UNIVERSIDAD CATLICA SANTA MARA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS, BIOQUIMCAS Y BIOTECNLOGICAS

PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERA BIOTECNOLGICA

PROYECTO DE INVESTIGACIN
Aislamiento y Caracterizacin de microorganismos nativos Bioxidantes de minerales refractarios.

ALUMNOS

MARIA ALEJANDRA SALAMANCA GERMAIN FIGUEROA SNCHEZ CESAR MUNIVE TALAVERA KAREN PACO MENDIVI

SEMESTRE CURSO

: VII : INENIERIA GENTICA II

DOCENTE

: Dra. ROSARIO VALDERRAMA

AREQUIPA 2013

TITULO Aislamiento y Caracterizacin refractarios. RESUMEN La amplia biodiversidad de nuestro Pas se manifiesta a travs de distintos formas biolgicas, es as que, en los distritos mineros de San Rafael (Puno) y la Provincia de Caraveli (Arequipa) se tomaron muestras de relaves y rocas para la identificacin de organismos nativos que forman parte de los procesos naturales de lixiviacin de minerales refractarios. Mediante mtodos de identificacin se lograra detectar la presencia de cepas de Thiobacillus ferrooxidans y especies nativas no determinadas, los mismos que sern aislados, cultivados, experimentados y conservados en medios apropiados. La presente investigacin pretende estudiar la adaptacin individual y conjunta de las bacterias en sistemas adecuados de agitacin y aireacin, en los cuales se ha colocado concentraciones distintas de muestras aurferas refractarias que provienen de los procesos de recuperacin de oro por mtodos tradicionales, a fin de comprobar su efectividad como pretratamiento en los procesos de cianuracin y sulfuracin. La presencia de Thiobacillus ferrooxidans en condiciones cidas ha sido ya probada con anterioridad, sin embargo, la presencia de especies nativas nuevas en estas condiciones son estudiadas para probar su eficacia como otra alternativa para la biolixiviacin. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIN La gran minera es una actividad que genera la mayor parte del actual crecimiento de nuestro PBI y paga casi la mitad del impuesto a la renta recaudado. Sin embargo es tambin el eje de un modelo que inhibe la industrializacin del pas y no produce trabajo decente para los peruanos. Adems, disputa el agua con las comunidades aledaas y produce pasivos ambientales en muchos casos irreparables. La alternativa frente a esta situacin no es cancelar la actividad minera, si no promover una nueva minera, econmica, social y ambientalmente sustentable, para ello se requiere de la innovacin cientfica tecnolgica de nuevas alternativas de explotacin y extraccin. Una de las alternativas con las que se cuenta es la Biolixiviacin. Desde los aos 40 fue demostrado que entre los procesos implicados en la oxidacin de minerales sulfuroso, existen reacciones biolgicas que involucran la actividad de microorganismos. En particular se ha reconocido a bacterias de la especie Thiobacillus ferrooxidans, por su habilidad para acelerar la disolucin oxidativa de minerales sulfurosos presentes en minerales residuales de minas, lo que incrementa la generacin de acidez producto de la oxidacin de algunos minerales sulfurosos (Colmer y Hinfle, 1947; Colmer el al., 1950). Este hallazgo ha sido importante no solo para la economa industrial (con la aplicacin de los procesos de biolixivacin), sino tambin para aminorar los efectos del impacto ambiental controlado la actividad de estos microorganismos. Por lo que la biotecnologa se considera en la actualidad, como alternativa de la solucin a problemas que incluyen al impacto ambiental. En este trabajo se planea aislar e identificar cepas nativas presentes en relaves de mineros de metales refractarios (oro y estao) HIPOTESIS El proceso de biolixiviacin para la recuperacin de oro a partir de pirita y arsenopinta y estao a partir de Calciterita, se podra incrementar, usando cepas nativas y modificadas de Thiobacilhts ferrooxidans con alta resistencia a metales pesados. Para demostrar nuestra hiptesis, nos hemos planteado los siguientes objetivos: de microorganismos nativos Bioxidantes de minerales

