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ISSN 1808-9992 Dezembro, 2008

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BIORREATORES Aspectos Gerais e sua Utilizao para Cultura de Tecidos Vegetais

ISSN 1808-9992 Dezembro, 2008

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa Semi-rido Ministrio da Agricultura, pecuria e Abastecimento

Documentos 214

Biorreatores: Aspectos Gerais e sua Utilizao para Cultura de Tecidos Vegetais

Juliana Martins Ribeiro Dbora Costa Bastos

Embrapa Semi-rido Petrolina - PE 2008

Esta publicao est disponibilizada no endereo: http://www.cpatsa.embrapa.br Exemplares da mesma podem ser adquiridos na: Embrapa Semi-rido BR 428, km 152, Zona Rural Caixa Postal 23 56302-970 Petrolina-PE Fone: (87) 3862-1711 Fax: (87) 3862-1744 sac@cpatsa.embrapa.br Comit de Publicaes da Unidade (Gesto 01/2007-12/2008) Presidente: Maria Auxiliadora Coelho de Lima Secretrio-Executivo: Eduardo Assis Menezes Membros: Mirtes Freitas Lima Geraldo Milanez de Resende Josir Laine Aparecida Veschi Digenes da Cruz Batista Tony Jarbas Ferreira Cunha Gislene Feitosa Brito Gama Elder Manoel de Moura Rocha Supervisor editorial: Eduardo Assis Menezes Revisor de texto: Eduardo Assis Menezes Normalizao bibliogrfica: Helena Moreira de Queiroga Bezerra Gislene Feitosa Brito Gama Tratamento de ilustraes: Hviner Uchoa Pedrosa Foto(s) da capa: Deivid Costa Editorao eletrnica: Hviner Uchoa Pedrosa 1a edio (2008): Formato digital Todos os direitos reservados. A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610). permitida a reproduo parcial do contedo desta publicao desde que citada a fonte. CIP - Brasil. Catalogao na publicao Embrapa Semi-rido Ribeiro, Juliana Martins Biorreatores: aspectos gerais e sua utilizao para cultura de tecidos vegetais / Juliana Martins Ribeiro e Dbora Costa Bastos. -Petrolina: Embrapa Semi-rido, 2008. 26 p. : il. ; 21 cm. - (Embrapa Semi-rido. Documentos, 214) 1. Cultura de tecido. I. Ttulo. II. Srie.

CDD21 571.538 Embrapa 2008

Autores

Juliana Martins Ribeiro Pesquisadora, Biloga, D.Sc., Embrapa Semi-rido juliana.ribeiro@cpatsa.embrapa.br Dbora Costa Bastos Pesquisadora, Enga. Agrnoma, D.Sc., Embrapa Semirido. debora@cpatsa.embrapa.br

Apresentao

Os biorreatores utilizados para a cultura de tecidos vegetais so conceituados como equipamentos para cultivo de clulas, gemas ou embries vegetais, compostos de um sistema de frascos, que podem ser de vidro, ao inoxidvel, policarbonato, polipropileno ou qualquer outro material que suporte autoclavagem a uma temperatura de 121oC por perodos de tempo de 15 a 30 minutos, onde os materiais a serem multiplicados esto contidos. Apresentam uma srie de vantagens quando comparados com a metodologia tradicional de micropropagao, entre elas a acelerao do processo de multiplicao. Os frascos dos biorreatores so interligados por tubos de borracha flexvel, por meio dos quais os referidos materiais recebem ar e meio de cultura por asperso ou borbulhamento. Os sistemas de imerso do material vegetal no interior dos frascos so divididos em imerso permanente e temporria. No sistema de imerso permanente, o material permanece imerso continuamente no meio de cultura; j no cultivo sob imerso temporria, o material fica temporariamente imerso no meio de cultura (Alvard et al., 1993; George, 1996). Recentemente, os biorreatores comearam a ser utilizados para o cultivo de clulas, tecidos, gemas e plntulas, tendo como objetivo final a produo de mudas em larga escala. A utilizao da tecnologia dos biorreatores permite s empresas especializadas na produo de mudas acelerar o ciclo de produo, reduzindo os custos e aumentando a produtividade, com preos bastante competitivos. Diante da importncia econmica dos biorreatores para a rea de cultura de tecidos, este documento teve como objetivo reunir informaes relativas ao funcionamento, aspectos fsicoqumicos e utilizao desta tecnologia para o cultivo de diferentes espcies vegetais.

