro congelado pr cozido Misturas geladas Gelo comestvel Leite em p Casenas Contagem total de aerbios mesfilos mxima (UFC/g) 5,0x104 1,0x103 1,0x104 1,0x105 2,5x104 5,0x104 5,0x104 3,0x104

FAO = Food and Agriculture Organization, WHO = World Health Organization (Organizao Mundial da Sade - OMS).

Tabela 6.3. Especificaes apresentadas pelo Standard Methods for the Examination of Dairy Products da APHA para a contagem total de aerbios mesfilos em produtos lcteos (Lewis et al., 2004).
Produto Leite e produtos lcteos pasteurizados Leite condensado Leite desnatado em p tipo A e tipo Instantneo Leite desnatado em p tipo Extra Leite desnatado em p tipo Padro Leite integral em p tipo Extra Leite integral em p tipo Padro
APHA = American Public Health Association.

Contagem total de aerbios mesfilos mxima (UFC/g ou ml) 2,0x104 3,0x104 3,0x104 4,0x104 7,5x104 3,0x104 5,0x104

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Contagem total de Aerbios Mesfilos e Psicrotrficos em Placas

Definio de psicrotrficos
Microrganismos que crescem em alimentos sob refrigerao (0-7oC) mas apresentam temperatura tima acima de 20oC so chamados de psicrotrficos ou psicrotrfilos. So definidos como microrganismos capazes de produzir crescimento visvel a 71oC no prazo de 7 a 10 dias, independente de sua temperatura tima. Na classificao tradicional dos microrganismos em funo da temperatura termfilos, mesfilos e psicrfilos - os psicrotrficos so um subgrupo dos mesfilos, no dos psicrfilos, porque esses ltimos geralmente morrem temperatura ambiente. Os psicrotrficos, ao contrrio, se multiplicam em alimentos refrigerados mas crescem melhor nas temperaturas da faixa mesfila. As principais bactrias psicrotrficas esto distribudas em vrios gneros, incluindo, cocos e bastonetes, esporognicos e no esporognicos, aerbios e anaerbios. As mais comuns em alimentos (produtos lcteos, crneos, aves, peixes e frutos do mar) so espcies dos gneros Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brochothrix, Carnobacterium, Chromobacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Klebsiella, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Microbacterium, Micrococcus, Moraxella, Pseudomonas, Psychrobacter, Serratia, Shewanella, Streptococcus e Weissella. Espcies de Alteromonas, Photobacterium e Vibrio so importantes deteriorantes de pescados. Espcies de Bacillus, Clostridium, Enterobacter, Flavobacterium, Pseudomonas e Yersinia causam amolecimento e deteriorao em vegetais refrigerados. Brochothrix, Lactobacillus, Leuconostoc e membros da famlia Enterobacteriaceae so deteriorantes de alimentos embalados sob vcuo ou atmosferas modificadas, bem como Carnobacterium e Weissella viridescens, em menor extenso. Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus e Lactobacillus so deteriorantes de produtos lcteos, Pseudomonas sendo a mais freqente. Algumas bactrias patognicas tambm so psicrotrficas, incluindo Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, algumas cepas de E. coli enteropatognica, algumas cepas de Bacillus cereus, algumas cepas de Clostridium botulinum tipo E e tipos B e F no proteolticos.

Mtodos de anlise
O mtodo clssico de contagem total de aerbios mesfilos ou psicrotrficos em alimentos, descrito no Captulo 7 do Compendium, a contagem padro em placas (plaqueamento em profundidade, superfcie ou filtrao em membrana). O meio de cultivo recomendado para a maioria dos ensaios o gar Padro para Contagem (PCA), incubado a 351oC/482h, com as seguintes excees: Na anlise de leite e produtos lcteos o Captulo 6 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004) recomenda incubar o PCA a 321oC/482h, prolongando a incubao at 723h no caso de produtos lcteos desidratados.

Na anlise de sucos de frutas o Captulo 58 do Compendium (Hatcher et al., 2001) recomenda substituir o PCA pelo gar Soro de Laranja (OSA), incubado a 301oC/482h. O OSA um meio nutricionalmente mais rico que o PCA, permitindo recuperar as bactrias lcticas, normalmente presentes nesses produtos. Na anlise de gua, a Seo 9215 do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice, 2005) recomenda substituir o PCA pelo gar R2A ou NWRI, incubados a 350,5oC/ 482h. Esses meios podem ser usados no plaqueamento em profundidade, superfcie e filtrao em membrana. Recomenda ainda, exclusivamente para a tcnica de filtrao em membrana, o gar m-HPC, incubado a 350,5oC/482h. Em gua o PCA resulta em contagens menores do que 89

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o R2A ou o NWRI, mas foi mantido na 21o edio do Standard Methods, para estudos comparativos com outros meios e para laboratrios que necessitam manter a continuidade de registros antigos. Outros mtodos que j foram oficializados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2005) so os kits analticos descritos na Tabela 6.4.
Tabela 6.3. Kits analticos oficializados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2005) para contagem total de aerbios em alimentos.
Fabricante 3M Microbiology Products 3M Microbiology Products BioControl Systems, Inc. Nome do kit Petrifilm Aerobic Count Plate Redigel Aerobic Plate Count SimPlate for Total Plate Count Color Indicator (TPC-CI) Validao AOAC AOAC Official Methods 990.12, 989.10, 986.33 AOAC Official Method 988.18 AOAC Official Method 2002.07 Aplicao Alimentos, produtos lcteos, leite Produtos lcteos e no lcteos Alimentos, ingredientes e amostras ambientais

Fonte: AOAC International, disponvel no site <http://www.aoac.org/testkits/kits-microbiology.htm>, acesso em 10/02/06.

