INFORME FINAL DE INVESTIGACIN EXPERIMENTAL CURSO DE FARMACOLOGA 2008

ARTCULO ORIGINAL

EFECTO ANTIDIARRICO Y ANTIESPASMDICO DEL EXTRACTO METANLICO DE PUNICA GRANATUM L. (GRANADA) EN RATONES
Ochoa Christiam L., Chapoan Martin O., Granda Cecilia A., Quintana Willy, Chauillco Xavier W., Puerta Everth B., Gutierrez Graham

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGA, FACULTAD DE MEDICINA SN FERNANDO UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS. christiam8a@hotmail.com: correspondencia del autor. Entregado el 22 de julio de 2008 al Departamento de Farmacologa Facultad de San Fernando -UNMSM

RESUMEN
INTRODUCCIN.- La granada (Punica granatum L.) es empleada tradicionalmente en nuestro pas y en muchos otros para tratar la diarrea aguda simple. No existe mucha informacin sobre la validacin pre clnica del efecto antidiarrico y antiespasmdico del extracto de la cscara de granada actualmente, por lo cual nos propusimos comprobar su actividad farmacolgica como parte de un estudio pre clnicos. METODOLOGA.- Para comprobar el efecto antidiarrico en ratones machos (laca strain), primero se formaron 3 grupos aleatoriamente de 6 ratones cada uno. El grupo 1 sirvi de control negativo (1 ml solucin salina), el grupo 2 recibi el extracto metanlico (300mg/kg v.o) reconstituido en agua y el grupo 3 recibi Loperamida (3g/kg v.o.). Media hora despus se administr el aceite de ricino (0.3ml) como inductor de diarrea. Para comprobar el efecto antiespasmdico se emple el modelo in vivo de trnsito intestinal en ratones. Se formaron 3 grupos aleatoriamente. Un grupo con el extracto de granada metanlico reconstituido en agua (300mg/kg v.o.), un control positivo con Loperamida (3g/kg. v.o.) y un control negativo que solo recibi solucin salina (1ml). RESULTADOS.- Se encontr que en el tratamiento con extracto metanlico de granada disminuy significativamente la cantidad total de deposiciones (7) frente al control negativo (20) despus de 2 horas de induccin. Por otra parte, el tiempo de aparicin de la primera defecacin semilquida del grupo granada fue 80 minutos mas tarde que la del grupo control negativo. Tambin se encontr que en el tratamiento con el extracto de granada el trnsito intestinal disminuy significativamente (61.55% 21.26) respecto del control negativo (95.97% 2.53) pero no frente al grupo con Loperamida (18.69% 7.23) para un p<0.05. CONCLUSIN.- Los resultados hallados demuestran el efecto antiespasmdico y el efecto antidiarrico del extracto metanlico reconstituido en agua de Punica granatum en ratones probablemente debido al alto contenido de taninos, antocianinas y polifenoles con propiedades antisecretorias, antiespasmdicas y antiinflamatorias en la mucosa gastrointestinal. Palabras clave: antidiarrico, antiespasmdico, Punica granatum, aceite ricino

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ABSTRACT
BACKGROUND.- pomegranate (Punica granatum) in used in our country and other countries around the world as a traditional medicine for treatment of simple acute diarrhea. There is no much information of preclinical validation of antidiarroheal and antispasmodic effect of pomegranates extract. We purpose probe the pharmacological activity of this plant as a part of a preclinical study. METHODS.- to probe the antidiarroheal effect in mice we divided them in 3 groups of 6 mice each one. Group one was used as negative control (1ml saline solution), group 2 received metanolic extract of pomegranate (300mg/kg v.o.) and group 3 received loperamide (3g/kg i.p.). After 30 minutes they were given 0.3ml of castor oil as a diarrhea inductor. To probe de antispasmodic effect we used and in vivo model of intestinal transit in mice. 3 groups were formed randomly. One group received metanolic extract (300mg/kg v.o.), one positive control with loperamide (3g/kg i.p.) and a negative control which only received saline solution (1ml). RESULTS.- It was found a significant decrease in the number of defecations in pomegranate group (7) compared with the control (20) after 2 hours form induction. On the other hand, the time elapsed for the first semiliquid defecation was 80 minutes later in pomegranate group than negative control. We also found a significant decrease in intestinal motility in metanolic extract group (61.55% 21.26) compared with the negative control (95.97% 2.53). However there was no statistic difference with the loperamide group (18.69% 7.23) using a p<0.05. CONCLUSION.- the results founded in the experiment shown the antispasmodic and antidiarroheal effect of Punica granatum in mice probably due the high contends of tannins, antocianins and polifenols which have antisecretory, antiespasmodic and antiinflamtory effect over the gastrointestinal epitelium. KEY WORDS: antidiarroheal, antispasmodic, Punica granatum, castor oil

