Replicao de DNA

Replicao de DNA
Dupla
Dupla
-
-
hlice composta
hlice composta
de
de
nucleotdeos ligados
nucleotdeos ligados
entre si
entre si
e
e
cujas
cujas
bases
bases
nitrogenadas
nitrogenadas
de
de
uma
uma
hlice fazem
hlice fazem
pontes de
pontes de
hidrognio
hidrognio
com bases
com bases
nitrogenadas
nitrogenadas
de
de
outra
outra
hlice
hlice
,
,
numa direo
numa direo
anti
anti
-
-
paralela
paralela
.
.
DNA
DNA
Replicao do DNA
Processo que precede a divis
Processo que precede a divis

o celular e atrav
o celular e atrav

s do qual s
s do qual s

o
o
geradas c
geradas c

pias
pias
id
id

nticas
nticas
das mol
das mol

culas de DNA presentes

culas de DNA presentes
na c
na c

lula
lula
-
-
m
m

e, a seguir herdadas pelas duas c

e, a seguir herdadas pelas duas c

lulas
lulas
-
-
filhas
filhas
Duplicao dos
cromossomos
Diviso celular
Separao dos
cromossomos
Cada vez que uma Cada vez que uma
clula divide a clula divide a
informao informao
gentica precisa gentica precisa
ser transmitida s ser transmitida s
clulas filhas clulas filhas
formao de formao de
gametas para gametas para
transmisso da transmisso da
informao informao
para a prxima para a prxima
gerao gerao
Ciclo Celular
Ciclo Celular
Antes de iniciar a Antes de iniciar a
condensao dos condensao dos
cromossomos o DNA cromossomos o DNA
necessita ser duplicado : necessita ser duplicado :
a fase S a fase S
Experimento Experimento de de Meselson Meselson & Stahl, 1958 & Stahl, 1958
A pergunta A pergunta
Cultivo de bactrias Cultivo de bactrias
em meio contendo em meio contendo
15 15
NH NH
4 4
Cl, Cl,
Istopo Istopo pesado de N pesado de N
Transferncia para Transferncia para
meio contendo meio contendo
14 14
NH NH
4 4
Cl Cl
Extrao e purificao do DNA Extrao e purificao do DNA
seguida de centrifugao em seguida de centrifugao em
gradiente de gradiente de CsCl CsCl
Molcula parental
Primeira gerao de
molculas filhas
Segunda gerao de
molculas filhas
Experimento Experimento de de Meselson Meselson & Stahl, 1958 & Stahl, 1958
A resposta A resposta
Replicao
Replicao
do DNA
do DNA
-
-
caractersticas
caractersticas

Sntese de DNA
Sntese de DNA
semi
semi
-
-
conservativa
conservativa
Fita 1 parental
Fita 2 parental
Fita 1
parental
Fita 2
parental
Fita 2
filha
Fita 1
filha
Replicao
Replicao
do
do
cromossomo
cromossomo
bacteriano
bacteriano
Experimento Experimento de J. Cairns, 1963 de J. Cairns, 1963
Cultivo de bactrias Cultivo de bactrias
em meio contendo em meio contendo
Trtio ( Trtio (
3 3
H), H), istopo istopo
radioativo de H radioativo de H
Isolamento do DNA, Isolamento do DNA,
espalhamento em espalhamento em
emulso fotogrfica emulso fotogrfica
Observao em Observao em
microscpio eletrnico microscpio eletrnico
Replicao
Replicao
do DNA
do DNA
-
-
caractersticas
caractersticas