Sumrio

Pg.

Cultura de Tecidos Vegetais ............................................................. 9 Biorreatores na cultura de tecidos vegetais ......................................... 9 Vantagens do uso de biorreatores em relao ao processo de micropropagao convencional ....................................................... 10 Problemas no uso de biorreatores e como contorn-los ........................ 11 Principais tipos de biorreatores ....................................................... 13 Principais parmetros fsicoqumicos em um biorreator ........................ 19 Formas e efeitos da agitao ............................................................... 19 Formas de transferncia e efeitos do oxignio dissolvido ...................... 21 Efeitos provocados pelas variaes de CO2 e pH ................................ 22 Consideraes finais ..................................................................... 23 Referncias bibliogrficas .............................................................. 23

Fig. 1

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Juliana Martins Ribeiro Dbora Costa Bastos

Cultura de Tecidos Vegetais

Tcnica que consiste em se cultivar plantas ou partes de plantas, tais como rgos completos, tecidos ou clulas in vitro. uma forma de multiplicao assexuada que se baseia na teoria da totipotncia das clulas vegetais, segundo a qual os seres multicelulares possuem, em cada uma de suas clulas, toda a informao gentica necessria para a formao de um indivduo completo. Por meio da micropropagao, plantas podem ser cultivadas em condies de laboratrio, em meio nutritivo especfico, sob condies asspticas e ambiente controlado.

Biorreatores na cultura de tecidos vegetais

A metodologia tradicional de micropropagao baseia-se em cultivos em pequenos frascos com nmero reduzido de plntulas por frasco e uso de meio nutritivo semi-slido ou lquido, o que acarreta intensa manipulao das culturas, aumentando a necessidade de mo-de-obra especializada (Ponce, 1998). Os primeiros biorreatores utilizados para a cultura de tecidos vegetais surgiram a partir dos equipamentos denominados fermentadores, desenvolvidos h muitas dcadas para o cultivo de fungos e bactrias para fins industriais. Os biorreatores utilizados para a produo de embries ou brotos sofreram modificaes, tais como a presena de sensores para monitoramento da temperatura, da velocidade de agitao do meio lquido, do pH, do oxignio dissolvido, do potencial redox e do dixido de carbono (Preil, 1991).

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Vantagens do uso de biorreatores em relao ao processo de micropropagao convencional

Os biorreatores utilizam meio de cultura lquido que permite a renovao do ar e de nutrientes durante o cultivo e resulta em maior crescimento e multiplicao quando comparado com o meio slido. Essas condies podem permitir um crescimento timo das clulas vegetais mediante uma regulao precisa dos fatores ambientais e um fornecimento contnuo de gua, nutrientes e oxignio (Perez Ponce, 1998). Segundo Teixeira (2006), comparada com a tecnologia de micropropagao tradicional, a utilizao de biorreatores apresenta uma srie de vantagens que tornam esta tcnica de extrema importncia para a rea de cultura de tecidos vegetais, entre elas: a) acelerao do processo de multiplicao; b) reduo significativa dos custos com mo-de-obra; c) adaptvel a diversas espcies vegetais; d) uniformizao da produo; e) simplicidade de montagem do sistema; f) eliminao do estresse gasoso e mecnico; g) reduo do custo total por unidade produzida. Alm dos fatores supracitados, a utilizao de computadores como sistemas de controle dos biorreatores agrega vantagens sobre o sistema convencional de micropropagao em termos de automao e economia de trabalho, resultando em uma reduo significativa da mo-de-obra e, conseqentemente, baixando expressivamente os custos de produo. Frente aos benefcios proporcionados pela utilizao de biorreatores para a cultura de tecidos vegetais, a seguir sero abordados, entre outras informaes, os tipos de biorreatores disponveis atualmente e os parmetros fsicoqumicos que devem ser considerados para um bom desenvolvimento das culturas no interior dos frascos.