INTRODUCCIN
La diarrea aguda es uno de los problemas ms importantes que se afrontan en la salud pblica. Los cuadros de diarrea aguda afectan a todos los grupos etarios, siendo ms prevalente en los nios menores de 5 aos. En este grupo poblacional las muertes producidas por los cuadros de diarrea aguda se calculan entre 5-8 millones por ao, siendo la mayora de casos pertenecientes a los pases en va de desarrollo (1) . La OMS la define como la presencia de tres o ms deposiciones lquidas dentro de 24 horas (2). La diarrea se refiere a una disfuncin en la absorcin y secrecin y electrolitos a nivel del epitelio intestinal. La alteracin en la motilidad intestinal tambin contribuye a la produccin de la diarrea. Las consecuencias de estas disfunciones se reflejan en la alteracin de la frecuencia, cantidad y volumen de deposiciones (3). La diarrea es producida por una serie de mecanismos endgenos y exgenos. Algunas condiciones patolgicas como diabetes mellitus, sndrome de intestino irritable, enfermedad del colgeno vascular, entre otras, pueden producir cuadros de diarrea (4). Los mecanismos exgenos que producen diarrea son ms importantes en la produccin de la diarrea. Sustancias como los rganofosforados o agentes procinticos pueden producir diarrea. Muchas infecciones por organismos patgenos 2

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dan como resultado cuadros de diarrea; entre ellos estn bacterias como Vibrio cholerae, (diarrea de tipo acuosa), Salmonella typhi y Shigella spp (diarrea de tipo sanguinolenta); parsitos como Giardia lamblia, Cryptosporidium, Ciclosporidium, Microsporidium; virus, principalmente los rotavirus. (5) A nivel molecular una serie de sustancias estn involucradas en la produccin de la diarrea. Entre ellas se encuentran neurotransmisores como la acetilcolina, la sustancia P, taquininas (NK1 y NK2) y otros mediadores como VIP y PAF (6). Las sustancias que se usan para combatir la diarrea son aquellas que combaten los mecanismos especficos por los cuales se produce la diarrea como los antibiticos y antiparasitarios. La sustancias inespecficas tienen como mecanismo de accin reducir la motilidad y secrecin como la atropina, la papaverina y la loperamida, entre otras (7). La Punica granatum L. conocida popularmente como granada es un rbol frutal de la familia Punicaceae; originaria de Asia Menor (Arabia). Los principales constituyentes de la granada son los taninos hidrosolubles y condensados, as como alcaloides. Los taninos hidrosolubles son polioles con cido glico como sustituyente del ster, y los condensados son cadenas de flavan-3 ol como las catequinas y las epicatequinas. Otras sustancias extradas del fruto de la granada como la punicalagina y la punicalina han sido reportadas como taninos hidrosolubles txicos a grandes dosis (8). El uso popular extendido de esta planta le ha otorgado propiedades tiles para la medicina. Numerosas investigaciones realizadas con Punica granatum han demostrando su enorme potencial teraputico, posee actividad antiespasmdica, antioxidante, anticancergena, antiparasitaria y ya se encuentra en fase de estudios preclnicos sus propiedades como antiviral (9). Su actividad anti-influenza ha sido estudiada teniendo como modelo animal embriones de pollo, determinando las dosis no txicas del extracto hidroalcohlico de la planta, corroborando la razn de su uso folclrico en Cuba para el tratamiento de afecciones respiratorias (10). Su efecto anti-angiognico y pro-apopttico que derivan de sus componentes fitoqumicos, son estudiados como una alternativa teraputica natural para el tratamiento del cncer. Las proantocianidinas presentes en la cscara tiene propiedades antiangiognicas. Fitoqumicos como el tocoferol, entre otros, presentes en el extracto acuoso de la cscara de Punica granatum provocaron una ruptura del DNA de lneas celulares de Linfoma de Burkkit (11). El extracto metanlico de las semillas de Punica granatum demostraron su efecto antidiarreico, basado en la actividad antisecretoria de la planta, frente a la induccin de diarrea por aceite de ricino y un aumento de la secrecin intestinal de PGE2, en modelos experimentales de ratas (12). Por lo expuesto anteriormente, se decidi trabajar con un extracto metanlico de la cscara de Punica granatum a dosis de 300mg/kg en modelos de ratones albinos, para evaluar su efecto antidiarreico y antiespasmdico inducido por aceite de ricino, teniendo como frmaco de comparacin a la loperamida.

