UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR ION IONESCU DE LA BRAD IAI

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

TNASE DUMITRU

NACU GHERASIM

BIOTEHNOLOGII DE REPRODUCIE
ANUL III, SEMESTRUL I

MATERIAL DE STUDIU I.D.

IAI, 2011

CUPRINS
CAP.1 BIOTEHNOLOGIA NSMNRILOR ARTIFICIALE.........................3 1.1 Importana nsmnrilor artificiale ..........................................................................3 1.2 Aspecte organizatorice ale nsmnrilor artificiale n ara noastr ..........................5 1.3 Principiii metode de recoltare a spermei...................................................................7 1.3.1 Bazele fiziologice ale recoltrii spermei ....................................................7 1.3.1.1 Comportamentul sexual al masculilor ........................................7 1.3.1.2 Specificul reflexelor sexuale la principalele specii de animale .................................................................................10 1.3.1.2.1 Reflexele sexuale la taur.............................................10 1.3.1.2.2 Reflexele sexuale la berbec ........................................12 1.3.1.2.3 Reflexele sexuale la vier.............................................12 1.3.1.2.4 Reflexele sexuale la armsar ......................................13 1.3.2 Principiii metode generale de recoltare a spermei ....................................13 1.3.2.1 Recoltarea spermei la taur ..........................................................15 1.3.2.2 Recoltarea spermei la berbeci ap .............................................19 1.3.2.3 Recoltarea spermei la vier ..........................................................20 1.3.2.4 Recoltarea spermei la armsar....................................................22 1.3.2.5. Recoltarea spermei la psri ......................................................23 1.4 Examenul nsuirilor spermei .....................................................................................24 1.5 Diluarea spermei.........................................................................................................24 1.5.1 Consideraii generale ..................................................................................24 1.5.2 Principiile dilurii, nsuirile generale ale diluanilor i clasificarea acestora ............................................................................25 1.5.3 Tehnica preparrii diluanilor .....................................................................26 1.5.4 Tehnica diluiei...........................................................................................27 1.5.4.1 Diluarea spermei de taur.............................................................27 1.5.4.2 Diluarea spermei de berbec ........................................................29 1.5.4.3 Diluarea spermei de vier.............................................................31 1.5.4.4 Diluarea spermei de armsar ......................................................33 1.5.4.5 Diluarea spermei de psri .........................................................33 1.6.Conservarea spermei ..................................................................................................34 1.6.1 Conservarea spermei de taur ......................................................................38 1.6.2 Conservarea spermei de berbeci ap..........................................................44 1.6.3 Conservarea spermei de vier .....................................................................46 1.6.4 Conservarea spermei de armsar ................................................................48 1.6.5 Conservarea spermei de psri ...................................................................49 1.7 Inocularea spermei......................................................................................................50 1.7.1 Inocularea spermei la vac .........................................................................50 1.7.1.1 Punctul de nsmnri artificiale la vaci (P.I.A.V.)...................50 1.7.1.2 Descoperirea femelelor n cldurii stabilirea momentului optim al nsmnrii.............................................51 1.7.1.3 Pregtirea femelelor pentru nsmnare ....................................52 1.7.1.4 Reanimarea spermatozoizilor .....................................................53 1.7.1.5 Tehnica inoculrii spermei .........................................................64 1.8.2 Inocularea spermei la oaiei capr ..............................................................56 1.8.2.1 Organizarea punctului de nsmnri artificiale la ovine (P.I.A.O.) .....................................................................56 1.8.2.2 Depistarea oilori caprelor n clduri .........................................57 1.8.2.3 Inocularea materialului seminal .................................................59 1.7.3 Inocularea spermei la scroaf .....................................................................60 1.8.3.1 Organizareai dotarea punctului de nsmnare artificial (P.I.A.S.) cu activitate complex ..............................60 1.7.3.2 Descoperirea scroafelor n clduri..............................................61
1

1.7.3.3 Stabilirea momentului optim de nsmnare .............................61 1.7.3.4 Aparaturai instrumentarul folosit pentru nsmnarea artificial a scroafelor ..........................................62 1.7.3.5 Inocularea spermei......................................................................63 1.7.4 Inocularea spermei la iap ..........................................................................64 1.7.5 Inocularea spermei la psri .......................................................................65 CAP. 2 BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE ..67 2.1 Istoriculi importana transferului de embrioni ..........................................................67 2.2 Biotehnologia transferului de embrioni la vac ..........................................................68 2.2.1 Seleciai pregtirea vacilor donatoare .......................................................69 2.2.2 Seleciai pregtirea vacilor primitoare (receptoare) ..................................70 2.2.3 Sincronizarea estruluii ovulaiei la vacile donatoare i primitoare............................................................................................70 2.3.4 Inducerea poliovulaieii nsmnarea artificial a vacilor donatoare..................................................................................71 2.3.5 Fecundarea ovocitelor.................................................................................74 2.2.6 Recoltarea embrionilor ...............................................................................74 2.2.7 Cutareai aprecierea calitii embrionilor .................................................76 2.2.8 Conservareai deconservarea .....................................................................78 2.2.9 Transferul embrionilor ...............................................................................81 2.3 Biotehnologia transferului de embrioni la rumegtoarele mici ..................................82 2.3.1 Alegerea donatoarelori receptoarelor ........................................................83 2.3.2 Sincronizarea estruluii ovulaiei la femelele donatoare i receptoare............................................................................................84 2.3.2.1 Tratamente progestative de sincronizare ....................................85 2.3.2.2 Tratamente de stimulare ovarian ...............................................85 2.3.2.3 Inducerea estruluii ovulaiei la receptoare ................................86 2.3.3 nsmnarea femelelor donatoare ..............................................................87 2.3.4 Recoltarea embrionilor ...............................................................................88 2.3.5 Examenuli aprecierea embrionilor ............................................................89 2.3.6 Congelarea-decongelarea embrionilor........................................................90 2.3.7 Transferul embrionilor la femelele receptoare............................................91 2.3.7.1 Transferul chirurgical .................................................................91 2.3.7.2 Transferul embrionilor sub control endoscopic ....................................................92 CAP. 3 BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFERUL DE EMBRIONI..................................................................................................94 3.1 Fecundaia ,,in vitro ..................................................................................................94 3.1.1 Obinerea ovocitelor ...................................................................................95 3.1.2 Maturarea ,,in vitro a ovocitelor ...............................................................95 3.1.3 Capacitarea spermatozoizilor......................................................................96 3.1.4 Fecundaiai cultura ,,in vitro a embrionilor .............................................97 3.1.5 Transferul embrionilor obinui ,,in vitro ..................................................98 3.1.6 Importana, perspectivelei aplicaiile fecundaiei ,,in vitro .....................99 3.2 Bisecia embrionilor................................................................................................ 100 3.3 Sexarea embrionilor................................................................................................ 102 3.4 Transplantarea nucleilori obinerea de clone ........................................................ 103 3.4.1 Pregtirea ovocitelor receptoare ............................................................. 103 3.4.2 Izolarea nucleilor embrionului donator .................................................. 104 3.4.3 Reconstituirea embrionilor ..................................................................... 104 3.5 Transgeneza ............................................................................................................ 105 BIBLIOGRAFIE107

CAPITOLUL 1 BIOTEHNOLOGIA NSMNRILOR ARTIFICIALE 1.1. Importana nsmnrilor artificiale

Astzi, exist numeroase ri care nsmneaz artificial ntregul efectiv de vaci realiznd astfel un progres rapid i substanial n ameliorarea raselor. nsmnrile artificiale s-au extins n practic datorit avantajelor zooeconomice i sanitar-veterinare. Din punct de vedere zoo-economic, nsmnrile artificiale sunt importante pentru c folosesc intens reproductorii de valoare, cu poten individual mare, ceea ce conduce la grbirea ritmului i gradului de ameliorare a efectivelor de animale. La nsmnrile artificiale se folosesc masculi testai dup descendeni, astfel nct, pe lng calitatea superioar a spermei, exist i testarea real a valorii de ameliorare. Prin congelarea materialului seminal, reproductorul valoros poate fi folosit la reproducere mai muli ani, chiar dup moartea acestuia prin constituirea depozitului cu sperma provenit de la acesta. Datorit congelrii materialului seminal s-a creat posibilitatea schimbului internaional de material seminal valoros din puct de vedere genetic, chiar la distane intercontinentale, fr trasportul i aclimatizarea reproductorului. Prin folosirea nsmnrilor artificiale, testarea dup descendeni a reproductorilor se poate realiza mult mai repede, iar prin examenul complex, zootehnic i sanitar-veterinar, se pot descoperi reproductorii cu diferite anomalii congenitale ale aparatului genital sau cu tulburri ereditare ale spermatogenezei. Se realizeaz, astfel, o profilaxie genetic a sterilitii. Datorit evidenelor stricte care se in pentru toate operaiile ce se efectueaz, se poate cunoate ntr-o mai mare msur paternitatea descendenilor. Evidenele sunt completate cu determinarea grupei sanguine a prinilor i descendenilor. Reproductorii masculi fiind grupai separat de femele, se pot lua msuri specifice de alimentaie raional i ngrijire corespunztoare i se poate institui un regim de recoltare a spermei favorabil obinerii de produi la un pre de cost mai sczut i ofer posibilitatea crerii unor nuclee de animale valoroase. La reproductorii de elit, concentrai n uniti specializate, se practic i determinarea genofondului, a structurii imunogenetice, ceea ce d posibilitatea cunoaterii prezenei sau absenei echilibrului genetic n cadrul unei populaii date. n condiiile unor centre mari de nsmnri artificiale unde sunt concentrai muli reproductori, este posibil stabilirea valorii de ameliorare n selecia concomitent pentru mai multe caractere productive. Acest lucru se realizeaz pentru c se obine un numr mare de produi contemporani, masculi i femele, care pot fi repartizai n mai multe uniti. De asemenea, numrul mare de reproductori de diferite vrste, concentrai n uniti specializate, permite alegerea unui moment optim pentru determinarea performanelor, respectiv a vrstei la care s-ar putea determina, cu cea mai mare precizie, valoarea de ameliorare. Lucrrile efectuate pe ovine,

pentru determinarea valorii de ameliorare n direcia produciei de ln, au demonstrat c selecia trebuie s se fac pe baza celei de-a doua tunsori. Sub raport economic, reproductorii foarte valoroi din punct de vedere zootehnic, sunt folosii cu mare eficien economic. ntr-un sezon sexual, numrul femelelor nsmnate artificial cu sperma de la un taur, comparativ cu monta, este , n medie, de 50-80 de ori mai mare, de 25 de ori mai mare la oi i de 3-4 ori mai mare la cabaline i suine. Astfel, n cazul practicrii montei, unui taur i se repartizeaz anual 50-70 de femele. Dac se practic nsmnrile artificiale, cu sperma conservat prin refrigerare se pot nsmna anual 1000-3000 de vaci. n cazul n care se conserv sperma prin congelare, numrul vacilor nsmnate cu sperma provenit de la un taur poate ajunge la 10000-30000. n cazul unor tauri deosebit de valoroi s-au putut obine pn la 50000 de viei pe ntreaga perioad de exploatare a taurului (6-7 ani). Literatura de specialitate citeaz cazuri n care de la un taur, ntr-un an s-au obinut peste 120000 de doze de nsmnare, iar n toat perioada de exploatare a acelui taur de peste o jumtate de milion de viei. La taurine, pot fi nsmnate dintr-un singur ejaculat pn la 1000 de vaci. La porcine, ovine i cabaline, dintr-un singur ejaculat se pot nsmna numai 5-50 de femele. Acest numr mic de femele nsmnate artificial este important din punct de vedere economic i genetic i a redus rspndirea nsmnrilor artificiale la aceste specii. Economicitatea procedeului de congelare a spermei este exemplificat cel mai bine de posibilitatea reducerii numrului de spermatozoizi n doza de nsmnare fr a scdea rata de concepie Dac aplicarea tehnicilor de nsmnare artificial cu material congelat a progresat la taurine, nu acelai lucru se poate spune i despre celelalte specii. Ratele de concepie i numrul de produi la o ftare realizate cu material seminal congelat sunt mai sczute la porcine. La ovine i cabaline, ratele de concepie sunt satisfctoare. Aceste rezultate demonstreaz diferene distincte de specie, n cerinele pentru supravieuirea optim a spermatozoizilor n perioada congelrii i decongelrii. La vier, esenial este modificarea compoziiei diluantului dup decongelarea spermatozoizilor pentru a maximaliza rata de fecundare. Organizarea reelei de nsmnri artificiale pe baza unor centre puternice, cu un numr mare de reproductori, creeaz, prin concentrarea i specializarea produciei, o eficien economic sporit n raport cu ntreinerea i exploatarea reproductorilor masculi n fiecare ferm zootehnic. Din punct de vedere sanitar-veterinar, prin practicarea nsmnrilor artificiale a efectivelor de femele, se pot preveni i combate unele boli transmisibile prin actul montei (iniial a constituit principala cauz a rspndirii nsmnrilor artificiale). Totodat, se previn i combat boli cu etiologie parazitar (trichomonoza la taurine, durina la cabaline) i cu etiologie infecioas (bruceloza, campylobacterioza la taurine, ovine, porcine). Prin practicarea acestei valoroase biotehnologii de reproducere devine posibil continuarea reproducerii n unitile carantinizate. De asemenea, se pot preveni i combate unele forme de infecunditate la femele, cum ar fi spasmul vaginal i altele. Metoda actual de inoculare a spermei permite efectuarea de observaii asupra organelor genitale femele, ceea ce influeneaz favorabil rezultatul nsmnrilor. Concentrarea de reproductori n uniti specializate permite luarea unor msuri riguroase i tiinifice de alimentaie, adpostire i ngrijire a animalelor precum i de prevenire a bolilor, care i ele pot influena negativ sau chiar compromite reproducerea animalelor pe o arie ntins, egal cu cea deservit de centrul respectiv de nsmnri artificiale.
4

