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ISSN 0102-2067 Licenciado sob uma Licena Creative Commons

[I]

ARTIGO ORIGINAL

Anlise citolgica do lquido peritoneal


[I]

Cytological analysis of peritoneal fluid


[A]

Samuel Ricardo Comar[a], Tamirys Schulz[b], Nicolle de Arajo Machado[c], Franciane da Silva Frana[d], Patrcia Haas[e]
[R]

[a]

Resumo

O lquido peritoneal ou asctico se apresenta como uma ultrafiltrao do plasma contido na cavidade peritoneal. Sua principal funo a proteo da cavidade abdominal, banhando-a e lubrificando-a, reduzindo, assim, o atrito entre os rgos o que permite melhor mobilidade destes. Alteraes na sua condio fisiolgica podem se dar por vrios fatores, como variaes nas foras hidrostticas no sistema circulatrio e presso onctica do plasma. Essas alteraes podem levar a um acmulo de lquido na cavidade abdominal, ocasionando a ascite. Doenas crnicas do fgado, como a cirrose, associadas hipertenso portal so as causas mais frequentes de ascite. A anlise laboratorial fornece dados essenciais que auxiliam o clnico no diagnstico e conduta teraputica eficaz. constituda da avaliao das caractersticas fsicas (volume, colorao e aspecto), testes bioqumicos, contagem celular e anlise diferencial das clulas nucleadas. A metodologia adotada, assim como as caractersticas do fluido asctico devem ser muito bem dominadas pelos profissionais envolvidos, o que garante uma melhor qualidade dos resultados.
[P]

Palavras-chave: Asctico. Lquido peritoneal. Anlise laboratorial. Citologia.


[B]

Abstract

The peritoneal ou ascitic fluid is presented as an ultrafiltered of plasma in the peritoneal cavity. Its main function is protecting the abdominal cavity by lubricating it, thus reducing the friction between the bodies, which allows for their greater mobility. Changes in its physiological condition can occur by several factors such as changes in hydrostatic forces in the circulatory system and plasma oncotic pressure. These changes may lead to an accumulation of fluid in the abdominal cavity, causing ascites. Chronic liver diseases such as cirrhosis, associated with portal hypertension are the most fronts of ascites. Laboratory analysis provides essential data that assist the clinician in diagnosis and effective therapy. It consists of evaluation of physical characteristics (volume, color and appearance), biochemical tests, cell counts and differential analysis of nucleated cells. The method used and the characteristics of the ascitic fluid should be performed by thoroughly familiarized professionals, which ensures better quality of results.
[K]

Mestre em Cincias Farmacuticas (rea de concentrao: Anlises Clnicas) pela Universidade Federal do Paran (UFPR), farmacutico bioqumico da seo de Hematologia da Unidade de Apoio Diagnstico do Hospital de Clnicas da Universidade Federal do Paran (UFPR), Curitiba, PR - Brasil. [b] Especializao em Citologia Crvico Vaginal e Lquidos Corporais, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianpolis, SC - Brasil. [c] Especializao em Citologia Crvico Vaginal e Lquidos Corporais Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianpolis, SC - Brasil, e-mail: ni_machado@hotmail.com [d] Mestranda do Programa de Ps-Graduao em farmcia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianpolis, SC - Brasil. [e] Doutorando em Cincia dos Alimentos pela Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), professor adjunto I da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianpolis, SC Brasil, e-mail: patricia.haas@ufsc.br

Keywords: Ascitic fluid. Peritoneal fluid. Laboratorial analisys. Cytology.

Recebido: 24/02/2010 Received: 02/24/2010 Aprovado: 14/10/2010 Approved: 10/14/2010


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Comar SR, Schulz T, Machado NA, Frana FS, Haas P.

