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COLUMNA DE WINOGRADSKY

UNIVERSIDAD CENTRAL
La columna de Winogradsky es un mtodo de fcil construccin y anlisis pero efectiva manera de simular ambientes de ecosistemas, especialmente las interacciones de microorganismos en suelos. (Bautista Francisco, 2004, P. 195)

Biogeoqumica

Sonia Lucia Gonzales Cardona Stephanie Toro Castaeda Juan Camilo Contreras Andrs David Ramrez Vivas David Alejandro Ruiz Galeano

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COLUMNA DE WINOGRADSKY OBJETIVOS. Generar un ecosistema en el laboratorio donde aparezcan distintos tipos de bacterias interrelacionadas metablicamente. Identificar las diferentes etapas que ocurren durante el ciclo del azufre

MATERIALES Y REACTIVOS Esptula Botella plstica de 500 mL Papel peridico. Lodo rico en materia orgnica. Sulfato de Calcio. Carbonato de Calcio Huevo Carbonato cido de sodio Cloruro de amonio Balanza.

PROCEDIMIENTO 1. Para realizar la columna se utiliza una probeta de 100 ml o una botella plstica de agua o gaseosa. 2. Aadir una fuente de carbono y energa para la cadena trfica microbiana, en este caso es celulosa, que puede administrarse en forma de tiras de papel peridico. Es importante que la celulosa permanezca en el fondo o en la zona intermedia, pero no en la zona superficial 3. Se llena la columna con lodo, (materia orgnica), hasta 1/3 de su volumen. 4. Se aade a la mezcla una fuente de sulfato (sulfato de calcio, CaSO4 o yeso) y un agente tempanador del pH (carbonato de calcio, CaCO3). 5. El lodo tambin puede mezclarse con el contenido de un huevo, como fuente de azufre. Se aade tambin bicarbonato sdico (NaHCO3), cloruro de amonio (NH4Cl) y tampn fosfato pH 7,3. La mezcla se compacta para forzar la salida de las burbujas de aire, hasta obtener una capa de unos 10 cm.

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COLUMNA DE WINOGRADSKY 6. Se aade agua, de charca, hasta rellenar casi completamente la columna (hay que dejar con aire unos 5 cm de la misma). Si no se dispone de suficiente agua de ro, se puede terminar de llenar la columna con agua corriente. 7. Se tapa la columna, con parafina o con papel de aluminio con la tapa del envase, para evitar la evaporacin. Se coloca cerca de una ventana donde reciba luz solar atenuada, y se deja durante varias semanas. 8. Se examinar la columna peridicamente, anotando los cambios de color y grosor de las diferentes capas. Se tomarn muestras de las capas para estudiar los diferentes tipos de microorganismos. MARCO TEORICO Los ecosistemas tienen complicadas relaciones de metabolismos bacterianos donde los ciclos biogeoqumicos tienen fundamental importancia. Esto hace del estudio de microorganismos en ecosistemas naturales, una actividad difcil de hacer debido a la complejidad de las relaciones entre organismos vivos y la magnitud del campo a estudiar (Moreno, 2012). Por lo anterior, se simplifica el campo de estudio por medio de la Columna de Winogradsky, donde en una representacin de ecosistema anaerbico microbiano simple, se pueden estudiar fcilmente los ciclos biogeoqumicos, las relaciones1 y diferencias entre diferentes tipos de microorganismos de distintas comunidades y metabolismos energticos; adems permite observar cmo los microorganismos altamente especficos ocupan microespacios dependiendo de sus necesidades de supervivencia y reproduccin, como sus requisitos de carbono, energa y oxgeno. Esta simulacin de ecosistema, slo requiere de energa lumnica para su mantenimiento, es autnomo y completamente autoreciclable (UNAM) (Moreno, 2012) (Santos, 2009). La columna de Winogradsky se dise en 1880 con objeto de estudiar los microorganismos del suelo, se ha usado de manera recurrente en el aislamiento de bacterias fototrficas rojas y verdes, y de otros anaerobios (Santos, 2009); fue diseado por el ruso Sergei Winogradsky quien con Martinus Willem Beijerinck fueron los primeros en estudiar las relaciones entre variados microorganismos en un mismo hbitat. El ruso precursor de la columna, fue uno de los fundadores de la ecologa microbiana y de los ciclos biogeoqumicos a finales del siglo XIX y principios del XX (Moreno, 2012).

