J ULIANA RIBEIRO MARIOTTO

ESTGIO DE DOCNCIA
Cintica Enzimtica





JULHO 2006
CINTICA ENZIMTICA
A Cintica de Reaes Enzimticas apresentam os seguintes objetivos:
Medir as velocidades das transformaes que se processam;
Estudar a influncia de condies de trabalho (concentraes de reagentes e das enzimas,
temperatura, pH, concentraes de ativadores e de inibidores) naquelas velocidades;
Correlacionar (equaes empricas ou modelos matemticos) as velocidades das
transformaes com alguns dos fatores que as afetam;
Colaborar na otimizao do processo;
Estabelecer critrios para o controle do processo;
Projetar o reator mais adequado.
1 Influncia da concentrao de substrato
Um dos fatores que afetam a velocidade de uma reao catalisada por uma enzima
purificada a concentrao do substrato presente [S]. O estudo dos efeitos da concentrao de
substrato complicado pelo fato de a [S] variar durante o curso de uma reao medida que o
substrato convertido em produto. Uma forma de simplificar este problema medir a
velocidade inicial da reao (V
0
). Em um experimento cintico a [S] sempre muito maior
que a concentrao da enzima [E], e se o tempo de reao suficientemente curto, as
mudanas da [S] sero negligenciveis, podendo ser considerada como uma constante.
O efeito provocado em V
0
pela variao da [S], quando a concentrao de enzima
mantida constante est mostrado na Figura 1. Em concentraes pequenas do substrato, V
0

aumenta quase linearmente com os aumentos de [S]. Em concentraes maiores de substrato
V
0
aumenta por incrementos menores em respostas aos aumentos da [S]. Finalmente,
alcanado um ponto acima do qual ocorrem apenas aumentos insignificantes em V
0
, mesmo
diante de aumentos em [S], sendo este ponto chamado de velocidade mxima (V
mx
).

Figura 1. Efeito da concentrao de substrato na velocidade inicial de uma reao catalisada
enzimaticamente.

Existem alguns casos em que a velocidade inicial no pode ser medida, ou porque no
existe uma tcnica experimental que permita acompanhar as variaes das concentraes no
sistema, ou a transformao no pode ser representada por uma equao qumica com
reagentes e produtos definidos. A velocidade da reao, nesses casos, freqentemente
representada por uma velocidade mdia de consumo, ou de produo, de substncias
convenientemente escolhidas (Figura 2) ou, ainda, pela variao de uma propriedade do
sistema (viscosidade, textura, absorbncia, etc.) em um intervalo de tempo prefixado.

Figura 2. Medida da velocidade mdia de formao do produto no intervalo de tempo t.

O perfil cintico apresentado na Figura 1 levou Victor Henri a propor, em 1903, que
uma enzima liga-se molcula de seu substrato para formar o complexo ES, sendo este um
passo obrigatrio no processo cataltico enzimtico. Esta idia foi expandida em uma teoria
geral da ao das enzimas, especialmente por Leonor Michaelis e Maud Menten, em 1913.
Eles propuseram que a enzima primeiro combina-se reversivelmente com o substrato, para
formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversvel relativamente rpido:
k
1
E +S ES (1)
k
-1

A seguir, em um passo mais lento, o complexo ES se rompe com o reaparecimento da
enzima livre e a formao do produto da reao P:
k
2
ES E +P (2)

