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Ao antibacteriana e antiaderente de pithecellobium Cochliocarpum (gomez) macbr sobre microrganismos orais Antimicrobial and antiadherent activity of pithecellobium cochliocarpum (gomez) macbr tested on oral microorganisms
Doutoranda em Cincias Farmacuticas pela UFPE Mestranda em Odontologia Social pela UFPB 3 Mestranda em Cincias Farmacuticas pela UFPE 4 Professor Adjunto do Departamento de Clnica e Odontologia Preventiva da UFPE 5 Professora Adjunta do Departamento de Biologia Molecular da UFPB 6 Professora Adjunta do Departamento de Antibiticos da UFPE
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O presente artigo corresponde parte da tese de Doutorado do Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas pela UFPE. Renata Patrcia Freitas Soares de Jesus1, Maria Regina Macedo Costa2, Isla Vanessa Bastos3, Geraldo Bosco Lindoso Couto4 , Maria do Socorro Vieira Pereira5, Ivone Antnia de Souza6

DESCRITORES: Pithecellobium cochliocarpum; Atividade antimicrobiana; Atividade antiaderente.

RESUMO O biofilme dental o fat or de maior impor tncia na etiologia da crie e das doenas periodontais . Diversos produtos de origem v egetal mostraram ser pot encialmente interessantes no que se r efere a sua atividade antimicrobiana. O objetivo do estudo foi o de avaliar a atividade antibacteriana e antiaderente do Pithecellobium cochliocarpum (Gomez) Macbr. (babatenon) frente Streptococcus mutans, S. sanguinis, S. salivarius, S. mitis, S. oralis e Lactobacillus casei. Para a determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM), os ensaios foram realizados em triplicata, em meio slido , atravs da tcnica de gar-Difuso em placas de Petri. Em relao determinao da Concentrao Inibitria Mnima de Aderncia (CIMA) da bactria ao vidro na presena de sacarose a 5%, utilizou-se a tcnica dos tubos inclinados. Em estudo comparativo, foi determinada a CIM e a CIMA do digluconato de clorexidina a 0,12%. Quanto CIM, o Pithecellobium cochliocarpum apresentou atividade antibacteriana similar ao digluconato de clorexidina frente a todas as linhagens ensaiadas. Os halos variaram entre 10 a 30mm c om resultado destacado (at a diluio 1:512) frente a S. sanguinis, S. oralis e L. casei. J a CIMA frente ao babatenon mostrou-se efetivo na inibio da aderncia at a ltima diluio considerada (1:512) para S. sanguinis, S. mitis e S. oralis, apresentando desempenho mdio superior clorexidina. Conclui-se que o Pithecellobium cochliocarpum apresentou potencial atividade antimicrobiana e antiaderente, ressaltando a impor tncia de se a valiar um agent e fitoterpico mais ac essvel populao com perspectiva da prescrio nos servios de Ateno Bsica, estando em consonncia com as novas diretrizes do Ministrio da Sade. Abstract The dental biofilm is the major factor in the etiology of caries and periodontal diseases. Several plant products have shown to be potentially inter esting with r egard to its antimicr obial activity. The aim of this study w as to ev aluate the antibacterial and adher ent the ethanol ex tract of P ithecellobium cochliocarpum (Gomez) Macbr (babatenon) front Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis and Lactobacillus casei. To determine the minimum inhibitor y concentration (MIC) tests were perfomed in triplicate on solid medium, using the technique of A gar Diffusion in petri dishes r elation to determining the minimum inhibitory concentration of adherence (CIMA) of the bac teria to glass in the pr esence of sucrose at 5%, w e used the technique of inclined tubes . In a c omparative study, it w as determined the CIM and CIMA v alues of chlorhexidine 0.12%. As for CIM, P ithecellobium cochliocarpum showed antibacterial activity similar to chlorhexidine gluc onate against all strains tested. The zones ranged from 10 to 30 mm with outstanding results (up to dilution 1:512) against S. sanguinis, S. oralis and L. casei. Already the CIMA in relation the babatenon was effective in inhibiting adhesion to the last dilution was considered (1:512) for S. sanguinis, S.oralis and S. mitis, showing average performance than chlorhexidine. It is concluded that Pithecellobium cochliocarpum showed significant antimicrobial activity and antiadherent emphasizing the importance of evaluating an agent herbal medicine mor e accessible to people with perspec tive of the prescription in primary care services, and in line with new guidelines from the Ministry of Health.