6.2. MTODO DE CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS MESFILOS EM PLACAS


Mtodo da American Public Health Association (APHA) para a anlise de alimentos, descrito no Captulo 7 da 4o Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Morton, 2001). Includas tambm as recomendaes especficas do Captulo 58 do Compendium (Hatcher et al., 2001) para a anlise de sucos de frutas, as do Captulo 6 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004) especficas para a anlise de produtos lcteos, e as da Seo 9215 do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice, 2005), para a anlise de gua. Aplicao: anlise de gua e de todos os alimentos. A contagem pode ser feita utilizando-se os mtodos de plaqueamento em profundidade (pour plate), superfcie (spread plate) e filtrao em membrana. Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as orientaes do Captulo 3, que apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de microrganismos em placas, da seleo das diluies ao clculo dos resultados. O procedimento descrito abaixo no apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo analista. 6.2.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANLISE Preparaco da amostra e diluies seriadas Diluente: gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Tubos de diluio com 9ml de gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Pipetas de 1 ou 2ml Observao: consultar o Anexo 2.2 do Captulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em funo da amostra analisada. Inoculao por plaqueamento em profundidade Placas de Petri de 20 x 100mm estreis vazias gar Padro para Contagem (PCA) gar Soro de Laranja (OSA) (para sucos de frutas) gar R2A ou NWRI (preferenciais para amostras de gua) 90

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Contagem total de Aerbios Mesfilos e Psicrotrficos em Placas

Inoculao por plaqueamento em superfcie Placas com gar Padro para Contagem (PCA) Placas com gar Soro de Laranja (OSA) (para sucos de frutas) Placas com gar R2A ou NWRI (para amostras de gua) Ala de espalhamento (ala de Drigalski) mergulhada em etanol 70% Inoculao por filtrao em membrana Placas com gar Padro para Contagem (PCA) Placas com gar R2A, NWRI ou m-HPC (para amostras de gua) Membranas de 47mm de dimetro, porosidade de 0,45m, brancas e quadriculadas Conjunto de filtrao previamente esterilizado Bomba de vcuo Pinas para transferncia das membranas, mergulhadas em etanol Proveta de 100 ou 200ml estril, para medio de volumes de amostra Incubao Estufa incubadora regulada a 351oC com termmetro calibrado (para alimentos em geral) Estufa incubadora regulada a 301oC com termmetro calibrado (para sucos de frutas) Estufa incubadora regulada a 321oC com termmetro calibrado (para leite e produtos lcteos) 6.2.2. PROCEDIMENTO O esquema geral de anlise para contagem total de microrganismos aerbios mesfilos em placas encontra-se descrito na Figura 6.1.
Homogeneizao 10
-1

1ml

10

-2

1ml

10

-3

9ml H20p 25g de amostra + 225ml de gua Peptonada (H20p)

9ml H20p

1ml ou 0,1ml

1ml ou 0,1ml

1ml ou 0,1ml

PCA

gar Padro para Contagem (PCA) plaqueamento em profundidade ou superfcie 351oC/482h

PCA

CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS MESFILOS UFC/g

Figura 6.1. Esquema geral de anlise para contagem total de microrganismos aerbios mesfilos em placas (Morton, 2001).

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6.2.2.1. Plaqueamento em profundidade a) Preparao das amostras e diluies seriadas. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Inoculao. Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular 1ml de cada diluio em placas de Petri separadas, estreis e vazias. c) Adio do meio de cultura. Verter nas placas inoculadas, 12 a 15ml de gar Padro para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 44-46oC. Para amostras de sucos de frutas, substituir o PCA pelo gar Soro de Laranja (OSA). Para amostras de gua, preferencialmente, substituir o PCA pelo gar R2A ou NWRI. Misturar o inculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfcie plana, em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares, oito a dez vezes no sentido horrio e oito a dez vezes no sentido anti-horrio. Distribuir as placas numa bancada fria, sem empilhar, para solidificao do meio. Para amostras em que seja comum a ocorrncia de colnias grandes e espalhadas (leite em p, por exemplo), aguardar a completa solidificao do gar e adicionar uma sobrecamada do mesmo meio. d) Incubao. Inverter e incubar as placas nas seguintes condies: PCA - 351oC/482h para alimentos em geral PCA - 321oC/482h para produtos lcteos PCA - 321oC/723h para produtos lcteos desidratados OSA - 301oC/482h para sucos de frutas R2A e NWRI - 350,5oC/482h para gua e) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Selecionar as placas com 25 a 250 colnias e contar as colnias com o auxlio de uma lupa, em um contador de colnias. Calcular o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) por grama ou mililitro da amostra multiplicando o nmero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. Caso tenham sido utilizadas duas placas por diluio (duplicata), considerar como nmero de colnias a mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata. Usar notao exponencial e apenas uma casa decimal depois da vrgula, na apresentao dos resultados. Para a contagem de colnias e clculo dos resultados em situaes no usuais, seguir as orientaes do Captulo 3. Limite de deteco do procedimento padro (1ml/diluio): 1 UFC/ml de amostras lquidas ou 10 UFC/g de amostras slidas. 6.2.2.2. Plaqueamento em superfcie a) Preparao das amostras e diluies seriadas. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Preparao das placas. Preparar previamente placas de gar Padro para Contagem (PCA) e, antes do uso, secar em capela de fluxo laminar (30 a 60 minutos, com as tampas parcialmente abertas) ou em estufa (50oC/1,5-2h ou 25-30oC/18-24h). Para amostras de sucos de frutas, substituir o PCA pelo gar Soro de Laranja (OSA). Para amostras de gua, preferencialmente, substituir o PCA pelo gar R2A ou NWRI. c) Inoculao. Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular 0,1ml de cada diluio na superfcie das placas previamente preparadas. Usando uma ala de Drigalski, espalhar o inculo 92