Argumentaes
O peritnio uma membrana serosa, lisa e delicada, constituda de fibroblastos, matriz extracelular, vasos sanguneos e clulas mesoteliais, que reveste a parede e vsceras do abdmen e plvis (1). Apresenta dois folhetos, que so o parietal, que reveste a cavidade abdominal e o visceral que reveste os rgos (2-4). Entre esses folhetos, existe uma cavidade virtual denominada cavidade peritoneal, por onde circula o lquido peritoneal ou asctico (5). A cavidade peritoneal contm, em condies normais, aproximadamente 50mL de fluido, o qual se apresenta sob a forma de um lquido transparente, amarelo claro, estril e viscoso e produzido pelas clulas da membrana como um ultrafiltrado do plasma (6). Tanto a sua produo quanto sua reabsoro dependente de vrios fatores, como a permeabilidade dos capi lares peritoneais, as foras hidrostticas no sistema circulatrio, a presso onctica do plasma e a reabsoro linftica (7-9). A principal funo do lquido asctico a proteo da cavidade abdominal, banhando-a e lubrificando-a, reduzindo, assim, o atrito entre os rgos e permitindo sua movimentao durante o processo da digesto (4). Foram descobertos, tambm, importantes papis no transporte de fluidos e clulas, no processo inflamatrio, no reparo tecidual, na lise de depsitos de fibrina, na proteo contra microrganismos invasores e possivelmente na disseminao tumoral (5, 10). Evidncias sugerem que um distrbio de transporte de eletrlitos e fluidos na monocamada de clulas mesoteliais atuam como um importante fator na formao de derrames, no qual h acmulo de lquido na cavidade abdominal, seja por aumento da produo e/ou deficincia de remoo (7, 11-13). O acmulo de fluido dentro da cavidade peritoneal constitui uma efuso peritoneal, a qual assinala que o paciente possui ascite. Esta, por sua vez, pode ser classificada de acordo com o grau de severidade e resposta teraputica, em ascite descomplicada, complicada e ascite refratria (14). A fim de se obter a confirmao etiolgica da ascite, realiza-se um procedimento cirrgico chamado paracentese, que consiste na remoo de lquido asctico da cavidade peritoneal. Com a diferenciao do fluido asctico em transudato ou exsudato, a determinao da diferena entre a concentrao de albumina no soro e no lquido asctico de fundamental importncia para o fornecimento

de subsdios para uma posterior abordagem clnica e laboratorial (2, 13). Tendo em vista a correlao que se observa entre a presena de hipertenso portal e o gradiente entre a albumina do soro e a albumina do lquido asctico, pode-se afirmar que nveis maiores ou iguais a 1 g/dL associados a graus de protenas inferiores a 3,0 g/dL sugerem o diagnstico de cirrose. Naqueles casos em que a relao for menor ou igual a 1,1 g/dL, acompanhado da presena de nveis proteicos elevados, deveria se pensar em doena peritoneal e, quando ambos os parmetros estivessem acima dos nveis crticos propostos, a hiptese seria de hipertenso portal ps-sinusoidal (2, 6, 15). Doenas crnicas do fgado, como a cirrose, associadas hipertenso portal so as causas mais frequentes de ascite (9, 12, 16, 17). Outras etiologias menos comuns, porm no menos importantes, incluem neoplasia maligna principalmente de ovrio e mama, insuficincia cardaca, nefropatia, tuberculose, doenas pancreticas e peritonite bacteriana espontnea (13, 16). Pacientes com grande derramamento de lquido asctico podem desenvolver hrnias inguinais, umbilicais e incisionais (2, 18). O diagnstico precoce da ascite extremamente importante, considerando que algumas formas so benignas e possuem bons prognsticos. No entanto, outras podem se expressar como forma de patologias muito agressivas, potencialmente letais, que, se no descobertas a tempo, podem apresentar poucas chances de cura (7). Nos casos em que h suspeita de traumatismo fechado na cavidade abdominal, de leso interna associada a sinais clnicos no caractersticos e peritonite aguda ou pancreatite, realiza-se a lavagem peritoneal por meio da insero de 1 litro de soluo salina ou de Ringer para posterior anlise laboratorial. O lquido obtido por drenagem gravitacional, sendo que, para um resultado confivel, pelo menos 600 mL devem ser recuperados. As amostras geralmente so enviadas ao laboratrio somente para o exame citolgico (8).
Anlise laboratorial do lquido asctico