A segunda reao (Equao 2) mais lenta neste modelo e, portanto, limita a
velocidade da transformao global do reagente em produto. Disto resulta que a velocidade da
reao enzimtica deve ser proporcional concentrao da substncia reagente no segundo
passo, ES.
Em qualquer instante de uma reao, a enzima existe em duas formas, a no ligada ao
substrato, ou a forma livre E, e a forma ligada ES. Em concentraes pequenas do substrato
[S], a maior quantidade da enzima estar na forma livre E. Nestas condies, a velocidade de
reao ser proporcional [S] porque o equilbrio da Equao 1, medida que [S] aumentar,
ser deslocado na direo da formao de mais ES. A velocidade inicial mxima da reao
(V
mx
) ser atingida quando praticamente todas as molculas da enzima estiverem na forma do
complexo ES, e a concentrao da enzima livre E insignificante. Neste caso, diz-se que a
enzima est saturada com o substrato e a velocidade da reao no aumenta mais com os
aumentos de [S]. Em soluo contendo um excesso de substrato, haver um perodo cintico
inicial chamado de estado pr-estacionrio, ocorrendo o crescimento da concentrao de ES.
O estado pr-estacionrio , usualmente, de durao muito curta. A reao atinge o estado
estacionrio muito rapidamente e a concentrao do complexo [ES] permanecer
praticamente constante durante o decorrer do tempo.
1.1 Equao de Michaelis e Menten
A Figura 1 mostra a relao entre [S] e V
0
para uma reao enzimtica. A curva que
expressa esta relao possui a mesma forma para a maioria das enzimas, sendo expressa pela
Equao de Michaelis e Menten, derivada por estes pesquisadores partindo de sua hiptese
bsica de que, nas reaes enzimticas, o passo limitante da velocidade a quebra do
complexo ES para formar o produto e a enzima livre.
A Equao de Michaelis-Menten (Equao 3) a equao da velocidade para uma
reao catalisada enzimaticamente e com um nico substrato. uma expresso da relao
quantitativa entre a velocidade inicial V
0
, a velocidade inicial mxima V
mx
, e a concentrao
inicial de substrato [S], todas relacionadas atravs da constante de Michaelis-Menten, K
m
. A
constante de Michaelis-Menten uma constante dinmica, ou de pseudoequilbrio, que
expressa a relao entre as concentraes reais no estado estacionrio ao invs de
concentraes no equilbrio.
[ ]
[ ] S K
S V
V
m
mx
+
=
0
(3)

Uma relao numrica importante emerge da Equao de Michaelis-Menten no caso
especial quando V
0
exatamente metade de V
mx
(Figura 1). Ento:
[ ] S K
m
=
mx
V V
2
1
0
= (4)
K
m
equivalente concentrao de substrato na qual V
0
igual metade de V
mx
, e
indica a afinidade de uma enzima pelo seu substrato. Quanto menor for o valor de K
m
,
maior ser a afinidade da enzima pelo substrato.
Obs: V
mx
depende do k
2
, que uma constante, e da concentrao da enzima na experincia
realizada. V
mx
proporcional concentrao da enzima (Figura 3).
k
1
k
2
E +S ES E +P (5)
k
-1



Figura 3. Grfico de V
mx
variando de acordo com a [E].

1.1.1 Significado de V
mx
e K
m

Todas as enzimas que exibem uma dependncia hiperblica de V
0
em relao a [S] so
ditas seguir a cintica de Michaelis-Menten Entretanto, esta equao no depende do
mecanismo de reao relativamente simples de dois passos. Muitas enzimas possuem
mecanismos de reao muito diferentes entre si; como enzimas que catalisam reaes com
seis ou oito passos identificveis, que exibem o mesmo comportamento cintico no estado
estacionrio. Portanto, o significado real e a magnitude de V
mx
e K
m
podem variar de uma
enzima para outra.
O significado real de K
m
depende de aspectos especficos do mecanismo de reao,
como o nmero e as velocidades relativas dos passos individuas da reao. Considerando as
reaes de dois passos:
1
1 2
k
k k
K
m

+
= (6)
Para a reao de Michaelis-Menten, k
2
o limitante da velocidade; assim, quando k
2

<<k
-1
, K
m
se reduz ao valor
1
1
k
k

. Onde esta condio prevalece o K

m
representa uma
medida da afinidade da enzima pelo substrato no complexo ES. Muitas vezes k
2
>>k
-1
, e
ento
1
2
k
k
K
m
= . Em outros casos, k
2
e k
-1
so comparveis e K
m
permanece com uma
funo mais complexa do relacionamento entre todas as trs constantes de velocidade.
A V
mx
tambm varia muito de uma enzima para outra. Se uma enzima reage pelo
mecanismo de dois passos de Michaelis-Menten, a V
mx
equivalente a k
2
[Et], onde k
2
o
passo limitante da velocidade. Entretanto, o nmero de passos da reao e a identidade do(s)
passo(s) limitante(s) da velocidade podem variar de enzima para enzima.
Exemplo: Liberao do produto EP E +P limitante da velocidade.

k
1
k
2
k
3

E +S ES EP E +P (7)
k
-1
k
-2

Na saturao, a maior parte da enzima est na forma EP e [ ] Et k V
mx 3
= . Portanto
pode-se definir a constante k
cat
para descrever a velocidade limitante de qualquer reao
catalisada por uma enzima nas condies de saturao.
Cada enzima tem valores timos de k
cat
e K
m
que refletem o ambiente celular, a
concentrao do substrato normalmente encontrado in vivo pela enzima e a qumica da reao
que est sendo catalisada.
1.1.2 Ordem da reao
1.1.2.1 Primeira ordem
Ocorre quando [S] <<K
m