Comea numa
Comea numa
origem de
origem de
replicao (
replicao (
Ori
Ori
) e
) e
bidirecional
bidirecional
O genoma bacteriano circular constitui um
O genoma bacteriano circular constitui um
nico
nico
replicon
replicon
A velocidade da forquilha de replicao A velocidade da forquilha de replicao
bacteriana bacteriana 50.000 50.000 pb/min pb/min
Um nica origem de replicao em Um nica origem de replicao em E. E.coli coli
( (OriC OriC, 245 pb) , 245 pb)
Forquilha de replicao
Forquilha de replicao
Regio do DNA onde ocorre a transio do DNA parental fita dupla Regio do DNA onde ocorre a transio do DNA parental fita dupla para as para as
novas fitas filhas duplas novas fitas filhas duplas
O genoma eucaritico possui
O genoma eucaritico possui
vrios
vrios
replicons
replicons
A velocidade da forquilha de replicao eucaritica A velocidade da forquilha de replicao eucaritica 2.000 2.000 pb/min pb/min
Os Os replicons replicons eucariticos tem 40 eucariticos tem 40- -100 kb e so iniciados em tempos diferentes 100 kb e so iniciados em tempos diferentes
Fase S demora ~ 6hrs em uma clula somtica Fase S demora ~ 6hrs em uma clula somtica
Replicon
Replicon
Unidade do DNA onde est ocorrendo um evento de replicao Unidade do DNA onde est ocorrendo um evento de replicao
Origem + Trmino Origem + Trmino
Ativados apenas uma nica vez em cada ciclo celular Ativados apenas uma nica vez em cada ciclo celular
O genoma de uma O genoma de uma clula procaritica clula procaritica possui um possui um nico nico replicon replicon
Cada Cada cromossomo eucaritico cromossomo eucaritico possui possui vrios vrios replicons replicons e todos so e todos so
ativados uma nica vez no ciclo celular ainda que no ativados uma nica vez no ciclo celular ainda que no
simultaneamente simultaneamente
Primeiro passo
Primeiro passo
:
:
abrir
abrir
o DNA (
o DNA (
forquilha
forquilha
de
de
replicao
replicao
) e
) e
manter
manter
as
as
fitas separadas
fitas separadas
O que dirige a escolha do nucleotdeo a ser adicionado fita a
especificidade A-T/C-G e o alongamento ocorre somente no
sentido 5 3, devido necessidade de um grupamento 3OH
livre para formao da ligao fosfodister
DNA ou
iniciador RNA
DNA polimerase
Fita de DNA
molde
Desoxiribonucleosdeo Desoxiribonucleosdeo
5trifosfato 5trifosfato
(substrato) (substrato)
Fita sendo Fita sendo
polimerizada polimerizada
Fita molde Fita molde
Sntese da cadeia de DNA envolve a formao
Sntese da cadeia de DNA envolve a formao
das ligaes
das ligaes
fosfodister
fosfodister
A ligao fosfodister se d entre o grupamento 3OH de um
nucleotdeo j existentes na fita e o grupamento 5P do
nucleotdeo livre
iniciador
trifosfato
de guanosina
Fita de DNA molde
Fita de DNA molde
iniciador
Na formao da ligao fosfodister liberado um grupo
pirofosfato rico em energia
Fita de DNA molde
iniciador
Liberao de pirofosfato
DNA sintetizado por DNA sintetizado por
DNA
DNA
polimerases
polimerases
DNA DNA polimerase polimerase I foi isolada a I foi isolada a
partir de E. partir de E.coli coli em 1955 por A. em 1955 por A.
Kornberg Kornberg
As DNA As DNA polimerases polimerases necessitam necessitam
sempre de um sempre de um DNA molde DNA molde e uma e uma
sequncia sequncia iniciadora. iniciadora.
O substrato da sntese o O substrato da sntese o
desoxiribonucleosdeo desoxiribonucleosdeo 5 5- -trifosfato. trifosfato.
A sntese de DNA ocorre pela A sntese de DNA ocorre pela
adio de nucleotdeos a adio de nucleotdeos a
extremidade 3OH extremidade 3OH da cadeia em da cadeia em
crescimento. crescimento.
Sentido da sntese Sentido da sntese sempre sempre
5 5 3. 3.
Replicao
Replicao
do DNA
do DNA
-
-
caractersticas
caractersticas