1. Coleta da amostra: pacientes com sintomas e suspeita de ascite tm seu diagnstico confirmado pela ultrassonografia, que detecta volumes variados de fluido. Ela auxilia tanto no diagnstico quanto na escolha do melhor local para a realizao. da paracentese,
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especialmente quando se lida com um volume pequeno de lquido asctico (8). Em geral, esse procedimento seguro, mas os riscos iatrognicos no so isentos. As principais complicaes so relacionadas perfurao de rgos abdominais, desvio da agulha do local indicado, deposio de fragmentos do catter no local da inciso e eventuais sangramentos (13). A tcnica contraindicada nos casos de paciente inconsciente no colaborativo com o procedimento, infeces na pele, gravidez e distenso intestinal (19). Uma paracentese bem sucedida deve satisfazer aos seguintes critrios: quantidade suficiente de fluido na primeira coleta, ausncia de complicaes e o mnimo de desconforto ao paciente durante o procedimento (20). O paciente colocado em uma posio supina, com uma inclinao de 30 a 45 para a retirada de grandes volumes ou em decbito lateral para a retirada de pequenos volumes. Os locais indicados para inciso da agulha a fim de evitar a perfurao de redes vascularizadas esto localizados na linha mdia, 2 cm abaixo do umbigo ou numa rea considerada incmoda no quadrante inferior esquerdo, lateralmente ao msculo retoabdominal. A agulha inserida na parede abdominal, aps anestesia local. A agulha utilizada possui calibre 22 e anexada a uma seringa que pode variar de 20 a 50 mL. A pele puxada de 1 a 2 cm da sua posio natural para evitar o retorno de lquido na hora da perfurao. Ento, a agulha inserida suavemente, e a aspirao feita de forma lenta permitindo o livre retorno do fluido asctico. Aps coletar a quantidade suficiente de amostra, a agulha retirada rapidamente, e, assim, a pele retorna sua posio normal. Um curativo feito no local, e a amostra encaminhada para as devidas anlises laboratoriais (20, 21). necessrio um mnimo de 30 mL para a avaliao completa do lquido asctico. Se possvel, pelo menos 100 mL devem ser fornecidos para o exame citolgico. As amostras devem ser coletadas em trs tubos identificados com nome, nmero de registro do paciente e data da coleta. O primeiro deve conter EDTA ou heparina (1 a 2 gotas para 5 mL) para a contagem global e diferencial. O segundo, sem anticoagulante, utilizado para as anlises bioqumicas, e o terceiro se destina microbiologia e deve ser estril (6, 7, 22). 2. Transporte e Armazenamento: a amostra deve ser analisada o mais rpido possvel, no entanto, caso o exame citolgico no possa ser realizado imediatamente aps a coleta, a amostra deve ser refrigerada entre 2 e 8 C para que suas caractersticas morfolgicas sejam mantidas por at 48h (22).
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3. Preparo da amostra: para a contagem de clulas nucleadas em cmara, utilizam-se amostras frescas, homogeneizadas e no centrifugadas. No entanto, na confeco da lmina, deve-se lanar mo de uma ressuspenso do sedimento obtido por centrifugao em baixa rotao em soluo salina. A sobreposio celular deve ser mnima. Em concentraes celulares ideais, uma monocamada de clulas formada, o que facilita a sua visualizao. Para isto, deve-se primeiramente avaliar a quantidade celular de cada amostra, e se for o caso, realizar a sua diluio pela adio de soluo salina, NaCl 0,9%. Amostras coaguladas, sem identificao e envelhecidas so rejeitadas (22). 4. Exame fsico: a primeira anlise aps a coleta o exame macroscpico. O aspecto visual do derrame (citrino, hemorrgico, purulento, etc.) o critrio inicial para agrupar diversas hipteses diagnsticas e direcionar para exames especficos de anlise laboratorial, alm de permitir adotar medidas teraputicas imediatas, como a drenagem no caso de empiema. O aspecto e a colorao devem ser anotados antes e aps a centrifugao (6, 7). Fisiologicamente, o lquido peritoneal ou asctico transparente, amarelo claro, estril e viscoso, mas, em alguns casos, ele pode sofrer transformaes como, por exemplo, apresentar turbidez em virtude das infeces bacterianas, colorao esverdeada em perfuraes do trato gastrointestinal, pancreatite e colecistite, um aspecto leitoso que no clareia aps a centrifugao em efuso quilosa ou pseudoquilosa (6, 8). Um lquido macroscopicamente hemorrgico deve ser diferenciado de puno traumtica, evitando, assim, erros de diagnstico. Na puno traumtica, o clareamento do fluido asctico observado no decorrer da paracentese e na ascite hemorrgica, pequenas quantidades de sangue colorem aproximadamente um litro de lquido peritoneal de vermelho vivo e opaco, de modo que as impresses no podem ser lidas a partir do tubo de lavagem. Isso corresponde a uma contagem eritrocitria de 100.000/L (7, 8). 5. Contagem global de clulas: a contagem global de clulas uma etapa muito importante para fazer a diferenciao da amostra entre transudato e exsudato. Os tipos celulares que podem ser encontrados no lquido peritoneal so os eritrcitos e as clulas nucleadas, que incluem leuccitos e clulas mesoteliais. A contagem global dessas clulas realizada comumente em cmara de Neubauer. No entanto pode ser realizada em qualquer retculo de contagem (8).