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Keywords: Abarema c ochliocarpa, antimicr obial ac tivity, antiadherent activity.

Endereo para correspondncia Renata Patrcia Freitas Soares de Jesus Rua do Sossego, 246/32 - Ed. Lotus Boa Vista Recife/PE CEP: 50.050-080

As infeces humanas, particularmente aquelas que en volvem a pele e muc osas, c onstituem um srio problema, especialment e em pases desen volvidos tr opicais e subtropicais. As plantas tm sido valorizadas como produtos naturais importantes para a manuteno da sade , especialment e na ltima dcada, c om a realizao de muitos estudos sobre terapias naturais1. O importante cr escimento mundial da fitoterapia dentro

INTRODUO

de programas preventivos e curativos tem estimulado a avaliao da atividade de dif erentes extratos de plantas para o controle do biofilme dental bem c omo de outras afeces bucais. Inmeros trabalhos v m sendo r ealizados par a a valiao de espcies v egetais na Odont ologia2,3, 4,5. O Brasil apresenta um grande potencial para o de senvolvimento da Fitoterapia, inclusive no que se r efere Odont ologia, vinculado ao c onhecimento tradicional
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e tecnologia para validar cientificamente este esclarecimento6. A tualmente a F itoterapia faz par te do Sist ema nico de Sade, sendo possvel a sua incluso mdica e odontolgica7,8. Pithecellobium c ochiliocarpum ( Gomez) M acbr uma rvore de grande porte endmica do Brasil pertencente L eguminosae-mimosaceae, enc ontrada na M ata Atlntica. Sua dec oco tem sido amplament e utilizada pela populao devido a sua pr opriedade antissptica, cicatrizante, anti-inflamatria, analgsica e antiulcerognica8. c onhecida popularmente como babatenon, babatimo ou barbatimo . Estudos fitoqumicos relatam a presena de saponinas , flavonoides, catequinas e terpenos. P oucos estudos t m demonstrado suas atividades biolgicas. Estudo realizado com o ex trato hidroalcolico das cascas de P . cochliocarpum demonstrou atividade antibacteriana em cepas Gram-positivas9, 10. Em virtude da biodiversidade presente nos diferentes biomas brasileir os, exist e uma cr escente demanda para pr odutos naturais que impulsionam as in vestigaes cientficas e a busca por dr ogas naturais. A ssim, o objetivo deste estudo foi o de verificar a ao antimicrobiana e antiaderente do extrato das cascas de P. cochliocarpum (Gomez) Macbr frente a Str eptococcus mutans, S. sanguinis, S. salivarius, S. mitis, S. oralis e Lactobacillus casei.