Sntese de DNA procede

Sntese de DNA procede
na direo 5
na direo 5
-
-
3
3
A replicao se d nas duas fitas ao mesmo tempo, porm A replicao se d nas duas fitas ao mesmo tempo, porm
em sentidos opostos em sentidos opostos
DNA parental
Fita contnua
Fita descontnua
No caso da sntese da fita descontnua, iniciadores de RNA No caso da sntese da fita descontnua, iniciadores de RNA
so produzidos ao longo de todo o processo pela so produzidos ao longo de todo o processo pela primase primase
Fita contnua
Fita descontnua
Iniciador Iniciador
de de RNA RNA
Observe o alongamento das duas fitas em sentidos opostos Observe o alongamento das duas fitas em sentidos opostos
Fita contnua
Fita descontnua
Os fragmentos sintetizados na fita descontnua so Os fragmentos sintetizados na fita descontnua so
chamados de fragmentos de chamados de fragmentos de Okazaki Okazaki e so ligados e so ligados
enzimaticamente enzimaticamente para gerar uma fita contnua para gerar uma fita contnua
Fita contnua
F
i
t
a

d
e
s
c
o
n
t

n
u
a
Fragmento de
Okazaki
Fita com sntese contnua
Fita com sntese descontnua
Fragmentos de Fragmentos de Okazaki Okazaki: :
Bactria: Bactria: 1.000 a 2.000 1.000 a 2.000 pb pb
Eucariotos Eucariotos: : 150 a 200 150 a 200 pb pb
Sntese de DNA ocorre
Sntese de DNA ocorre
sempre
sempre
na direo
na direo
5
5

3
3

e
e

semi
semi
-
-
descont
descont

nua
nua
As sub
As sub
-
-
unidades Beta da DNA
unidades Beta da DNA
-
-
polimerase
polimerase
envolvem a
envolvem a
dupla hlice formada durante a replicao
dupla hlice formada durante a replicao
Dupla - hlice
nascente
Sub-unidades beta da Pol
PRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAO PRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAO
DNA polimerase
DNA polimerase
protena ligante
de DNA
Protenas presentes na origem de Replicao de E.coli
DnaA Reconhece a origem oriC e abre a dupla fita em stios
especficos
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
DnaC Auxilia a ligao de DnaB na origem
HU Protena do tipo histona que estimula a iniciao
Primase (DnaG) Sintetiza os iniciadores de RNA
Single strand binding
(SSB)
Liga a fita simples de DNA
RNA polimerase Facilita a ao da DnaA
DNA girase
(topoisomerase)
Alivia a tenso torsional gerada pela abertura da dupla-fita
Dam Metilase Metila as sequncias GATC na OriC
Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
Pol I Pol II Pol III
Polimerizao 5 3 + + +
Exonuclease 3 5 + + +
Exonuclease 5 3 + - -
Nmero de subunidades 1 4 10
Velocidade de
Polimerizao(nt/seg) 16-20 40 250-1.000
Processividade 3-200 1.500 500.000
(nt adicionados antes
da dissociao da fita-molde)
Reparo (Pol IV e V) Principal enzima de
replicao em E.coli
Atividade exonuclease 5 3,
responsvel pelo processo de remoo dos iniciadores de RNA
A DNA
A DNA
-
-
polimerase
polimerase
III
III
multimrica
multimrica
, formada por mais
, formada por mais
de 10 cadeias, com uma simetria
de 10 cadeias, com uma simetria
dimrica
dimrica
Fita na qual ocorre Fita na qual ocorre
a sntese contnua a sntese contnua
Fita na qual ocorre a Fita na qual ocorre a
sntese descontnua sntese descontnua
As sub As sub- -unidades unidades mant mant m a m a
estrutura estrutura dim dim rica rica
6 sub 6 sub- -unidades unidades 6 sub 6 sub- -unidades unidades
Inicia
Inicia

