Villanueva A. Carlos E.

Biotecnologa Microbiana

ESTEQUIOMETRIA MICROBIANA

1. CONCEPTOS Y APLICACIN EN BIOPROCESOS

Estudia las relaciones aritmticas entre las masas o volmenes de los reactantes y los productos en una reaccin qumica llevada a cabo por los microorganismos. Los clculos estequiomtricos permiten determinar las relaciones msicas y molares entre los reactantes y los productos finales en los procesos fermentativos. Cual es la concentracin final de microorganismos o productos obtenidos respecto de la concentracin de los componentes (sustratos) del medio de cultivo ? Esta informacin se deduce de las ecuaciones de reaccin escrita y balanceadas correctamente y de los pesos atmicos pertinentes. Por ejemplo: Reactantes 1. 2 H2 4g + 36 g 2. C6H1206 + 6 O2 180 g 192 g 372 g 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP 264 g 108 g 372 g O2 32 g Productos 2 H2 O 36 g

Durante las reacciones qumicas o bioqumicas los tomos y molculas se reordenan para formar nuevos grupos pero se conservan las cantidades siguientes: 1. La masa total de reactantes = masa total de productos; y 2. El numero de tomos de cada elemento (C,H,O) en los reactantes = numero de tomos de cada elemento (C,H,O) en los productos. Sin embargo, no existe una ley correspondiente para la conservacin de moles, es decir, moles de reactantes # moles de productos La estequiometra es de aplicacin en bioprocesos porque permite: 1. El balance de masa y energa 2. Determinar el rendimiento terico y compararlo con el rendimiento actual del producto. 3. Chequear la consistencia de datos de la fermentacin experimental 4. Formulacin del medio de nutrientes

El crecimiento microbiano (rx = dx /dt = X) y la formacin de productos (rp = dp/dt = qp . X) son procesos complejos que reflejan la cintica y estequiometra global de cientos de reacciones intracelulares.
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Discutiremos: Como son formuladas las ecuaciones de reaccin para el crecimiento microbiano y la sntesis de productos (metabolitos) ?

2. ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Cuando ocurre crecimiento celular (rx = dx /dt = X), las clulas (biomasa, X) constituye un producto de la reaccin y debe ser representada en la ecuacin de reaccin estequiomtrica.

A. PLANTEAMIENTO DE LA ECUACION DE CRECIMIENTO CELULAR a. El crecimiento celular obedece a la ley de la conservacin de la masa y podemos escribir la siguiente ecuacin para expresar el crecimiento celular aerobio. c CHON Formula quimica biomasa seca

CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi Formula quimica sustrato Formula quimica fuente N2

+ d CO2

+ e H2 O

Glucosa: C6H1206 W=6 X =2 Y =6 Z = carece Donde: a, b, c, d, e son los coeficientes estequiomtricos

b. La ecuacin es escrita sobre la base de 1 mol de sustrato. Por lo tanto: a moles de O2 son consumidos y d moles de CO2 son formados por mol de sustrato reactante. c. La figura representa esta conversin a nivel celular.
Bioconversin del sustrato, oxigeno y fuente de nitrgeno para crecimiento celular

CwHxOyNz ----------- a O2 b HgOhNi ---------- ----------

--------- -------- ---------

c CHON d CO2 e H2 O

CELULA

d. No se incluye multitud de compuestos tales como ATP y NADH, no sujetos a intercambio neto con el ambiente. Las vitaminas y minerales podran estar incluidos, pero se obvian por su consumo pequeo. Otras sustancias y productos podran ser seleccionados si son apropiados.
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e. La biomasa es representada por la formula CHON que es una reflexin de la composicin de la biomasa microbiana. Los microorganismos (por ej. E. coli) contienen un amplio rango de elementos (Tabla 1). Sin embargo 90 95 % de la biomasa puede estar constituida por 4 elementos mayores: C, H, O, N. Tabla 1.

En la Tabla 2 son listadas la composicin elemental de varias especies en trminos de aquellos 4 elementos. Tabla 2 Composicin elemental y grado de reduccin para organismos seleccionados Organismo Formula elemental Grado de reduccin (Relativo al NH3) 4.07 4.20 4.28 4.45

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Candida utilis Candida utilis Candida utilis Candida utilis Promedio

C H 1.77 O 0.49 N 0.24 C H 1.83 O 0.56 N 0.17 C H 1.81 O 0.51 N 0.17 C H 1.83 O 0.54 N 0.10 C H 1.87 O 0.56 C H 1.83 O 0.46 C H 1.87 O 0.56 C H 1.79 O 0.50 N 0.20

4.9

C H 1.8 O 0.5 N 0.2 puede ser usado como una formula general cuando el anlisis de composicin no es disponible.