Materialul seminal recoltat trebuie s corespund tuturor criteriilor zooigienice i a standardelor internaionale referitoare la ncrcarea cu flor microbian, standarde respectate astzi de toate rile avansate. nsmnrile artificiale prezint i numeroase avantaje tiinifice. Astfel, aplicarea lor a permis dezvoltarea cercetrilor tiinifice asupra biochimiei, histochimiei i imunologiei reproduciei n general i a spermei n special. Gameii sunt studiai la nivel molecular i de microscopie electronic. Aceste cercetri au constituit baza pentru progresul rapid n domeniul metodelor de laborator pentru testarea capacitii fecundante a spermei, a congelrii materialului seminal i a aplicrii practice a nsmnrilor artificiale. Folosindu-se nsmnrile artificiale, a devenit posibil efectuarea unor hibridri ntre reproductori din specii care nu se mperecheaz ntre ele n condiii naturale, ca de exemplu ntre oaie i capr, iak i zebu, iap i mgar, psri domestice i slbatice etc . Toate aceste avantaje recomand nsmnrile artificiale ca una din cele mai moderne i avantajoase metode de reproducere a animalelor domestice. Ea permite nsemnate realizri n zootehnie i progresul rapid al acestui important sector al economiei naionale. 1.2. Aspecte organizatorice ale smnrilor artificiale n ara noastr La nivel naional, procesul de ameliorare a populaiilor de animale din diferite specii, organizarea i conducerea activitii pe linia nsmnrilor artificiale este coordonat de Ministerul Agriculturii i Alimentaiei care stabilete metodologia i msurile de lucru privind aplicarea nsmnrilor artificiale. Primele Staiuni de nsmnri artificiale (S.I.A.V.) la vaci au fost nfiinate n anul 1953. Cele 42 de S.I.A.V. au fost dotate cu reproductori valoroi, folosii la nsmnarea artificial a vacilor cu sperm brut. n perioada anilor 1956-1957 au nceput s fiineze primele Centre de nsmnri artificiale, dotate cu reproductori (tauri, berbeci) a cror material seminal -diluat i conservat prin refrigerare- era difuzat n teritoriu la punctele de nsmnri atificiale (P.I.A.V.). n unitile de stat, erau concentrai reproductori valoroi folosii la nsmnarea artificial a femelelor de la fiecare unitate zootehnic, n aa-numitele ferme de ameliorare i reproducie (F.A.R.). n anul 1965 a luat fiin Centrul Naional de Reproducie i Selecie la Animale care a contribuit la introducerea metodelor unitare i practice pe ntregul teritoriu al rii, excepie fcnd localitile din zonele greu accesibile. ncepnd cu anul 1969 s-a introdus i n ara noastr conservarea spermei de taur prin congelare, la nceput ntr-un numr restrns de centre de nsmnri artificiale, apoi metoda s-a extins o dat cu nfiinarea, n anul 1976, a Intreprinderii pentru Testarea Reproductorilor i Producerea Materialului Seminal Congelat (SEMTEST). Pn n anul 1990, n conformitate cu prevederile programului de ameliorare a taurinelor, activitile menionate cdeau n sarcina acestei intreprinderi, care aparinea de Institutul de Cercetare i Producie pentru Creterea Bovinelor Baloteti, avnd rolul de a coordona activitatea celor 6 complexe teritoriale. Principalele atribuii care reveneau acestei intreprinderi, erau: - organizarea creterii i testrii reproductorilor dup performanele proprii i descendeni; - livrarea produilor testai, disponibili;
5

producerea i livrarea de material seminal congelat pentru nsmnri artificiale la animale; - asigurarea i ntreinerea echipamentului criogenic, aprovizionarea cu azot lichid a beneficiarilor de material seminal congelat; - producerea de echipament i aparatur pentru nsmnrile artificiale i selecia animalelor, a diluanilor pentru material seminal pe specii i ai unor biostimulatori ai funciei de reproducie la animale. Dup anul 1990, reeaua SEMTEST a fost reorganizat, cele 6 complexe teritoriale (Bucureti, Iai, Craiova, Timioara, Trgu-Mure i Baia Mare), fiind transformate n Societi Comerciale cu capital de stat, atribuiile lor rmnnd aceleai. Teritoriul de activitate al celor ase societi tip SEMTEST este dictat de zonarea celor trei rase principale de taurine care se cresc n ara noastr: Blat romneasc, Brun de Maramure, Blat cu negru romneasc. n prezent, denumirea Centrului Republican de Reproducie i Selecie a Animalelor este Agenia Naional pentru Ameliorare i Reproducie n Zootehnie Prof. dr. G.K.Constantinescu subordonat Ministerului Agriculturii i Alimentaiei. Majoritatea vacilor se nsmneaz cu sperm congelat n paiete mijlocii i mici, metod care, datorit avantajelor pe care le prezint, a nlocuit conservarea n granule i fiole. De la taurii n exploatare din unitile comerciale SEMTEST se recolteaz, controleaz, prelucreaz, conserv i livreaz sperma ctre Unitile de Ameliorare i Reproducie n Zootehnie (fostele Oficii Judeene de Reproducie i Selecie la Animale) i altor uniti. Activitile legate de nsmnarea artificial la animale revine Unitilor de Ameliorare i Reproducie n Zootehnie(U.A.R.Z.) (fostele O.J.R.S.A.) subordonate direct Direciilor Agricole. Unitile de Ameliorare i Reproducie n Zootehnie au, pe lng activitatea de difuzare a materialului seminal congelat sau refrigerat i obligaia de dirijare a ntregului proces de reproducie pe raza lor de difuzare. Fiecare U.A.R.Z. are n subordonare 1-4 Centre Teritoriale de Ameliorare si Reproducie n zootehnie care deservesc cresctorii n ceea ce privete asistena tehnic de specialitate n domeniul reproduciei i seleciei animalelor. Pentru aceasta, fiecare U.A.R.Z. colaboreaz cu unitile SEMTEST din zona respectiv i cu Asociaia cresctorilor de animale (taurine, ovine, suine) din jude. ndeplinirea propriu-zis a acestor atribuii se face de ctre Centrele de selecie i reproducie la animale, iar subunitatea verig de baz a reelei naionale de selecie i reproducie este Punctul de nsmnri artificiale (P.I.A.V.), ca formaiune tehnico-organizatoric la nivelul fiecrei uniti zootehnice (de stat sau particulare), a fiecrei comune, avnd sarcina s efectueze operaiunile de nsmnare artificial a femelelor aparinnd diverselor specii (taurine, ovine, suine), a supravegherii respectrii instruciunilor referitoare la activitatea de ameliorare a animalelor etc. Punctul de nsmnare artificial este subunitatea de baz a ntregii reele de reproducie i selecie a animalelor, prin a crei activitate se materializeaz i finalizeaz ntregul proces de reproducie i ameliorare a efectivelor din toate sectoarele zotehnice. Fiecare punct de nsmnare artificial este dotat cu un minim de aparatur i instrumentar necesare desfurrii n condiii normale a activitii specifice, iar persoanele ncadrate la aceste puncte trebuie s participe nemijlocit la coordonarea procesului de reproducie a efectivelor din ferma sau localitatea respectiv, s in corect evidena evenimentelor de reproducie i s cunoasc perfect efectivul matc, produii i destinaia acestora, contribuind la aplicarea msurilor de prevenire i combatere a strilor de infecunditate. Pentru ndeplinirea acestor atribuii, punctul de nsmnri artificiale trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s fie amplasat n incinta fermelor atunci cnd asigur n exclusivitate nsmnarea artificial a femelelor din unitatea respectiv sau la periferia localitilor, ctre locul de punat al animalelor din gospodriile individuale; - s permit accesul uor al mijloacelor de transport; - s dispun de ap curent i s fie conectat la reeaua electric; - s dispun n interior de spaiul necesar pstrrii i conservrii materialului seminal, a operaiilor pregtitoare nsmnrii artificiale a femelelor, a documentelor necesare evidenelor minime, a efecturii nsmnrii artificiale propriu-zise. De regul, n unitile zootehnice, spaiul necesar punctului de nsmnare artificial se amenajeaz la captul unui grajd. n condiiile de stabulaie a animalelor n sistem de ntreinere legat, nsmnarea femelelor se face, de regul, pe linia grajdului, cu respectarea regulilor de igien corespunztoare. n acest caz, punctul de nsmnare artificial este dotat cu un crucior special n care este amplasat containerul cu dozele de nsmnare, vasul cu ap cald necesar pentru decongelarea paietelor cu material seminal, mnuile de protecie necesare i pipetele de nsmnare, meninute n condiii aseptice. n situaia ntreinerii femelelor la pune sau n sistem dezlegat, este necesar un stand de contenie. 1.3. Principii i metode de recoltare a spermei Recoltarea este operaia prin care se obine sperma de la reproductori prin intermediul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Este o operaie important i dificil, succesul ei fiind determinat de cunoaterea fiziologiei comportamentului sexual al masculilor n vederea adoptrii celor mai adecvate metode de obinere a ejaculatului. 1.3.1. Bazele fiziologice ale recoltrii spermei 1.3.1.1. Comportamentul sexual al masculilor Comportamentul sexual al mamiferelor se bazeaz pe un schimb reciproc de semnale specifice care, n final se materializeaz n actul sexual propriu-zis. La animalele crescute n libertate, ntreinute n padocuri sau boxe comune pentru ambele sexe, comportamentul sexual se desfoar secvenional: - cutarea reciproc a celor doi parteneri; - sincronizarea comportamental; - actul sexual propriu-zis. La toate speciile, activitatea sexual ncepe printr-o cutare reciproc de contact ntre mascul i femel. Schimburile de informaii senzoriale fac posibil identificarea receptivitii sexuale a celor doi parteneri, apoi provoac rspunsurile comportamentale care induc reaciile de atitudine necesare mperecherii. Semnalele caracteristice emise de femel indic stadiul receptivitii sexuale, femela neacceptnd saltul masculului dect n momentul impregnanei estrogenice maxime. La toate mamiferele, femela se va imobiliza naintea mperecherii, lund o poziie care s permit masculului intromiterea penisului. Cunoaterea particularitilor fiziologice ale comportamentului sexual este necesar n momentul obinuirii reproductorilor folosii la nsmnrile
7

artificiale, cu recoltarea materialului seminal. Obinuirea presupune rbdare i tact, astfel nct, s se suprapun peste reflexele necondiionate, cele condiionate pozitive, permind o bun recoltare a spermei, fr a stresa masculul respectiv. Dup obinuirea masculului cu recoltarea spermei, datorit reflexelor condiionate pozitive, ejaculatul poate fi recoltat uor, pe o femel n oricare stadiu al ciclului sexual, pe un mascul sau pe un manechin adaptat ca form, mrime i aspect speciei respective. n desfurarea reflexelor sexuale necesare recoltrii spermei, un rol deosebit revine corpusculilor senzitivi i terminaiilor nervoase existente la nivelul penisului. Totodat, un rol deosebit revine i organelor de sim. Factorii mediului extern (lumina, temperatura, mirosul specific al femelelor n clduri, efectuarea montei ntre ali parteneri, mbriarea efectuat de mascul sau femel etc) provoac excitaii, care ajunse la nivelul hipotalamusului, declaneaz mecanismul neuro-endocrin care st la baza formrii reflexelor sexuale. Fiziologia actului sexual const dintr-o succesiune de etape care se manifest prin urmtoarele reflexe sexuale: reflexul de apropiere, reflexul de erecie, reflexul de mbriare, reflexul de intromisiune i reflexul de ejaculare. Reflexul de apropiere const ntr-o cutare reciproc de contact ntre mascul i femel. Schimburile de informaii senzoriale, care au loc cu acest prilej, provoac rspunsuri comportamentale care induc atitudinile caracteristice desfurrii actului sexual. Un rol particular n realizarea contactului ntre mascul i femel l au semnalele olfactive datorate feromonilor care declaneaz reacii specifice, de stimulare sau inhibiie. Fonaia, audiia, contactul corporal ntre parteneri, jocul, lupta care precede acceptarea masculului, ndeplinesc un rol deosebit n apropierea partenerilor. Toi aceti factori induc excitaia precopulatoare. La mamifere, sursa cea mai puternic de excitaii o constituie stimularea tactil astfel nct este posibil declanarea excitaiei precopulatoare chiar prin simple excitaii mecanice ale zonei genitale. Excitaia precopulatoare se manifest prin libidou, care este datorat impregnrii structurilor necesare de ctre hormonii androgeni. Acest tip de excitare se caracterizeaz printr-un complex de manifestri variate ca: accelerarea pulsului, creterea tensiunii arteriale, modificri ale circulaiei periferice cu ridicarea temperaturii tegumentului, aflux sanguin, creterea tensiunii nervoase etc. Reflexul de erecie. Erecia const n schimbarea formei, volumului i constituiei organului copulator. n repaus, penisul este adpostit n furou, i la unele specii este flasc. Din aceast stare, penisul, prin erecie, este exteriorizat din furou i devine rigid printr-o modificare special a esutului erectil. Erecia este consecina fenomenelor dilatatoare care se produc la nivelul corpului spongios i al corpilor cavernoi ai penisului, urmat de umplerea acestora cu snge. n urma acumulrii intense a sngelui, are loc dilatarea cavernelor, capsula fibroas se ntinde, muchiul se contract i penisul devine rigid, se alungete la maxim i este propulsat din furou. }esutul erectil al corpului spongios i al corpilor cavernoi reprezint un sistem spongios de spaii vasculare, presrate cu artere i vene. n stare de repaus, aceste spaii sunt colabate i conin cantiti mici de snge; o dat cu erecia ele devin caviti mari, umplute cu snge. Creterea afluxului de snge este determinat pe cale neuro-hormonal i asigurat de compresiunea cilor venoase de ntoarcere prin contracia muchilor bulbo- i ischiocavernoi. Afluxul de snge la nivelul esutului cavernos se produce treptat. La nceput se umplu cu snge cavernele care, datorit vasodilataiei arteriale, se destind, urmat de erecia esutului spongios din jurul uretrei. }esutul spongios se ncarc cu snge venos ca urmare a strii provocate de
8