o
o
-
-
1
1

est
est

gio
gio
da
da
replica
replica

o
o
em
em
E.
E.
coli
coli
Estrutura da origem de replicao bacteriana Estrutura da origem de replicao bacteriana ori ori C C
A origem de replicao A origem de replicao Ori Ori C C extremamente conservada extremamente conservada. .
sequncias sequncias repetidas com 9 e 13 bases, repetidas com 9 e 13 bases, ricas em A ricas em A- -T T so so
reconhecidas por > 9 enzimas diferentes. reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.
enriquecida enriquecida na na sequncia sequncia palindrmica palindrmica GATC, alvo de GATC, alvo de metilao metilao
enzimtica enzimtica na adenina . na adenina .
Origem de Replicao em bactrias
Origem de Replicao em bactrias
Somente origens completamente Somente origens completamente metiladas metiladas podem iniciar a replicao podem iniciar a replicao
Elongao
Elongao
-
-
2
2


estgio
estgio
da
da
replicao
replicao
Replicao do DNA
Replicao do DNA
-
-
Resumo
Resumo
Replicao do DNA semi-conservativa
Replicao bi-direcional.
Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 replicon,
cromossomos eucariotos possuem vrios amplicons.
O DNA sintetizado por DNA polimerase, uma enzima multimrica,
A sntese ocorre sempre no sentido 5 - 3, com atividade revisora
3- 5.
A sntese contnua em uma das fitas e descontnua na fita oposta
Um complexo de mais 9 enzimas est envolvido na iniciao,
elongao e terminao da replicao.
Replicao do DNA semi Replicao do DNA semi- -conservativa conservativa
Replicao bi Replicao bi- -direcional. direcional.
Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 replicon replicon, ,
cromossomos cromossomos eucariotos eucariotos possuem vrios possuem vrios amplicons amplicons. .
O DNA sintetizado por DNA O DNA sintetizado por DNA polimerase polimerase, uma enzima , uma enzima multimrica multimrica, ,
A sntese ocorre sempre no sentido 5 A sntese ocorre sempre no sentido 5 - - 3, com atividade revisora 3, com atividade revisora
3 3- - 5. 5.
A sntese contnua em uma das fitas e descontnua na fita op A sntese contnua em uma das fitas e descontnua na fita oposta osta
Um complexo de mais 9 enzimas est envolvido na iniciao, Um complexo de mais 9 enzimas est envolvido na iniciao,
elongao e terminao da replicao. elongao e terminao da replicao.
Geometria do pareamento das
Geometria do pareamento das
bases contribui para a fidelidade
bases contribui para a fidelidade
da replicao do DNA
da replicao do DNA
Pareamento correto
Pareamento incorreto
T T
A A
C C
G G
T T
A A
A A
C C
G G
G G
Atividade revisora (atividade
Atividade revisora (atividade
exonuclease
exonuclease
3
3

5)
5)
garante a fidelidade da replicao
garante a fidelidade da replicao
Reparo
Reparo
do DNA
do DNA
-
-

Mismatch repair
Mismatch repair

-
-
Reparo por Excis
Reparo por Excis

o de Bases
o de Bases
-
-
Reparo por Excis
Reparo por Excis

o de Nucleot
o de Nucleot

deos
deos
-
-
Reparo Direto
Reparo Direto
-
-
Reparo por Recombina
Reparo por Recombina

o
o

Mismatch repair
Mismatch repair

:
:
Corrige erros de replica
Corrige erros de replica

o
o
Reparo
Reparo
do DNA
do DNA
Reparo por Excis
Reparo por Excis

o
o
de Bases:
de Bases:
Remove a Uracila
Remove a Uracila
(citosina alterada)
(citosina alterada)
Reparo
Reparo
do DNA
do DNA
Uracila Uracila
Citosina Citosina
Reparo por
Reparo por
Excis
Excis