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Problemas no uso de biorreatores e como contorn-los

Assim como no cultivo de tecidos vegetais tradicional, alguns dos grandes problemas enfrentados com a utilizao de biorreatores esto relacionados com a contaminao, oxidao e hiperidricidade de explantes. As contaminaes podem ser divididas em dois grupos: contaminaes endgenas tipo de contaminao de difcil deteco pelo fato de ser sistmica, normalmente causada por bactrias (patognicas ou no) e vrus - e contaminaes exgenas causadas por microorganismos do solo que se encontram no ambiente, bem como aqueles que fazem parte da flora bacteriana normal do corpo humano, podendo ser fungos ou bactrias. De maneira geral, o controle de ambos os tipos de contaminaes pode ser Doenas arquitetnico adequado do local de trabalho; feito por meio de um desenho do conhecimento da procedncia e da idade das plantas matrizes; da higiene ambiental e pessoal e da habilidade e preparao tcnica dos operrios. O controle de contaminaes dos explantes se inicia com cuidados com as plantas matrizes, visto que apenas o tratamento desinfestante do explante no garante sua assepsia completa, havendo a necessidade da adoo de medidas complementares que permitam reduzir ao mximo a comtaminao prvia do propgulo. Levando-se em considerao que o tratamento desinfestante exclui apenas microorganismos existentes na superfcie do explante ou alojados em microcavidades como estmatos, devem ser tomadas medidas quanto s condies culturais das plantas matrizes. As mesmas devem ser mantidas em ambiente protegido, ou seja, um ambiente seco, ventilado, protegido de chuvas, vento e poeira, de modo a mant-las livres de doenas e pragas. Deve ser realizado um tratamento qumico e biolgico das mesmas, por meio de aplicaes de fungicidas, antibiticos e inseticidas. Alm disso, deve-se evitar a irrigao por asperso, visto que tal procedimento umedece a superfcie das plantas, criando um ambiente propcio para o crescimento de microorganismos. A gua deve ser colocada diretamente sobre o substrato, sem molhar a planta. Uma vez atendidos os cuidados quanto planta matriz, devem ser tomadas algumas medidas em relao ao explante. O controle de contaminaes exgenas comea com a idade do propgulo, pois rgos

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cronologicamente mais velhos apresentam-se mais contaminados do que os juvenis, devido ao fato de terem sido expostos por mais tempo penetrao dos contaminantes. Quanto ao tamanho dos explantes, quanto menores forem as suas dimenses, mais reduzida ser a probabilidade de se levar microorganismos em sua superfcie ou em seu interior. Entretanto, devem ser evitadas dimenses muito reduzidas, a fim de no prejudicar o desenvolvimento do explante. Um outro aspecto que deve ser levado em considerao em relao ao controle de contaminaes exgenas no explante so as caractersticas morfolgicas da espcie, devendo ser evitados rgos pilosos ou porosos, ou aqueles que oferecem dificuldade penetrao do desinfestante. Da mesma maneira, tecidos protegidos por estruturas especiais so sempre menos passveis de contaminao. Alm das precaues citadas, deve ser realizada a imerso dos explantes em solues desinfestantes tais como etanol, hipoclorito de sdio, hipoclorito de clcio, perxido de hidrognio, cloro comercial, antibiticos, fungicidas, inseticidas, entre outros. Por outro lado, o controle de contaminaes endgenas em explantes no pode ser realizado por meio de procedimentos de desinfestaes superficiais. Neste caso, so necessrios procedimentos de desinfeco que envolvam a eliminao cirrgica de tecidos j invadidos por microorganismos ou a limpeza clonal, tcnica destinada eliminao de microorganismos sistmicos do propgulo, que pode ser feita por meio de termoterapia, quimioterapia, eletroterapia e cultura de pices meristemticos. A oxidao fenlica se d por meio da atividade de enzimas oxidativas, como as monofenoloxidases e as polifenoloxidases. Estas enzimas e os correspondentes substratos (hidroxifenis) esto separados em compartimentos diferentes dentro da clula. Por ocasio da exciso do explante, e como conseqncia da injria e destruio de algumas clulas, enzima e substrato so postos em contato entre si e com o oxignio, resultando na oxidao da hidroxila fenlica, com formao de gua e quinona, sendo esta ltima txica a microorganismos e inibidora do crescimento celular. A oxidao fenlica pode ser minimizada com a adoo dos seguintes procedimentos: a) A idade do explante, pois explantes juvenis apresentam menos problemas de oxidao quando comparados com os adultos;

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b) Reduo dos danos mecnicos e qumicos ao explante; c) Remoo de substncias fenlicas por meio da adio de, por exemplo, PVP (polivinilpirrolidona) ao meio nutritivo; c) Modificao do ambiente, com cultivo no escuro ou em baixa intensidade luminosa, bem como a variao da composio do meio nutritivo, utilizando-se meios salinos diludos; d) Modificao do potencial redox por meio da lavagem dos explantes com cido ctrico ou cido ascrbico; e) Reduo da atividade da fenolase por meio da adio de inibidores das enzimas oxidativas, como, por exemplo, sulfito, bissulfito e metabissulfito de sdio. Quanto hiperidricidade dos explantes, esta pode ser evitada com a substituio dos biorreatores de imerso permanente por aqueles de imerso temporria, os quais sero descritos a seguir.