OBJETIVOS 1.- Aislamiento de cepas nativas de T. ferrooxidans a partir de diferentes relaves mineros. 2.- Determinacin de la resistencia natural a As, Mo, Cu, Cd, Hg y Ag. 3.- Obtencin de cepas con alta resistencia a arsnico. 4.- Anlisis de enzimas de restriccin del DNA ribosomal 16s amplificado ARDREA 5.- Anlisis Bioinformtico BLAST

MATERIAL Y METODOS Obtencin de muestras: Las muestras de relaves de estao se obtuvieron de relaves Mina San Rafael del consorcio Minsur, que se ubica en el Regin de Puno, Provincia de Melgar Ayaviri distrito de Antauta a 4500 mnsm. La muestras de relaves de oro de fueron obtenidas rocas relaves de la Minas Eugenia ubicadas en la regin de Arequipa, provincia de Canana. Las muestras se recolectaron en frascos estriles de 100 ml. Una alicuota de 10 ml sera transferida a un matraz de 250 ml conteniendo 90 ml de medio lquido 9K suplementado con FeS04-7H20 (Silverman y Lundgren, 1959), ajustando el pH= 3.0 con H2SO4. Las muestras se incubaran a 30C en agitacin constante (175 rpm) en una incubadora con agitacin, para el caso de relaves de estao se probar un nuevo mtodo de aislamiento con agarosa y sales filtradas presentes en rocas.

Aislamiento de cepas de T. ferrooxidans. A partir del cultivo de pre-enriquecimiento, se tomara una alcuota de 50 ul y se distribuir homogneamente sobre cajas de Petri, conteniendo diferentes medios selectivos (Harrison, 1989; Kelly y Harrison 1989) para la identificacin de cepas de T. ferrooxidans y de otro tipo de microorganismos presentes en estos consorcios. Las cepas puras de T. ferrooxidans seran crecidas en medio lquido 9K suplementado con sulfato ferroso, para su caracterizacin posterior, y unas alcuotas sern almacenadas en presencia de glicerol al 50% en un congelador 70C. El mtodo utilizado para obtener cepas resistentes a metales pesados, ser a presin selectiva, en la cual se aadieran a cultivos bacterianos en medios lquidos 9K, cantidades crecientes de metales pesados (CuSO4-5H2O, HgCl2, CdCl2, Na2MoO4-2H2Oy AgNO3) que ser registrado en etapas sucesivas de 200 en 200 ppm, hasta lograr tener crecimiento de bacterias a la concentracin mayor de 1,800 ppm. Anlisis de enzimas de restriccin del DNA ribosomal 16s amplificado ARDREA

Antes de extraer el DNA se filtrara 20ml de cultivo de los microorganismo en condiciones de esterilidad y al vaco con papel filtro de 3um de poro; los filtrados se lavaran con acido sulfrico hasta alcanzar una concentracin final del acido de 10mM, y luego se extraer el DNA siguiendo la metodologa descrita por Johnson ET al (2005) Para la amplificacin del gen 16s ribosomal por PCR se utilizaran los cebadores universales 27 f (5 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3) y 1492r (5 TACGGYTCCTTGTTACGATT 3 ) Una alcuota de DNA genmico bacteriano se combinar con 2,5 ul de buffer de reaccin (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl pH 8,8 a 25C); 1,25 ul de MgCl2 (50 mM); 0,5 ul de mezcla de desoxinucleosidos trifosfato (dNTP 10Mm cada uno); 0,125 ul de cada cebador (100uM), y 17,75 ul de agua desionizada; a esta mezcla se le adicionara 1U de Taq DNA