stimularea nervilor splahnici pelvieni, iar stimularea inervaiei simpatice determin constricia arterelor penisului i ncetarea ereciei. Erecia este un reflex nnscut provocat pe cale reflex, centrul fiind situat n mduva sacral, la nivelul neuromerelor S1-S2. Arcul reflex include nervii dorsali, ruinos i hipogastric, centrul medular, nervii simpatici i parasimpatici. Senzaiile vizuale, auditive, tactile i olfactive stimuleaz sistemul nervos central de la nivelul cruia pornete impulsul excitator al centrului ereciei. Erecia este determinat i de excitarea mecanic a receptorilor penieni, reflex care st la baza recoltrii spermei prin masturbaie. Erecia este nsoit de eliminarea la nivelul meatului a unei secreii mucoase, clare, filante cu rol lubrifiant produs de glandele Littr i de glandele bulbo-uretrale. Aceast secreie, mpreun cu cele ale glandelor Bartholin, faciliteaz intromiterea penisului n conductul vestibulo-vaginal. Erecia este nsoit de contracia tunicii externe a burselor testiculare, n urma creia testiculele sunt apropiate de orificiul extern al canalului inghinal. Durata ereciei depinde de specia i vrsta reproductorului. La masculii tineri, erecia se poate menine un timp mai ndelungat (chiar o jumtate de or), ns durata ereciei scade progresiv cu vrsta. Manifestarea ereciei este determinat de nivelul hormonilor androgeni din organism, de tipul de sistem nervos al masculului, de vrst, condiii de exploatare, ntreinere etc. Erecia diminu consecutiv uzurii nervoase, a abuzului sexual, obinuinei, oboselii, alimentaiei i ntreinerii necorespunztoare. n caz de mbtrnire, erecia se produce intermitent, pn ce dispare complet, stare ce se observ la taurii, berbecii i vierii btrni. n diversele boli ca meningita, turbarea, tetanosul, erecia este mai pronunat dect la animalul sntos. Toxina tetanic, avnd o elecie special pentru sistemul nervos, scade centrul de excitabilitate a tuturor centrilor medulari, deci i a centrului ereciei. Substanele afrodiziace (iohinibina, stricnina etc), cele parasimpatice comimetice stimuleaz erecia penian, fie prin provocarea vasodilataiei locale (iohinibina), fie prin scderea pragului de excitabilitate a centrului ereciei (stricnina). Anafrodiziacele (opiumul, bromurile etc) intoxicaiile cu diverse sruri de mercur, potasiu, arseniu etc, inhib erecia. Sunt i numeroi centri nervoi superiori, localizai n bulb, hipotalamus i centri corticali, ca sediu al reflexelor condiionate care, n urma excitaiei, determin erecia. Reflexul de mbriare. Excitaiile acumulate n timpul reflexelor de apropiere i de erecie determin necesitatea reflexelor de mbriare i intromisiune. Este un reflex nnscut, masculii tineri ncercnd s efectueze saltul pe orice femel sau pe ali masculi. Executarea cu siguran a saltului se transmite ereditar i este unul din semnele bunei fertiliti a taurului. mbriarea poate fi normal, cnd se produce la scurt timp dup erecie, rapid, cnd se produce naintea ereciei i tardiv, cnd apare mult dup erecie (masculii btrni, bolnavi, subalimentai). Cunoaterea tipului de reactivitate a masculului este important atunci cnd are loc pregtirea masculului pentru recoltare, de o corect pregtire a acestuia depinznd volumul spermei. Reflexul de mperechere (intromisiune, coit). Este un reflex nnscut i const n intromiterea organului copulator n conductul vestibulo-vagino-cervical al femelei n clduri. Intromiterea penisului este facilitat de secreiile glandelor Littr, bulbo-uretrale (parial), glandelor Bartholin i de smegma prepuial. Introducerea penisului are loc la nivelul vaginului la rumegtoare i carnivore, pn la cervix la cabaline i pn n uter la suine.

Reflexul de ejaculare const n proiectarea, sacadat i sub presiune, spermei n afara cilor genitale mascule. Ejacularea se produce pe cale reflex, consecutiv excitaiilor acumulate n timpul actului coital i transmise sistemului nervos. n primul rnd sunt excitate terminaiile nervoase din penis, reprezentate n special prin corpusculii VaterPaccini, Meissner i genitali. Ejacularea este iniiat de stimulii genitali i mediat de nervii care transmit impulsuri la creier. De la creier, n sens invers, sunt elaborate impulsuri la nivelul sistemului simpatic lombar (L2-L4-centrul ejaculator) de unde impulsurile eferente trec prin ganglionii simpatici, de-a lungul nervului presacral i a celui pelvin, la toate organele din cavitatea pelvin. Ele dau fibre motorii pentru muchii netezi ai tractusului genital (epididim, canale deferente, canal ejaculator, prostat, glande seminale). Prin contracia fibrelor musculare netede de la nivelul acestor organe, coninutul este mpins n uretra penian, segmentul prostatic, unde, din amestecul fluidului testicular i epididimar cu secreiile glandelor anexe, se formeaz sperma. Sperma, o dat format, acioneaz reflex i determin nchiderea gtului vezicii urinare i contracia fibrelor musculare netede de la nivelul uretrei pelvine, sporind pesiunea exercitat de sperm i mpingnd-o spre baza penisului. n acest moment intervin i muchii penisului, bulbo- i ischiocavernoi i contracia ritmic a uretrei, nvingnd rezistena periferic i expulznd sperma n jeturi ritmice. La producerea ejaculrii este necesar contracia sincron a muchilor epididimului, canalelor deferente, canalului ejaculator, uretrei i penisului. Aceste contracii determin ejacularea sacadat la armsar, vier i cine i spontan la rumegtoare. Prin excitaiile electrice produse la nivelul centrului ejaculator din mduva lombar, se provoac eliminarea spermei. Acest principiu st la baza electroejaculrii. Modul de eliminare a spermei difer cu specia: - la taur, berbec i ap toi componenii spermei se elimin simultan; - la armsar, la nceput se elimin secreia glandelor Littr i a celor bulbo-uretrale, lipsit de spermatozoizi, apoi sunt expulzai spermatozoizii mpreun cu secreia prostatic, la urm fiind eliminat secreia glandelor seminale; - la vier, ejacularea este multifazic; prefaza, cu o durat de 1-2 minute, n decursul creia se elimin secreiile glandelor uretrale lipsite de spermatozoizi (2-5% din coninutul ejaculatului); faza principal, cu o durat de 2-3 minute, reprezentat de secreiile epididimului, veziculelor seminale, prostatei i glandelor bulbo-uretrale (30-50% din coninutul ejaculatului); faza postspermatic, cu o durat de 4-5 minute, i un coninut de 50-60% din ejaculat, srac n spermatozoizi, compus n cea mai mare parte din secreiile veziculelor seminale i ale glandelor bulbo-uretrale. 1.3.1.2. Specificul reflexelor sexuale la principalele specii de animale 1.3.1.2.1. Reflexele sexuale la taur Reflexul de apropiere este puin exteriorizat i se bazeaz, n principal, pe excitaiile vizuale, taurul apropiindu-se de femele, indiferent de stadiul ciclului sexual n care se afl acestea. n cazul recoltrii spermei cu ajutorul vaginului
10

artificial, taurul se apropie de partenerul de recoltare, contenionat n stand (femel, mascul) (foto 1). Reflexul de erecie este necondiionat, peste care se suprapun reflexe condiionate, prin interme-diul crora acest reflex poate fi dirijat n sens pozitiv. Erecia se produce chiar din momentul intrrii n sala de recoltare sau numai la vederea vaginului artificial i a operatorului recoltator cu care s-a obinuit. Din aceast cauz, vaginul artificial trebuie s fie corect pregtit, n caz contrar se formeaz reflexe Foto 1 Reflexul de apropiere la taur condiionate inhibitoare ale acestui reflex. Reflexul de mbriare (salt, cuprindere) (foto 2) este bine evideniat la taurii crescui n libertate, mpreun cu femelele. n cazul practicrii montei, se formeaz un reflex condiionat numai pentru vacile n clduri. n cazul recoltrii spermei cu ajutorul vaginului artificial se creaz un reflex condiionat pentru masculul partener, recoltarea Foto 2 Reflexul de mbriare i ejaculare la taur pe taur fiind practicat n cvasitotalitatea unitilor taur care se ocup cu producerea de material seminal conservat. La taurii folosii la nsmnri artificiale se practic aa-numitul salt n gol cu scopul mbuntirii volumului ejaculatului. n cazul unor afeciuni la nivelul coloanei vertebrale, membrelor posterioare etc, acest reflex poate fi inhibat . Reflexul de intromisiune (mperechere, coit) const n introducerea penisului n conductul vestibulo-vaginal al femelei n cazul montei, sau n lumenul vaginului artificial corect pregtit, n cazul practicrii nsmnrilor artificiale. {i acest reflex poate fi inhibat n cazul pregtirii necorespunztoare a vaginului artificial: tempera-tur, presiune i lubrifiere necorespunztoare, falduri n spiral etc. Reflexul de ejaculare se produce avnd la baz senzaiile termice, de presiune i tactile recepionate de corpusculii dispui la nivelul penisului i transformate n stimuli pe calea filetelor nervoase aferente pentru centrul ejaculator lombar de la nivelul cruia, pe calea filetelor nervoase eferente, sunt transmise la nivelul musculaturii netede a diverselor segmente ale aparatului genital i, prin contracia acesteia, se produce expulzarea spermei. Reflexul de ejaculare la taur este foarte rapid, suprapunndu-se intromisiunii. n cazul recoltrii spermei cu vaginul artificial, dac acesta este corect pregtit, ejacularea este rapid, fr a influena negativ i n timp desfurarea reflexelor sexuale la
11

taurii de reproducie. Tipul de sistem nervos influeneaz manifestarea i desfurarea reflexelor sexuale. 1.3.1.2.2. Reflexele sexuale la berbec Pentru animalele n libertate, comportamentul sexual, care se termin n mod normal printr-o mperechere, se caracterizeaz printr-o secven specific a reflexelor sexuale. Reflexul de apropiere const n interesul berbecului pentru oaia n clduri i cutarea acesteia. Masculul dirijeaz parada sexual (apropieri ritualizate laterale, nsoite de micri ale unui membru anterior). Adulmec oaia n clduri, urmnd ridicarea capului i manifestarea unui rictus al buzei superioare. Abordarea oii n clduri se face prin lovirea acesteia cu capul n regiunea abdomenului i apoi cu membrul anterior. Imobilizarea oii constituie semnul vizual de identificare a strii de estru cu ajutorul unui berbec ncerctor. Recunoaterea olfactiv a acestei stri joac rolul de declanator pentru comportamentul sexual al berbecului. Un berbec tnr este mai puin apt s identifice starea de estru a oilor. Atunci cnd contactul este stabilit, imobilizarea femelei constituie semnalul desfurrii urmtoarelor reflexe sexuale. Reflexul de erecie se realizeaz prin tergerea S-ului penian. Caracteristic ereciei este ntinderea i ndeprtarea apendicelui uretral al glandului, urmat de executarea unor micri ondulatorii ale acestuia. Reflexul de mbriare const n cuprinderea oii sau a partenerului de recoltare cu membrele anterioare. Ca i la taur i la berbec se formeaz reflexul condiionat i pentru oile care nu sunt n clduri sau pentru masculi, recoltarea fcndu-se i mascul pe mascul. Reflexul de intromisiune const n introducerea penisului n conductul vestibulo-vaginal al oii n clduri, n cazul montei, sau n lumenul vaginului artificial, cnd se practic nsmnarea artificial. n situaia n care vaginul artificial este corect pregtit, se produce imediat ejacularea. Reflexul de ejaculare este foarte rapid i se evideniaz printr-o zvcnire evident a ntregului corp i mai ales a trenului posterior. n cazul recoltrii spermei, aceasta este proiectat n cea mai mare cantitate, direct n paharul colector, adaptat la vaginul artificial. Cnd vaginul artificial nu este pregtit corespunztor, actul sexual se ntrerupe la reflexul de intromisiune. 1.3.1.2.3. Reflexele sexuale la vier Reflexul de apropiere se manifest prin cutarea reciproc dintre vier i scroaf. Vierul caut scroafa folosind simul mirosului, vzului i auzului. Vierul, introdus ntr-un lot de scroafe, cu ajutorul mirosului examineaz pe rnd aproape toate scroafele, adoptnd poziia cap la cap, prin aplicarea unor lovituri uoare n regiunea flancurilor i ncercri de salt. Prin acest comportament, vierul depisteaz starea de estru a scroafelor, ns nu se oprete la cele n estru. n apropierea celor doi parteneri, rolul principal revine scroafelor n clduri. n prezena scroafei n clduri, vierul se plimb n jurul ei, grohie caracteristic, o lovete n regiunea flancului, adulmec regiunea vulvar, aceast agitaie permanent fiind determinat de reflexele olfacto-sexuale. Acest preludiu sexual dureaz, n medie, 5-10 minute i este mai evident i de durat n timp mai mare la vierii tineri. Se mai remarc micri caracteristice ale maxilarului inferior,
12