[ ]
m
mx
K
S V
V =
0
(8)
Considerando k
K
V
m
mx
= :
[ ] S k V =
0
(9)
Onde:
k: constante de velocidade de primeira ordem (min
-1
).
A Equao 9 indica que quando [S] muito pequena, a velocidade absoluta diminui a
cada momento, medida que [S] decresce (Figura 4). Porm, em um certo momento, uma
frao constante de substrato presente se transforma em produto:
[ ]
[ ] S k V
dt
S d
= =
0

[ ]
[ ] dt S
S d
k
1
= (10)
Como V
0
diminui com o tempo na regio de primeira ordem, grficos de [S] e [P]
contra o tempo so curvos (Figura 5). Pode-se determinar a quantidade de substrato utilizada
ou de produto formado durante qualquer intervalo de tempo utilizando a equao integrada de
velocidade de primeira ordem, cujo resultado ser:

[ ]
[ ]
( )
0
0
log 3 , 2 t t k
S
S
= (11)

Figura 4. V
0
diminui continuamente com o tempo.


Figura 5. Aparecimento de [P] e desaparecimento de [S] no so lineares com o tempo.
Um grfico semilog da forma integrada da velocidade de primeira ordem possui uma
inclinao
3 , 2
k
, e uma interseo de log [S]
0
no eixo de log [S] (Figura 6).

Figura 6. Grfico semilog.

Obs: t
1/2
chamado de tempo de meia vida, que o tempo necessrio para converter em
produto metade do substrato originalmente presente relacionado ao k (Equao 12).
k
t
693 , 0
2
1
= (12)
1.1.2.2 Ordem zero
Ocorre quando [S] >>K
m
.
[ ]
[ ] S
S V
V
mx
=
0

mx
V V =
0
(13)
1.1.1 Determinaes dos parmetros cinticos
A Equao de Michaelis-Menten pode ser algebricamente rearranjada em formas que
so mais teis no tratamento grfico dos dados experimentais.
1.1.2.3 Lineweaver-Burk
Uma transformao muito empregada obtida de forma simples, invertendo-se os dois
lados da Equao de Michaelis-Menten:
[ ]
mx mx
m
V S V
K
V
1 1 1
+ = (14)
Grfico:
V
1
contra
S
1
;
A linha reta tem inclinao igual a
mx
m
V
K
, o intercepto no eixo
V
1
igual a
mx
V
1
e o
intercepto no eixo
] [
1
S
igual a
m
K
1

;
Vantagem: permitir uma determinao acurada de V
mx
, o que pode ser feito apenas
aproximadamente em grficos de V versus [S].

Figura 7. Grfico duplo-recproco ou de Lineweaver-Burk.

1.1.2.4 Mtodo de Hanes
Consiste simplesmente em multiplicar por [S] ambos os membros da Equao 14.
[ ]
[ ] S
V V
K
V
S
mx mx
m
1
+ = (15)

V
S] [
varia linearmente com [S];
A linha reta tem inclinao igual a
mx
V
1
, o intercepto no eixo
V
S] [
igual a
mx
m
V
K
e
o intercepto no eixo [S] igual a K
m
.

Figura 8. Grfico de Hanes.

1.1.2.5 Mtodo de Eadie-Scatchard
Rearranjando e multiplicando por
[ ] S
1
os dois lados da Equao 3, obtm-se:

[ ] S
V
K V V
m mx
= (16)
Grfico: V versus
[ ] S
V
;
A linha reta tem inclinao igual a
m
K , o intercepto no eixo V igual a
mx
V e o
intercepto no eixo
] [S
V
igual a
m
mx
K
V
.

Figura 9. Grfico de Eadie-Scatchard.

1.1.2.6 Forma integrada da Equao de Michaelis-Menten
K
m
e V
mx
podem ser determinados pelo uso da forma integrada da equao de
velocidade.
[ ] [ ]
[ ] S K
S V
dt
S d
V
m
mx
+
= =
[ ]
[ ]
[ ] [ ] ( ) S S
S
S
K t V
m mx
+ =
0
0
log 3 , 2 (17)
Onde:
[S]: concentrao de substrato em qualquer tempo t [ ] [ ] P S t =
0

[ ] [ ] ( ) S S
0
: concentrao de substrato utilizado no tempo t t =[P] (concentrao do
produto formado no tempo t).
Dividindo a Equao 17 por t e rearranjando:
[ ]
[ ]
[ ] [ ] ( )
t
S S
K K
V
S
S
t
m m
mx

=
0 0
1
log
3 , 2
(18)
Grfico:
[ ]
[ ] S
S
t
0
log
3 , 2
versus
[ ] [ ] ( )
t
S S
0
;
A linha reta tem inclinao igual a
m
K
1
, o intercepto no eixo
[ ]
[ ] S
S
t
0
log
3 , 2
igual
a
m
mx
K
V
e o intercepto no eixo
[ ] [ ] ( )
t
S S
0
igual a
mx
V .