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por toda a superfcie do meio, at que o excesso de lquido seja absorvido. Se o nvel de contaminao esperado da amostra for baixo, inocular um volume maior da primeira diluio, distribuindo esse volume por quatro placas (trs placas com 0,3ml e uma placa com 0,1ml). d) Incubao. Aguardar que as placas sequem (mnimo 15min), inverter e incubar nas seguintes condies: PCA - 351oC/482h para alimentos em geral PCA - 321oC/482h para produtos lcteos PCA - 321oC/723h para produtos lcteos desidratados OSA - 301oC/482h para sucos de frutas R2A e NWRI - 350,5oC/482h para gua e) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Seguir as mesmas orientaes descritas para o plaqueamento em profundidade, porm, multiplicar o resultado por dez, para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado. Se foi feita a distribuio de 1ml da primeira diluio em quatro placas, o nmero de colnias dessa diluio a soma das quatro placas. Se o clculo do resultado for feito com a contagem dessa diluio, ento no necessrio multiplicar por dez. Para a contagem de colnias e clculo dos resultados em situaes no usuais, seguir as orientaes do Captulo 3. Limite de deteco do procedimento padro (0,1ml/diluio): 10 UFC/ml de amostras lquidas ou 100 UFC/g de amostras slidas. 6.2.2.3. Filtrao em membrana O mtodo de filtrao em membrana aplica-se a lquidos lmpidos, sem slidos em suspenso. recomendado para amostras com contagens abaixo do limite de deteco dos outros mtodos, sendo bastante utilizado na anlise de refrigerantes (no contendo sucos naturais) e gua para consumo humano. Pode tambm ser utilizado na anlise de produtos slidos convertidos em solues lmpidas, como sal e acar, por exemplo. a) Preparao do conjunto de filtrao. Seguir as orientaes do Captulo 3. b) Preparao das placas . Preparar previamente, da mesma forma recomendada para o plaqueamento em superfcie. Para amostras de gua, preferencialmente, substituir o PCA pelo gar R2A, NWRI ou m-HPC. Podem tambm ser utilizadas placas de 50mm de dimetro (com 5ml de meio de cultura) ou almofadas absorventes (pads) estreis, colocados no interior de placas (tambm estreis) e embebidos com pores de 2ml dos mesmos meios, na forma lquida. c) Preparao da amostra. Homogeneizar a amostra seguindo as orientaes do Captulo 2. Medir 100ml numa proveta estril e verter cuidadosamente no copo do conjunto de filtrao, evitando respingos. Se o copo do conjunto de filtrao for graduado e a escala contiver a marcao de volume requerida, o volume da amostra pode ser medido diretamente, sem a utilizao da proveta.
Nota c.1) Como o mtodo de filtrao uma tcnica de concentrao dos microrganismos em amostras com baixas contagens, o procedimento usual a filtrao de 100ml da amostra, que podem ser fracionados em duas pores de 50ml, quatro pores de 25ml ou trs pores de 70, 25 e 5ml, respectivamente. A seleo do volume a ser filtrado, entretanto, depende da contaminao estimada na amostra, de forma a resultar em placas com contagens na faixa de 20 a 200 colnias.

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Nota c2) Quando o volume a ser filtrado for menor do que 20ml, adicionar ao copo do conjunto de filtrao cerca de 20-30ml de diluente, antes da adio da amostra. No necessria uma medida exata de diluente, cuja funo aumentar o volume a ser filtrado, facilitando uma melhor distribuio dos microrganismos na membrana.

d) Filtrao. Ligar a bomba de vcuo e proceder filtrao. Aps a passagem da amostra, ainda com a bomba ligada, enxaguar as paredes do copo com 20 a 30ml de diluente, para recolher eventuais contaminantes aderidos. Repetir esse procedimento mais uma vez. Desligar a bomba de vcuo antes que a membrana seque excessivamente. e) Transferncia e incubao da membrana. Retirar o copo e, com uma pina flambada e resfriada, transferir a membrana para a placa com o meio de cultura, com a face quadriculada para cima. Ao colocar a membrana na placa importante que toda a superfcie fique completamente aderida ao meio, para que haja contato dos microrganismos com os nutrientes. Se houver formao de bolhas, deve-se levantar a borda da membrana mais prxima da(s) bolha(s) e recoloc-la de forma a eliminar a(s) bolha(s). f) Incubao. Incubar as placas nas condies abaixo, invertidas e, preferencialmente, acondicionadas em sacos ou bandejas com papel toalha ou papel de filtro mido, para evitar desidratao. PCA - 351oC/482h para alimentos em geral R2A, NWRI ou m-HPC - 350,5oC/482h para gua g) Contagem das colnias e clculo dos resultados. Proceder contagem das colnias com o auxlio de um microscpio estereoscpico, com aumento de 10 a 15 vezes e, para facilitar a visualizao posicionar as placas de forma a obter uma iluminao perpendicular ao plano da membrana. Selecionar para contagem placas com 20 a 200 colnias. Seguir as orientaes abaixo para contagem e clculo do nmero de UFC/ml: Se o nmero de colnias por quadrcula da membrana for menor ou igual a dois, contar todas as colnias presentes e dividir pelo volume filtrado, para obter o nmero de UFC/ml. Se o nmero de colnias por quadrcula estiver na faixa de trs a dez, contar dez quadrculas e tirar a mdia por quadrcula. Multiplicar esse valor por 100 e dividir pelo volume filtrado, para obter o nmero de UFC/ml. Se o nmero de colnias por quadrcula estiver na faixa de dez a vinte, contar apenas cinco quadrculas para tirar a mdia e calcular o nmero de UFC/ml da mesma forma. Se o nmero de colnias por quadrcula for maior do que vinte, expressar o resultado como maior do que 2,0x103 dividido pelo volume filtrado. Limite de deteco do procedimento padro (filtrao de 100ml): 1 UFC/100ml.

6.3. MTODO DE CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS MESFILOS EM PETRIFILM (AOAC 990.12/989.10/986.33)


Petrifilm uma modificao da contagem de clulas viveis em placas. composto por dois filmes estreis, reidratveis, impregnados por substncias geleificantes solveis em gua fria, pelo meio de cultura (similar ao gar Padro para Contagem - PCA) e por um indicador de tetrazlio (torna as colnias vermelhas, facilitando a contagem). 94

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Contagem total de Aerbios Mesfilos e Psicrotrficos em Placas

Mtodo oficial da AOAC (Association of Official Analytical Chemists), includo no Captulo 7 da 4 Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Morton, 2001) e no Captulo 6 da 17a Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al., 2004). Aplica-se anlise de todos os alimentos.
a

6.3.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANLISE Preparaco da amostra e diluies seriadas Diluente: gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Tubos de diluio com 9ml de gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Pipetas de 1 ou 2ml Observao: consultar o Anexo 2.2 do Captulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em funo da amostra analisada. Inoculao Placas de PetrifilmAC para Contagem Total (3M Company) Espalhador Incubao Estufa incubadora regulada a 351oC com termmetro calibrado Estufa incubadora regulada a 321oC com termmetro calibrado (para leite e produtos lcteos) 6.3.2. PROCEDIMENTO Observao. O procedimento abaixo orientativo, devendo sempre ser verificadas e obedecidas as instrues do fabricante. a) Preparao das amostras e diluies seriadas. Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. b) Inoculao. Posicionar os petrifilms em uma superfcie plana. Selecionar trs diluies adequadas da amostra para a inoculao. Inocular 1ml de cada diluio em placas de PetrifilmAC para Contagem Total (3M Company) separadas, levantando o filme superior e depositando o inculo no centro da rea circular do filme inferior. Baixar o filme superior sobre o inculo, posicionar o espalhador (que acompanha o kit de petrifilms) e, seguindo as instrues do fabricante, aplicar uma leve presso, para espalhar o inculo. c) Incubao: Aguardar um minuto para o gel solidificar e incubar 351oC/482h, em pilhas de no mais de 20 filmes, sem inverter. No caso de produtos lcteos, incubar a 321oC/483h d) Contagem das colnias e clculo dos resultados. A rea circular de crescimento do petrifilm tem aproximadamente 20cm2 e a contagem deve ser feita nos petrifilms com 25 a 250 colnias. Contar todas as colnias vermelhas, independente do tamanho ou intensidade da cor. Calcular o nmero de UFC por grama ou mililitro da amostra multiplicando o nmero de colnias pelo inverso da diluio. Para determinar o nmero de colnias em petrifilms com mais 250, contar as colnias em um ou mais quadrados de 1cm2, calcular a mdia por cm2 e multiplicar por 20. Limite de deteco: 1 UFC/ml de amostras lquidas ou 10 UFC/g de amostras slidas.

