A Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR) uma tcnica de Biologia Molecular que permite replicao in vitro do ADN de forma extremamente

e rpida. Com a PCR, quantidades mnimas de material gentico podem ser amplificadas milhes de vezes em poucas horas, permitindo a deteco rpida e fivel dos marcadores genticos de doenas infecciosas, cancro ou doenas genticas. O uso da tecnologia de Reaco em Cadeia da Polimerase aumentou enormemente a capacidade dos cientistas para estudar o material gentico. Desde a sua inveno por cientistas da Cetus Corporation em 1983, a PCR mudou a forma como se realiza investigao e diagnstico mdico. A capacidade de produzir rapidamente grandes quantidades de material gentico permitiu avanos cientficos significativos em todas as reas de investigao genmica. A tecnologia de PCR influenciou ainda significativamente as reas de diagnstico e seguimento de doentes, em particular nas reas de HIV/SIDA e Hepatite C. Desde o primeiro momento, os cientistas da Roche aperceberam-se da importncia e do potencial da tecnologia de PCR. A Roche tem vindo a desenvolver esforos no sentido de aperfeioar os vrios passos e componentes da reaco de replicao (por exemplo, enzimas polimerases termoestveis). A Roche oferece preparaes enzimticas optimizadas e inovadoras, kits de qualidade e fiabilidade, que permitem a obteno de ptimos resultados. A PCR est desenhada de acordo com o princpio natural de replicao de ADN. Este um processo que decorre em trs passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um nmero especfico de vezes. Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos: 1. Desnaturao 2. Hibridizao ou Annealing 3. Extenso Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante perodos programados de tempo para o nmero apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos). A temperatura elevada (geralmente >90C) separa a cadeia dupla de ADN em dois filamentos, sendo este processo conhecido como desnaturao. Os dois filamentos ou cadeias de ADN so mantidos juntos por ligaes de hidrognio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligaes covalentes mais fortes, permanecem intactas. O objectivo da PCR no replicar a cadeia inteira de ADN, mas apenas replicar a sequncia de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que nica no organismo. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequncia alvo: estes iniciadores so curtas sequncias sintticas de nucletidos, entre 20 e 30 bases.

Numa reaco de PCR so includos dois primers, um para cada cadeia simples de ADN que foi produzida durante o passo de desnaturao. O incio da sequncia de ADN alvo marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequncia complementar. Temperatura de annealing ou hibridizao: normalmente encontra-se entre 40 C e 65 C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequncia. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequncias iniciadores se liguem sequncia alvo com elevada especificidade. Aps a ligao dos primers ou iniciadores s sequncias complementares de ADN, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 C e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de ADN. A Taq polimerase uma polimerase de ADN termo-estvel recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrrio de outras polimerases, se mantm activa a temperaturas elevadas. O processo de sntese iniciado numa zona com cadeia dupla (onde esto ligados os primers), incorporando os nucletidos complementares sequncia alvo e utilizando os dNTPs em soluo. A extenso inicia-se sempre no extremo 3 do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direco 5 para 3. No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de ADN idnticas original. Ponto final: A ADN polimerase no reconhece o final da sequncia. Assim, as novas cadeias sintetizadas tm o seu incio definido pelo primer, mas a sua extremidade 3 no est definida, podendo haver fragmentos de diferentes tamanhos. No entanto, no ciclo seguinte, esta cadeia vai servir de molde sntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia. A cadeia de ADN, sintetizada a partir deste molde, ter ento o comprimento definido, com os limites definidos pelos primers. Estas cadeias denominam-se Amplicons. Aps alguns ciclos, as cadeias de ADN, que correspondem ao tamanho exacto da sequncia alvo, esto presentes num nmero muito maior do que as sequncias de comprimento varivel. Por outras palavras, a sequncia flanqueada pelos iniciadores ou primers a seco do ADN que se amplifica.