urmate de o secreie abundent de saliv i eliminarea ritmic a unor cantiti mici de urin (Feredean T., 1969). Reflexul de erecie const n exteriorizarea treptat a penisului prin tergerea S-ului de la acest nivel, n urma iniierii jocurilor descrise. Reflexul de mbriare const n fixarea crupei scroafei sau prii posterioare a manechinului cu membrele anterioare, penisul intr n erecie deplin, vierul modificndu-i permanent poziia, cutnd insistent fanta vulvar. Penisul este introdus n conductul vestibulo-vaginal, poriunea spiralat ajungnd la nivelul conductului cervical, unde st fixat pe toat durata ejaculrii. Reflexul de ejaculare se caracterizeaz prin contracii ritmice ale musculaturii din regiunea anal, apropierea testiculelor de orificiul extern al canalului inghinal, concomitent cu retractarea burselor testiculare. Durata ejaculrii este de 4-8 minute i se realizeaz fazial: prespermatic, spermatic i postspermatic. 1.3.1.2.4. Reflexele sexuale la armsar Reflexul de apropiere este evident la armsar, care, n prezena iepei devine nelinitit. Reflexul de erecie se manifest treptat, ncepnd cu preerecia la distan de iap, penisul fiind evideniat circa jumtate, ntrindu-se i ngrondu-se progresiv. Reflexul de mbriare se manifest energic. Reflexul de intromisiune, de regul se desfoar ajutat de o persoan aezat lateral. Armsarul execut 5-10 micri de pistonare n urma crora penisul ajunge la momentul maxim al ereciei. Glandul este puternic tumefiat, cu diametrul de 10-12 cm, n form de ciuperc. Reflexul de ejaculare se desfoar la cteva secunde de la intromisiune, eliminarea spermei fcndu-se fazial. 1.3.2. Principii i metode de recoltare a spermei Recoltarea este operaia prin care se obine sperma de la reproductor cu ajutorul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Recoltarea spermei se bazeaz pe urmtoarele principii: - realizarea, prin mijloace artificiale, a condiiilor existente n seciunea copulatoare a femelei n clduri: temperatur, presiune, lubrifiere, respectiv recoltarea spermei cu vaginul artificial; - excitarea artificial a centrului ejaculator din mduva lombar prin intermediul curentului electric de o anumit tensiune i intensitate, respectiv recoltarea spermei prin electroejaculare; - realizarea artificial a unor excitaii mecanice prin masaj local, efectuat manual la diverse niveluri i anume: masajul penisului prin traversul tecii furoului, respectiv recoltarea spermei prin masturbaie; - recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente i ale glandelor seminale; - masajul regiunii abdominale la masculii psrilor, respectiv recoltarea spermei prin masaj abdominal.

13

n prezent, metoda cea mai rspndit pentru recoltarea spermei este metoda cu vaginul artificial, metod prin care cantitatea i calitile ejaculatului nu sunt modificate. Vaginul artificial este alctuit dintr-un tub cilindric, rigid sau semirigid, confecionat din cauciuc pnzat, ebonit sau tabl (n raport cu specia) a crui form i dimensiuni variaz de asemenea cu specia; o cma vaginal confecionat din cauciuc subire; un pahar colector confecionat din sticl sau cauciuc, de mrime i form difereniate cu specia, cu perei simpli sau dubli dup cum spermatozoizii speciei sunt mai mult sau mai puin rezisteni la variaiile de temperatur. Cmaa vaginal se fixeaz prin intermediul unor inele de cauciuc la tubul vaginal, formndu-se n acest fel un spaiu virtual n care se introduce ap cald i aer, n raport cu specia. n momentul recoltrii, temperatura interioar trebuie s fie de 40-420C. Completarea spaiului virtual se poate face i cu ap rece, ns vaginul artificial astfel pregtit trebuie s fie pstrat la termostat reglat la temperatura de 40-420C. n momentul recoltrii se insufl aerul necesar realizrii presiunii optime. Presiunea se realizeaz att prin intermediul apei ct i a aerului introdus n spaiul dintre tub i cmaa vaginal. Lubrifierea se face cu vaselin neutr sterilizat. Recoltarea spermei prin folosirea vaginului artificial se face fie pe femele care nu se gsesc n clduri, fie pe manechine, sau mascul pe mascul. Recoltarea spermei se efectueaz n ncperi special amenajate. Operatorul recoltator, aezat pe una din laturile partenerului de recoltare, ine vaginul artificial pregtit pentru recoltare, nclinat la 35-450 fa de crupa femelei (masculului). n momentul n care masculul execut saltul, operatorul prinde cu o mn prin traversul furoului penisul acestuia i l dirijeaz ctre lumenul vaginului artificial. Dac vaginul artificial este corect pregtit i manevrat, masculul ejaculeaz, sperma fiind proiectat n paharul colector, care se trece n laborator, unde se face controlul spermei. Timpul scurs ntre intromisiunea penisului n lumenul vaginului i ejaculare este dependent de specie, de condiiile n care a fost pregtit vaginul, de tipul de sistem nervos al masculului, de existena sau nu a unor reflexe condiionate inhibitoare etc. Recoltarea spermei prin electroejaculare a fost preconizat de Batelli (1922) citat de I. Dumitrescu i colab., 1978, ulterior metoda fiind mbuntit de cercettori din diverse ri. Metoda se bazeaz pe excitaiile produse cu ajutorul curentului electric, de o anumit tensiune, intensitate i durat asupra centrului ejaculator din mduva lombar. n urma excitaiilor se produc contracii ale musculaturii netede din pereii cilor de eliminare a spermei. Aceast metod se aplic la berbec, taur, psri. Sperma obinut nu difer, cantitativ i calitativ, de cea obinut cu ajutorul vaginului artificial. Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente i a glandelor seminale a fost experimentat n anul 1934 n S.U.A., la bovine de ctre Miller i Evans. Metoda se bazeaz pe provocarea eliminrii spermei consecutiv excitaiilor mecanice realizate prin masajul acestor formaiuni, n urma contraciilor musculaturii netede. Recoltarea spermei prin masajul abdominal a fost imaginat de Burrows i Quinn n 1937 i d bune rezultate la psri. Recoltarea spermei prin masturbaie a fost aplicat pentru prima dat de Spallazani la cine. Ejacularea are loc n urma excitaiilor mecanice produse asupra corpusculilor senzoriali de la nivelul glandului i prepuului. Prin acest procedeu se poate recolta sperma de la cine, vier, vulpoi.

14

1.3.2.1. Recoltarea spermei la taur Recoltarea spermei la taur se poate face prin trei metode: - cu vaginul artificial; - prin electroejaculare; - prin masajul ampulelor canalelor deferente i al veziculelor seminale. Recoltarea spermei cu vaginul artificial Este cea mai rapid i comod posibilitate de recoltare a spermei a crei reuit este condiionat de realizarea optim a celor trei factori de baz: temperatur, presiune i lubrifiere. Vaginul artificial este alctuit dintr-un tub rigid sau semirigid, o cma vaginal i un pahar colector. Tubul (carcasa) este cilindric, confecionat din cauciuc pnzat sau material plastic, prevzut cu un orificiu, nchis cu un dop. Tubul are o lungime ce difer cu modelul i unitatea constructoare, care variaz ntre 40 i 50 cm, cu un diametru de 5,56 cm. Cmaa vaginal este cilindric, cu o lungime de 6575 cm, lime de 7 cm, confecionat din cauciuc subire. Dimensiunile cmii vaginale se coreleaz cu cele ale tubului la care se adapteaz. Paharul colector este reprezentat de un recipient din sticl cu pereii dubli (ntre care se gsete ap) sau dintr-o eprubet gradat ce se fixeaz la vagin printr-un con prelungitor din cauciuc (fig. 1, foto 3). Lungimea vaginului artificial este condiionat de necesitatea ca materialul seminal s fie obinut direct n paharul colector, cu o trecere scurt prin cmaa vaginal sau conul prelungitor din cauciuc spre a evita, pe ct posibil, pierderile de sperm i eventualul efect negativ al acestor materiale asupra viabilitii spermatozoizilor Pregtirea vaginului artificial pentru recoltare const n introducerea cmii vaginale n lumenul carcasei vaginului i rsfrngerea capetelor care depesc lungimea corpului peste acesta, astfel nct cmaa vaginal s fie moderat de ntins, iar faldurile care le face n interior s fie dispuse longitudinal. Fixarea Fig. 1 Modele de vagin artificial pentru capetelor cmii vaginale la tub se recoltarea spermei de taur face prin intermediul a dou inele din cauciuc. ntre tub i cmaa vaginal se formeaz un spaiu care va fi umplut cu ap cald i aer pentru realizarea temperaturii i a presiunii. n momentul recoltrii, temperatura din interiorul vaginului artificial trebuie s fie de 4043oC. Pentru realizarea presiunii normale, cantitatea de ap introdus se completeaz cu aer, care se insufl cu o par din cauciuc pe la nivelul robinetului ce obtureaz orificiul. Se introduce aer pn cnd lumenul vaginului este obturat de faldurile Foto 3 Aparatur de recoltare a spermei cmii vaginale. la armsar, taur, berbec
15

Paharul colector se adapteaz fie direct la unul din capetele vaginului artificial i fixat cu ajutorul unui cpstru, fie prin intermediul unui tub prelungitor, temperatura apei dintre cei doi perei trebuind s corespund temperaturii vaginului artificial. n cazul folosirii ca recipient de colectare a eprubetei gradate, aceasta se adapteaz la vaginul artificial prin intermediul unui con prelungitor din cauciuc. La captul opus paharului colector, cu ajutorul unei baghete de sticl se lubrifiaz 1/3 din lungimea vaginului artificial cu vaselin neutr hidrosolubil. Excesul de vaselin neutr determin scurgerea acesteia n sperm, cu efecte negative asupra mobilitii spermatozoizilor, insuficiena vaselinei neasigurnd condiia de lubrifiere, de unde i insuccesul n recoltarea spermei prin aceast metod. Crearea presiunii necesare n interiorul vaginului artificial se poate realiza numai cu aer care se insufl naintea recoltrii propiuzise. Tehnica recoltrii n unitile specializate, recoltarea spermei se face ntr-o sal special amenajat n acest scop, spaioas (80100 m2), luminoas, aerisit, prevzut cu un stand de contenie i cu o anex n care se face splarea i dezinfecia componentelor vaginului artificial i n care se gsete i termostatul electric la temperatura de 4143oC. Pardoseala slii de recoltare este din asfalt, care favorizeaz meninerea cureniei i menajeaz ongloanele membrelor posterioare foarte solicitate n timpul saltului. napoia standului de recoltare, pardoseala se acoper cu un covor din cauciuc, rumegu sau nisip pentru a menaja i mai bine membrele posterioare. nainte de introducerea taurului n sala de recoltare ntr-un stand ce se gsete ntr-o antecamer se efectueaz toaleta orificiuluii a regiunii periprepuiale care se spal cu ap cald i spun, se terge cu un prosop curat, individual, propriu fiecrui taur i se dezinfecteaz orificiul prepuial cu o soluie de permanganat de potasiu 1o/oo sau alt antiseptic uzual (foto 4). Planificarea taurilor la recoltare, n unitile specializate se face dup un grafic lunar. Pentru aceasta, taurii sunt lotizai pe grupe de recoltare constituite din 2030 de tauri (funcie de efectivul n exploatare din fiecare unitate) iar n cadrul grupelor de recoltare, pe loturi formate din 4 Foto 4 Toaleta regiunii prepuiale la taur 6 tauri.
Planificarea la recoltare se face pe grupe ntr-o anumit succesiune (A, B, C, D), ntr-o zi urmnd a se recolta de la toi taurii din grupa planificat. Taurii sunt scoi din grajd pe loturi i introdui pe rnd n sala de recoltare, timp n care ceilali tauri din lot sunt plimbai. Frecvena recoltrilor depinde de vrsta taurilor, de condiiile de alimentaie i ntreinere, de experiena practic a unitilor productoare de material seminal, funcie de autori aceast frecven oscilnd de la 1 la 6 ejaculate pe sptmn. Experiena practic a artat c cea mai bun eficien n obinerea

unui numr optim de spermatozoizi/sptmn este atunci cnd se recolteaz 4 ejaculate pe sptmn, cte dou consecutiv pe ziua de recoltare, cu o pauz de 34 zile, sau dou ejaculate pe sptmn la interval de 34 zile dar cu o atent pregtire a taurului nainte de recoltare. Pregtirea taurului const n gimnastica funcional a acestuia naintea introducerii n sala de recoltare (foto 5), apoi reinerea acestuia timp de 23 minute nainte de ejaculare, efectuarea a 23 salturi n gol, n raport i cu vrsta taurului i tipul de sistem nervos al acestuia.
16