Polimerasa. Las reacciones de amplificacin se realizaran en un termociclador con el siguiente perfil trmico: desnaturalizacin inicial a 95C por tres minutos; 40 ciclos de desnaturalizacin a 95 C por un minuto, alineamiento de cebadores a 52 C por un minuto , y elongacin a 72 C por 30 segundos; incubacin a 72 C por 10 minutos. Los productos de PCR sern digeridos con las enzimas de restriccin Xcml, BasAl, Eco24I y Eco 721 segn las recomendaciones de los fabricantes. Estas enzimas se seleccionaron por su habilidad para discriminar entre bacilos gran negativos, mesofilos los ( Xcm, Eco24I) o moderadamente termfilos Eco 721 y BasAl) con capacidad de oxidar (Johson et al., 2005) debido a que no se contaban con los patrones de restriccin de microorganismos acidofilos oxidadores de azufre. Se realizara un anlisis de secuencias del gen 16s ribosomal publicadas en la base de datos primarias GenBank, EMBL y DBJ, Adems con ayuda de los programas Bioedit y Webcutter.

El DNA extrado y los fragmentos obtenidos por PCR, se separaran por electroforesis sembrando 5ul de la mezcla de reaccin en gel de agarosa al 0,8 % de p/v en buffer TBE 0.5X , por 60 min a 70 voltios; y se teirn con 0,1 uL/mL de bromuro de etidio, y se analizaran los patrones de las bandas. CRONOGRAMA PRIMERA SEMANA ABRIL DEL 8 -14 DE Recoleccin de muestras

SEGUNDA SEMANA DEL 15- 21 DE Preparacin de medios inoculacin de muetras ABRIL

de

cultivo

TERCERA SEMANA DEL 22- 29 DE Evaluacin del crecimiento y dems factores ABRIL CUARTA SEMANA DEL 29 DE ABRIL Aislamiento de cepas totales AL 5 DE MAYO QUINTA SEMANA DEL MAYO 6 - 12 DE Repiques y consorcios purificacin de cepas y/o

SEXTA SEMANA DEL 13 - 19 DE MAYO

SEPTIMA SEMANA DEL MAYO SEPTIMA SEMANA DEL MAYO OCTAVA SEMANA DEL MAYO

Curva de crecimiento bacteriano en medio 9K e Inoculacin de cepas en concentraciones de metales pesados 20 - 26 DE Evaluacin de Curvas de crecimiento en diferentes concentraciones de metales pesados 20 - 26 DE Extraccin del DNA genmico, anlisis de restriccin y electroforesis

27 - 31 DE Secuenciacin y anlisis bioinformtica del DNA ribosomal 16s

PRESUPUESTO: Material de Vidrio Material de Vidrio

Matraces 1000 ml Matraces 500 ml Matraces 250 ml Beackers 250ml Beackers 100 Beackers 50 Fiolas 1000ml Fiolas 500 ml Fiolas 100 ml Fiolas 50 ml Fiolas 10 ml Fiolas 1ml Pipetas 10ml Pipetas 5ml Pipetas 1ml Cajas Petri N Costo /unidad Total

Reactivos FeSO4 x 7H2O MgSO4 x 7H2O (NH4)2SO4 K2HPO4 x 3H2O H2SO4 CuSO4 x 5H2O, HgCl2, CdCl2, Na2MoO4 x2H2O AgNO3 m-NaAsO2 Bacto Agar BHI Agar Nutritivo

g/L 33.3 0.4 0.1 0.04

BIBLIOGRAFIA Q.B.P. Erasmo Orrantia Borunda, Aislamiento y caracterizacin de cepas de Thiobacillus ferrooxidans con alta resistencia a arsnico y su utilizacin en la recuperacin de oro a partir de concentrados de pirita y arsenopirita, Tesis de la universidad autnoma de nuevo len Monterrey Mexico 1997. Agudelo J, Betancur U, Largo M. Biolixiviacin de minerales sulfurosos. Revista Facultad de Ingeniera. Universidad de Antioquia. 2002; 27. Lucia C, Ligia S, Paula S, Alba S, Viviana S, Julieth Z. Estudio piloto de aislamiento y fenotipificacin de bacterias que participan en los procesos de biolixiviacin, en las zonas mineras del Departamento de Boyaca.

Victor O., Edna M, Marco M. Caracterizacin por Ardrea de microorganismo acidofilos aislados en minas de oro de marmato Colombia.