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MATERIALES Y MTODOS
PREPARACIN DE PLANTA Y DEL EXTRACTO
La cscara del fruto de Punica granatum (granada) fueron secadas a 38C en un horno con aire circulante en el laboratorio de Farmacologa de la Facultad de Medicina de la UNMSM. El extracto metanlico de la cscara del fruto se prepar segn la tcnica del CYTED 1995 (13). El material seco fue pulverizado en un molino de cuchillas y se macer con metanol durante 72 horas a temperatura ambiente. Se filtr y el filtrado se desec a 38C en una estufa. El residuo seco se conserv en frasco color mbar a 4C hasta su uso. Al dosificarlo se reconstituy el extracto en agua destilada.

ANIMALES Y TRATAMIENTO
Se compraron 36 ratones macho (Laca strain) de 20-25g de peso de los bioterios del Instituto Nacional de Salud (Chorrillos). Se les acondicion un ambiente higinico, con temperatura ambiente de 23C con agua y alimento balanceado estndar de ratn ad libitum. Las consideraciones ticas se hicieron de acuerdo a los lineamientos del departamento de Farmacologa de la UNMSM. Los grupos fueron separados para 2 experiencias diferentes tratados de la siguiente manera:

MEDICIN DE LA MOTILIDAD INTESTINAL: EXPERIENCIA 1

Se formaron 3 grupos de 6 ratones cada uno. Control negativo: recibieron una dosis con suero fisiolgico 30 minutos antes de la comida de carbn Control positivo: este grupo recibi una dosis de loperamida 3g/kg v.o. 30 EMG.- recibi una sola dosis intragstrica de extracto minutos antes de comida de carbn. Tratamiento con metanlico de granada reconstituido en agua (EMG) (300mg/kg) 30 minutos antes de la administracin de carbn. Los animales ayunaron 6 horas antes del experimento con agua ad libitum. El momento del experimento todos los animales recibieron sus tratamientos respectivos descritos lneas arriba y media hora despus 1ml de comida de carbn (10% carbn desactivado y 90% solucin vehculo). Los animales se sacrificaron 30 minutos despus de administrado el carbn. El abdomen se diseccion y se eviscer todo el intestino empezando en el borde del ploro hasta el ciego y se colocaron sobre papel bond de 80g. La distancia del carbn se midi y se expres en porcentaje de trnsito intestinal (%= distancia viajada por el carbn / total del intestino del ratn multiplicado por 100).

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EXPERIMENTO DE DIARREA INDUCIDA POR ACEITE DE RICINO: EXPERIENCIA 2

Los ratones se dividieron en 3 grupos de 6 animales cada uno. El grupo 1 que sirvi de control negativo (2 ml solucin salina), el grupo EMG (300mg/kg v.o.) y el grupo control positivo que recibi loperamida (3mg/kg v.o.). Una hora despus la diarrea se indujo administrando 0.3 ml de aceite de ricino va oral (obtenido en la Facultad de Farmacologa de la UNMSM) a todos los grupos. Inmediatamente despus se empez el conteo de defecaciones teniendo en cuenta frecuencia de la primera deposicin semilquida y el nmero total de deposiciones semilquidas al cabo de 2 horas de observacin.

ANLISIS ESTADSTICO VARIABLES

Trnsito intestinal: se refiere a la distancia recorrida por la sustancia marcadora (carbn), siendo el 100% del recorrido la longitud del tubo digestivo que abarca desde el ploro hasta la vlvula leo-cecal. Actividad antiespasmdica: se define como la capacidad de reducir la motilidad intestinal, medida por la reduccin del porcentaje de trnsito intestinal con respecto del grupo control negativo. Diarrea inducida: se define como la aparicin de deposiciones semilquidas o liquidas despus de la administracin de 0.3ml de aceite de ricino. Se medir por la frecuencia del a primera deposicin y total de las deposiciones producidas en las 2 horas siguientes a la administracin de aceite de ricino. Efecto antidiarrico: se define como la accin protectora del tratamiento frente a la diarrea inducida por aceite de ricino medida por la frecuencia de la primera deposicin y el total de las deposiciones en un lapso de 2 horas despus el administracin del inductor diarreico comparados con el grupo control negativo

PLAN DE ANLISIS EFECTO ANTIESPASMDICO:

Medidas las distancias recorridas por la comida de carbn en los distintos grupos, los datos se presentaron con media, desviacin estndar y se analizaron mediante la prueba de t Dunnet para comparar los grupos tratamiento con el grupo control con un p<0.05 aceptado como significativo.