Foto 5 Gimnastica funcional a taurilor naintea recoltrii spermei Pentru obinuirea taurilor la recoltare se folosete ca manechin o vac n clduri sau n oricare stadiu al ciclului sexual, un mascul care este, de regul, unul din taurii n exploatare, folosii prin rotaie sau un manechin confecionat din lemn sau metal, mbrcat cu o piele de taurine, prevzut n partea posterioar cu un dispozitiv n care se fixeaz vaginul artificial pregtit corespunztor. n unitile specializate recoltarea se face taur pe taur, taurul manechin fcnd parte din lotul de recoltare i se stabilete prin rotaie, la sfritul recoltrii spermei de la lotul n cauz, urmnd a se recolta sperma i de la taurul folosit ca manechin. Taurul manechin se contenioneaz ntr-un stand, iar operatorul recoltator se plaseaz pe una din laturile manechinului, innd ntr-o mn, la o nclinaie de 3545o fa de orizontal, vaginul artificial (foto 6). Dup 2 3 salturi effectuate n gol, operatorul cu una din mini, prin traversul furoului orienteaz penisul spre lumenul vaginului artificial. n cazul n care vaginul artificial a fost pregtit corespunztor, ejacularea se produce la un interval de timp foarte scurt i Foto 6 Recoltarea spermei la taur cu se evideniaz printr-o micare brusc de pistonare spre nainte a trenului vaginul artificial posterior (zvcnire). Sperma este proiectat direct n paharul colector. Se desprinde cu atenie vaginul artificial i se orienteaz cu paharul colector n jos n vederea colectrii ntregii cantiti de sperm ejaculat. Oricare ar fi tipul de vagin artificial (lung sau scurt), pierderile de material seminal se situeaz ntre 1020%, sperm care ader de pereii vaginului artificial. Indiferent de durata perioadei de reinere de la sritur sau de numrul sriturilor n gol, pregtirea sexual trebuie s precead fiecare ejaculare chiar dac se recolteaz dou ejaculate consecutiv. Aceast pregtire menine capacitatea sexual a taurului pe toat perioada de timp ct se afl n exploatare. Dup recoltare, paharul colector cu sperm se transmite la laborator pentru examinare, prelucrare i conservare. Recoltarea spermei prin electroejaculare Se bazeaz pe excitaiile produse de curentul electric asupra centrului ejaculator din mduva lombar. Musculatura neted de la nivelul cilor de
17

eliminare a spermei se contract, sperma fiind eliminat la exterior. Se folosete foarte rar, n condiii de laborator, atunci cnd eueaz ncercrile de recoltare cu vaginul artificial. Se aplic taurilor cu inhibiii ale reflexului de mbriare i ejaculare, celor fr apetit sexual i celor care au divesre defecte la nivelul membrelor posterioare, tauri care au mare valoare de ameliorare. Electroejaculatorul este constituit dintr-un electrod bipolar conectat la o surs de curent, portabil, circuitele fiind tranzistorizate i miniaturizate. Contenia taurului se face ntr-un stand sau travaliu. Pregtirea taurului pentru recoltare const n nlturarea materiilor fecale din rect, prin splarea acestuia cu civa litri de soluie NaCl 5%, care va uura conductibilitatea electric i din splarea regiunii furoului i tunderea prului de la nivelul orificiului prepuial. Se introduce electrodul n rect, cu precauie, se ateapt 35 minute dup care se ncepe declanarea impulsurilor electrice. La nceput se folosesc 1520 de excitaii electrice, fiecare cu o durat de 23 secunde i desprite de pauze de 5060 secunde. Intensitatea curentului crete treptat cu fiecare excitaie, pornindu-se de la 100 miliamperi, la 8001500 miliamperi i cu tensiunea de 2530 V, durata excitaiilor mrindu-se pn la 56 secunde. La fiecare excitare se obine ejaculat, format la nceput de secreiile glandelor anexe i apoi fraciuni cu un coninut crescut de spermatozoizi. Durata total a recoltrii este de 510 minute, cantitatea de sperm obinut fiind egal sau uor mai mare dect volumul spermei recoltat cu ajutorul vaginului artificial. Eliminarea spermei se produce fr ca penisul s intre n erecie. Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente i al glandelor seminale Metoda prezint interes numai n cazul taurilor care din diverse motive nu pot efectua saltul i la care recoltarea cu vaginul artificial nu se poate aplica. Taurul se contenioneaz ntr-un stand sau travaliu, se execut toaleta furoului i splarea bursei prepuiale cu o soluie izotonic de NaCl, apoi se videaz vezica urinar prin masaj transrectal pentru a se evita amestecul urinei cu sperma. Cnd peretele rectal este destins se palpeaz cu precauie planeul cavitii pelvine unde, sub forma unui cordon durcartilaginos, cu un diametru de circa 23 cm, se identific uretra intrapelvin. Se palpeaz gtul vezicii urinare apoi, de o parte i de alta a acesteia, dispuse n unghi ascuit, form alungit, aspect boselat, se palpeaz glandele seminale. Deasupra vezicii urinare se gsesc i dilataiile canalelor deferente sub forma a dou cordoane elastice, ce converg spre gtul vezicii urinare n unghi ascuit, diametrul fiind de 0,81,2 cm. Tot la acest nivel se gsete prostata. Masajul se face n sens cranio caudal, pe o distan de 2030 cm, cu atenie, timp de 35 minute, dup care ncepe s se elimine sperma, pictur cu pictur. Pe timpul masajului taurul este linitit, testiculele sunt retrase spre inelul inghinal, glandul este parial exteriorizat din teaca furoului, fr ca penisul s intre n erecie. La nceput se colecteaz un lichid albapos care reprezint secreia veziculelor seminale, srac n spermatozoizi, care se ndeprteaz. Urmeaz eliminarea unei fraciuni bogat n spermatozoizi, culoare alb glbui, consisten cremoas. Unii tauri nu rspund favorabil la colectarea spermei prin acest procedeu. n cazul n care sperma nu se elimin n decurs de 7 10 minute, se renun la masaj, operaiunea fiind reluat n ziua urmtoare. Metoda prezint avantajul c nu necesit condiii speciale de contenie i recoltare i dezavantajul obinerii unei sperme inferioare calitativ, n urma amestecului cu urin i a venirii n contact cu aerul un timp mai ndelungat.

18

1.3.2.2. Recoltarea spermei la berbec i ap Dou tehnici pot fi utilizate pentru colectarea spermei la masculii rumegtoarelor mici: cu ajutorul vaginului artificial i prin electroejaculare. Recoltarea spermei cu vaginul artificial este cea mai rspndit, uor accesibil centrelor de reproducie, rezultatele obinute fiind bune sub aspectul volumului ejaculatului i calitii spermei. Obinuirea masculilor la recoltare necesit un anumit interval de timp i mult rbdare. Se ncepe totdeauna n sezonul sexual (sfritul verii i toamna) folosindu-se pentru obinuire o oaie n oricare stadiu a ciclului sexual. Vaginul artificial este dimensionat pentru aceast specie: 2021 cm lungime, 45 cm diametru, prevzut cu un orificiu astupat cu un dop, pe unde se introduce apa cald sau apa cald i aer pentru a asigura condiiile de temperatur i presiune. Paharul colector este confecionat din sticl cu perei simpli, termoizolat cu un manon din burete, sau din sticl cu perei dubli, pentru a evita efectul negativ al ocului termic (a frigore) asupra viabilitii spermatozoizilor. Temperatura din interiorul lumenului n momentul recoltrii trebuie s fie de 40 43oC. Adaptarea paharului colector se face la unul din capetele deschise ale vaginului artificial, cu ajutorul acestuia reglndu-se presiunea din interiorul vaginului n funcie de distana pe care se introduce paharul colector. La captul opus paharului colector se lubrifiaz cu vaselin neutr lumenul pe circa 1/3 din lungime, evitndu-se folosirea n exces a vaselinei sau insuficiena lubrifierii. Se consider bine pregtit vaginul artificial atunci cnd faldurile formate de cmaa vaginal au o dispoziie longitudinal i optureaz complet lumenul. Recoltarea se face ntr-o sal special amenajat n care se gsete un stand de contenie a oii partener. Sala de recoltare trebuie s fie curat, luminoas, iar pregtirea berbecului pentru recoltare se face ca i la taur. Lna din jurul orificiului prepuial se tunde, se spal cu ap i spun i se cltete cu soluie izotonic de NaCl 0,9% pentru ndeprtarea impuritilor. Oaia manechin se contenioneaz ntr-un stand metalic fixat pe un podium din lemn. Operatorul, cu vaginul artificial pregtit, se aaz n genunchi pe una din laturile oii, n dreptul crupei, innd vaginul artificial nclinat la circa 45o fa de orizontal, cu paharul colector n sus. Dup efectuarea saltului, operatorul dirijeaz cu o mn, prin traversul furoului, penisul spre lumenul vaginului artificial. n cazul n care vaginul artificial a fost pregtit corespunztor (temperatur, presiune, lubrifiere) ejacularea coincide cu intromisiunea i se evideniaz printr-o micare de propulsie a trenului posterior. Dup ejaculare, berbecul coboar de pe femel, iar vaginul artificial se desprinde cu atenie i se orienteaz cu paharul colectoer n jos, apoi paharul se scoate i sperma se transmite la laborator pentru examinare i prelucrare. Pentru masculii obinuii cu recoltarea, n sezonul sexual, se prelev dou ejaculate succesiv la 25 minute. Recoltarea spermei prin electroejaculare Se bazeaz pe provocarea ejaculrii prin excitarea electric a ganglionilor simpatici lombari care determin contracia musculaturii netede de la nivelul ampulelor canalelor deferente i eliminarea spermei, fr ca penisul s intre n erecie. Aceast tehnic necesit un volum mare de munc prin contenia animalului, o sal cu dotare special, un electroejaculator identic cu cel utilizat la taur, este dureroas pentru mascul, iar caracteristicile spermei difer de a celei obinute prin folosirea vaginului artificial, motive pentru care aceast metod nu este rspndit.

19

Se poate folosi n condiii de laborator, n cazul unor reproductori de nalt valoare zootehnic i care din diverse motive nu pot efectua saltul. n prezent se folosesc electroejaculatoare tranzistorizate, portabile care asigur un curent de 258 V i 150 mA prevzut cu un electrod bipolar. Pentru recoltare, berbecul se fixeaz n decubit lateral i se contenioneaz pe o mas de lucru (sau pe o scar ntins). Se face o clism cu o soluie de NaCl 10% i toaleta furoului i apoi se fixeaz cu o me de tifon steril trecut pe la baza poriunii terminale a glandului. Electrodul bipolar se introduce n rect pn ce acesta ajunge n dreptul regiunii lombare. Paharul colector, termoizolat i sterilizat, se menine n dreptul deschiderii uretrei. Se stabilete contactul electric i se provoac cteva impulsuri cu o durat de 25 secunde, cu pauze de 510 secunde. Dup 57 impulsuri se provoac eliminarea spermei care se colecteaz n pahar. Impulsurile continu pn se obine cantitatea normal de sperm. 1.3.2.3. Recoltarea spermei la vier Se poate realiza prin trei metode: cu vaginul artificial; prin masturbare (metoda manual); prin electroejaculare. Recoltarea spermei cu vaginul artificial Recoltarea spermei presupune obinuirea vierului cu partenerul si sala de recoltare si cu operatorul recoltator. Pentru recoltarea spermei se folosete un partener natural sau artificial. Partenerul natural poate fi o scroaf n clduri sau alte categorii de porci: scroafe care nu sunt n clduri, vieri, masculi castrai. Scroafa n clduri se folosete pentru obinuirea vierilor. Scroafele care nu sunt n clduri se contenioneaz sub un manechin special construit din bare metalice, iar vierul partener se contenioneaz prin fixarea unei frnghii de maxilarul superior, obinndu-se astfel starea de imobilitate. ntruct partenerul natural obosete, de regul dup o recoltare, cel mai folosit este partenerul artificial. Partenerul artificial, manechinul trebuie s imite conformaia scroafei, motiv pentru care se nvelete cu pile de porc (foto 7). Vaginul artificial se compune dintr-un tub (carcas) vaginal cu o lungime de circa 20 cm, cmaa vaginal, confecionat din cauciuc subire, prelungitorul vaginal confecionat din material plastic i paharul colector. Paharul colector este reprezentat dintr-un borcan de sticl cu capacitatea de 300500 ml termoizolat (cu pereii dubli sau acoperit de un manon din Foto 7 Manechin pentru recoltarea spermei burete fixat ntr-un recipient metalic adecvat) (fig.7). la vier Pentru reinerea i ndeprtarea fraciunii gelatinoase a spermei, la gura paharului se fixeaz un filtru confecionat din tifon steril. Paharul colector se menine la termostat reglat la 4143oC pn n momentul recoltrii, astfel nct pe
20

toat durata recoltrii, temperatura din interiorul paharului colector s nu scad sub 3536oC. Aparatura, sticlria i ustensilele igienizate i sterilizate se menin la termostat, reglat la 40 42oC, pn la ntrebuinare. Vierii de la care urmeaz s se recolteze se pregtesc, ntr-o box special amenajat n incinta slii de recoltare, prin splarea cu ap cald i spun a zonei prepuiale i dezinfectarea cu o soluie de permanganat de potasiu 1o/oo Fig. 2 Schema vaginului artificial pentru recoltarea spermei la vier Tehnica recoltrii Pregtirea vaginului pentru recoltare se face ca la rumegtoare, presiunea i temperatura necesare realizndu-se cu ajutorul apei calde i a aerului. Vaginul artificial se fixeaz ntr-un suport ce culiseaz n interiorul manechinului. Dup ce vierul a efectuat saltul pe manechin, penisul va fi dirijat spre lumenul vaginului. Ejacularea la vier dureaz 510 minute, timp n care presiunea din interiorul vaginului se ridic prin insuflarea aerului sau prin presarea manual la nivelul conului prelungitor, n funcie de tipul de vagin artificial folosit. Dup recoltare, paharul colector se detaeaz de vagin i se trece la laborator pentru examinare i prelucrare. Materialul seminal obinut prin acest procedeu de recoltare este de bun calitate ns se impune o bun cunoatere a exigenelor fiecrui vier, funcie de care se pregtete corect vaginul artificial. Recoltarea spermei prin metoda manual (masturbare) n prezent este cea mai rspndit, fiind un procedeu de recoltare simplu i care nu necesit aparatur complicat, calitatea materialului seminal obinut fiind foarte bun. Vierul este condus n boxa de recoltare, este lsat s efectueze saltul pe manechinul artificial, apoi operatorul plasat de regul pe partea dreapt a manechinului, prinde cu mna stng penisul exteriorizat din teaca furoului i-l trage lateral i n jos. Aceast extensie a penisului i presiunea exercitat cu mna la nivelul poriunii spiralate declaneaz reflexul de ejaculare. Fraciunea presperma-tic lipsit de spermatozoizi i cu un coninut ridicat n micro-organisme se nltur. Cu cealalt mn se menine paharul colector termoizolat i prevzut cu un filtru de tifon, la nivelul orificiului extremitii libere a penisului, pentru recoltarea spermei (foto 8 ). Primele jeturi de sperm care au un aspect lptos se colecteaz n pahar, recoltarea continund pn la terminarea eliminrii spermei. Fraciunea gelatinoas a spermei reinut pe filtru se nltur, iar paharul colector se trimite la laborator pentru evaluare I prelucrare. Pentru evitarea apariiei unor reflexe negative se recomand ca vierul s fie scos din box de acelai operator recoltator, s urmeze acelai traseu pn n boxa de recoltare iar boxa s fie ntotdeauna aceeai, fr schimbri n interior.