El peso molecular promedio de biomasa basado sobre cantidades de C, H, O, N, es por lo tanto 24.6 aunque el 5-10 % de residuo mineral es a menudo adicionado para contar aquellos elementos no incluidos en la formula.

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B. FORMULA MINIMA DE UN MICROORGANISMO PROMEDIO 1. Composicin elemental de un microorganismo Es el porcentaje de cada elemento contenido en 100 partes de masa celular (tabla 1) Se puede definir un microorganismo promedio como aquel cuya composicin (% P/P) de elementos mayoritarios (C,H,O,N) es: C = 46.5 % ; H = 6.49 ; O = 31.0 % ; N = 10.85

Siendo el contenido de sales 5 % La composicin elemental de la biomasa se mantiene constante durante el cultivo, No se modifica mayormente durante un cultivo. Son semejantes para distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos). Sin embargo, la composicin macromolecular (protenas, cidos nucleicos, etc.) puede variar sensiblemente.

2. Determinacin de formula mnima de un microorganismo promedio Teniendo en cuenta la composicin elemental media anterior es posible escribir una formula mnima de un microorganismo promedio, como:

C H 1.67 O 0.5 N 0.2

Esta formula representa solo el 95 % p/p de la biomasa. Se calcula as: Clculo de cocientes atmicos: Dividir composicin centesimal de cada elemento por su peso atmico C = 46.5 / 12 = 3.88 H = 6.49 / 1 = 6.49 O = 31.0 / 16 = 1.94 N = 10.85 / 14 = 0.78 Obtener relacin atmica: Dividir los cocientes atmicos por el menor de ellos C = 3.88 / 0.78 = 4.97 O = 1.94 / 0.78 = 2.49 Relacionando al carbono Dividir relaciones atmicas entre 4.97 C = 1 Resulta la: H = 1.67 0 = 0.5 N = 0.2 H= N= 6.49 / 0.78 = 8.32 0.78 / 0.78 = 1

Frmula mnima : C H 1.67 O 0.5 N 0.2

Definir 1- C mol de biomasa Con fines netamente prcticos: cantidad de biomasa que contiene un atomo gramo de carbono

Qu peso de clulas ( o biomasa) corresponde a un mol ? es decir, Cuantos gramos de clulas ( o biomasa) corresponde a un mol ?

12 (1) + 1 (1.67) + 16 (0.5) + 14 (0.2) 24.47 1C-mol de biomasa = ------------------------------------------------- = ------- = 25.8 g 0.95
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Por tanto una concentracin de biomasa ( X en gL-1) es equivalente a: X/25.8 C-mol de biomasa; o bien: XGx /12 C-mol de biomasa L-1

Donde: Gx es la fraccin de carbono de biomasa (0.465 para el microorganismo promedio) Esta ltima forma de calcular los C-moles de biomasa es ventajosa ya que solo requiere conocer Gx, un dato que se puede obtener fcilmente de la bibliografa. En caso de no existir datos disponibles, se puede suponer Gx = 0.465 sin temor a cometer errores graves. Definir 1-C mol de fuente de carbono y energa, y tambin 1 C mol de producto. Por ejemplo para : Glucosa (C6H1206) Etanol (C2H60) 1-C mol de glucosa ser CH20 = 30 g 1-C mol de etanol ser CH30 0.5 = 23 g

En general para un compuesto de la forma Cn HLOq Nm 1-C mol estar representado por C HL/n Oq/n N m/n C. DETERMINACION DE COEFICIENTES ESTEQUIOMETRICOS La ecuacin de reaccin planteada no es completa si no se conocen los coeficientes estequiomtricos a, b, c, d, e CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi c CHON + d CO2 + e H2 O

PROCEDIMIENTO:
1. Obtencin de la formula para biomasa: una vez obtenida, los coeficientes son evaluados usando procedimientos normales para balances de ecuaciones. 2. Balance elemental y solucin de ecuaciones simultaneas CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi c CHON + d CO2 = = = = c+ d c + 2e c + 2d + e c + e H2 O