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EFECTO ANTIDIARRICO:
Se tabul los resultados de las frecuencias de las primeras deposiciones y la cantidad total de defecaciones de todos los grupos y se present en tablas de contingencia para compararlos.

DISEO DEL ESTUDIO

El diseo del estudio es de tipo prospectivo, analtico-experimental, aleatorizado, completo, pre-clnico in vivo.

RESULTADOS
EFECTO ANTIESPASMDICO DE LA PUNICA GRANATUM
El transito intestinal obtenido en el grupo control positivo con Loperamida (18.69% 7.23) fue bastante inferior al obtenido por el grupo control negativo (95.97% 2.53) con un p<0.05 (tabla1). De igual forma, el porcentaje de transito intestinal del grupo con tratamiento de extracto metanlico de granada (61.55% 21.26) fue considerablemente menor que el grupo control para p<0.05. El grupo tratado con loperamida mostr la mayor reduccin del transito intestinal (15.43% 5.84). El grupo con tratamiento de extracto metanlico mostro una reduccin significativa del trnsito intestinal (61.55% 21.26) comparado con el grupo control negativo que logr un avance notable (95.97% 2.53). El grupo tratado con extracto metanlico mostr reduccin significativa del trnsito intestinal con respecto al grupo control negativo. Sin embargo, no es comparable estadsticamente con el grupo Loperamida. (anexo 1)

TABLA 1.Efecto del extracto metanlico de la Punica granutum (EAG) y de la loperamida en el transito intestinal de ratones. Tratamiento Longitud total del intestino (cm) 61.66 1.29 62.91 4.58 Distancia recorrida por el carbn (cm) 59.16 1.29 14.58 11.77 42.5 13.13 % trnsito intestinal 95.97 2.53 18.69 7.23 61.55 21.26

Control Loperamida (3 g/kg v.o.) EMG (300 mg/kg 61.91 7.18 v.o.)

Anlisis estadstico: media y desviacin estndar de 6 observaciones por grupo. Valores con p<0.05 fueron considerados significativos.

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EFECTO ANTIDIARRICO DE LA PUNICA GRANATUM

La diarrea apareci despus de 20 minutos en promedio en el grupo sin tratamiento (tabla 2). El grupo con extracto de granada y el grupo Loperamida mostraron la primera defecacin mucho mas tarde pero a diferentes tiempos. La primera defecacin semilquida del grupo EMG se observo a los 80 minutos de inducir la diarrea con aceite de ricino. El grupo Loperamida no mostro defecaciones semilquidas. En cuanto a la cantidad de deposiciones se observo marcada reduccin de las heces en el grupo EMG comparado con el grupo control. Por otra parte, la Loperamida no mostro ninguna deposicin semilquida. Se observ durante toda la induccin signos de clico abdominal intenso en el grupo control negativo pero no en los dems.

TABLA 2
Efecto del extracto metanlico de Punica granatum sobre la diarrea inducida por aceite de ricino en ratones. Tratamientos Aceite de ricino + suero (2 ml/kg) Aceite de ricino + EMG (300 mg/kg v.o.) Aceite de ricino + loperamida (3g/kg v.o.) Numero de heces acuosas en 2h 20 7 0 Tiempo de la primera defecacin semilquida (minutos) 20 80 No se observ

DISCUSIN DE RESULTADOS
Los mecanismos fisiopatolgicos de la diarrea incluyen aumento de la motilidad intestinal, aumento de la secrecin intestinal, alteraciones de la absorcin y procesos inflamatorios de la mucosa gastrointestinal. El proceso de la diarrea incluye nmeros neurotrasnmisores como acetilcolina, noradrenalina y otros candidatos como ATP, CGRP,CCK-8, ENK, GAL, GABA, serotonina, NO, somatostaina, SP, VIP. Basados en le conocimiento limitado de todos estos factores desencadenantes de la diarrea capaces de alterar la secrecin y motilidad del intestino numeroso trabajos se han encaminado par encontrar productos naturales o sintticos que atenen estos los efectos indeseados sin alteran los fisiolgicos pero pocos resultados se obtuvieron tanto en eficacia como en seguridad (14). Los dos principales procesos implicados en todos los cuadros diarreicos agudos son el exceso de secrecin por parte la mucosa en respuesta a la noxa de diversas toxinas producidas por agentes microbianos dentro del lumen intestinal y a la alteracin de la mucosa gastrointestinal producto de un proceso inflamatorio subyacente que altera la permeabilidad, produce exudado y disminuye la capacidad de absorcin (15). Los frmacos y productos naturales que se utilizan para atenuar los cuadros diarreicos utilizan sus principios activos para trabajar a nivel de estas dos principales causas de la diarrea principalmente. La Loperamida es un derivado butiraminico de piperidina con actividad sobre el receptor u y es un frmaco antidiarrico activo por va oral. Es antisecretorio contra la 7