La actividad metablica de un microorganismo puede inhibir o favorecer el crecimiento de otros microorganismos.

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COLUMNA DE WINOGRADSKY La construccin de la columna de Winogradsky se hace en un recipiente transparente donde se adicionan muestras de suelo hmedos, que se enriquecen con materiales orgnicos e inorgnicos, posteriormente el recipiente se expone a la luz natural y se observan y analizan los cambios, en la que probablemente haya una sucesin (Santos, 2009) (Moreno, 2012); donde despus de 3 4 semanas aumenta la poblacin de microorganismos, que se establecen en diferentes partes de la columna de acuerdo a sus caractersticas fisiolgicas (UNAM). Pueden construirse Columnas de Winogradsky para cada ciclo biogeoqumico, la Columna ms usada para prcticas de laboratorio es en la que involucra el ciclo del azufre como elemento principal. Estratificacin La asientacin de los microorganismos forma diferentes estratos en la columna. En la zona inferior, en ausencia de oxgeno, se desarrollan microorganismos anaerbicos de actividades fermentativas produciendo como subproductos de su metabolismo alcohol, cidos orgnicos, cido sulfhdrico, metano, hidrgeno y cidos grasos que sirven como sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato. Los subproductos liberan productos sulfurados que se expanden a la capa superior creando intercambios de sulfuro de hidrgeno en diferentes concentraciones en cada capa; luego las bacterias rojas (bacterias rojas del azufre), prpuras y verdes (bacterias verdes del azufre), se estratifican de acuerdo a su tolerancia al sulfuro de hidrgeno, en el medio de esta zona se ubican bacterias rojas y verdes no del azufre. En la zona media, microaerfila, se hayan bacterias oxidadoreductoras aerobias y bacterias fotosintticas que usan los compuestos qumicos para su metabolismo. Una capa superior, pueden hallarse organismos aerbicos como algas verdes eucariotas y cianobacterias que liberan oxgeno y mantienen esta zona de la columna aerbica, dichos organismos crecen rpidamente en esta capa de la columna (Moreno, 2012) (Santos, 2009). Cuadro de identificacin de potenciales microorganismos en base a la coloracin de estratos. COLOR Verde Rojo/marrn Rojo/prpura Blanco Rojo/prpura Verde Negro MICROORGANISMOS Algas y Cianobacterias Cianobacterias o Tiobacilos Bacterias prpuras no del azufre Bacterias sulfo-oxidadoras Bacterias prpuras del azufre Bacterias verdes del azufre Bacterias sulfo-reductoras o fermentadoras (Moreno, 2012)

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Las algas y cianobacterias forman una capa superficial de color verde brillante, y al producir oxgeno ayudan a mantener la aerobiosis en la zona superior de la columna, mientras que, en el fondo de la columna, las bacterias reductoras del sulfato (SO4-2) producen sulfuro, que provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre, de modo que se establecen dos gradientes en la columna, uno deoxgeno y otro de sulfuro de hidrgeno (H2S). Las bacterias quimiorganotrofas crecen a lo largo de toda la columna, los microorganismos aerobios y microaerfilos en la parte superior, los anaerobios en las zonas donde hay sulfuro de hidrgeno, al cabo de cuatro o seis semanas comenzarn a observarn una serie de comunidades microbianas en la columna, que de arriba abajo son: (ver figura)

Principales reacciones (desde la parte superior a la inferior en la Columna de Winogradsky)