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6.4. MTODO DE CONTAGEM DE AERBIOS PSICROTRFICOS


Mtodo da American Public Health Association (APHA), descrito no Captulo 13 da 4 Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Cousin et al., 2001) e no Captulo 8 da 17o Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004). Aplica-se anlise de todos os alimentos. O Compendium recomenda que as amostras destinadas contagem de aerbios psicrotrficos sejam analisadas no intervalo de seis horas, a partir da coleta. A estocagem refrigerada permite sua multiplicao e o tempo de gerao de vrios desses microrganismos encontra-se dentro desse intervalo. O congelamento no indicado para essas amostras, porque pode provocar injria ou morte de vrios microrganismos. Se o congelamento for indispensvel, considerar na avaliao dos resultados que parte da microbiota pode ter sido perdida.
o

6.4.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANLISE Preparaco da amostra e diluies seriadas Diluente: gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Tubos de diluio com 9ml de gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Pipetas de 1ml Observao: consultar o Anexo 2.2 do Captulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em funo da amostra analisada. Inoculao por plaqueamento em superfcie Meio de cultura: placas com gar Padro para Contagem (PCA), que pode ser substitudo pelo gar Tripticase de Soja (TSA) ou pelo Petrifilm Contagem Total (3M Company) Ala de espalhamento (ala de Drigalski) mergulhada em etanol 70% Estufa incubadora regulada a 7 1oC com termmetro calibrado Estufa incubadora regulada a 171oC com termmetro calibrado (opcional) 6.4.2. PROCEDIMENTO O esquema geral de anlise para contagem total de microrganismos aerbios psicrotrficos em placas encontra-se descrito na Figura 6.2. Segue o mesmo procedimento da contagem total de aerbios mesfilos, alterando a condio de incubao. O Captulo 13 do Compendium (Cousin et al., 2001) recomenda plaqueamento em Petrifilm ou plaqueamento em superfcie, usando gar Padro para Contagem (PCA) ou gar Tripticase de Soja (TSA) como meios de cultivo. No recomenda o plaqueamento em profundidade porque as bactrias so sensveis ao calor e podem ser afetadas pelo meio de cultura quente. A incubao pode ser feita a 71oC por 10 dias ou 171oC por 16 horas, seguido de mais 3 dias a 71oC. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) recomenda, para leite e produtos lcteos, plaqueamento em profundidade, usando PCA resfriado a 451oC, antes da adio sobre o inculo. Incubao a 71oC por 10 dias.

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Contagem total de Aerbios Mesfilos e Psicrotrficos em Placas

Homogeneizao

10

-1

1ml

10

-2

1ml

10

-3

9ml H20p 25g de amostra + 225ml de gua Peptonada (H20p)

9ml H20p

0,1ml

0,1ml

0,1ml

PCA ou TSA

gar Padro para Contagem (PCA) ou gar Tripticase de Soja (TSA) Plaqueamento em superfcie 71 C/10 dias ou o 171 C/16h seguido de 71oC/3 dias
o

PCA ou TSA

CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS PSICROTRFICOS UFC/g

Figura 6.2. Esquema geral de anlise para contagem total de microrganismos aerbios psicrotrficos em placas (Cousin et al., 2001).

6.5 REFERNCIAS
AOAC International, 2005. Rapid Test Kits. Disponvel no site <http://www.aoac.org/testkits/kits-microbiology.htm>, acesso em 10/02/06. COUSIN, M.A., JAY, J.M. & VASAVADA, P.C. Psychrotrophic microrganisms. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 13, p.159-166. DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. EATON, A.D., CLESCERI, L.S., RICE, E.W. & GREENBERG, A.E. (Eds). Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater, 21st Ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF), 2005. FRANK, J.F. & YOUSEF, A.E. Tests for groups of microrganisms. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 8, p.227-248. HATCHER, W.S., PARISH, M.E., WEIHE, J.L., SPLITTSTOESSER, D.F. & WOODWARD, B.B. Fruit beverages. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 58, p.565-568.

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HUNT, M.E. & RICE, E.W. Microbiological examination. In: EATON et al. (Eds), Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater, 21st Ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF), 2005. Part 9000, Section 9215, p.9.34-9.36. LAIRD, D.T., GAMBREL-LENARZ, S.A., SCHER, F.M. et al. Microbiological count methods. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 6, p.153-186. LEWIS, D., SPOMER, D., SMITH, M., CLARK, W. Milk and milk products standards. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 16, p.537-550. MORTON. R.D. Aerobic plate count. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D. C, 2001. Chapter 7, p.63-67. WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.). Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004.