badas a 37C por 18-20 horas em micr oaerofilia. Foram realizadas perfuraes no meio de cultura ( Agar Mueller Hinton DIFC O, acrescido de sacar ose a 5%) de apr oximadamente 6mm de dimetr o. Nos orifcios , c olocou-se um v olume de 50 l da sol uo do ex trato diludo , variando de 1:1 a 1:5 12. A s placas f oram incubadas em estufa bac teriolgica a 37C por um perodo de 24 ho ras. Os mesmos pr ocedimentos f oram r ealizados c om o gluc onato de clor exidina a 0,12% (c ontrole positiv o). Cada ensaio f oi realizado em duplicata fr ente a cada linhagem selecionada. F oi c onsiderada c omo CIM a me nor concentrao do ex trato que inibiu c ompletamente o crescimento bacteriolgico. Determinao da Concentrao Inibitria Mnima de Aderncia A c oncentrao I nibitria M nima de A derncia (CIMA) da bac tria ao vidr o foi determinada na pr esena de sacar ose a 5%, de ac ordo c om Gerbara, Zar detto e M ayer (1996), usando -se c oncentraes cr escentes e dobradas da soluo diluda do extrato, variando de 1:1 a 1:512. A partir do crescimento overnight, as linhagens foram subcultivadas a 37C em caldo Meller-H inton (DIFCO), em micr oaerofilia, por um perodo de 40min, obtendo-se um inculo de 106 UFC/ml . A incubao f oi a 37C por 24 horas em micr oaerofilia, com os tubos inclinados a 30. Os mesmos pr ocedimentos tambm foram realizados com o gluconato de clorexidina a 0,12% (controle positiv o). C ada ensaio f oi r ealizado em duplicata frente a cada linhagem selecionada. A CIM A foi definida como a menor concentrao do agente antibac teriano que impediu a aderncia bacteriana ao tubo de vidro. Anlise estatstica Os r esultados obtidos no t este da C oncentrao Inibitria M nima f oram c oletados, or ganizados e apr esentados em forma de tabelas com os seus respectivos valores das mdias dos halos , indicando a inibio do crescimento bac teriano. P osteriormente, os r esultados obtidos foram transferidos para um banc o de dados informatizado e calculado os parmetr os estatsticos que incluram valor es das r espectivas medidas descritivas mnimo, mximo , mdia e desvio -padro mediant e o emprego do programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences), verso 13.0. O nvel de confiana utilizado para a obt eno dos int ervalos f oi de 95%. Utiliz ou-se, ao nv el de 5% de sig nificncia, o t este t -Student ( para duas amostras independentes) na comparao da inibio bacteriana mnima de cada ex trato em relao ao digluconato de clor exidina a 0,12%. P ara o seu uso , verificaram-se, inicialment e, as pr emissas de normalidade e igualdade de varincias atra vs dos seguint es t estes: Kolmogorov-Smirnov (uma amostra) para normalidade e Levene para verificao da homogeneidade dos dados.

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Material Botnico e obteno do extrato Amostras de P. cochliocarpum foram coletadas no NUPA (Ncleo de P esquisa e P rocessamento de Alimentos/ UFPB) em Joo P essoa PB e post eriormente identificadas pela botnica Dra. R ita de C ssia de A. P ereira. Uma ex cicata f oi depositada no herbrio Prof. Laur o Pires Xavier, da Univ ersidade Federal da P araba, sob o nmero 61.336. O processo de secagem foi efetuado em temperatura ambiente, durante 24 horas. Em seguida, foi colocado na estufa a 33C, durante uma semana, sendo, posteriormente, triturada a p . A ex trao f oi r ealizada em lcool etlico 95% (p/p) e , aps uma semana de macerao, foi obtido o ex trato brut o por filtrao. Este foi evaporado em rotavapor a 40C, obtendo-se resduo escuro e higroscpico. Cepas Bacterianas Utilizaram-se, neste estudo, linhagens bacterianas padronizadas de Str eptococcus mitis A TCC 903, Str eptococcus sanguinis A TCC 15300, Str eptococcus mutans ATCC 25175, Str eptococcus salivar es ATCC 7073, S. oralis ATCC 10557 e Lac tobacillus casei ATCC 9595, obtidas mediante solicitao na Fundao Tropical de Pesquisas e Tecnologia Andr Tozello ( Campinas- SP) e I nstituto Adolfo L utz (So P aulo- SP), r espectivamente. F oram replicadas em A gar Sangue inclinado ( slants), e , posteriormente, estocadas, repicadas no Laboratrio de Gentica de M icrorganismos Depar tamento de Biologia Molecular/CCEN, da Universidade Federal da Paraba. Determinao da Atividade Antimicrobiana do Extrato de Pithecellobium cochliocarpum. A atividade antimicr obiana em placas f oi determinada pelo mt odo de difuso em meio slido , para a determinao da C oncentrao I nibitria M nima ( CIM) do extrato etanlico de P. cochliocarpum (EEPc) sobre as linhagens bacterianas. As linhagens foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI-Brain Hear t I nfusion-DIFCO) e incuOdontol. Cln.-Cient., Recife, 9 (4) 331-335, out./dez., 2010 www.cro-pe.org.br