21

Foto 8 Recoltarea spermei la vier prin metoda manual (masturbare)

Recoltarea spermei prin electroejaculare Ofer posibilitatea examinrii spermei unui vier de la care nu se obine ejacularea pe manechin sau n caz de impoten. Se poate folosi n lucrrile de cercetare pentru examinarea secreiilor glandelor anexe la vierii nematuri sexual. Se folosete un electroejaculator prevzut cu un electrod bipolar i cu o surs de curent alternativ care s asigure o tensiune de 10 30 V i o intensitate de 100 1000 mA. Se contenioneaz vierul, se igienizeaz prepuul cu o soluie izotonic de NaCl 0,9%, se face o clism rectal cu o soluie de NaCl 10% pentru eliminarea coninutului. Electrodul bipolar se introduce n rect astfel nct electrozii s ajung pn n dreptul regiunii lombare, vertebrele L2 L4.

La nceput se produc ocuri electrice cu o tensiune de 5 V i o intensitate de 50100 mA, apoi tensiunea i intensitatea cresc progresiv cu fiecare impuls. Dup fiecare impuls electric se face pauz de 510 secunde. Eliminarea spermei se produce cnd tensiunea curentului este de 1520 V i intensitatea de 5001000 mA. 1.3.2.4 Recoltarea spermei la armsar nsmnarea artificial la cabaline nu constituie o practic curent de reproducie, att la noi n ar ct i pe plan mondial. Recoltarea spermei se face cu ajutorul vaginului artificial. Tubul vaginului este confecionat din tabl zincat, material plastic sau aluminiu, avnd o lungime de 55 cm, diametrul interior la un capt, de 12 cm, iar la cellalt de 8,5 cm. Cmaa vaginal este confecionat din cauciuc, cu lungimea de circa 70 cm i un diametru de 1517 cm. Recipientul pentru sperm, confecionat din material plastic, este cilindric i se fixeaz la tubul vaginal la extremitatea cu diametrul mai mic, prin intermediul unui con prelungitor. Paharul colector este termoizolat. Pregtirea vaginului se face n mod asemntor ca pentru taur. Pentru recoltare, iapa se contenioneaz cu platlonje, se nfoar coada iepei cu tifon pentru a se evita lezionarea penisului. Armsarul se contenioneaz cu dou pene de cpstru, inut lateral de ngrijitori. n momentul efecturii saltului, operatorul recoltator orienteaz penisul armsarului spre lumenul vaginului artificial, vagin inut oblic, la 45o fa de
22

orizontal i alturat de crupa iepei. Dup executarea unor micri de pistonare, ejacularea se produce dup 1517 secunde i se evideniaz prin micri ritmice la baza cozii. La ncheierea ejaculrii, armsarul coboar de pe iap, iar operatorul desprinde cu atenie vaginul artificial de pe organul copulator. Dup recoltare se spal penisul armsarului cu ap cald i se dezinfecteaz cu o soluie de permanganat de potasiu 1o/oo. 1.3.2.5. Recoltarea spermei la psri n perioada anilor 19021937 s-au ncercat diverse metode de recoltare a spermei la psri: interpunerea unei canule din sticl ntre cloaca cocoului i a ginii n timpul clcatului, folosirea unui spermocaptator fixat prin intermediul unor curelue la cloaca ginii, folosirea ca spermocaptator a unui prezervativ fixat la cloaca cocoului, recoltarea prin electroejaculare, recoltarea prin masaj abdominal. Dintre toate aceste variante, cea mai avantajoas sub aspect practic este recoltarea spermei prin masaj abdominal i se poate aplica la toate speciile de psri de ferm fiind astzi cea mai utilizat metod de recoltare pe plan mondial. Recoltarea spermei la coco Operatorul se aaz pe un taburet i menine cocoul n decubit sterno abdominal imobilizand membrele acestuia prin prinderea intre picioarele operatorului. Cu mna stng se maseaz uor regiunea sacral n direcie cranio caudal iar cu mna dreapt regiunea abdominal dinspre apendicele xifoid spre apofizele pubiene. Cocoul prolabeaz cloaca n care se observ cele dou papile mai congestionate (culoare roz-roietic). Operatorul, cu mna stng preseaz zona pericloacal, iar cu mna dreapt colecteaz sperma n paharul colector. Colectarea spermei se mai poate face i prin aspiraie ntr-o fiol cu capacitatea de 2 ml astupat cu un dop de plut sau cauciuc. Prin dop este trecut un tub din sticl ndoit, puin mai larg la un capt cu care se va colecta sperma i un al doilea tub tot din sticl, la care se adapteaz un prelungitor din cauciuc sau material plastic pe unde se creaz depresiunea prin aspirare. Sperma aspirat va cdea n fiola respectiv. Contenia cocoului se poate face i sub braul drept al unui ajutor, cu coada nainte i cu mna se imobilizeaz ambele picioare. Operatorul efectueaza masajul abdominal si recoltarea spermei. n unitile mari n care cocoii sunt ntreinui n cuti, contenia cocoului se face direct la ua cutii de un ajutor, operatorul efectund masajul abdonimal i apoi colecteaz sperma. n acest fel, productivitatea muncii crete foarte mult. Recoltarea spermei la curcan Se face cu bune rezultate de o echip constituit din dou persoane. Pentru aceasta se folosete un scaun dublu cu sptar, n care este practicat un orificiu. Curcanul se contenioneaz n decubit sterno-abdominal, cu capul introdus n orificiul practicat n sptar. Ajutorul se aaz n partea stng a curcanului i cu spatele imobilizeaz aripa stng a acestuia, iar cu piciorul stng, prin intermediul unei fee de tifon imobilizeaz piciorul stng al curcanului. Imobilizeaz aripa dreapt a curcanului cu mna stng ntre cotul i sptarul scaunului imobiliznd totodat i piciorul drept al curcanului. Cu mna dreapt ridic coada i evideniaz orificiul cloacal. Operatorul execut masajul abdominal cu ambele mini i cnd curcanul este excitat execut pericloacal compresiuni cu degetele mari de la ambele mini. Sperma se evideniaz la nivelul cloacei de unde se recolteaz ntr-un pahar sterilizat.
23

1.4. Examenul nsuirilor spermei Examenul nsuirilor spermei are ca necesitate legat att de cunoaterea fertilitii reproductorului ct I de tehnica dilurii I aprecierii spermei 1n diferite faze de prelucrare I conservare. Compoziia spermei, variaz n funcie de specie i chiar reproductor, calitatea spermei difer n decursul aceleiai zile, funcia spermatogenetic fiind dependent de numeroi factori exogeni i endogeni. Metodele care se folosesc pentru aprecierea calitii spermei se pot mpri n urmtoarele categorii: examenul nsuirilor fizice; examenul nsuirilor biologice; examenul citologic; examenul biochimic; examenul bacteriologic i micotic. Rezultatele obinute se consemneaz ntr-un formular oficial denumit spermogram, hotrtoare pentru aprecierea unui reproductor. 1.5. Diluarea spermei 1.5.1. Consideraii generale Rspndirea nsmnrilor artificiale s-a datorat posibilitilor de diluare i conservare a spermei. Diluarea spermei reprezint o etap premergtoare i obligatorie pentru conservarea spermei; n rare situaii sperma se nsmneaz sub form brut sau imediat dup diluare, fr a fi conservat. Pstrarea spermei presupune diluarea i conservarea ei, dou etape interdependente ce se aplic succesiv i corelat. Diluarea permite: - creterea volumului total al masei spermatice; - posibilitatea fracionrii ejaculatului n mai multe doze i, deci, nsmnarea unui numr mult mai mare de femele; - asigurarea unui mediu favorabil prelungirii viabilitii i capacitii fecundante a spermatozoizilor, etc. n cazul n care nu exist dotarea tehnic necesar conservrii, se poate folosi sperma diluat, dar numai dup scurgerea intervalelor de timp necesare echilibrrii (3-4 ore). Sperma diluat trebuie s fie inoculat femelelor n clduri, ntr-un interval de timp ct mai scurt, imediat dup echilibrare. Indiferent de metoda de conservare a spermei, pentru prelungirea viabilitii i a capacitii fecundante a spermatozoizilor in vivo, sunt necesare: - reducerea formrii i acumulrii produilor rezultai din metabolismul celulelor seminale; - neutralizarea substanelor toxice rezultate din metabolism; - trecerea parial sau definitiv a spermatozoizilor n anabioz. Aceste deziderate se realizeaz prin diluarea spermei, realizarea unui mediu cu un pH uor acid (6,2 - 6,4) sau scderea temperaturii n timpul dilurii, cu meninerea temperaturii sczute pe toat durata conservrii. 1.5.2. Principiile dilurii spermei, nsuirile generale ale diluanilor i clasificarea acestora Diluia spermei se bazeaz pe faptul c din numrul total de spermatozoizi depui prin mont, numai o fraciune redus (circa 5%) ajung pn la nivelul treimii anterioare a oviductului, locul unde urmeaz s se desfoare fecundaia.
24

n acest fel, marea majoritate a spermatozoizilor devin disponibili pentru a fi inoculai altor femele. Experienele ntreprinse au demonstrat faptul c numrul de spermatozoizi necesari pentru nsmnarea unei vaci este de 10-12 miliioane, numr care poate fi redus pn la 5 milioane, fr a fi diminuat nivelul ratei fecundaiei. La ovine, numrul de spermatozoizi mobili pe doz poate fi redus pn la 150- 200 de milioane, la suine, la 2-5 miliarde, iar la cabaline, pn la o,51,0 miliarde. Principiile care stau la baza dilurii spermei sunt: - se dilueaz numai sperma corespunztoare calitativ; - diluantul trebuie s conin substane care s protejeze i s ajute la activarea i meninerea metabolismului spermatozoizilor; - materialul seminal diluat trebuie s fie aseptizat prin ncorporarea unui antibiotic cu spectru larg de aciune. Pentru ndeplinirea condiiilor create prin diluarea spermei, mediul de diluie trebuie s aib mai multe nsuiri: - s conin substane care s favorizeze metabolismul, vitalitatea i capacitatea fecundant a spermatozoizilor (fructoz, glucoz, galactoz); - s conin substane care s menin un timp mai ndelungat pH-ul spermei n limite fiziologice, numite substane tampon, cum ar fi: citraii, fosfaii, tartraii i sulfaii de sodiu i potasiu (necesare mai ales pentru diluia spermei cu concentraie mare n spermatozoizi); - s fie izotonic, izotermic i s aib acelai pH cu sperma; - s conin substane coloidale care s protejeze spermatozoizii (glbenu de ou, lipoproteine, lecitin etc); - s aib ncorporate antibiotice cu efect bacteriostatic sau bactericid ntr-un spectru ct mai larg; - s posede nsuiri antioxidante; - s fie ieftin i uor de preparat; - s se pstreze, nealterat, un timp ct mai ndelungat. Diluanii se pot clasifica dup compoziie, scop i specia la care se folosesc. Dup compoziie diluanii se mpart n salini, pe baz de lapte i sintetici. Diluanii salini constau n soluii de concentraii diverse n sruri de fosfai, citrai, sulfai, tartrai de sodiu i potasiu, care au rol de substane tampon. Soluiile mai conin zaharuri (glucoz, fructoz, zaharoz etc) i glbenu de ou, difereniat cu specia la care se folosesc. Diluanii pe baz de lapte conin: lapte proaspt de vac ecremat sau lapte praf degresat, cu sau fr adaos de glbenu de ou. Diluanii pe baz de medii sintetice sunt, n prezent, cei mai rspndii, sunt produi de firme specializate, avnd n compoziia lor diferite combinaii de sruri, lapte, cu adaosuri de vitamine, hormoni, extracte tisulare etc, funcie de unitatea productoare, pentru fiecare specie n parte, purtnd diferite denumiri comerciale: Laiciphos, Spermasol, Diploten, Triladyl, Seminan etc. Dup scopul lor diluanii se folosesc pentru sperma conservat prin refrigerare, congelare sau la temperatura camerei. Dup specia de animale la care se folosesc, diluanii se pot prepara dup aceleai formule, pentru o singur specie sau pentru mai multe specii (taur, berbec, ap).