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As clulas nucleadas so contadas nos quatro quadrantes externos da cmara de Neubauer, cujo volume total de 0,4 mm. Algumas amostras podem ser contadas sem a realizao de uma diluio, e neste caso, o fator de converso para microlitros 2,5. J em amostras com elevada celularidade, pode-se realizar uma diluio em soluo aquosa de fucsina 0,2% na proporo (1:20). Essa soluo otimiza a contagem, sobretudo por corar o ncleo das clulas nucleadas e por provocar lise dos eritrcitos, os quais, dependendo da quantidade, dificultam a contagem. Neste caso, o fator de converso da cmara multiplicado pela diluio, passando a ser igual a 50 (1, 8). Para obteno de uma contagem mais precisa e confivel, esta deve ser realizada em ambos os lados do hemocitmetro. Se os valores obtidos resultarem em uma diferena maior que 10% entre si, o procedimento deve ser realizado novamente, pois esse fato indica erros tcnicos de preenchimento e montagem da cmara (22). A contagem de eritrcitos pode ser igualmente realizada em cmara de Neubauer, porm a rea de contagem a parte central. O procedimento de contagem de eritrcitos varia de acordo com a celularidade da amostra (Tabela 1) (22).
Tabela 1-  Procedimento de contagem global de eritrcitos em cmara de Neubauer, conforme a celularidade presente na amostra
Celularidade BAIXA INTERMEDIRIA ALTA ALTSSIMA (sobreposio de eritrcitos) Procedimento de contagem Contar os 25 quadrados maiores e multiplicar por 10. Contar 5 quadrados maiores e multiplicar por 50. Contar 1 quadrado maior e multiplicar por 250. Fazer diluio com salina e multiplicar o resultado final pelo fator da diluio.

Fonte: Dados da pesquisa.

6. Contagem diferencial de leuccitos: o papel da contagem leucocitria do lquido asctico, e sua anlise diferencial, de extrema importncia na sugesto diagnstica e consequente conduta teraputica adotada pelo clnico. Diferentes procedimentos e equipamentos podem ser utilizados para a confeco da lmina onde