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toxina del clera, E. coli y acta en receptor tipo G1 (16). En el estudio se confirm los efectos antiespasmdicos de la Loperamida evidenciados por el avance del carbn activado mucho menor que del control con un p<0.05. Similar resultado obtuvieron K. Sairam y cols. cuando compararon el efecto antidiarrico de la Mangifera indica utilizando loperamida como control positivo en ratones (17). El grupo tratado con el extracto metanlico de granada reconstituido en agua (EMG) obtuvo diferencia significativa con un p<0.05 con respecto del control en los modelos de disminucin de motilidad intestinal y efecto antidiarrico. Esto confirma las propiedades antidiarricas que se le atribuyen a este producto natural. Iguales resultados en cuanto a la motilidad intestinal y el extracto de Punica granatum obtuvieron Das AK y cols. (18) al probar el efecto antidiarrico del extracto de semillas de la Punica granatum en ratas. Otro resultado parecido lo obtuvieron E. Y. Qnais y cols. que comprobaron el efecto antidiarrico del extracto acuoso del pericarpio de la granada en ratas (19) que a diferencia de nuestro experimento utilizaron un extracto acuoso en autoclave (120C) durante 15 minutos que garantizaba la presencia de algunos principios activos que se pierden en un proceso de extraccin acuosa a base de deshidratacin. El efecto global de inhibicin del peristaltismo anormal que ejerce la granada se debe a diversos compuestos activos que contiene, principalmente taninos. La elevada concentracin de gallotaninos y ellagitaninos como la punicalina y punicalagina (mayor a 28%) explica su accin antiespasmdica directa (20,21). El aceite de ricino (castor oil) al contacto con las lipasas intraluminales libera acido rinoleico que acta irritando la mucosa. El resultado final es una alteracin de la membrana celular al flujo del agua y electrolitos aumentando significativamente la secrecin intraluminal. Por otra parte, tambin se vio el papel del oxido ntrico en la induccin de diarrea por aceite de ricino, adems de prostaglandinas y PAF. En el estudio del efecto antidiarrico de la granada se vio la disminucin significativa de las deposiciones semilquidas y retraso de la aparicin de la primera deposicin. Este efecto protector probablemente se deba a la constitucin del extracto de Punica granatum que contiene flavonoides, polifenoles entre otros antiinflamatorios que reducen el efecto daino del acido ricinoleico sobre la mucosa. Sin embargo, el principal principio activo que estara implicado en la actividad antidiarrica de la Punica granatum son las antocianinas que se demostr son eficaces para inhibir la lipoperoxidacin, la produccin de oxido ntrico (NO) y la oxido ntrico sintasa (iNOS) en diferentes modelos experimentales. (22) El efecto de la granada puede ser antiinflamatorio, antisecretorio y antiespasmdico por lo tanto acta como agente antidiarrico eficiente para cuadros agudos de diarrea no complicados. Sin embargo, hay que considerar los efectos adversos que causa incluidos rash inexplicable, angioedema, urticaria, escozor, hinchazn de los labios, boca, lengua o garganta as como dificultades para deglutir. Tambin se ha estudiado que la granada inhibe la isoenzima CYP3A4 heptica de rata y puede incrementar los niveles plasmticos de carbamazepina y otras drogas que utilizan esta va aunque su efecto no ha sido probado en humanos (23).

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CONCLUSIONES
Los resultados hallados demuestran el efecto antiespasmdico y el efecto antidiarrico del extracto metanlico reconstituido en agua de la Punica granatum en ratones probablemente debido al alto contenido de taninos, antocianinas y polifenoles con propiedades antisecretorias, antiespasmdicas y antiinflamatorias en la mucosa gastrointestinal. Se recomienda estandarizar la dosis para futuros estudios as como estudiar la dosis letal en animales de experimentacin.

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ANE EXOS

ANEXO 1.EFEC CTO ANTI IESPASM DICO DEL L EMG (3 300mg/kg), LOPERAM MIDA (3g/k kg) Y CON NTROL NEG GATIVO (su uero salino 1ml).-

G: gr ranada extr racto metan nlico de gra anada (300mg/kg) L: Lo operamida (3g/kg) ( B: gr rupo control l negativo (s suero salino o 1ml)

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