Figura 10. Grfico da forma integrada da Equao de Michaelis-Menten.

Exemplo: Os valores da Tabela 4 mostram a velocidade inicial de formao do produto para
diversos valores de concentrao inicial do substrato em uma reao enzimtica (Figura 11).


Tabela 1. Velocidade inicial de formao do produto em funo da concentrao inicial
de substrato.
[S] (g/L) V
0
(g/L.h)
0,25 0,78
0,51 1,25
1,03 1,66
2,52 2,19
4,33 2,35
7,25 2,57



0,0
1,0
2,0
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
V
o

(
g
/
L
.
h
)

Figura 11. Representao grfica dos valores da Tabela 1.

Aplicando-se, aos valores da Tabela 1, o mtodo de Lineweaver-Burk e o de Hanes,
obtm-se os resultados representados, respectivamente, nas Figuras 12 e 13.
y =0,228x +0,3668
R
2
=0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[ S] (L/g)
1
/
V
o

(
L
.
h
/
g
)

Figura 12. Determinao de V
0
e K
m
pelo mtodo de Lineweaver-Burk.

Resultados
[ ]
[ ]
L
g
K
V
K
h L
g
V
V
S V
V S V
K
V
m
mx
m
mx
mx
mx mx
m
622 , 0 228 , 0
73 , 2 3668 , 0
1
Portanto,
3668 , 0
1
228 , 0
1
1 1 1
0
0
= =

= =
+ =
+ =

y =0,3595x +0,2419
R
2
=0,9993
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 2 4 6 8
[ S] (g/L)
[
S
]
/
V
o

(
h
)

Figura 13. Determinao de V
0
eK
m
pelo mtodo de Hanes.

Resultados
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
L
g
K
V
K
h L
g
V
V
S
V
S
S
V V
K
V
S
m
mx
m
mx
mx
mx mx
m
672 , 0 2419 , 0
78 , 2 3595 , 0
1
Portanto,
3595 , 0 2419 , 0
1
0
0
= =

= =
+ =
+ =


2 Inibio da atividade enzimtica
A catlise enzimtica pode ser impedida por compostos, que, quando presentes no
meio, ligam-se diretamente enzima, impedindo sua ao.
2.1 Inibidores reversveis competitivos
Os inibidores competitivos so substncias que tm forma estrutural suficientemente
semelhante do substrato para poderem ligar-se ao stio ativo da enzima (Figura 14). Faltam-
lhe, entretanto, grupos qumicos que pudessem levar a reao a cabo; o resultado da sua
presena no meio de reao o estabelecimento de uma competio entre as molculas do
inibidor competitivo e as do substrato pela ligao com o stio ativo da enzima. Naturalmente,
o porcentual de inibio resultante depender de dois fatores: (1) as concentraes relativas de
substrato e inibidor competitivo; (2) da afinidade diferencial da enzima pelo substrato e pelo
inibidor. Por suas caractersticas, a inibio competitiva bastante especfica.

Figura 14. Inibidores competitivos.

Como o inibidor se liga reversivelmente enzima a competio pode se tornar
favorvel ao substrato, pela simples adio ao meio de reao de mais substrato, tornando
mnima a probabilidade de uma molcula de inibidor se ligar enzima. A reao, neste caso,
exibir uma V
mx
normal. Entretanto, o valor de K
m
aumentar na presena do inibidor. Este
efeito no K
m
aparente e a ausncia de um efeito em V
mx
so diagnsticos da inibio
competitiva e facilmente revelado atravs de um grfico duplo-recproco.
A Figura 15 mostra um conjunto de grficos duplo-recproco obtidos na ausncia do
inibidor e em duas concentraes diferentes de um inibidor competitivo. O aumento de [I]
resulta na produo de uma famlia de linhas com intercepto comum no eixo
0
1
V
, mas com
inclinaes diferentes. Devido ao intercepto no eixo
0
1
V
ser igual a
mx
V
1
observa-se que a
velocidade mxima no muda quando a reao ocorre na presena de um inibidor
competitivo, isto , em uma dada reao enzimtica sempre haver uma concentrao to alta
de substrato que deslocar o inibidor competitivo do stio ativo da enzima, no importando
quo alta seja a concentrao do mesmo.

Figura 15. Grfico duplo-recproco da inibio competitiva.