MATERIAIS E MTODOS

Os r esultados da atividade antimicr obiana para a determinao da C oncentrao I nibitria M nima em meio slido c om halos de ini bio do ex trato da casca de babat enon sobr e S. mitis , S. mutans , S. sanguinis , S. oralis, S. salivarius e L. casei esto apr esentados nas tabelas 1. Nesse ensaio , ficou demonstrado que t odas as amostras utilizadas foram sensveis ao extrato. Os halos de inibio variaram de 10 a 30mm. A ao antimicr obiana f oi homognea para as linhagens ensaiadas, e a inibio do crescimento bacte-

RESULTADOS

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e S. sanguinis, com halo de inibio at a diluio 1:32. O S. mitis, apresentou halo de inibio at a diluio 1:16. Na tabela 3, ficou demonstrado que o EEP c apr esentou atividade antiaderente em todas as cepas estudadas. O extrato etanlico de P . cochiliocarpum apresentou maior atividade antiaderente frente a todas as bactrias estudadas, quando c omparado ao c ontrole positiv o (1:16), e atividade antiader ente maior fr ente ao S. sanguinis, S. oralis e S. mitis com CIMA de 1:512.

riano diminuiu , c onforme a r eduo na c oncentrao do extrato, com a formao de halos de inibio a par tir do extrato bruto at a ltima diluio do ex trato (1:512) frente s amostras de S. sanguinis, S. oralis e L. casei. A Figura 1 expressa a ao antimicrobiana in vitro do extrato

Admitiu-se normalidade para a Concentrao Inibitria Mnima do ex trato considerado (v erificada atravs do teste no-paramtrico de normalidade de Kolmogo rov-Smirnov) e igualdade de varincias populacionais (verificado atravs do teste de Levene) (Tabelas 4 e 5).

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hidroalcolico de P . cochliocarpum frente a uma amostra de S. aureus multiresistente. Em relao aos ensaios da atividade antimicr obiana realizados com o digluconato de clorexidina a 0,12% (Tabela 2), t odas as linhagens selecionadas f oram inibiConforme resultados do teste-t (tabela 6), o extrato de Babatenon teve desempenho mdio superior ao Gluconato de clorexidina a 0,12% nas c oncentraes E1:8 a E1:128 quant o c oncentrao inibit ria mnima ( CIM), entretanto houv e dif erena sig nificativa apenas nas concentraes E1:64 (sig. p-valor < 0,05) e E1:128 (sig. p-valor < 0,01). A clor exidina apresentou mdia superior com as c oncentraes EB v s SP e E1:2, sendo , por m, estatisticamente no-significante.