Principais tipos de biorreatores

Os biorreatores podem ser conceituados como um sistema de frascos onde os materiais so reproduzidos. Os frascos so interligados por tubos de vidro ou silicone, por meio dos quais os referidos materiais recebem ar e meio de cultura por asperso ou borbulhamento. O sistema de imerso pode ser realizado de duas maneiras:

Biorreatores de imerso permanente : tambm conhecidos

como BIPER, neste procedimento, o material vegetal (clulas, tecidos, rgos ou plantas completas) permanece imerso continuamente no meio de cultura. mais utilizado para o cultivo de clulas vegetais do que das plantas propriamente ditas, pois apresenta como principal desvantagem a hiperhidratao dos tecidos, causando ainda srios distrbios fisiolgicos que iro afetar o crescimento e o desenvolvimento do material em cultivo (Debergh et al., 1981). Vrios trabalhos foram realizados utilizando-se os biorreatores de imerso permanente, entre eles podendo ser citados os seguintes: Kosky et al. (1999) realizaram experimentos visando (i) o estabelecimento de suspenses celulares embriognicas, utilizando como explantes calos

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embriognicos de banana cv. FHIA 18; (ii) multiplicao de embries somticos em biorreatores com meio lquido, e (iii) obteno de embries somticos maduros e a sua posterior regenerao em plantas completas. Os resultados obtidos demonstraram a possibilidade do estabelecimento de suspenses de clulas embriognicas utilizando cultura de FHIA 18. Tambm foi observado que a reduo de oxignio dissolvido no meio promoveu um aumento da quantidade de embries somticos no estado maduro e, conseqentemente, uma diminuio daqueles no estado globular. Em relao ao pH, resultados demonstraram que uma maior quantidade de embries somticos foi obtida com o pH 3,8. Como continuao do experimento, parte dos embries somticos obtidos foi transferida para um biorreator de imerso temporria, regenerando plantas completas que foram, posteriormente, transferidas para meio MS (Murashige e Skoog, 1962) slido. Cid e Cruz (2001), trabalhando com micropropagao usando biorreator de imerso permanente (BIPER) de brotos de caf (C. arabica) cv. Catua vermelho 81, em meio lquido suplementado com 0, 12 e 24 M de BAP (6-benzilaminopurina), nos quais foram inoculados 16 brotos por tratamento por biorreator, ao final de 45 dias de cultivo em BIPER, constataram incremento significativo na massa, no nmero de brotos e na altura destes no tratamento de 24 M de BAP, o que representa uma taxa de multiplicao oito vezes superior do controle e duas vezes em relao ao outro tratamento (12 M de BAP). Pereira e Fortes (2003) realizaram experimentos visando estabelecer um protocolo para a multiplicao de material propagativo de batata, cv. Eliza, em meio de cultura lquido. Os melhores resultados foram obtidos quando o material foi cultivado em meio MS lquido, acrescido de cido pantotnico (5,0 mg L -1), tiamina (1,0 mg L -1), cido giberlico (0,25 mg L -1 ) e sacarose (20,0 g L -1), sob agitao constante.

Biorreatores de imerso temporria: procedimento no qual o material vegetal fica temporariamente imerso no meio de cultura. Pode ser constitudo de frascos dispostos lado a lado (Fig. 1), ou por frascos sobrepostos (Fig. 2), embora o primeiro seja o mais utilizado. Esse sistema constitudo por dois frascos transparentes, tubos autoclavveis, filtros de ar hidrofbicos, vlvulas eltricas e compressores de ar. Um frasco contm o meio lquido e o outro contm as plantas que sero cultivadas.

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Ambos os frascos so conectados pelo tubo, que pode ser de silicone ou de vidro, e a esterilidade do ambiente mantida pelos filtros hidrofbicos. Neste tipo de biorreator, a abertura da vlvula eltrica faz com que o meio de cultura seja impulsionado pelo ar comprimido para o frasco que contm o material vegetal. Aps a imerso do material vegetal no meio, o meio de cultura retorna ao frasco original.