Equao de Michaelis-Menten com a presena de um inibidor competitivo:
[ ]
[ ]
[ ] S
K
I
K
S
V V
I
m
mx
+

+
=
1
(19)
Aplicando-se o mtodo de Lineweaver-Burk na Equao 19 (Figura 16):
[ ]
[ ] S V
K
I
K
V V
mx
I
m
mx
1
1
1 1

+
+ = (20)
Determinao de K
I
:

Figura 16. Determinao de K
I
.

As Equaes (3) e (19) permitem calcular a relao entre as velocidades da reao sem
inibidor e com inibidor:
[ ] ( )
[ ] I
S K K
K
V
V
m I
m
I

+
+ =1
0
(20)
Se for possvel trabalhar com concentraes de substrato relativamente altas, a
influncia do inibidor pode se tornar desprezvel (Figura 17).

Figura 17. Influncia das concentraes do substrato e do inibidor competitivo na relao
I
V
V
0 .

Curiosidade: A inibio competitiva empregada terapeuticamente para tratar pacientes que
ingeriram metanol, um solvente encontrado em misturas anticongelantes para veculos
automotores. No fgado da pessoa intoxicada o metanol convertido em formaldedo pela
ao da enzima lcool desidrogenase. O formaldedo muito lesivo para os tecidos vivos e a
cegueira o resultado freqente da intoxicao pelo metanol, porque os olhos so
particularmente sensveis. O etanol compete efetivamente com o metanol como substrato para
a lcool desidrogenase. A terapia para o envenenamento com metanol uma infuso
endovenosa de etanol, que diminui a velocidade de formao do formaldedo, o suficiente
para que a maior parte do metanol possa ser excretado na urina sem maiores danos.
2.2 Inibidores reversveis no competitivos
O inibidor no compete com o substrato pelo stio ativo, mas vai ocupar outro stio da
enzima (stio regulativo ou de inibio), formando alm de complexos ES e EI, um terceiro
complexo, enzima-inibidor-substrato (EIS) (Figura 18). A enzima inativada quando o
inibidor est ligado, o substrato estando tambm presente ou no. Uma concentrao
infinitamente alta de substrato no consegue levar toda enzima sob forma de ES, que a
forma produtiva. Para qualquer [I] uma parte da enzima permanecer sob a forma [EIS], onde
se pode prever que V
mx
ser menor que a V
mx
observada na ausncia de inibidor. Em geral, o
efeito sobre K
m
pequeno ou nenhum.

Figura 18. Inibio no competitiva.

A equao da velocidade dada por:
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]

+ +

+
=
I I
m
mx
K
I
S
K
I
K
S
V V
1 1
(21)
Aplicando o mtodo de Lineweaver-Burk na Equao 21:
[ ]
[ ]
[ ]

+ +

+ =
I mx I mx
m
K
I
V S K
I
V
K
V
1
1 1
1
1
(22)
Na inibio no competitiva, grficos construdos com os valores de velocidade
obtidos experimentalmente produzem a famlia de linhas mostrada na Figura 19, com
intercepto comum no eixo
[ ] S
1
. Isto indica que K
m
para o substrato no alterado por um
inibidor no competitivo, mais V
mx
diminui.

Figura 19. Grfico duplo-recproco da inibio no competitiva.

2.3 Inibidores reversveis incompetitivos
Trata-se de uma inibio por bloqueio do complexo ES. Supe-se que existam na
enzima dois stios ativos: um reservado ao substrato e outro ao inibidor, mas este ltimo s
pode se fixar de modo reversvel sobre o complexo intermedirio ES (Figura 20).

Figura 20. Inibio incompetitiva.

A associao enzima-inibidor no exclusiva. O inibidor no permite ao complexo
ternrio ESI evoluir para elaborar o produto. Neste tipo de inibio, a velocidade mxima
(V
mx
) e K
m
so menores que na ausncia de inibidor.
A equao da velocidade dada por:
[ ]
[ ]
[ ]
[ ] S
K
I
K
S
K
I
V
V
I
m
I
mx
+
+

+
=
1
1
(23)
Aplicando o mtodo de Lineweaver-Burk na Equao 23 (Figura 21):
[ ]
[ ]

+ + =
I mx mx
m
K
I
V S V
K
V
1
1 1 1
(24)

Figura 21. Grfico duplo-recproco da inibio incompetitiva.

2.4 Inibidores irreversveis
Inibidores irreversveis so aqueles que se combinam com um grupo funcional na
molcula da enzima e que essencial para sua atividade, estes inibidores podem, tambm,
promover a destruio de tal grupo (Figura 22). comum a formao de uma unio covalente
entre um inibidor irreversvel e uma enzima.