se realiza a contagem diferencial, como a cmara de Suta, a citocentrifugao e a centrifugao em tubo. A cmara de Suta possui um sistema de filtros de papel, que absorvem a parte lquida do asctico, concentrando, assim, as clulas, o que fornece um esfregao de boa qualidade. A lmina introduzida na cmara e coberta com um papel absorvente, o qual deve conter um halo de dimetro discretamente menor que o di metro do tubo conector da cmara. O tubo conector torcido at tocar na lmina, e ento um aperto deve ser dado de modo a permitir a absoro da amostra por capilaridade. Na continuao do processo, o lquido colocado na cmara, sendo que a quantidade necessria dependente da quantidade de leuccitos presentes na amostra. Depois de a lmina seca, o tubo conector e o papel absorvente so retirados de cima da lmina, tomando o devido cuidado para que as clulas aderidas no sejam arrastadas. Ento, a colorao da lmina feita com May Grunwald-Giemsa ou outros corantes de Romanowsky (22). Na preparao da lmina por citocentrifugao, a amostra centrifugada em baixa rotao (1000 rpm), e o sedimento obtido ressuspenso em soluo salina. No citofunil adicionado 100l da amostra, a qual processada de acordo com o protocolo de funcionamento desse aparelho. As clulas ficam concentradas, visto que o lquido sobrenadante absorvido pelo papel filtro. Aps a secagem da lmina, realiza-se a colorao (22). Aps a lmina pronta, realiza-se a contagem diferencial celular. Primeiramente observa-se a distribuio e agrupamento celular, em objetiva de 10x e 40x e ento se muda para a objetiva de imerso (100x) em que a diferenciao celular propriamente feita. As clulas podem sofrer alteraes aps a citocentrifugao mostrando-se distorcidas com vacolos e projees citoplasmticas, fendas nucleares, nuclolos proeminentes e agrupamentos celulares semelhantes neoplasia (22). As contagens celulares variam de acordo com a formao e resoluo da ascite, como a diurese que pode aumentar a contagem leucocitria de 300 clulas/l at 1.000 clulas/l (8). 7. Consideraes sobre a anlise morfolgica das clulas: primeiramente, uma viso geral da qualidade de uma amostra citolgica realizada com o auxlio das objetivas de 10x e 40x. Nessas ampliaes, o examinador pode estimar a celularidade da amostra, examinar agregados celulares, identificar agentes infecciosos grandes como, por exemplo, leveduras
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e elementos fungoides e determinar as melhores localizaes da lmina, onde as clulas esto distribudas em uma monocamada, para se observar posteriormente em maiores aumentos. A observao em aumento de 1.000x utilizada para examinar as bactrias, a estrutura das clulas e outras estruturas pequenas tais como incluses celulares. O citodiagnstico enfatiza a aparncia geral das clulas e seus ncleos. As caractersticas celulares importantes incluem a celularidade da amostra, a distribuio celular, tamanho e forma das clulas e a aparncia citoplasmtica. As caractersticas nucleares mais importantes incluem o tamanho, a forma e a posio do ncleo dentro da clula, o nmero de ncleos atuais; o padro da cromatina do ncleo; a aparncia do nuclolos e a presena de figuras de mitose. O tamanho do ncleo das clulas avaliado frequentemente com relao quantidade de citoplasma. A relao ncleo citoplasma (N:C) uma indicao da proporo entre o tamanho do ncleo e o volume citoplasmtico. As clulas epiteliais maduras, bem diferenciadas, tendem a ter ncleos pequenos e uma baixa relao N:C, enquanto as clulas epiteliais malignas, indiferenciadas, tm frequentemente grandes ncleos e uma relao N:C elevada. A forma do ncleo varia de acordo com o tipo celular. A maioria das clulas normais tem um nico ncleo; entretanto algumas clulas normais podem conter mltiplos ncleos. Por exemplo, algumas clulas mesoteliais so binucleadas, e alguns macrfagos podem ser multinucleados. Os padres apresentados pela cromatina nuclear geralmente incluem cromatina de distribuio uniforme e finamente granulada, cromatina de distribuio irregular e finamente granulada, cromatina grosseira e granular com distribuio uniforme e cromatina grosseira e granular com distribuio irregular. A cromatina finamente granulada indica geralmente a imaturidade nuclear. Alguns ncleos como, por exemplo, ncleos de linfcitos maduros, contm frequentemente alguns agrupamentos de cromatina que simulam nuclolos proemientes. As figuras de mitose indicam diviso celular ativa e pode ser uma caracterstica celular normal em alguns tecidos, tais como a medula ssea e o fgado, quando forem encontradas em baixas quantidades. Nmeros elevados de figuras de mitose indicam anomalias, tais como a neoplasia. Os nuclolos aparecem como espaos desobstrudos, circulares dentro do ncleo das clulas coradas por corantes de Romanoswski. Muitas clulas normais contm frequentemente um ou vrios
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nuclolos pequenos. Os nuclolos grandes e irregulares so considerados anormais. Ncleos com numerosos nuclolos, geralmente acima de cinco, so considerados igualmente anormais (1). As caractersticas do fundo da lmina de um espcime citolgico no devem ser negligenciadas porque podem fornecer indcios quanto natureza do material que est sendo examinado. Por exemplo, lminas que contm muitas clulas secretoras podem ter o material de fundo pesado por causa da acumulao do produto secretado. Um fundo finamente granulado nas lminas de exsudatos inflamatrios pode ser observado em preparaes coradas com azul de metileno novo e sugere um aumento no teor de protenas. Um fundo grosseiro e granulado pode ser visto em lminas preparadas com amostras contendo quantidades elevadas de mucopolissacardeos como mucina, quando coradas por May Grunwald- Giemsa. A presena de bactrias, de cristais, de gotas de lipdeos, de materiais nucleares das clulas rompidas e de materiais estranhos como, por exemplo, plen, talco ou cristais do amido, deve ser igualmente descrita no resultado. As amostras citolgicas tambm podem conter quantidades variveis de sangue perifrico. A contaminao excessiva de sangue perifrico em uma amostra de lquido asctico mascara as clulas diagnsticas, tornando a interpretao citolgica mais difcil (1). 8. Controle de qualidade das contagens: de fundamental importncia que se faa o controle de qualidade nas cmaras de contagem, evitando, assim, qualquer interferente que altere o resultado final da contagem. O controle de qualidade das contagens em cmara pode ser feito diluindo-se uma amostra de sangue total em EDTA e comparando-se os resultados obtidos manualmente com os obtidos em analisadores hematolgicos automatizados. Para o controle da contagem de clulas nucleadas, deve-se escolher uma amostra com 10.000 leuccitos/l (valor obtido em contagem automatizada) e fazer a contagem manual em cmara de Neubauer, de preferncia diluindo-se a amostra em lquido de Turk para hemolisar os eritrcitos. Quinzenalmente, deve-se verificar se houve contaminao dos diluentes (soluo de fucsina, lquido de Turk e soluo salina), examinando-os em cmara de contagem com aumento de 40x. Os diluentes contaminados com partculas ou fungos devem ser descartados e novas solues devem ser preparadas. Semestralmente, preciso realizar a manuteno preventiva da citocentrfuga para verificar a velocidade e o tempo de citocentrifugao (22).