Vlvula eltrica Compressor de ar

Filtro

Tubo de silicone

Filtro

Vlvula eltrica Compressor de ar

Temporizador

Temporizador

Fig. 1: Esquema ilustrativo de um biorreator de imerso temporria composto de frascos dispostos lado a lado.

Desenho: Juliana Martins Ribeiro

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Desenho: Juliana Martins Ribeiro

Filtro

Rolha de borracha Temporizador Vlvula eltrica Compressor de ar Filtro Tubo de vidro

Fig. 2: Esquema ilustrativo de um biorreator de imerso temporria composto de frascos sobrepostos. A Fig. 3 mostra o cultivo de cana-de-acar em um biorreator de imerso temporria, ressaltando o frasco contendo o meio nutritivo e o tubo que promove a passagem do meio para o frasco onde est contido o material vegetal, conforme descrito na Fig. 1.

Fig. 3: Ilustrao de um sistema automtico de imerso temporria com cultivo de cana-de-acar.

Fotos: Deivid Costa

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A Fig. 4 mostra fotos de biorreatores de imerso temporria sendo utilizados para o cultivo de banana e orqudea.

Fotos: Deivid Costa

Fig. 4: Ilustrao de biorreatores de imerso temporria sendo utilizados para o cultivo de banana (A) e orqudea (B). Vrios trabalhos foram realizados utilizando-se os biorreatores de imerso temporria para o cultivo de tecidos vegetais, podendo ser citados os seguintes exemplos: Prez et al. (1999) realizaram experimentos com microtubrculos de batata, visando comparar o comportamento das plantas no campo oriundas de tubrculos cultivados in vitro no sistema tradicional e as resultantes do cultivo de tubrculos com a utilizao do sistema de biorreatores de imerso temporria. Os resultados obtidos em condies de campo indicaram que microtubrculos obtidos pelo cultivo em sistema de imerso temporria apresentaram 89% de brotaes em 15 dias, enquanto aqueles resultantes do cultivo in vitro no sistema tradicional apresentaram 74% de brotaes no mesmo perodo de tempo. Alm disso, tubrculos cultivados em sistema de imerso temporria apresentaram peso (g) por planta e dimetro e comprimento (cm) maiores do que aqueles oriundos de tubrculos cultivados in vitro no sistema tradicional. Dessa forma, pode-se definir a utilizao desta tecnologia como uma alternativa para a obteno de mudas de batata em larga escala com elevada qualidade fitossanitria. Escalona et al. (1999) analisaram os fatores relacionados com a propagao de abacaxi em biorreatores de imerso temporria. Para esse estudo, foram considerados os seguintes fatores: efeito do Paclobutrazol (PBZ) na fase de proliferao e a freqncia de imerso no meio nutritivo (4 minutos a cada 3 horas; 4 minutos a cada 12 horas, e 4 minutos a cada

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24 horas). Os resultados indicaram que houve uma maior porcentagem de brotaes e de sobrevivncia dos brotos nos tratamentos em que foi adicionado o PBZ ao meio nutritivo, com sistema de imerso de 4 minutos a cada 3 horas. Garca et al. (1999), em experimentos visando a otimizao de metodologia de micropropagao de manga, observaram que houve um aumento significativo na fase de multiplicao de brotos axilares quando os explantes foram colocados em biorreatores de imerso temporria. Lemos et al. (2001) realizaram a micropropagao de bananeiras cv. Terra, utilizando biorreatores de imerso temporria, com o objetivo de aumentar a taxa de multiplicao e diminuir os custos de produo das mudas. Observaram que o ciclo de imerso de 4 horas e a renovao do meio de cultura aos 30 dias foram essenciais para uma maior produo de biomassa e crescimento dos explantes. A composio do meio de cultura tambm influenciou o desenvolvimento dos explantes de banana cultivados nos biorreatores. Explantes cultivados em meio MS + 3,0 mg L -1 de BAP, com renovao para MS aps 30 dias, apresentaram maior produo de biomassa e alta taxa de multiplicao. Comparando o biorreator de imerso temporria com o sistema tradicional em semi-slido, observou-se que, no primeiro, as microplantas apresentaram maior comprimento, produo de biomassa de 2,86 vezes maior e 2,20 vezes mais brotos do que no sistema tradicional. Rodrigues et al. (2006), em estudos com um biorreator artesanal de imerso temporria, utilizando explantes de Heliconia champneiana Griggs cv. Splash, submetidos a trs subcultivos com quinze minutos de imerso em intervalos de uma hora (T1), quatro horas (T4), seis horas (T6) e oito horas (T8), verificaram que o melhor resultado ocorreu no tratamento T1, sendo invivel o tratamento T8 para esse tipo de cultura. Na comparao com o mtodo convencional (C), os tratamentos T1 e T4 demonstraram melhor eficincia da imerso temporria na produo de brotos. Silva et al. (2007) verificaram que o uso de biorreatores foi eficiente para a propagao de plntulas de abacaxizeiro em larga escala, produzindo, em mdia, 19 brotos por explante e at 200 mudas aos 45 dias de cultivo em recipientes de 1.000 mL. O sistema de imerso temporria acionada a cada 2 horas apresentou-se melhor do que os cultivos em biorreatores de imerso permanente.