25

1.5.3. Tehnica preparrii diluanilor Prepararea diluanilor difer n funcie de compoziia acestora. Diluanii salini cu adaos de glbenu de ou se pregtesc n doi timpi. Timpul 1. Se prepar soluia salin prin adugarea n apa bidistilat a cantitilor de sruri prevzute prin receptura diluantului respectiv. Apa bidistilat se obine n distilatoare de sticl pentru a nu duna viabilitii spermatozoizilor. Distilatoarele metalice modific pH-ul apei distilate prin ionii de metal ce se formeaz. Soluia salin se prepar zilnic,n funcie de necesar sau pentru mai multe zile, cand se pstreaz n sticle sterilizate la ntuneric, la temperatura de refrigerare. Diluantul salin se prepar la nivelul unor laboratoare zonale sau naionale de unde este expediat unitilor specializate n flacoane nchise ermetic care se pstreaz la frigider o perioad de circa 6 luni. Timpul 2. nainte de folosirea diluantului se adaug glbenuul de ou n cantitile prevzute n formulele de preparare a acestora. Se folosesc ou de gin proaspete (1-3 zile) provenite de la un efectiv sntos. Oule se spal cu ap cald, se dezinfecteaz coaja cu alcool sanitar, se sparg i se separ glbenuul de albu, albuul netrebuind s ajung n diluant deoarece are o reacie acid i modific pH-ul mediului. Dup obinerea cantitii necesare de glbenu de ou se omogenizeaz cu o baghet din sticl sau cu un agitator mecanic timp de 5-10 minute, apoi, glbenuul bine omogenizat, se adaug peste soluia salin, sub o omogenizare continu, fr a se forma spum. Omogenizarea face globulele de grsme din glbenu s fie dispersate, evitndu-se aglomerarea acestora, ceea ce ar mpiedeca micarea spematozoizilor. Pentru aseptizarea materialului seminal diluat, se adaug n diluant antibiotice cu spectru de aciune ct mai larg, conform reetelor de preparare. n ara noastr, cele mai folosite antibiotice sunt: penicilina, streptomicina n cantiti de 500 U.I. i respectiv 250-500 g/ml diluant. Se folosesc cele mai eficiente antibiotice conform antibiogramei. Prepararea diluantului cu glbenu de ou i antibiotice se face, de regul, cu 1-2 ore naintea folosirii, timp necesar ca srurile de Na sau K s clarifice sau s fac transparente particulele de globuline din glbenu. Substanele care se introduc n diluant trebuie s fie proaspete, nealterate, chimic pure i s nu conin impuriti toxice pentru spermatozoizi. Sticlria i ustensilele folosite la prepararea diluantului s fie sterilizate. Diluanii pe baz de lapte se prepar astfel: laptele de vac proaspt, integral sau ecremat, se fierbe sau se pasteurizeaz la 90-92oC, se rcete i filtreaz printr-o hrtie de filtru, steril. Cnd temperatura laptelui ajunge la 20oC se adaug proporia de glbenu de ou, stabilit prin receptur, dup tehnica descris. Laptele praf degresat se prepar cu ap bidistilat n raport de 1/9, apoi se pasteurizeaz, se filtreaz, se rcete i se amestec cu cantitatea necesar de glbenu de ou (5-10%). Diluanii sintetici sunt cei mai ntrebuinai n prezent. Ei sunt produi de diferite uniti specializate i sunt livrai sub form de pulberi sau granule. Sunt nsoii de instruciunile de folosire. n prezent, aceste medii de diluie se prepar pe scar industrial, ceea ce conduce la uniformizarea i simplificarea tehnicilor de lucru, obinerea unor rezultate bune, n condiiile scderii preului de cost.

26

1.5.4. Tehnica diluiei Diluia propriu-zis difer cu specia i cu modul de conservare a spermei.

1.5.4.1. Diluarea spermei de taur Pentru conservarea spermei prin refrigerare se folosesc medii pe baz de soluii saline cu adaos de glbenu de ou, glucoz, sau diluanii pe baz de lapte. Cel mai frecvent sunt ntrebuinai diluanii sintetici, livrai de diverse firme, cu diferite denumiri, funcie de ara i unitatea productoare. Diluantul sintetic este un mediu uscat, pe baz de lapte ecremat, echilibrat i sterilizat, la care se adaug n final 10% glbenu de ou i 7% glicerin cu densitate 1,25 (de exemplu Laiciphos). Nivelul relativ sczut de glbenu de ou faciliteaz examinarea microscopic, fr s influeneze negativ fecunditatea. Indiferent de natura diluantului, se adaug cantitile necesare de antibiotice (preferabil n funcie de antibiogram), se pasteurizeaz, se filtreaz i se rcesc. Diluarea spermei pentru conservare prin refrigerare se face n dou etape: - diluia iniial (prediluia), la 37oC, n raport de 1/1 i n condiii de izotermie; - diluia final (definitiv), la 18-20oC, tot n condiii de izotermie, conform raportului final de diluie, calculat n funcie de concentraia spermei brute i a celei diluate n spermatozoizi/mm3 sau pe ml. Formula de calcul este:
G.D.F. = C1 C2 xMx V

n care:

- G.D.F = gradul de diluie final; - C1 = concentraia spermei brute n spermatozoizi/ml; - C2 = numrul de spermatozoizi vii pe care dorim s-i avem n doz; - M = mobilitatea spermatozoizilor dup decongelare, exprimat n sistemul zecimal; - V = volumul dozei de sperm exprimat n ml. Exemplu: C1=109; C2=12x106; M=0,6; V=1,0ml. G.F.D.=109x0,6x1,0/12x106=50, sau cnd V=0,5ml rezult G.DF.=109x0,6x0,5/12x106=25. n aceast situaie, la un volum de sperm se adaug 49 volume de diluant n primul caz, i respectiv 24 de volume, n cazul al doilea. Precizm c mobilitatea spermatozoizilor dup deconservare se calculeaz pentru fiecare taur n parte pe baza mediei mai multor determinri. n acest caz, raportul de diluie final va fi: R.D.F=1/49; R.D.F=1/24. Pentru calcularea numrului de doze pe care le putem obine dintr-un ejaculat, se nmulete volumul ejaculatului cu gradul de diluie final obinut i se mparte la volumul dozei.
27

n exemplul dat, dac volumul ejaculatului este de 5 ml, numrul de doze va fi; Nr. doze=50x5/1=250; sau N=5x25/0,5=250 Gradul de diluie pentru sperma de taur, oscileaz n medie ntre 20 i 40, astfel nct ntr-o doz de nsmnare s se asigure 10-12 milioane de spermatozoizi mobili. Mobilitatea minim admis pentru sperma de taur conservat prin refrigerare este de 60% sau de 0,6, determinat nainte de a fi nsmnat. Dup diluare, se apreciaz mobilitatea spermatozoizilor i dac aceasta nu a sczut cu mai mult de 10% fa de mobilitatea spermei brute, diluia se consider c a fost efectuat n condiii bune i se trece la repartizarea n doze a spermei. Repartizarea spermei n doze se face cu ajutorul unor seringi semiautomate, n fiole de sticl care se nchid apoi la flacr oxiacetilenic, sau n fiole care se nchid cu dop de plut sau din material plastic. Pentru conservarea spermei de taur prin congelare se folosesc dou medii de diluie care se deosebesc numai prin aceea c unul conine, n plus, glicerin, substan crioprotectoare. {i n acest caz se pot folosi diluani salini, pe baz de lapte sau sintetici (de exemplu Laiciphos, Tryladil, Seminan etc.) care se prepar dup tehnicile descrise. Cantitatea de diluant necesar se separ n dou pri egale (A i B). Diluantul B conine n plus fa de diluantul A 14-16% glicerin chimic pur, astfel nct concentraia de glicerin, n final, s fie de 7-8%. Diluantul A se mparte n dou pri inegale: o parte (A1) mai redus (510%) se pstreaz la termostat reglat la 37oC, iar cealalt parte, (A2) se las la temperatura camerei. Diluantul B se pstreaz la frigider sau ntr-o vitrin frigorific la 2-4oC. Diluia comport 3 etape: iniial, intermediar i final. Diluia iniial se face la temperatura de 37oC, n condiii de izotermie, n raport de 1/1, cu diluantul A1, direct n paharul sau eprubeta colectoare. Dup efectuarea acestei prime diluii, paharul sau eprubeta cu sperma astfel diluat se scot de la termostat i se aaz alturi de fraciunea A2 a diluantului, la temperatura laboratorului (18-20oC). Diluia intermediar se face dup circa 20-30 de minute, cnd cele dou componente ating aceeai temperatur, la temperatura laboratorului, adugndu-se diluantul A2 ntr-un raport care s asigure jumtate din cantitatea total de diluant calculat prin raportul final de diluie. Dup diluia intermediar, paharul cu sperma se introduce ntr-o vitrin frigorific sau la frigider, alturi de fraciunea B a diluantului. Diluia final se face la temperatura de 2-4oC, tot n condiii de izotermie, dup 50-60 de minute de la efectuarea diluiei intermediare. ntruct glicerina este o substan toxic pentru spermatozoizi, diluantul glicerinat se adaug treptat, pictur cu pictur, sub o permanent agitare a recipien-tului cu sperm (foto 12). Congelarea spermei sub form de granule se bazeaz pe rcirea rapid a acesteia, n alveolele unei plci de zpad carbonic rezultnd pastile cu un volum de 0,1 ml. Dup recoltarea spermei se examineaz nsuirile ejaculatului, n funcie de care se determin gradul final de diluie i volumul total al spermei diluate. n acest interval de timp, sperma se dilueaz n proporie de 1/1 la temperatura de 37oC, n condiii de izotermie ntre diluant i sperm. Cel mai frecvent se folosete diluant pe baz de lactoz: lactoz 11% n ap bidistilat - 75,3 ml, glbenu de ou - 20 ml, glicerin anhidr - 4,7 ml. Dup 15 minute de la diluia iniial, se adaug volumul total de diluant glicerinat, cu ajutorul unui dozator automat, cuplat la un omogenizator. Adugarea se face la temperatura laboratorului, raportul de diluie fiind foarte strns (1/2, 1/4), datorat
28

volumului redus al granulei i mobilitii mai reduse a spermatozoizilor, comparativ cu alte metode de congelare. Compoziia diluanilor utilizai n aciunea de nsmnri artificiale este foarte diferit, ns se poate afirma c cea mai mare parte, aparine diluanilor salini, pe baz de lapte sau sintetici. Fiecare ar i unitate specializat n practica nsmnrilor artificiale au reete specifice pentru prepararea diluanilor. Din multitudinea de reete de preparare a diluanilor redm pe cele mai simple i mai frecvent folosite: 13,6 g 1) Sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4) Glucoz anhidr 12,0 g Pepton 5,0 g Ap distilat (nclzit) 1000 ml 2) Citrat de sodiu (Na3C6H5O5) Ap bidistilat Glbenu de ou 2,9 g 100 ml 20%

3) Diluant pe baz de lapte praf ntr-un litru de ap bidistilat se adaug 100 g lapte degresat apoi se fierbe 10 minute ntr-un vas conic. Dup rcire se completeaz apa pierdut prin evaporare, apoi se adaug antibioticele menionate la reeta 10. n prezent, pentru diluarea spermei de taur se folosesc diluani sintetici, preparai de diverse firme i care ncorporeaz toate substanele chimice necesare, n laborator urmnd s se adauge, eventual, glbenuul de ou proaspt preparat i apa bidistilat. Funcie de firma care-i comercializeaz, diluanii poart diverse denumiri: Laiciphos, Spermasol, Dilapten, Triladyl, Seminan etc. 1.5.4.2. Diluarea spermei de berbec I ap Un mare numr de nsmnri artificiale la ovine, att pe plan mondial ct i n ara noastr se realizeaz cu sperm nediluat, imediat dup recoltare i examinare. Aceast metod asigur o fertilitate ridicat, ns necesit prezena masculilor n aceeai unitate cu femelele care urmeaz a fi nsmnate. Proprietile biochimice ale spermei de berbec i ap impun anumite precauii n folosirea spermei pentru nsmnrile artificiale. Astfel, plasma seminal nu creeaz un mediu optim pentru supravieuirea spermatozoizilor in vivo. Cercetrile au evideniat, spre exemplu, la ap, atunci cnd sperma a fost recoltat din epididim ( care nu a venit n contact cu secreiile glandelor anexe), a fost diluat i congelat, c proporia de spermatozoizi vii i mobilitatea lor dup decongelare sunt mult superioare celor din sperma ejaculat, ceea ce indic faptul c venirea n contact a spermatozoizilor cu secreiile glandelor anexe reduce supravieuirea in vitro a acestora. La berbec, adugarea plasmei seminale la spermatozoizii provenii din epididim, stimuleaz mobilitatea acestora timp de 3-7 ore, apoi mobilitatea se reduce brusc, comparativ cu spermatozoizii care nu vin n contact cu plasma seminal i care i menin mobilitatea peste 22 de ore. La ap, plasma seminal pare nefast meninerii calitii spermatozoizilor, pe durata stocrii ndelungate n azot lichid (G. Baril i colab., 1993).
29