Balance de C: w Balance de H: x + bg Balance de O: y + 2a + bh Balance de N: z + bi

Se tiene 5 coeficientes desconocidos y solo 4 ecuaciones de balance 3. Informacin adicional: esta es requerida antes que las ecuaciones puedan ser resueltas. Usualmente es obtenida de experimentos. Un parmetro medible til es el: Moles CO2 producido d

Coeficiente estequiomtrico, RQ = ---------------------------------- = --moles O2 consumido a 4. Determinacin de los coeficientes estequiomtricos 5. Completar ecuacin de reaccin. 6. Determinar cantidades de S, N, O
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3. ESTEQUIOMETRIA DE LA FORMACION DE PRODUCTOS

BALANCE QUIMICO: Los procesos microbianos en los cuales la biomasa microbiana (CHON) es el nico producto formado (ej. produccin de levadura de panificacin), son en la practica relativamente raros. Cuando el crecimiento microbiano es acompaado de la produccin de uno o varios metabolitos (CjHkOlNm) la reaccin global obedece al principio de la conservacin de la materia y la ecuacin estequiomtrica del crecimiento puede extenderse para incluir la sntesis del metabolito de la sgte manera: CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi Donde: CjHkOlNm f
: frmula

c CHON

+ d CO2 + e H2 O + f CjHkOlNm

bruta del conjunto de productos del metabolismo diferentes a la biomasa, CO2 y H2 O : coeficiente estequiomtrico para el producto.

APLICACIONES DE LOS CLCULOS ESTEQUIOMTRICOS 1. Estequiometra de la produccin de etanol 1.1. Clculo del coeficiente rendimiento terico del etanol

Ejercicio: Determnese el coeficiente de rendimiento de etanol conociendo que la reaccin global del proceso fermentativo obedece a la siguiente ecuacin qumica: C6 H12 O6 Solucin: La ecuacin corresponde a la reaccin principal de la fermentacin de etanol: conversin de glucosa en etanol y dixido de carbono Esta ecuacin expresa que una molcula de glucosa se descompone para dar 2 molculas de etanol y dos molculas de dixido de carbono Aplicando los pesos moleculares, la ecuacin muestra que la reaccin de 180 gramos de glucosa produce 92 gramos de etanol y 88 gramos de dixido de carbono. 2C2 H5OH + 2CO2

Y p/s

2 [ 12(2) + (6) + (16) ] 92 = ---------------------------------- = ------ = 0.51 gg-1 [ 12(6) + (12) + 16 (6) ] 180

Quiere decir: se formaron 0.51 g de etanol por gramo de glucosa consumida

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2. Estequiometra de la produccin de aminocidos 2.1. Clculo del coeficiente rendimiento terico del acido glutmico

Ejercicio: Cual es el rendimiento terico del acido glutmico a partir de la glucosa y del total de reactantes consumidos? La ecuacin estequiomtrica es: C6 H12 O6 180 g Solucin: Aplicando los pesos moleculares, la ecuacin muestra que la reaccin de 180 gramos de glucosa produce 147 gramos de acido glutmico . + NH3 17 g + 3/2 O2 48 g C5 H9NO4 147 g + CO2 + 3H2O

Y p/s

147 g C5 H9NO4 147 = ------------------------------- = ------ = 0.81 gg-1 180 g C2 H12 O6 180

147 g C5 H9NO4 147g producto Y p/s = ------------------------------------------------- = ----------------------- = 0.6 gg-1 180 g C2 H12 O6 + 17 g NH3 + 48 O2 245 g reactantes Consumidos

El rendimiento es un trmino muy importante en el anlisis bioqumico dada la complejidad del metabolismo y la existencia de frecuentes reacciones laterales. 2.2. Clculo de relaciones msicas en la produccin de acido glutmico

Ejercicio: La reaccin global para la conversin microbiana de glucosa a acido glutmico es: C5 H9NO4

C6 H12 O6

+ NH3

+ 3/2 O2

+ CO2 + 3H2O

Qu masa se O2 se necesita para producir 15 g de acido glutmico? Solucin:

Pesos moleculares: Oxigeno = 32 Acido glutmico: 147 En la ecuacin, los gramos de acido glutmico se convierten en moles utilizando los corchetes unidad de pesos moleculares. Se aplica la ecuacin estequiomtrica para convertir los moles de acido glutmico en moles de oxigeno. Finalmente los moles de oxigeno se convierten en gramos 1 mol glutmico 3/2 mol O2 32 g O2 15 g. glutmico [ --------------------- ] [ -------------------- ] [ ----------- ] = 4.9 g O2 147 glutmico 1 mol glutmico 1 mol 02 Entonces se necesitan 4.9 g de oxigeno. Si existe tambin crecimiento microbiano se necesitar una cantidad de oxigeno mayor.