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COLUMNA DE WINOGRADSKY CO2 + 2 H2O (CH2O) + H2O + O2 Fotosntesis SH2 + 2 O2 H2SO4 Organismos del S 2 SH2 + O2 2 S + 2 H2O Beggiatoa y Thiothrix CO2 + 2 SH2 2 (CH2O) + 2 S + H2O Anoxigenica (CH2O)2 + SO4-2 + 8 H+ 3(CH2O) + CO2 + S-2 + H2O Quimioorganotrofo y anaerbico En las dos ltimas capas de la columna, las Cianobacterias producen la fotosntesis usando el agua como cedente de electrones con liberacin de oxgeno molecular, por ende se produce una zona oxignica (Sagardoy, 2004). Clasificacin de microorganismos La identificacin de los microorganismos presentes en la Columna de Winogradsky generalmente se hace de manera macro, observando la coloracin, las caractersticas y comportamiento a travs del tiempo de los materiales que componen la Columna. Hacer un anlisis ms profundo para determinar de manera exacta las concentraciones de la solucin y los microorganismos presentes en ella requiere de procedimientos ms complejos, que pueden involucrar algunas herramientas de difcil adquisicin (Santos, 2009). Pigmentos microbianos: Una forma de identificacin de microorganismos puede ser posible por sus caractersticas de los pigmentos microbianos, los cuales suelen ser carotenoides y clorofilas; especialmente los carotenoides se encuentran en todo el Reino Vegetal en tejidos fotosintticos y no fotosintticos. Cuando los pigmentos se extraen para su estudio, se debe hacer con especial cuidado debido a su fragilidad con la temperatura, luz y aire; estos elementos favorecen diferentes reacciones en los pigmentos que pueden provocar su degradacin o descomposicin. Por tal motivo, se debe (preferiblemente) realizar la prctica lo ms rpido posible, en ausencia de luz, oxgeno y a temperatura ambiente o menor. Despus de haber obtenido el extracto de carotenoides, se pueden separar por liofilizacin, ste mtodo tiene mejores ventajas respecto a los dems porque se realiza a baja temperatura y al vaco.

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COLUMNA DE WINOGRADSKY Cromatografa: La determinacin de presencia y cantidad de microorganismos por cromatografa se hace por medio de la separacin por competencia de dos fases, una fija y otra mvil. La muestra que es aplicada a la fase fija es adsorbida por la actividad de fuerzas electrostticas en la superficie del material, luego se liberan en dependencia a la constante de afinidad de los componentes de la muestra de fase mvil. Cromatografa en Capa Fina (CCF): En esta tcnica de separacin, la fase fija est sobre un plano, haciendo una capa de partculas slidas esparcida sobre una placa de vidrio o aluminio que sirve como soporte. La muestra se aplica en puntos o en banda, para seguidamente, ser diluida en un tanque cromatogrfico. Si los elementos de la muestra no pasan de incoloros a coloros, puede ser necesario usar el revelado de la placa, mtodo que permite visualizar los elementos presentes en la muestra. El mtodo requiere contar con un patrn de referencia para comparar el valor de efecto retardo (Rf) de la muestra a analizar y el color de la muestra estndar al ser revelada con agentes qumicos Mtodo de revelado de placa: El mtodo de revelado de placa se puede hacer por mtodo qumico o mtodo fsico. En el primero se obtienen derivados coloreados o fluorescentes de los componentes de la muestra. En el segundo, con radiacin con luz UV a la placa cromatogrfica a 254nm-365nm. Caracterizacin espectral: Cuando hay carotenoides que no se pueden identificar por CCF, revelado de placa y comparacin de muestras, se debe recurrir a identificacin por mtodos espectrales, tales como UV-visible, iR, EM y RMN (Resonancia Magntica Nuclear). El espectro visible de los carotenoides se encuentra alrededor de 400 a 500nm. El espectro por iR es poco til y rara vez se usa, pero tiene utilidad en carotenoides de poca aparicin en las muestras.

DATOS OBTENIDOS 15 DE FEBRERO: primera toma que se basa en la construccin de la columna de winogradsky 3 DE MAYO: 2 toma que se basa en la observacin de la columna pasados 3 meses aproximadamente

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DIMENSIONES FINALES DE CADA UNA DE LAS CAPAS PRIMERA CAPA (papel peridico) SEGUNDA CAPA (tierra) TERCERA CAPA (parte liquida) 6,8cm 4,7 cm 5 cm

CUESTIONARIO

1. Realice los dibujos correspondientes a cada una de las observaciones realizadas

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2. Investigar las principales reacciones de oxidacin y reduccin que se presentan en las zonas de la columna indicando la clase de microorganismos. Zona aerbica: Esta es la parte de la columna ms rica en oxgeno y ms pobre en azufre. El agua de la parte superior de la columna contiene abundantes poblaciones de microorganismos aerobios, que aparecen normalmente en hbitats acuticos ricos en materia orgnica (estanques poco profundos, arroyos, etc.). Suelen ser microorganismos flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en nuevas reas, as como microorganismos fotosintticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El oxgeno que producen estos productores primarios difunde desde la superficie, creando condiciones similares a las que existen en un lago con sedimentos ricos en nutrientes. Zona microaerfila: Es la zona en la que solapan ambos gradientes, el de oxgeno y el de sulfuro de hidrgeno. Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como Beggiatoa Thiothrix o Thiobacillus, que usan como fuente de carbono la materia orgnica, y oxidan el H2S que llega por difusin desde las capas inferiores a azufre elemental. La reaccin qumica que se lleva a cabo es la siguiente (reaccin de Bunsen): O 2+ H2S H20 + S. Son, por lo tanto, microorganismos mixtrofos. Estos gneros acumulan grnulos de azufre en sus citoplasmas por oxidacin del H2S. Si se deja evolucionar el sistema, cuando la concentracin de H2S es muy baja, los grnulos de azufre elemental intra- citoplasmtico