o de
o de
Nucleot
Nucleot

deos :
deos :
Remove o
Remove o
nucleot
nucleot

deo
deo
Reparo
Reparo
do DNA
do DNA
Reparo Direto :
Reparo Direto :
N
N

o h
o h

remo
remo

o de nucleot
o de nucleot

deos
deos
Reparo
Reparo
do DNA
do DNA
Reparo por
Reparo por
Recombina
Recombina

o :
o :
Usa
Usa
-
-
se uma outra
se uma outra
mol
mol

cula de DNA
cula de DNA
Reparo
Reparo
do DNA
do DNA
Clula
Clula
Normal
Normal
Cncer
Cncer
estima estima- -se que 6 se que 6- -7 eventos devem ocorrer (em ~20 7 eventos devem ocorrer (em ~20- -
40 anos) para induo do cncer 40 anos) para induo do cncer
em certos casos a propenso ao cncer hereditria em certos casos a propenso ao cncer hereditria
Recombinao

constitui na troca ou constitui na troca ou

incorporao de uma incorporao de uma
seqncia de DNA com seqncia de DNA com
() outra () outra

na meiose ocorre a na meiose ocorre a

recombinao homloga recombinao homloga
(troca de trechos) (troca de trechos)

a recombinao a recombinao
somtica responsvel somtica responsvel
pelo rearranjo de BCR e pelo rearranjo de BCR e
TCR TCR

DNA de bactrias e DNA de bactrias e

virus virus tambm sofrem tambm sofrem
recombinao recombinao
recombinase RecA recombinase RecA e e Rec Rec BCD BCD
recombinao homloga recombinao homloga
cadeia leve cadeia leve
cadeia leve cadeia leve
cadeia pesada cadeia pesada
Recombinao Somtica
Recombinao Somtica
recombinase recombinase RAG1 e RAG2 RAG1 e RAG2
RSS: a regra de recombinao
RSS: a regra de recombinao
h a formao
h a formao
de alas durante
de alas durante
o rearranjo
o rearranjo
e parte do
e parte do
DNA
DNA
genmico
genmico


perdido
perdido
Repertrio Imunolgico Repertrio Imunolgico
Repertrio Imunolgico
Eventos Eventos
V V
D D
J J
inseres inseres
TOTAL
TOTAL
H H
51 51
30 30
5 5
2 2
+ +
69 69
0 0
5 5
(1) (1)
10
10
16 16
Imunoglobulinas Imunoglobulinas
DNA germinativo DNA germinativo
DNA DNA rearranjado rearranjado
mRNA mRNA maduro maduro
protena protena
A
A
hipermutao
hipermutao
somtica ocorre aps a
somtica ocorre aps a
ativao do linfcito B no centro
ativao do linfcito B no centro
germinativo e leva a maturao por
germinativo e leva a maturao por
afinidade.
afinidade.
taxa de mutao neste processo : 1/1000
taxa de mutao neste processo : 1/1000
bp
bp
(normal : 1/ 10
(normal : 1/ 10
6 6
ou menos)
ou menos)
a cada diviso 1/2 linfcitos modificam sua
a cada diviso 1/2 linfcitos modificam sua
seqncia
seqncia
mutao ocorre nas regies V
mutao ocorre nas regies V
rearranjadas
rearranjadas
conseqncia da grande proliferao e
conseqncia da grande proliferao e
hipermutao
hipermutao
na fase aps infeco de uma bactria pode ocorrer a
recombinao (integrao) do DNA do fago no DNA da bactria
Ciclo de vida de um bacterifago lambda
Ciclo de vida de um bacterifago lambda
na fase aps infeco de uma bactria ocorre a recombinao
(integrao) stio-especfica (att) do DNA do fago no DNA da
bactria
H replicao do DNA do fago, formao de novas
partculas e o ciclo de fecha
os fagos permanecem dentro das bactrias e assim
podem ser usados para formar bibliotecas de DNA