ESTEQUIOMETRIA EN LAS REACCIONES INDUSTRIALES La ecuacin de la fermentacin alcohlica: C2 H12 O6 2C2 H5OH + 2CO2 . Sugiere que todos los reactantes (GLUCOSA) se convierten en los productos especificados (ETANOL y CO2) y que la reaccin progresa hasta el final . Sin embargo, en los procesos industriales esto no es el caso. En las reacciones industriales la estequiometra puede no conocerse con exactitud y con el fin de manipular la reaccin convenientemente, los reactantes no se alimentan en las proporciones exactas indicadas por la ecuacin de la reaccin. Normalmente se aaden cantidades de algunos reactantes en exceso, los cuales se encuentran mezclados con el producto una vez que la reaccin ha finalizado. Adems los reactantes se consumen en reacciones laterales para formar productos no descritos en la reaccin principal; estos subproductos forman parte tambin de la mezcla final de la reaccin. En estas circunstancias se necesita informacin adicional antes de calcular las cantidades de producto formado o de reactante consumido. Algunos trminos utilizados para describir las reacciones parciales o laterales son: REACTANTE LIMITANTE Reactante que se encuentra presente en la menor cantidad estequiomtrica. Mientras que los otros reactantes pueden estar presentes en menores cantidades absolutas al mismo tiempo que se consume la ltima molcula de reactante limitante, en la mezcla final de la reaccin aparecern cantidades residuales de todos los reactantes excepto del reactante limitante. Ejercicio: Para la reaccin de produccin del acido glutmico: C6 H12 O6 180 g + NH3 17 g + 3/2 O2 48 g C5 H9NO4 147 g + CO2 + 3H2O

Cual es el reactante limitante si se proporcionan 100 g de glucosa, 17 g de NH3 y 48g de O2 ? Solucin:

La glucosa ser el reactante limitante, incluso aunque se disponga de la mayor cantidad de masa comparada con las dems sustancias.

REACTANTE EN EXCESO Reactante presente en una cantidad en exceso sobre la necesaria para combinar con aquel reactante limitante. Es aquel que permanece en la mezcla de reaccin una vez que el reactante limitante se ha consumido totalmente. El porcentaje en exceso se calcula utilizando la relacin entre la cantidad de material en exceso y la cantidad necesaria para el consumo completo de reactante limitante. Moles (masa) presente moles (masa) necesarios para reaccionar completamente con el reactante limitante % en exceso = ------------------------------------------------------------------------------ x 100 moles (masa) necesarios para reaccionar completamente con el reactante limitante

CANTIDAD REQUERIDA DE REACTANTE Es la cantidad estequiomtrica necesaria para alcanzar la conversin completa del reactante limitante. Ejercicio: En el caso de la produccin del acido glutmico: C6 H12 O6 180 g + NH3 + 3/2 O2 17 g 48 g C5 H9NO4 147 g + CO2 + 3H2O

a. Cul es la cantidad requerida del reactante NH3 para alcanzar la conversin completa de 100 g de glucosa ? b. Si se aaden 17 g de NH3 Cul es el % en exceso de NH3? Solucin: a. Se requiere 17 g de NH3 para la conversin completa de 180 g de glucosa. Por lo tanto, la cantidad requerida de NH3 para la conversin completa de 100 g de glucosa es: 17 g NH3 x 100 g glucosa Cantidad requerida de NH3 =___---------------------------------------------------------- = 9.4 g NH3 180 g glucosa

% en exceso de NH3 =

17 g NH3 - 9.4 g NH3 --------------------------------- x 100 9.4 g NH3

0.80 x 100 = 80%

Las cantidades requeridas y en exceso se basan en la misma cantidad de reactante limitante incluso solo se produzca una parte de la reaccin.