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COLUMNA DE WINOGRADSKY presentes en estas bacterias empiezan a desaparecer poroxidacin total a sulfato (H2S S0SO4 (2 )) Zona anaerbica: Esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona anaerbica superior predominan las bacterias fotosintticas anaerobias, y en la columna se observan bandas de colores rojo y verde: Bacterias rojas no del azufre: Rhodospirillum, Rhodomicrobium Rhodopseudomona, son bacterias anaerobias fotoorgantrofas, que slo pueden realizar la fotosntesis en presencia de una fuente de carbono orgnico. Forman una capa de color rojo-anaranjado. Las bacterias verdes no del azufre son termfilas y, por lo tanto, no crecen la columna a temperatura ambiente. Bacterias rojas del azufre: (Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa, forman una capa de color rojo-prpura) y bacterias verdes del azufre, (Chlorobium, Pelodyctium). Estas bacterias son fotolittrofas y realizan una fotosntesis anoxignica, no producen oxgeno ya que no utilizan H2O como elemento reductor sino H2S, generando en este proceso sulfatos (SO4-2). La reaccin que tiene lugar es la siguiente: 2 H2S + CO2 (CH2O) + H2O + 2 S0 Estos microorganismos aparecen como zonas decrecimiento en el lodo de la columna, pero tambin pueden desarrollarse en el agua si los fottrofos oxignicos son escasos.

En la zona anaerobia ms profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos capaces de realizar respiracin anaerbica y fermentacin. Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter Desulfotomaculum o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandes cantidades de H2S en el proceso. La reaccin de reduccin bacteriana del sulfato es la siguiente: SO4-2 + 8 H+ H2S + 2 H2O + 2 OH. Este H2S reaccionar con el hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro (II), que precipita y da el color negro. Es por esto que, en la naturaleza, los sedimentos acuticos son frecuentemente negros. La reaccin sera la siguiente:

Sin embargo, no todo el H2S reacciona con el hierro (II), parte de ste difunde hacia arriba a lo largo de la columna de sedimentos y es utilizado por las bacterias verdes y rojas del azufre que crecen en las zonas superiores.

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COLUMNA DE WINOGRADSKY Bacterias fermentadoras: utilizan la celulosa del papel aportado como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del gnero Clostridium Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxgeno desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan la celulosa hasta residuos de glucosa y, a continuacin, fermentan la glucosa para obtener la energa que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgnicos simples (etanol, cido actico, cido lctico, cido succnico, etc.) como productos finales de esa fermentacin. Estos compuestos orgnicos sern, a su vez, respirados por las bacterias reductoras del sulfato. Cuando la celulosa se agote, usarn la materia orgnica producida por el resto de bacterias.

Tambin pueden aparecer bacterias metanognicas que generan CH4, que se observa como burbujas de gas en el fondo de la columna

3. Investigar cmo se relaciona la practica con los ciclos biogeoqumicos.

La transformacin de los elementos claves para la supervivencia de los organismos dentro de la columna tienen relacin con los ciclos biogeoqumicos, pues las relaciones de transformacin y traslado de compuestos de una clase de organismos a otro, se da por medio de los nombrados ciclos biogeoqumicos (UNAM).

La columna de la prctica se enfoca sobre todo al ciclo del azufre, pero se podra desarrollar igualmente la reproduccin de otros ciclos biogeoqumicos equivalentes para nitrgeno, carbono y otros elementos.