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fato que a contagem diferencial de neutrfilos manual e automatizada se correlaciona e pode ser intercambivel. Para garantir a qualidade da metodologia utilizada, pode-se fazer a adeso do laboratrio a programas de controle de qualidade externos que realizem a anlise do lquido asctico (22). 9. Deteco de clulas malignas no lquido asctico: doenas malignas, acompanhadas da cirrose, so as causas mais comuns de ascite. Independentemente do tempo de aparecimento, o achado de clulas neoplsicas nas efuses ascticas est associado a uma significativa implicao teraputica e prognstica, pois uma propagao celular alheia ao rgo de origem, portanto, uma progresso tumoral. As clulas malignas nos derrames so frequentemente encontradas entre os macrfagos e populaes de clulas mesoteliais em efuses. Alm disso, as clulas mesoteliais podem reagir a uma ampla variedade de estmulos e ferimentos, de modo que fiquem com morfologia semelhante s clulas malignas. Essas alteraes podem ser ainda mais acentuadas aps radioterapia ou quimioterapia associadas cirurgias e tratamento dessas malignidades. Diante dessas implicaes clnicas, diagnstico preciso dessa condio de fundamental importncia (23). 9. Biossegurana: o lquido asctico uma amostra contaminante. Para tanto, necessria a utilizao dos equipamentos de proteo individual (EPIs) como avental ou jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, luvas descartveis, culos de proteo, pipetadores manuais ou automticos e, quando for o caso, protetor facial. O ideal seria se todos os laboratrios possussem uma cmara de fluxo laminar vertical para maior proteo do operador (22).

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