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Principais parmetros fsicoqumicos em um biorreator

Os aspectos mais influentes sobre o ambiente no interior dos frascos de um biorreator que, conseqentemente, podem afetar a multiplicao e desenvolvimento de embries somticos e rgos (sem sentido), so os sistemas de agitao e aerao (Perez Ponce, 1998).

Formas e efeitos da agitao

A agitao do meio nutritivo necessria em biorreatores de imerso permanente, vez que nos biorreatores de imerso temporria, a prpria passagem do meio de um frasco para outro j promove sua agitao. Considerando os sistemas de agitao, os biorreatores utilizados para o cultivo de clulas de plantas podem ser classificados em dois tipos, segundo Preil (1991):

. Biorreatores agitados por fluxo de ar: dentre os tipos de biorreatores agitados pneumaticamente, a forma mais utilizada para disperso de ar comprimido feita por meio de tubos que estabelecem correntes de ar no interior do frasco (Fig. 5), havendo, assim, estabilizao dos padres de circulao do lquido, resultando em um fluxo bem definido. Basicamente, este sistema consta de um recipiente de vidro ou plstico, cuja tampa apresenta dois orifcios, um para a entrada do ar e outro para a sada, ambos providos de dutos de ao inox com filtro Millipore (0,2m de poro), a fim de evitar a contaminao do meio nutritivo. O ar introduzido no frasco por meio de um microcompressor e conduzido ao fundo do recipiente por um tubo de silicone. Com exceo da borracha que liga o filtro de entrada ao compressor de ar, todos os componentes do sistema so autoclavveis (120C e 20 minutos).

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Filtro Filtro
Desenho: Juliana Martins Ribeiro

Compressor de ar

Fig. 5: Esquema ilustrativo de um biorreator de imerso permanente agitado por fluxo de ar por meio de tubos de silicone. Biorreatores agitados pneumaticamente tambm so muito utilizados para o cultivo de clulas vegetais visando a produo de metablitos secundrios. Vrios trabalhos j foram publicados nesse sentido, entre eles a utilizao desse tipo de biorreator para a produo de cidos benzicos (Liau & Ibrahim, 1973); antocianinas (Harborne et al., 1970; Ibrahim et al., 1971; Stickland & Sunderland, 1972), carotenides (Williams & Goodwin, 1965), entre outros.

. Biorreatores com agitao f mecnica: so mais utilizados

para o cultivo de suspenses celulares. Dentre os tipos mais comuns de biorreatores com agitao mecnica, esto aqueles compostos de ps giratrias (Fig. 6 A), ou bales volumtricos rotacionados em sentido orbital (Fig. 6 B).

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Desenho: Juliana Martins Ribeiro

Fig. 6: Esquema ilustrativo de biorreatores de imerso permanente agitados mecanicamente, sendo (A) agitao feita por ps giratrias e (B) agitao com bales volumtricos rotacionados em sentido orbital. Um dos principais problemas do cultivo de clulas em suspenso a formao de agregados celulares, devido ao fato de os mesmos afetarem negativamente o processo de agitao em si. Para controlar esse problema, existe um sistema de agitao especfico que promove vibraes que evitam sua formao. Alm de controlar a formao de agregados celulares, esse sistema de vibrao demonstra ser satisfatrio, por no causar nenhum dano na clula cultivada. Entretanto, apresenta a desvantagem de aumentar a viscosidade do meio de cultura, diminuindo, assim, a eficincia de agitao (Preil, 1991).