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COLUMNA DE WINOGRADSKY Las bacterias y arqueas tienen gran cantidad de diferentes formas metablicas, que son mantenidas por las relaciones y dependencias que hay entre microorganismos, unos incentivan el crecimiento de otros y algunos inhiben el desarrollo de otros microorganismos. La mineralizacin2 o solubilizacin3 de un compuesto y la oxido-reduccin del cometabolismo de los microorganismos con interacciones con los ciclos biogeoqumicos4 dependen de las condiciones ambientales. Estos organismos incentivan el desarrollo de sus pares. En funcin de la actividad enzimtica de los microorganismos, pueden usar elementos o compuestos orgnicos e inorgnicos de la naturaleza, tal como ocurre con el fsforo, dado que la mayora del elemento en la naturaleza, est atrapado en las rocas y en el suelo y algunos otros se encuentran en condiciones insolubles en agua; la disponibilidad del elemento para los organismos vivos es limitada. En razn a lo anterior, puede radicar la importancia del ciclo del fsforo, en la medida que se produce la mineralizacin y solubilizacin de las formas insolubles y la asimilacin de los fosfatos inorgnicos. El azufre abunda en la corteza terrestre, se encuentra disponible como sulfato soluble o en compuestos orgnicos; el ciclo biogeoqumico del azufre se produce por la reduccin a H2S por cuenta de los microorganismos, posteriormente el sulfato reducido por la reaccin de oxidacin es usada por bacterias anaerbicas para su metabolismo. El azufre es uno de los numerosos compuestos orgnicos, algunos forman protenas, otros llegan a plantas y productores primarios en forma de ion sulfato SO4-2; los organismos lo incorporan a las molculas en forma de protena y luego, por cadena trfica, llegan a organismos superiores. Cuando estos mueren, el azufre de las protenas se descompone y entra al ciclo del azufre en forma de ion sulfato en que las plantas pueden usarlo nuevamente. El antagonismo o antibiosis es el caso en el que los metabolitos inhiben el crecimiento de otros organismos, por medio de la produccin de sustancias txicas (en concentraciones menores a 10 ppm) para los otros microorganismos (UNAM)

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Por mineralizacin se entiende por la transformacin de un compuesto orgnico, a uno inorgnico Solubilizacin est definida como la transformacin de un compuesto de una forma insoluble, normalmente inorgnica, a otra soluble en agua. Por lo cual los compuestos quedan disponibles para los organismos. 4 Las transformaciones se realizan por medio de reacciones de xido-reduccin de elementos como el Nitrgeno, Azufre, etc., por consiguiente algunas transformaciones ocurren en ambientes aerobios o anaerbicos.

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COLUMNA DE WINOGRADSKY Anlisis En la prctica se busc identificar de manera general, las caractersticas de los compuestos y la presencia de microorganismos en un micro-ecosistema construido con una muestra de lodo, papel peridico y otros compuestos orgnicos e inorgnicos. En ella se puede observar en la Columna de Winogradsky la an abundante presencia de celulosa (representada en papel peridico), la cual tiene la capa de mayor tamao. La zona anaerobia es la zona de menor tamao entre las tres capas identificadas, en ella hay menor cantidad de bacterias. En la ltima capa, la zona aerobia y microaeroflica hay mayor presencia de oxgeno y por ende, mayor presencia y actividad microbiana. La coloracin de las capas, especialmente en la capa microaeroflica y anaerbica no es clara, posiblemente debido a que durante la prctica se agit la Columna y la coloracin se torn homognea.

Conclusiones En la capa anaerobia hay presencia de bacterias reductoras que dan el aspecto negro observado en la Columna analizada, stas componen la mayor parte de la poblacin de los microorganismos en la capa, a juzgar por su coloracin. La ausencia de lodo, el ambiente anaerobio observado y la descomposicin de parte de la celulosa, evidencian la presencia de bacterias Clotridium. En las capas microaeroflicas y aerobias se observan una mayor cantidad de actividad y poblacin de bacterias; en ella no se visualizan bacterias prpura no del azufre, tampoco bacterias prpuras del azufre. A pesar de que las coloraciones no son lo suficientemente claros, se puede especular que hay presencia de algas, Cianobacterias, Tiobacilos, bacterias sulfo-oxidadoras y bacterias sulfo-reductoras o fermentadoras

BIBLIOGRAFIA

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Sagardoy, M. (2004). Biologa del suelo. Baha Blanca, Argentina: Editorial de la Universidad Nacional del Sur. Santos, A. (13 de Julio de 2009). Revista Reduca. Recuperado el 12 de Mayo de 2013, de http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/802/818 UNAM. (s.f.). UNAM. Recuperado el 12 de Mayo de 2013, de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/DiversidadMicrobianaColumnaWinogradsky _21554.pdf

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