das pela ao dessa substncia, c omo esperado . A s linhagens de S. oralis, S. salivarius e L. casei foram as mais sensveis, apr esentando halo de inibio at a diluio 1:128; o padro de sensibilidade seguido por S. mutans
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As af eces odont olgicas podem ser evidenciadas por sint omas carac tersticos de div ersas etiolog ias. Algumas dessas afeces vm sendo tratadas com a fitoterapia, sendo algumas espcies vegetais indicadas nos casos de gengivite, abscesso na boca, inflamao e aftas 8, 11, 12, 13 . P orm, apesar das inmeras possibilidades de uso de plantas medicinais por par te dos profissionais da rea da sade , seu uso na odont ologia tem sido pouc o explorado, seja para tratar doenas bucais ou para tratar doenas sistmicas com manifestaes bucais14,15, 16, 17. Os fitofrmacos aplicados em odontologia tm assumido um papel impor tante c om atividade antimicrobiana e antifng ica fr ente s af eces bucais pelo considervel a vano do desen volvimento de derivados naturais com ao bactericida ou fungicida12, 18, 19, 20, 21. No presente estudo, as cepas bacterianas de S. mitis, S. mutans e S. sanguis , S.oralis, S. salivar es, L. casei f oram susceptveis ao do ex trato etanlico da casca do caule P.cochliocarpum. A inibio do crescimento mostrou-se homognea, de acordo com o grau de concentrao do extrato. Houve uma diminuio proporcional do dimetro dos halos medida que a c oncentrao diminua, conforme a tabela 01. Est es r esultados f oram mais significativos dos que os enc ontrados, quando utilizada a clorexidina a 0,12%, conforme tabela 02. O biofilme dental uma pelcula de micr organismos que se desen volve naturalment e sobr e as superfcies dos dent es. Nas fases iniciais do seu pr ocesso de formao, o biofilme bacteriano necessita de polissacardeos ex tracelulares, permitindo a adeso , int erao e multiplicao das bactrias22. Sabe-se que a adeso das bac trias s super fcies dentais c onstitui um pr ocesso c omplexo multifat orial, influenciado pelo ambient e bucal , mor fologia dental , superfcie bacteriana e hbitos do hospedeiro e superfcie do substrato24. De acordo com Pereira et al., (2006)17, vrios fat ores esto associados a esse pr ocesso, dentr e estes, a interao de protenas, adesinas, lectinas e interaes hidrofbicas. Dessa forma, a interferncia com a adeso bac teriana nas super fcies dos dent es pode ser um caminho para se obter o controle do biofilme dental, e , c onsequentemente, se pr evenir a instalao de patologias orais utilizando pr odutos que c ontenham P. cochliocarpum. Neste e studo, o e xtrato d a c asca d e P. c ochliocarpum foi efetivo na inibio da ader ncia das cepas utilizadas, representada pela ausncia de aderncia ao vidro na presena de sacar ose, apresentando os melhor es resultados sobr e o S. sanguis , S. oralis e S. mitis , agent es importantes envolvidos nas afeces bucais. Essa atividade representada pela ausncia de aderncia da bactria par ede do tubo de vidr o, demonstrando a capacidade dos ex tratos de inibir a snt ese do glucan o pela glicosiltransferase24. Os resultados so promissores, uma vez que esses micr organismos tambm so os maior es responsveis pela formao do biofilme bacteriano. S. mutans esto diretamente envolvidos na etiopatogenia da crie, doenas periodontais , estomatites e outras infeces orais por contriburem para o desequilbrio da microbiota oral, na medida em que criam condies fa vorveis ader ncia de micr oorganismos oportunistas s super fcies dentrias , muc osas orais e prteses25. Neste estudo, o ex trato de P. cochliocarpum apresentou atividade inibitria frente a cepas de S. mutans maior do que o gluconato de clorexidina.
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DISCUSSO

C onsiderando os c onstituintes pr esentes no v egetal, a atividade antimicrobiana positiva do extrato de P. c ochliocarpum fr ente s amostras estudadas suger e ter sido devido pr esena de c ompostos como taninos (compostos polifenlicos), previamente encontrados na planta26, uma vez que esses compostos tm comprovada ao antimicr obiana e possuem uma ao inespecfica sobre o micr organismo, rompendo a par ede celular bacteriana e inibindo os sistemas enzimticos para a formao desta27. A resistncia bacteriana frente aos antimicrobianos considerada como um problema inerente terapia antimicrobiana; por esse motiv o, impor tante buscar no vas fontes teraputicas as quais sejam mais eficazes para o tratament o de inf eces, c omo as bac terianas28. O P . cochiliocarpum uma alt ernativa ex tremamente vivel para o descobrimento de novos produtos com princpios ativos pr omissores, alm de ser uma alt ernativa mais econmica no c ontrole de doenas para pases em de senvolvimento.

O ex trato etanlic o d a casca d e P ithecellobium cochliocarpum apr esentou ao antimicr obiana sig nificativa e atividade inibitria mnima de aderncia in vitro sobre as linhagens de S. mitis , S. mutans , S. sanguis , S. oralis, S. salivares e L. casei, presentes no biofilme bacteriano supragengival, apresentando-se como opo teraputica para as inf eces orais, sendo ac essvel populao, uma v ez que t em seu uso difundido na medicina popular.

CONCLUSO

REFERNCIAS

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Recebido para publicao: 26/03/10 Aceitop arap ublicao:0 7/05/10 Odontol. Cln.-Cient., Recife, 9 (4) 331-335, out./dez., 2010 www.cro-pe.org.br