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Captulo 7

Contagem de Bolores e Leveduras

7.1. INTRODUO
A maioria das informaes e orientaes contidas nesse captulo so da American Public Health Association (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium, foram tambm includas recomendaes da 17 Edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004), especficas para a anlise de produtos lcteos. Os bolores e leveduras constituem um grande grupo de microrganismos, a maioria originria do solo ou do ar. Os bolores so extremamente versteis, a maioria das espcies capaz de assimilar qualquer fonte de carbono derivada de alimentos. A maioria tambm indiferente com relao s fontes de nitrognio, podendo utilizar o nitrato, os ons de amnia e o nitrognio orgnico. Entretanto, se for necessrio utilizar as protenas ou os aminocidos como fonte tanto de nitrognio quanto de carbono, vrias espcies vo apresentar um crescimento limitado. As leveduras, de maneira geral, so mais exigentes do que os bolores. Muitas so incapazes de assimilar nitrato e carboidratos complexos, algumas exigem vitaminas e outras, como Zygosaccharomyces bailii, por exemplo, no conseguem utilizar a sacarose como nica fonte de carbono. Esses fatores, de uma certa forma, limitam a gama de alimentos susceptveis deteriorao por leveduras. Os bolores e leveduras so tambm bastante resistentes condies adversas, como pH cido e atividade de gua baixa. A maioria das leveduras apresenta atividade de gua mnima de crescimento na faixa de 0,88 e a maioria dos bolores na faixa de 0,80. Os bolores e leveduras capazes de crescer em atividades de gua abaixo do limite de 0,85 so chamados de xerfilicos, e aqueles que crescem em altas concentraes de sal so chamados halflicos. Com relao ao pH, os fungos so muito pouco afetados pela variao na faixa de 3,0 a 8,0. Vrios bolores que crescem abaixo de 2,0 e diversas leveduras abaixo de 1,5. Entretanto, quando o pH afasta-se do timo (geralmente prximo de 5,0) a velocidade de crescimento diminui e, se houver outros fatores de inibio (atividade de gua, temperatura, etc.), seu efeito restritivo sobre a velocidade de crescimento torna-se mais acentuado. A temperatura tima de crescimento da maioria dos fungos encontra-se na faixa de 25 a o 28 C, no crescendo bem nas temperaturas mesfilas (35-37oC) e raramente nas temperaturas de bactrias termotolerantes (45oC). Seu crescimento no incomum sob condies de refrigerao (5oC), porm, abaixo de 10oC negativos os alimentos podem ser considerados microbiologicamente estveis.

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Os bolores deteriorantes de alimentos, como quase todos os outros fungos filamentosos, exigem oxignio para crescimento, podendo ser considerados aerbios estritos. No entanto, vrias espcies, so eficientes em utilizar pequenas quantidades de oxignio, de forma que o efeito do O2 dependente da quantidade absoluta dissolvida no substrato, e no da concentrao presente na atmosfera. Ao contrrio dos bolores, muitas espcies de leveduras so capazes de crescer na completa ausncia de O2 e em diferentes concentraes de CO2. Isso as torna os deteriorantes mais comuns de alimentos lquidos engarrafados, nos quais o crescimento dos bolores limitado pela disponibilidade de oxignio. Eventualmente, algumas espcies de bolores dos gneros Mucor, Rhizopus, Byssochlamys e Fusarium podem crescer nesses produtos, provocando deteriorao. A consistncia do alimento, assim como a atmosfera de armazenamento, exerce uma considervel influncia sobre os tipos de fungos que iro provocar a deteriorao do produto. Em linhas gerais, as leveduras predominam em alimentos lquidos, porque so unicelulares e se dispersam mais facilmente em lquidos. Alm disso, substratos lquidos oferecem maior oportunidade para desenvolvimento de condies anaerbias, ideais para as leveduras fermentativas. Os bolores, ao contrrio, so favorecidos por substratos slidos firmes, em cuja superfcie h fcil acesso ao oxignio. Por outro lado, essa afirmao no deve ser entendida como absoluta, sugerindo que leveduras no possam deteriorar alimentos slidos ou bolores alimentos lquidos. Simplesmente, as leveduras so mais competitivas em lquidos, provocando alteraes percebidas mais fcil ou rapidamente. Os fungos infecciosos raramente so associados aos alimentos, porm, certas leveduras de origem alimentar podem desencadear reaes alrgicas e alguns bolores podem provocar infeces em indivduos imunodeprimidos. Vrios bolores produzem micotoxinas, que so metablitos txicos formados durante o crescimento. Os gneros de bolores toxignicos mais importantes so Aspergillus, Penicillium e Fusarium.

Mtodos de anlise de bolores e leveduras totais


A quantificao de bolores e leveduras em alimentos feita pelo mtodo de contagem padro em placas, determinando-se o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC). O mtodo mais recomendado o plaqueamento em superfcie, para aumentar a exposio ao oxignio e evitar o stress causado pelo meio de cultura quente. Vrios meios podem ser utilizados: O Captulo 20 do Compendium (Beuchat & Cousin, 2001) recomenda o gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos com atividade de gua superior a 0,95 e o gar Dicloran Glicerol 18 (DG18), para alimentos de atividade de gua menor ou igual a 0,95. O DRBC contm cloranfenicol, para inibir bactrias, alm de dicloran e rosa de bengala, para restringir o espalhamento da colnia. O DG18, alm de cloranfenicol e dicloran, contm tambm glicerol, que reduz a atividade de gua do meio. O Captulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) recomenda o DRBC para produtos lcteos em geral e o gar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC) para amostras com predomnio de leveduras ou com leveduras injuriadas pelo processamento. Nesses produtos o DRBC recupera menos leveduras do que o YEGC. Para produtos no submetidos a tratamento trmico, acidificao ou outro tratamento que possa provocar injrias s clulas, pode tambm ser utilizado gar Batata Dextrose Acidificado (PDA-AC), porm, algumas bactrias podem crescer neste meio (Taniwaki et al., 1999). Outros mtodos j oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) so os kits analticos descritos na Tabela 7.1. 100

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Contagem de Bolores e Leveduras

Tabela 7.1. Kits analticos oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para a contagem bolores e leveduras em alimentos.

Fabricante 3M Microbiology Products BioControl Systems Inc.

Nome do kit Petrifilm Yeast and Mold Count Plate SimPlate Yeast and Mold Color Indicator (YM-CI)

Validao AOAC Official Method 997.02 AOAC Official Method 2002.11

Aplicao Alimentos Alimentos, ingredientes e amostras ambientais

Fonte: AOAC International, disponvel no site <http://www.aoac.org/testkits/kits-microbiology.htm>, acesso em 10/02/06.

Fungos psicrotrficos
Os bolores e leveduras tambm apresentam cepas psicrotrficas, embora sejam menos estudadas do que as bactrias. Os fungos predominam em alimentos refrigerados, com baixa atividade de gua, alta acidez ou condies de embalagem que inibam bactrias, incluindo, frutas, gelias e produtos fermentados (iogurte, queijos, embutidos, etc.). Os gneros de leveduras mais encontrados so Candida, Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Kluveromyces, Pichia, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis e Trichosporon. Os bolores so Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Geotrichum, Monascus, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sporotrichum, Thamnidium e Trichothecium. O mtodo tradicional de quantificao de psicrotrficos em alimentos contagem padro em placas, determinando-se o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) de aerbios por grama ou mililitro. Os meios utilizados so o gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos em geral (pode ser substitudo pelo PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol) e o gar Dicloran Glicerol 18 (DG18), para alimentos com atividade de gua menor que 0,95. A temperatura de incubao de 71oC por 10 dias ou 171oC por 16 horas, seguido de mais 3 dias a 71oC.