Figura 22. Equao qumica com a presena de um inibidor irreversvel.

Um substrato que se combina irreversivelmente com uma enzima pode assemelhar-se
a um inibidor no competitivo porque V
mx
diminui, ao passo que K
m
permanece a mesma. A
V
mx
diminui porque parte da enzima completamente removida do sistema.
Equao de Michaelis-Menten na presena de um inibidor irreversvel (Figura 23):
( )
[ ]
[ ] S K
S
EI k V V
m
mx I
+
= ] [
3
(25)

Figura 23. Influncia de [S] na velocidade de reao na presena de um inibidor irreversvel.

Aplicando-se o mtodo de Lineawer-Burk na Equao (25) (Figura 24):
[ ] [ ] [ ] S EI K V
K
EI K V V
mx
m
mx I
1 1 1
3 3

= (26)


Figura 24. Mtodo de Lineweaver-Burk na inibio irreversvel.

3 Influncia do meio sobre a atividade enzimtica
A estrutura e a forma do stio ativo so decorrncia da estrutura tridimensional da
enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanas
conformacionais na estrutura protica. Isto torna a atividade enzimtica dependente do meio
ambiente, notadamente do pH e da temperatura.
3.1 Influncia do pH
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para o qual a sua atividade
mxima, a velocidade da reao diminui medida que o pH se afasta desse valor timo, que
caracterstico para cada enzima, mas com freqncia, est prximo do pH neutro.
cidos, pela definio de Brnsted, so compostos capazes de dissociar-se, liberando
H
+
. cidos fracos so aqueles em que a dissociao no completa, restando em soluo
tambm uma porcentagem do cido no dissociado; existe, portanto, um equilbrio qumico
que pode ser escrito:
+
+ H A HA (27)

As concentraes relativas de HA e de A dependem do pH. Quando o valor do pH
baixo (alta concentrao de prtons), o equilbrio rearranja-se pelo aumento da concentrao
de HA e diminuio da concentrao de A. Quando o valor do pH alto (baixa concentrao
de prtons), ocorre o inverso. Os grupos R dissociveis dos aminocidos comportam-se de
maneira anloga.
Existe uma concentrao hidrogeninica que propicia um determinado arranjo de
grupos protonados e desprotonados, que leva a molcula de enzima conformao ideal para
exercer seu papel cataltico. Esse pH timo depende do nmero e tipo de grupos ionizveis
que uma enzima apresenta, ou seja, depende de sua estrutura primria. Por outro lado, quando
o substrato contm grupos ionizveis, as variaes de pH tambm podero afetar sua carga.
A Figura 25 apresenta uma curva experimental da V
0
com relao variao do pH
(curva A) e a curva de estabilidade (curva B) para uma enzima.

Figura 25. Efeito do pH na atividade e estabilidade de uma enzima, curva A: atividade da enzima,
curva B: V
0
em pH 6,8 aps incubao em outros valores de pH.

Observa-se que a incubao da enzima em pH 5 ou pH 8 no produz nenhum efeito na
atividade medida em pH 6,8. Ento, o declnio da atividade entre pH 6,8 e 8 e entre pH 6,8 e 5
deve resultar da constituio de uma forma inica no adequada da enzima e/ou substrato.
Quando a enzima incubada em pH >8 ou pH >5, a atividade total no obtida em pH 6,8.
Portanto, parte do declnio na atividade acima de pH 8 e abaixo de pH 5 resulta em uma
inativao irreversvel da enzima. O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado
utilizando-se altas concentraes de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os
valores de pH.
3.2 Influncia da temperatura
A influncia da temperatura sobre a cintica da reao enzimtica deve ser entendida
em duas fases distintas: no princpio, aumentos de temperatura levam a aumentos de
velocidade de reao, por aumentar a energia cintica das molculas componentes do sistema.
Esse efeito observado em um intervalo de temperatura compatvel com a manuteno da
estrutura espacial da enzima. Temperaturas mais altas levam desnaturao da enzima por
alterarem as ligaes qumicas que mantm sua estrutura tridimensional. Rompidas as pontes
de hidrognio, que so ligaes bastante termolbeis, desencadeia-se uma cascata de
alteraes estruturais, levando a enzima a uma nova conformao ou a um estado sem
estrutura definida. A temperatura que provoca desnaturao est, geralmente, pouco acima de
sua temperatura tima.
Enzimas de baixo peso molecular compostas de uma nica cadeia polipeptdica e
possuindo pontes dissulfetos so geralmente mais estveis ao calor do que enzimas
oligomricas, de alto peso molecular.
O efeito da temperatura em uma enzima depende de um nmero de fatores que
incluem o pH, a fora inica do meio e a presena ou ausncia de ligantes. Os substratos
freqentemente protegem a enzima da desnaturao pelo calor.
Na reao enzimtica a constante de velocidade k funo crescente da temperatura
do sistema. A influncia da temperatura na constante de velocidade k obedece lei de
Arrhenius (Equao 28):
RT
e k k