Formas de transferncia e efeitos do oxignio dissolvido

A quantidade de oxignio dissolvido pode ser medida por meio de eletrodos, que devem ser calibrados depois da esterilizao e antes da inoculao no biorreator, e pode ser controlada regulando-se a velocidade de agitao e o fluxo de ar (Preil, 1991). Entretanto, em biorreatores para o crescimento de clulas vegetais, o controle de oxignio dissolvido no meio no pode ser feito por meio de velocidade de agitao e fluxo de ar, por causarem danos nas clulas.

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Para o cultivo de clulas em biorreatores, a manuteno da quantidade de oxignio dissolvido deve ser realizada por meio de equipamentos compostos de vlvulas eltricas que ajustam a quantidade do gs no interior do biorreator de acordo com um valor fixado, ou seja, aumentam ou diminuem sua quantidade em relao ao set point. Por meio desse sistema de controle de gases, pode-se manter valores mnimos de agitao que no causem danos nas clulas (Preil et al., 1988; Preil, 1991; Jay et al., 1992; Jimnez et al., 1994). O oxignio no completamente solvel em gua, sendo rapidamente consumido quando seu fornecimento interrompido, especialmente em uma alta densidade celular. Sendo assim, a concentrao de oxignio dissolvido do meio lquido est diretamente relacionada com a taxa de crescimento das clulas e/ou tecidos no meio nutritivo. O oxignio dissolvido influencia fortemente a atividade mittica das suspenses celulares e, em altas concentraes, responsvel por aumentar significativamente a concentrao de clulas no meio de cultura. Entretanto, a formao e o desenvolvimento embries somticos so superiores em concentraes mais baixas de oxignio dissolvido. De maneira geral, ao se controlar a quantidade de oxignio dissolvido em biorreatores, pode haver a limitao na formao de biomassa no diferenciada e uma maior produo de embries somticos em baixas concentraes de oxignio (Perez Ponce, 1998).

Efeitos provocados pelas variaes de CO2 e pH

A concentrao de CO2 influencia diretamente o pH do meio. Uma alta aerao pode resultar em uma rpida renovao de gases e substncias volteis, como CO2, etileno e etanol. Logo, a alta taxa de aerao reduz consideravelmente a concentrao de CO2 nas culturas. Alm disso, parece haver uma relao entre a formao de embries somticos e o aumento do pH do meio de cultura. Sendo assim, o pH pode ser explorado para induo da formao de embries somticos em diferentes espcies de plantas (Perez Ponce, 1998).

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Consideraes finais
A utilizao de meio de cultura lquido nos biorreatores permite a renovao do ar e nutrientes durante o cultivo e resulta em maiores crescimento e multiplicao quando comparado com o cultivo em meio slido. Alm disso, a utilizao de computadores como sistemas de controle resulta na automao e economia de trabalho, gerando uma reduo significativa da mo-de-obra, baixando expressivamente os custos de produo de mudas em biorreatores, quando comparados com a tcnica de micropropagao convencional. De maneira geral, devem ser evitados os danos mecnicos, causados por altas velocidades de agitao, e a limitao de oxignio, favorecida pelas baixas velocidades de agitao, em virtude de ambos os fatores serem determinantes para o rendimento final de biomassa e para a produo total de embries somticos. Variveis como o tipo de biorreator, o volume e a composio do meio de cultura, o fluxo de ar, a forma como os eletrodos de oxignio so calibrados e a forma utilizada para controlar a concentrao de oxignio dissolvido, CO2 e pH so de grande importncia para o desenvolvimento adequado da cultura e variam de acordo com a espcie vegetal que ser utilizada.

Referncias bibliogrficas
ALVARD, D.; COTE, F.; TEISSON, C. Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Netherlands, v. 32, n.1, p. 55-60, 1993. CID, L. P. B.; CRUZ, A. R. R. Induo de multibrotao em C. arabica cv. Catua Vermelho 81, usando diferentes concentraes de BAP em bioreator de imerso permanente (BIPER). In: SIMPSIO DE PESQUISA DOS CAFS DO BRASIL, 2., 2001, Vitria. Resumos... Braslia, DF: Embrapa Caf, 2001. p. 33. DEBERGH, P.; HARBAOUI, Y.; LEMEUR, R. Mass propagation of globe artichoke (Cynara scolymus): evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential. Physiology Plantarum, Belgium, v. 53, n. 2, p.181-187, 1981.

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CGPE 7410

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