Bolores termorresistentes
Os fungos, de maneira geral, apresentam baixa resistncia ao calor, sendo destrudos com relativa facilidade por tratamentos trmicos brandos. H, entretanto, excees, pois certos fungos filamentosos do sub-reino Ascomycotina produzem esporos sexuais (ascosporos), capazes de sobreviver aos tratamentos trmicos. As espcies conhecidas so Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Neosartoria fisheri, Talaromyces flavus, Talaromyces bacillisporus e Eupenicillium brefeldianum, cujos ascosporos podem apresentar resistncia trmica comparvel dos esporos bacterianos. Os ascosporos de B. fulva tem valor D90C de 1 a 12 min (Bayne & Michener, 1979) e valor z entre 6 e 7C (King et al., 1969). A resistncia trmica de B nivea ligeiramente inferior, com D88C de 0,75 a 0,8min e valor z entre 6 e 7C (Casella et al., 1990) e a de N. fischeri similar de B. fulva (Splittstoesser & Splittstoesser, 1977). Os bolores termorresistentes so mais comumente associados com a deteriorao de frutas e seus derivados, processados termicamente. Sua sobrevivncia ao tratamento trmico pode resultar em crescimento com formao de miclios e, no caso de Byssochlamys, na completa alterao da textura, devido produo de pectinases. 101

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Os bolores termorresistentes so amplamente distribudos no solo, porm, o nmero de esporos em frutas geralmente baixo, no excedendo 1-10/100g ou ml dos produtos processados. Ainda assim, na etapa imediatamente anterior ao tratamento trmico, a presena de apenas cinco esporos/g de produto j considerada um problema srio. Em alimentos processados assepticamente em altas temperaturas por curto tempo (UHT ou HTST), sem adio de conservantes, mesmo contagens ainda mais baixas so inaceitveis. Por essa razo, o sucesso da deteco depende da coleta de amostras significativamente maiores do que as normalmente requeridas nas demais anlises de alimentos. Essas amostras podem ser congeladas antes da anlise, porque os esporos no so afetados pelo congelamento. A deteco baseada no tratamento trmico das amostras, para eliminao das clulas vegetativas de bolores, leveduras e bactrias, seguido do plaqueamento em um meio adequado ao crescimento de bolores, como o gar Batata Dextrose (PDA) ou o gar Extrato de Malte (MEA).

7.2. MTODO DE CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS EM PLACAS


Mtodo da American Public Health Association (APHA), descrito no Captulo 20 da 4 Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Beuchat & Cousin, 2001). Includas tambm as recomendaes especficas do Captulo 52 do Compendium (Gray & Pinkas, 2001) para a anlise de gomas, pectina e celulose e as do Captulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) especficas para a anlise de produtos lcteos. Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as orientaes do Captulo 3, que apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de microrganismos em placas, da seleo das diluies ao clculo dos resultados. O procedimento descrito abaixo no apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
o

7.2.1.MATERIAL REQUERIDO PARA ANLISE Preparaco da amostra e diluies seriadas Diluente: gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Tubos de diluio com 9ml de gua Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) Pipetas de 1 ou 2ml Observao: consultar o Anexo 2.2 do Captulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em funo da amostra analisada. Contagem por plaqueamento em superfcie Placas de gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) (para alimentos com atividade de gua maior que 0,95 e produtos lcteos em geral) Placas de gar Dicloran Glicerol 18 (DG-18) (para alimentos com atividade de gua menor ou igual a 0,95, exceto produtos lcteos) Placas de gar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC) opcional para produtos lcteos com predomnio de leveduras ou com leveduras injuriadas)

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Contagem de Bolores e Leveduras

Ala de espalhamento (ala de Drigalski) mergulhada em etanol 70% Estufa incubadora regulada entre 22 e 25oC (251C para produtos lcteos) com termmetro calibrado 7.2.2. PROCEDIMENTO O esquema geral de anlise para contagem de bolores e leveduras em placas encontra-se descrito na Figura 7.1.
Homogeneizao 10
-1

1ml

10

-2

1ml

10

-3

9ml H20p 25g de amostra + 225ml de gua Peptonada (H20p)

9ml H20p

0,1ml

0,1ml

0,1ml

DRBC ou DG 18

gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) ou gar Dicloran Glicerol 18 (DG 18) Plaqueamento em superfcie 22-25oC/5 dias

DRBC ou Dg18

Colnias presuntivas de leveduras 5 colnias Colnias tpicas de bolores Observao microscpica da morfologia das clulas % de colnias confirmadas

CONTAGEM DE BOLORES (UFC/g)

CONTAGEM DE LEVEDURAS (UFC/g)

Somatrio

CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS (UFC/g)

Figura 7.1. Esquema geral de anlise para contagem de bolores e leveduras em placas (Beuchat & Cousin, 2001). DRBC = gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol, DG18 = gar Dicloram Glicerol 18

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a) Preparao das amostras e diluies seriadas Seguir os procedimentos descritos no Captulo 2. Para alimentos de umidade intermediria, manter a amostra de molho no diluente por um certo perodo de tempo, para amolecer o produto e facilitar a liberao dos microrganismos presentes. b) Inoculao Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular (plaqueamento em superfcie) 0,1ml de cada diluio em placas previamente preparadas e secadas, de um dos seguintes meios de cultura: gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos com atividade de gua maior que 0,95 e produtos lcteos em geral. gar Dicloran Glicerol 18 (DG-18), para alimentos com atividade de gua menor ou igual a 0,95, exceto produtos lcteos. No caso da anlise de matrias primas destinadas formulao de produtos com atividade de gua maior que 0,95, para verificar a contagem de potenciais deteriorantes do produto final, utilizar o gar DRBC. gar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC), opcional para produtos lcteos com predomnio de leveduras ou com leveduras injuriadas. gar Batata Dextrose Acidificado, opcional para produtos lcteos no submetidos ao calor, acidificao ou outro tratamento que possa provocar injrias s clulas Espalhar o inculo com uma ala de Drigalski, das placas de maior para as placas de menor diluio, at que todo o excesso de lquido seja absorvido. Se as contagens estimadas na amostra forem menores do que 100/g ou ml, inocular 1ml da primeira diluio, distribuindo o volume por quatro placas, trs com 0,3ml e uma com 0,1ml.
Nota b1) Na anlise de espessantes (gomas, pectina, celulose) a diluio inicial deve ser maior do que 1:10, em funo da viscosidade desses produtos. Se as contagens esperadas so baixas, pode ser feito o plaqueamento direto de 1g da amostra na placa, espalhando o material por toda a superfcie (Gray & Pinkas, 2001). Nota b.2) Antes do uso, estocar as placas de DRBC ou DG-18 em geladeira, protegidas contra a luz, para evitar a fotodegradao do rosa de bengala, com formao de compostos inibidores para os bolores e leveduras.