=
0
(28)
Onde:
: energia de ativao;
R: constante dos gases perfeitos;
T: temperatura absoluta do sistema.
A Figura 26 representa a Equao 28.

Figura 26. Representao da variao da constante de velocidade k com a temperatura absoluta T.

Lembrando que as enzimas so termolbeis, ao mesmo tempo que ocorre a reao
enzimtica que nos interessa, desenvolve-se tambm a reao de inativao trmica da enzima
que atua no sistema (Equao 29):
k
E Enzima inativada (29)

A constante de velocidade desta equao (k) tambm afetada pela temperatura de
acordo com a lei de Arrhenius (Equao 20):
RT
e k k

=
'
0
'
(30)
Sendo a correspondente energia de ativao.
O efeito da temperatura na velocidade das reaes em geral expresso em termos de
coeficiente de temperatura (Q
10
), fator pelo qual a velocidade aumenta quando a temperatura
aumenta 10C (Equao 31):

10
log 3 , 2
10 1 2
Q T T R
E
a

= (31)
4 Regulao da atividade enzimtica
No metabolismo celular grupos de enzimas trabalham em conjunto, formando vias
seqenciais para desenvolver um dado processo metablico. Nesses sistemas, o produto da
reao da primeira enzima tornar-se o substrato da enzima subseqente e assim
sucessivamente.
Em cada sistema enzimtico, entretanto, h pelo menos uma enzima que determina a
velocidade de toda a seqncia, porque ela catalisa a reao mais lenta ou a reao limitante
da velocidade. Estas enzimas reguladoras tm sua atividade cataltica aumentada ou
diminuda em resposta a determinados sinais, ajustando a velocidade de cada seqncia
metablica, devido as necessidades de energia e de biomolculas requeridas no crescimento
da clula e no seu auto-reparo.
A atividade das enzimas reguladoras modulada atravs de vrios tipos de molculas
sinalizadoras, as quais so, em geral, pequenos metablitos ou cofatores. Nas vias metablitas
existem duas grandes classes de enzimas reguladoras, as enzimas alostricas e as enzimas
reguladas pela modificao covalente.
4.1 Enzimas alostricas
As enzimas alostricas funcionam atravs da ligao no-covalente e reversvel de um
metablito regulador chamado modulador. Estas enzimas so aquelas que possuem outras
formas ou conformaes induzidas pela unio com moduladores.
Em alguns sistemas multienzimticos a enzima reguladora inibida especificamente
pelo produto final da via, sempre que este estiver em excesso em relao s necessidades
celulares. Quando a velocidade da reao catalisada pela enzima reguladora diminui, todas as
enzimas subseqentes passam a operar em velocidades reduzidas, porque as concentraes de
seus substratos diminuem proporcionalmente. Este tipo de regulao chamado de inibio
por retroalimentao
Os moduladores das enzimas alostricas podem ser inibidores ou estimuladores, ou
efetuadores alostricos negativos ou positivos, respectivamente. O prprio substrato
freqentemente um ativador e as enzimas reguladoras para as quais o substrato e o modulador
so idnticos so chamadas de homotrpicas, quando o modulador uma molcula diferente
do substrato a enzima heterotrpica. Algumas enzimas tm dois ou mais moduladores.
Em adio ao stio ativo ou cataltico, as enzimas alostricas geralmente tm um ou
mais stios reguladores ou alostricos para a ligao do modulador, sendo este especfico para
o seu modulador. As enzimas com vrios moduladores geralmente tm stio de ligao
diferente e especfico para cada um deles.
Outras diferenas entre as enzimas no reguladoras e as alostricas envolvem as
propriedades cinticas. As enzimas alostricas mostram relaes entre V
0
e [S] que diferem do
comportamento enzimtico normal, do tipo Michaelis-Menten. Elas exibem saturao quando
[S] suficientemente alta, mas para algumas enzimas alostricas quando V
0
colocada em
grfico contra [S] resulta em uma curva com saturao sigmide e no na curva hiperblica
exibida pelas enzimas no reguladoras (Figura 27).