c) Incubao Aguardar que as placas sequem (mnimo 15 minutos) e incubar a 22-25oC por cinco dias, sem inverter, em pilhas de no mais de trs placas, no escuro. Recomenda-se no contar as colnias antes de cinco dias, porque a movimentao das placas pode resultar em crescimento secundrio (devido ao deslocamento de esporos), invalidando a contagem final.
Nota c.1. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) recomenda incubao a 251oC por 50,5 dias para a anlise de produtos lcteos. Nota c.2) A International Commission on Food Mycology (ICFM) recomenda incubao a 25oC/5 dias como condio padro. Em regies tropicais, recomenda 30oC/5 dias para produtos estocados temperatura ambiente (Pitt & Hocking, 1997).

d) Contagem das colnias e clculo dos resultados Para a contagem de colnias e clculo dos resultados, selecionar as placas com 15 a 150 colnias e contar as colnias com o auxlio de uma lupa, em um contador de colnias.

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Contagem de Bolores e Leveduras

Na placa selecionada, contar separadamente as colnias com aspecto filamentoso, cotonoso ou pulverulento, caractersticas de bolores, anotando o resultado. Na mesma placa, contar as demais colnias, que podem ser de leveduras ou de bactrias, eventualmente capazes de crescer. Selecionar pelo menos cinco dessas colnias e verificar a morfologia das clulas ao microscpio, observando se a cultura de leveduras, bactrias ou mistura de ambas. Para isso, pode ser feita uma montagem mida ou uma colorao de Gram, conforme procedimento descrito no Captulo 5. Considerar como confirmadas todas as colnias que apresentarem leveduras ou mistura de leveduras e bactrias. Determinar o nmero de colnias de leveduras na placa em funo da porcentagem confirmada. Por exemplo, de 30 colnias contadas, cinco foram submetidas confirmao e trs foram confirmadas como leveduras (60%). Ento, o numero de colnias de leveduras na placa de 30x0,6=18. O clculo dos resultados deve ser feito de acordo com as orientaes do Captulo 3. Para calcular o nmero de UFC/g ou ml de bolores, multiplicar o nmero de colnias tpicas de bolores por dez e pelo inverso da diluio. Para calcular o nmero de UFC/g ou ml de leveduras, multiplicar o nmero de colnias confirmadas como leveduras por dez e pelo inverso da diluio. Para calcular o nmero total de bolores e leveduras, somar o nmero de colnias de bolores e o nmero de colnias confirmadas como leveduras e multiplicar por dez e pelo inverso da diluio. Exemplo - Diluio 10-2 (inoculados 0,1ml) - Total de colnias tpicas de bolores na placa = 30 - Colnias presuntivas de leveduras na placa = 40, cinco submetidas confirmao, quatro confirmadas (80%) - Total de colnias de leveduras na placa = 40x0,8 = 32 - UFC/g ou ml de bolores = 30x102x10 = 3,0x104. - UFC/g ou ml de leveduras = 32x102x10 = 3,2x104. - UFC/g ou ml de bolores e leveduras = (30+32)x102x10 = 6,2x104.

7.3. MTODO DE CONTAGEM DE FUNGOS PSICROTRFICOS


Mtodo da American Public Health Association (APHA), descrito no Captulo 13 da 4 Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Cousin et al., 2001). O esquema geral de anlise para contagem de fungos psicrotrficos em placas encontra-se descrito na Figura 7.2. Segue o mesmo procedimento da contagem total de bolores e leveduras, alterando a condio de incubao, que pode ser 71oC por 10 dias ou 171oC por 16 horas, seguido de mais 3 dias a 71oC. Na preparao das amostras, a homogeneizao em stomacher mais indicada do que em liqidificador, que pode favorecer a fragmentao dos miclios, alterando a contagem. Se for necessrio usar liqidificador, no ultrapassar dois minutos de homogeneizao. Os meios recomendados so o gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos em geral (pode ser substitudo pelo PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol) e o gar Dicloran Glicerol 18 (DG-18), para alimentos com atividade de gua menor que 0,95).
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Homogeneizao

10

-1

1 ml

10

-2

1 ml

10

-3

9ml H20p 25g de amostra + 225ml de gua Peptonada (H20p)

9ml H20p

0,1ml

0,1ml

0,1ml

DRBC ou DG18

gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) ou gar Dicloran Glicerol 18 (DG18) Plaqueamento em superfcie

DRBC ou DG18

71oC /10 dias ou 171oC/16h seguido de 71oC/3 dias

Colnias presuntivas de leveduras 5 colnias Colnias tpicas de bolores Observao microscpica da morfologia das clulas % de colnias confirmadas CONTAGEM DE BOLORES PSICROTRFICOS (UFC/g) CONTAGEM DE LEVEDURAS PSICROTRFICAS (UFC/g)

Somatrio

CONTAGEM TOTAL DE FUNGOS PSICROTRFICOS (UFC/g)

Figura 7.2. Esquema geral de anlise para contagem de fungos psicrotrficos em placas (Cousin et al., 2001). DRBC = gar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol, DG18 = gar Dicloram Glicerol 18

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Contagem de Bolores e Leveduras