Figura 27. Comparao de uma enzima reguladora com uma no reguladora; 1. Enzima no reguladora
(Michaelis-Menten), 2. Enzima reguladora.

As enzimas alostricas mostram diferentes respostas em suas curvas de variao da
atividade em funo da concentrao do substrato porque algumas possuem moduladores
inibidores, outras moduladores ativadores e vrias possuem os dois tipos.
4.2 Modificao covalente
Algumas enzimas so submetidas a um processo de regulao que consiste na ligao
covalente de um grupo qumico sua estrutura. Um exemplo freqente a transferncia de
um grupo fosfato, proveniente do ATP, para a enzima-alvo (Figura 28). Naturalmente, a
presena do grupo fosfato acarreta a mudana da conformao espacial da enzima, com duas
conseqncias possveis: para algumas enzimas a nova conformao cataliticamente inativa;
para outras, s ento se forma um stio ativo funcional. Assim, quando vrias enzimas so
simultaneamente fosforiladas, o metabolismo drasticamente alterado, sendo acionadas vias
que estavam inativas e inibidas vias at ento funcionando.

Figura 28. Modificao covalente de uma enzima.
APNDICE
Deduo da Equao de Michaelis e Menten
A deduo inicia-se com as duas reaes bsicas envolvendo a formao e o
desaparecimento de ES (Equaes 1 e 2). Nos primeiros momentos da reao a concentrao
do produto [P] negligencivel e para simplificar podemos assumir que k
-2
pode ser ignorado.
A reao reduz-se, ento, a:
k
1
k
2
E +S ES E +P (1)
k
-1

A V
0
determinada pela quebra de ES para formar o produto e, portanto, dependente
de [ES]:
[ ] ES k V =
2 0
(2)
Como [ES] na Equao 2 no facilmente medida experimentalmente, precisamos
descobrir uma expresso alternativa para [ES]. Primeiro introduziremos o termo [Et]
representando a concentrao total da enzima (ou seja, a soma das concentraes das enzimas
livre e ligada ao substrato). Logo, a concentrao da enzima livre, ou no ligada ao substrato,
pode ser representada por [Et] [ES]. Ainda, como [S] ordinariamente muito maior que
[Et], a quantidade de substrato ligada enzima em qualquer momento da reao
negligencivel quando comparada com [S].
4.2.1 Passos para a Equao de Michaelis e Menten
Passo 1: As velocidades de formao e desaparecimento de ES so determinadas pelos
passos governados pelas constantes de velocidade k
1
(formao) e k
-1
+ k
2
(desaparecimento), de acordo com as expresses a seguir:
Velocidade de formao de ES: [ ] [ ] ( )[ ] S ES Et k ES = (3)
Velocidade de desaparecimento de ES: [ ] [ ] ES k ES k ES
2 1
+ =

(4)
Passo 2: Assume-se, agora, que a velocidade inicial da reao reflete um estado estacionrio
no qual [ES] constante, isto , a velocidade de formao de ES igual velocidade de
desaparecimento. Estas condies assim assumidas definem o estado de equilbrio
estacionrio. No estado estacionrio, as expresses nas equaes 3 e 4 podem ser igualadas
para dar:
[ ] [ ] ( )[ ] [ ] [ ] ES k ES k S ES Et k
2 1 1
+ =

(5)
Passo 3: Desenvolvemos, agora, uma srie de passos algbricos para resolver a Equao 5 em
funo de [ES]. [ ]
[ ][ ]
[ ]
2 1 1
1
k k S k
S Et k
ES
+ +
=

(6)
Simplificando ainda mais esta ltima expresso de forma a que todas as constantes de
velocidade estejam combinadas em um nico termo:
[ ]
[ ][ ]
[ ]
( )
1
1 2
k
k k
S
S Et
ES

+
+
= (7)
O termo
( )
1
1 2
k
k k

+
definido como a constante de Michaelis-Menten, K
m
.
Substituindo esta na Equao 7, a expresso simplifica-se para:
[ ]
[ ][ ]
[ ] S K
S Et
ES
m
+
= (8)
Passo 4: V
0
pode agora ser expressa em termos de [ES]. A Equao 8 empregada para
substituirmos [ES] na Equao 2, dando:
[ ][ ]
[ ] S K
S Et k
V
m
+
=
2
0
(9)
Como a velocidade mxima ocorrer quando a enzima estiver saturada e, portanto,
[ES] =[Et], V
mx
pode ser definida como k
2
[Et]. Substituindo esta expresso na Equao 9
obtemos:
[ ]
[ ] S K
S V
V
m
mx
+
=
0