7.4. MTODO DE CONTAGEM DE BOLORES TERMORRESISTENTES


Mtodo da American Public Health Association (APHA), descrito no Captulo 21 da 4o Edio do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Beuchat & Pitt, 2001). 7.4.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANLISE gua destilada estril Liquidificador ou stomacher e bolsas estreis para homogeneizao da amostra gar Batata Dextrose (PDA) com Antibiticos ou gar Extrato de Malte (MEA) com Antibiticos, em concentrao 1,5 Tubos de 200x30mm ou Erlenmeyers de 250ml Placas de Petri estreis de dimetro 150 mm Banho-maria fechado regulado a 75-80oC e termmetro calibrado Estufa incubadora regulada a 301oC e termmetro calibrado 7.4.2. PROCEDIMENTO Ateno. Todas as etapas da anlise para deteco de bolores termorresistentes devem ser realizadas em capela de fluxo laminar, para evitar a contaminao acidental da amostra por bolores do ambiente. a) Choque trmico a.1) Para a anlise de frutas ou polpas contendo pedaos de frutas, pesar 100g da amostra em um copo de liquidificador estril, adicionar 100ml de gua destilada estril e homogeneizar por 5min ou pelo tempo necessrio para obter uma suspenso homognea. Colocar o copo em uma bolsa plstica estril e transferir para um banho-maria fechado, com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. Manter no banho por 90min, garantindo que a superfcie do produto permanea abaixo da superfcie da gua do banho. Alternativamente, pesar 100g da amostra em uma bolsa plstica estril, adicionar 100ml de gua destilada estril e homogeneizar em stomacher, por 2-4min. Aps a homogeneizao, transferir duas pores de 50ml para tubos de 200x30mm e colocar os tubos em um banho-maria fechado, com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. Manter no banho por 30min, garantindo que a superfcie do produto permanea abaixo da superfcie da gua do banho. a.2) Para a anlise de sucos de frutas no concentrados (Brix < 35o), transferir trs pores de 50ml da amostra para tubos de 200x30mm e utilizar um dos tubos para ajustar o pH em 3,4-3,6, com NaOH 10%. Anotar o volume de NaOH consumido no ajuste e adicionar assepticamente, aos dois demais tubos, igual quantidade de NaOH 10% estril. Descartar o tubo manuseado e transferir os dois demais para um banho fechado, com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. Manter no banho por 30min, garantindo que a superfcie do produto permanea abaixo da superfcie da gua do banho. a.3) Para a anlise de sucos de frutas concentrados (Brix > 35o), pesar 100g da amostra em uma bolsa plstica estril, adicionar 200ml de gua destilada estril e homogeneizar em stomacher. Aps a homogeneizao, transferir trs pores de 50ml para tubos de 107

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200x30mm, ajustar o pH e continuar a anlise da mesma forma descrita para sucos no concentrados. b) Inoculao Distribuir as pores de 100ml em oito placas de Petri grandes (150mm de dimetro) ou as pores de 50ml em quatro placas. Adicionar a cada placa, 10ml de gar Batata Dextrose (PDA) ou gar Extrato de Malte (MEA) com antibiticos e com 1,5 vezes a concentrao normal. Misturar bem a amostra com o meio de cultura e aguardar solidificar.
Nota b.1) Pitt & Hocking (1997) descrevem o seguinte procedimento alternativo: Pesar 100g da amostra em um saco de stomacher ou duas pores de 50g em tubos de 200x30mm ou Erlenmaeyers de 250ml. Amostras lquidas com Brix > 35o devem ser diludas, na proporo 1:1, com gua peptonada 0,1%, antes do aquecimento. Amostras muito cidas, devem ter seu pH ajustado em 3,5 a 4,0 com NaOH 10%. Colocar os tubos ou o saco de stomacher com a amostra num banho fechado, com a temperatura controlada 80oC. Manter no banho por 30min, garantindo que a superfcie do produto permanea abaixo da superfcie da gua do banho. Aps o choque trmico, misturar a amostra com 100ml de gar Batata Dextrose (PDA) ou gar Extrato de Malte (MEA), em dupla concentrao, com antibiticos, previamente fundido e resfriado a 50-60oC. Homogeneizar bem e distribuir em cinco placas de Petri estreis, vazias, aguardando a completa solidificao.

c) Incubao Transferir as placas para uma bolsa plstica estril, fechar bem a bolsa, para evitar o ressecamento do meio de cultura e incubar a 30C por at 30 dias, examinando semanalmente. A maioria dos esporos viveis normalmente germinar e formar colnias visveis em 7-10 dias, porm, esporos injuriados pelo calor podero requerer um perodo adicional para desenvolver colnias. d) Clculo dos resultados Contar as colnias desenvolvidas em todas as placas e calcular o resultado como nmero de esporos/100g ou ml.

7.5. REFERNCIAS
BAYNE, H.G. & MICHENER, H.D., 1979. Heat resistance of Byssochlamys ascospores. Appl. Environ. Microbiol. 37:449-453. BEUCHAT, L.R. & COUSIN, M.A. Yeasts and molds. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th Ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 20, p.209-215. BEUCHAT, L.R. & PITT, J.I. Detection and enumeration of heat resistant molds. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th Ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 21, p.217-222. CASELLA, M.L.A., MATASCI, F & SCHMIDT-LORENZ, W., 1990. Influence of age, growth medium, and temperature on heat resistance of Byssochlamys nivea ascospores. Lebensm. Wiss. Technol. 23:404-411. COUSIN, M.A., JAY, J.M. & VASAVADA, P.C. Psychrotrophic microrganisms. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th Ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 13, p.159-166.

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Contagem de Bolores e Leveduras

DOWNES, F. P. & ITO, K (eds.). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 2001. FRANK, J.F. & YOUSEF, A.E. Tests for groups of microrganisms. In: WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th Ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004. Chapter 8, p.227-248. GRAY, R.J.H. & PINKAS, J.M. Gums and spices. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th Ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2001. Chapter 52, p.533-540. KING, A.D., MICHENER, H.D. & ITO, K.A., 1969. Control of Byssochlamys and related heat-resistant fungi in grape products. Appl. Microbiol. 18:166-173. PITT, J.I. & HOCKING, A.D. (eds). Fungi and Food Spoilage, 2nd Ed. Blackie Academic & Professional, London, 1997. SPLITTSTOESSER, D.F. & SPLITTSTOESSER, C.M., 1977. Ascospores of Byssochlamys fulva compared with those of heat resistant Aspergillus. J. Food Sci. 42:685-688. TANIWAKI, M.H.; IAMANAKA, B.T. & BANHE, A.A. Comparison of culture media to recover fungi from flour and tropical fruit pulp. Journal of Food Mycology, 2: 291-302, 1999. WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.). Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 17th ed. American Public Health Association, Washington, D. C., 2004.

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