La aceste dou specii (ovine, caprine), glandele bulbouretrale au capacitatea de a secreta n cantiti nsemnate o enzim numit fosfolipaza A, sau a coagulrii glbenuului de ou. Aceast enzim catalizeaz hidroliza lecitinelor din glbenuul oului n acizi grai i lizolecitin. Lizolecitina, n concentraie mai ridicat, este toxic pentru supravieuirea in vitro a spermatozoizilor. Aceast particularitate de specie mpiedic folosirea unei cantiti importante de glbenu de ou sau a unui mediu cu coninut ridicat n lecitine pentru diluarea spermei. Totui, n cazul aplicrii nsmnrilor artificiale la ovine, pe scar mai larg, diluia spermei este necesar. Compoziia diluanilor i tehnica dilurii spermei de berbec i ap difer n funcie de modul n care se face conservarea: sub form lichid (refrigerare) sau solid (congelare). Diluia spermei pentru conservare sub form lichid presupune parcurgerea a dou etape principale: prepararea diluantului i diluia propriu-zis. Diluantul se prepar pe baz de lapte praf, cu o zi naintea ntrebuinrii (Baril G i colab.,1993). Se iau 100 ml de ap bidistilat, sterilizat i nclzit la 60oC, n care se dizolv 0,33 g de sulfamide. Se rcete amestecul pn la 20-25oC, apoi, n acest amestec se dizolv 11,1 g lapte praf de vac, ecremat. Se fierbe ntr-o baie-marie, timp de 15 minute, se rcete la temperatura laboratorului, se adaug 0,11 g streptomicin i 100000 U.I. penicilin. Diluantul astfel preparat se pstreaz la 24oC, timp de maxim 2-3 zile. n practica nsmnrilor artificiale din ara noastr i din lume se folosesc multe reete de preparare a diluanilor, cel mai frecvent ntrebuinai fiind diluanii sintetici, produi de diverse firme specializate. Dup recoltarea ejaculatului, acesta se examineaz cantitativ i calitativ, apreciindu-se cel puin mobilitatea i concentraia spermatozoizilor, pe baza crora se determin gradul final de diluie (raportul final de diluie - RDF) funcie de concentraia iniial i dup diluie a spermei n spermatozoizi/ml. Diluarea spermei se face n dou etape: iniial i final. Diluia iniial se face imediat dup recoltare, la temperatura de 32oC, n raport de 1/1, n condiii de izotermie, direct n paharul colector meninut ntr-un termostat la 32oC. Paharul colector mpreun cu sperma prediluat, se scoate de la termostat i se menine 10-15 minute la temperatura laboratorului, alturi de restul diluantului. Diluia final se face la temperatura ambiant, n condiii de izotermie, adugndu-se restul cantitii de diluant, calculat prin raportul final de diluie. n cazul n care raportul de diluie este mai larg (1/5-1/7), pentru mrirea vscozitii materialului seminal, se poate aduga la compoziia diluantului 2-3% gelatin sau polivinil pirolidon etc. Diluarea spermei pentru conservare sub form solid (congelare) Pentru congelare se folosesc numai ejaculate cu mobilitate de cel puin 0,8. Aprecierea volumului i concentraiei spermei permite calculul gradului diluiei finale. Diluantul se prepar cu o zi nainte sau n aceeai zi, puin timp nainte de folosire. Se folosesc doi diluani. Primul poate fi: 100 ml ap bidistilat, 10,3 g lactoz, 20% glbenu de ou. Cel de-al doilea conine diluantul 1 la care se adaug 4,0 g de lapte praf ecremat pentru fiecare 100 ml, astfel nct, n final presiunea osmotic s ating 450 miliosmoli. Se adaug la acest diluant glicerol, astfel nct, n sperma diluat, proporia de glicerol s fie de 4%. Tehnica diluiei include dou etape principale: - diluia iniial (prediluia) care se face cu diluantul 1 la 32oC, n condiii de izotermie, direct n paharul colector, meninut la termostat. Imediat dup prediluie paharul cu sperma respectiv se menine la

30

temperatura laboratorului timp de 10-15 minute apoi se introduce ntrun frigider (2-4oC) unde este meninut timp de 2,0-2,5 ore; - diluia final se face la temperatura de 2-4oC, n condiii de izotermie, adugndu-se cantitatea necesar din diluantul 2 (conform R.D.F) astfel nct n final, concentraia spermei n glicerol s fie de 4%. Exemple de diluani folosii pentru sperma de berbec: 1) Ap bidistilat Glucoz anhidr Citrat de sodiu Streptomicin Penicilin Glbenu de ou 100 ml 0,8 g 2,8 g 50000 mcg 50000 U.I. 20%

2) Ap bidistilat 80 ml Glicocol 0,34 g Citrat trisodic (cu 2 moli de ap) 2,71 g Glbenu de ou 20% Cnd se lucreaz cu un raport de diluie mai larg (1/5-1/7) n vederea mririi vscozitii spermei se mai poate aduga, de exemplu, 25% polivinil pirolidon.

1.5.4.3. Diluarea spermei de vier Pentru sperma de vier, cele mai bune rezultate s-au dovedit a fi date de mediile de diluie sintetice. Mediul de diluie trebuie s conin neelectrolii (zaharuri), substane ce conin i o surs exogen de energie. Pentru meninerea pH-ului n limite normale, n mediul de diluie sunt ncorporai anioni polivaleni (citratul de sodiu), glbenu de ou sau lecitin. Pentru a proteja spermatozoizii de efectul nefavorabil al ocului termic n mediul de diluie se introduc substane chelatoare (complexon III). Bune rezultate se obin cu medii pe baz de glucozcitrat-bicarbonat-complexon III - cu adaos de antibiotice cu rol bacteriostatic sau bactericid. O alt grup important o formeaz diluanii pe baz de lapte de vac, proaspt sau preparat din lapte praf, sau din lapte+soluie glucoz 6%+glbenu de ou 3% i antibiotice (Feredean i colab., 1964). Ali autori recomand ca mediul de diluie pentru sperma de vier, laptele integral cu adaos de soluie de glucoz 3,5% i 2% glbenu de ou, iar cercettori din China au obinut rezultate satisfctoare prin folosirea unui mediu alctuit din pri egale de lapte degresat, soluie de citrat de sodiu 2,9%, soluie de glucoz 5%, la care se adaug 10-20% glbenu de ou i antibiotice. De reinut c laptele poate constitui singur sau n amestec cu alte substane, un bun diluant pentru sperma de vier, fiind un mediu biologic complex, cu coninut favorabil de lipide (lecitin, cefalin), proteine (cazein, lactalbumin, lactoglobulin) i aminoacizi eseniali (metionin, treonin, lizin, triptofan), glucide (lactoza), substane minerale, acid citric, enzime i vitamine. Acest diluant este foarte uor de preparat, laptele trebuind s provin de la vaci sntoase, s fie proaspt i s se nclzeasc nainte de folosire, la 85-90oC, timp de 10-15 minute. Pentru congelarea spermei de vier, mediile de diluie trebuie s includ glucoz, citrat de sodiu cu tampon format din soluie tricin- tris, la care se adaug
31

glbenu de ou, glicerin 3-4% i antibiotice (Crabo i colab., 1971; Nouk, B.A.,1971). Mediile sintetice produse de uniti specializate i care se prezint sub form de pulbere, ambalat n pungi din material plastic, prevzute i cu instruciuni de folosire, sunt cele mai folosite n prezent n practica nsmnrilor artificiale la suine. Mediile sintetice se prepar numai din substane chimic pure, iar apa n care se dizolv aceste substane trebuie s fie bidistilat, fiart n prealabil. Diluanii pe baz de lapte se prepar numai nainte de recoltarea spermei, conform celor menionate anterior. Tehnica dilurii spermei este ct se poate de simpl. Diluia trebuie s se fac ct mai repede de la recoltare, la temperatura de 33oC, prin adugarea treptat a diluantului peste sperm, n condiii de izotermie, ntr-o baie de ap a crei temperatur este reglat la acest nivel. Gradul de diluie se stabilete pe baza concentraiei, mobilitii spermatozoizilor i a numrului de spermatozoizi mobili pe doza de nsmnare (3-5 miliarde), folosindu-se formula:
Vt = C x M x10 n 9 1,

n care:

Vt=volumul total al spermei diluate; C= concentraia spermei/ml; M= mobilitatea spermatozoizilor; n= numrul de spermatozoizi de dorit ntr-o doz de sperm. Dup efectuarea diluiei iniiale n raport de 1/1, paharul cu sperm se menine 20-30 minute la temperatura laboratorului, apoi se adaug treptat, n condiii de izotermie, restul cantitii de diluant calculat prin gradul final de diluie, apoi sperma se repartizeaz n doze, constituite din recipiente din material plastic, avnd o capacitate de 100 ml, de form oval sau cilindric. Cteva exemple de formule de diluani pentru sperma de vier: 1) Ap bidistilat Glucoz Bicarbonat de Na Glbenu de ou Streptomicin Penicilin 2) Ap bidistilat Glucoz Bicarbonat de Na Glbenu de ou Streptomicin Penicilin 3) Ap bidistilat Citrat de Na Glbenu de ou Penicilin Streptomicin 1000 ml 30,0 g 1,0 g 300 ml 0,5 g 500000 U.I. 1000 ml 40,0 g 2,0 g 250 ml 0,4 g 240000 U.I. 1000 ml 30,0 g 200 ml 500000 U.I. 0,5 g
32

1.5.4.4. Diluarea spermei de armsar Sperma de armsar, dup recoltare, oricare ar fi temperatura la care se pstreaz, nu conine nici un spermatozoid viu dup circa o or. Deci nsmnarea cu sperm brut trebuie s se fac n primele 5 minute de la recoltare. Dac nu este posibil, sperma trebuie s fie diluat n primele dou minute dup recoltare, rolul diluantului fiind acela de a neutraliza efectele nefaste ale plasmei seminale (E. Palmer i colab., 1984). Pentru diluarea spermei de armsar se folosesc mai multe formule de medii de diluie: pe baz de tartrat de sodiu i potasiu, glucoz, pepton, glbenu de ou i antibiotice: Cel mai simplu i ieftin diluant l constituie laptele semiecremat, sterilizat, la care se adaug penicilin (50000 U.I./l) i gentamicin(5 mg/l). Indiferent de mediul de diluie folosit, la 100 ml se adaug 500000 U.I.penicilin i 0,5 g streptomicin. Sperma se recolteaz cu ajutorul vaginului artificial la interval de 48 de ore, se filtreaz, apoi se dilueaz imediat la 32oC n condiii de izotermie, astfel nct dup diluie s se asigure 20 milioane spermatozoizi/ml. 1.5.4.5. Diluarea spermei de psri Dozele de sperm pentru nsmnarea artificial a psrilor trebuie s conin 100-120 milioane de spermatozoizi mobili, raportul de diluie cel mai frecvent fiind de 1/2-1/3, fr a depi 1/5. n cazul practicrii nsmnrilor artificiale n unitile cu flux tehnologic industrial, nu se recomand diluarea spermei, dac sperma brut se nsmneaz ntr-un interval maxim de 30-45 de minute dup recoltare. n cazul n care acest interval este depit, devine util i necesar diluarea spermei i conservarea acesteia. ntruct, spermatozoizii i pierd repede capacitatea fecundant, diluia spermei trebuie s se fac pe msur ce se recolteaz. Indiferent de specie, diluia spermei nu permite nsmnarea unui numr prea mare de femele dintr-un ejaculat ntruct, factorul cel mai important este numrul de spermatozoizi pe doza de nsmnare. De aceea, apare necesitatea creterii volumului dozei de sperm diluat n raport invers cu nivelul de diluie, pentru a menine constant numrul de spermatozoizi inseminai. Diluarea spermei la psri se face cu diluani care s prezerve nu numai mobilitatea spermatozoizilor ci i fecundana acestora. Pentru psri, un diluant bun este acela care diminu de o manier reversibil mobilitatea spermatozoizilor, tamponeaz tendina de acidifiere a mediului consecutiv metabolismului acestora, chiar la un nivel sczut de temperatur i conine nutrieni esenialmente energetici. Cnd sperma diluat nu se congeleaz, diluanii pot fi constituii din simple soluii tampon. Aceste soluii sunt alctuite din ap bidistilat la care se adaug fosfai de sodiu i potasiu (65 g/l) pentru a asigura o presiune osmotic de 380-400 mosm/l. Formulele de diluani mai cunoscute sunt cele menionate de Lake i colab.(1981) sau Sexton (1977), care au aceleai condiii de osmolaritate i conin unul sau mai multe sisteme tampon (citrat, fosfat, acetat, BES sau TES) i se caracterizeaz prin concentraii precise n anumii electrolii (Na+, K+, Mg++) i chelatani (aminoacizi de tip glicin sau glutamat). Aceti diluani mai conin glucoz sau fructoz. Gradul de dilutie este cuprins intre 1/2 i 1/3.
33

1.6. Conservarea spermei n prezent, extinderea nsmnrilor artificiale este condiionat ntr-o proporie nsemnat de conservarea spermei. A conserva spermatozoizii animali nseamn a conserva celule nu numai n stare vie ci i funcional. De aceea cercettorii au cutat s pun la punct metode care s fie ct mai adaptate fiziologic spermatozoidului, n sensul c acesta s-i reduc metabolismul fr a fi afectat capacitatea fecundant. Tehnicile de conservare a spermei se pot clasifica n trei grupe: a).- conservarea spermei la temperatura ambiant (18-20oC); b).- conservarea spermei la temperatura de refrigerare (2-4oC); c).- conservarea spermei la temperatura de congelare (-79;-196oC). a). Conservarea spermei la temperatura ambiant (18-20oC) n acest caz, conservarea se bazeaz pe aciunea inhibitoare a substanelor chimice incluse n diluant i care pot fi uor eliminate pentru a reanima spermatozoizii. n acest scop se folosete acidul carbonic, provenit din barbotarea bioxidului de carbon n masa spermatic cu apa (CO2+H2O=H2CO3). Spermatozoizii au un metabolism ncetinit att timp ct concentraia n bioxid de carbon se menine la saturaie. Cnd bioxidul de carbon este eliminat, spermatozoizii i recapt micarea i capacitatea lor funcional. Rezultatele obinute prin aceasta tehnica sunt nesatisfctoare pentru conservarea spermei de taur, berbec i vier. Tehnica nu permite meninerea puterii fecundante a spermatozoizilor dect pentru un interval de timp de circa 3-4 zile. Este necesar ca fiecare doz s fie pus ntr-un ambalaj etan i separat (fiol saturat cu gaz carbonic). n deceniul apte s-a propus ca metod de conservare a spermei la temperatura camerei, prin folosirea laptelui de nuc de cocos. Experienele au artat c acest mediu permite supravieuirea i prelungirea puterii fecundante a celulelor sexuale mascule de taur timp de circa 3-4 zile la temperatura de 15-20oC, metoda fiind depit tehnologic de conservarea spermei prin refrigerare i congelare. Sperma este diluat normal ntr-un mediu cu lapte de cocos i repartizat n tuburi pstrate la temperatura de 15-20oC. b). Conservarea spermei prin refrigerare (2-4oC) Aceast tehnic a fost cea mai folosit pn n deceniul opt pentru conservarea spermei la toate speciile i se mai folosete n prezent pentru conservarea spermei de vier, armsar i psri cu rezultate mulumitoare. Mobilitatea spermatozoizilor i activitatea lor metabolic descresc progresiv pe msur ce temperatura mediului n care se gsesc scade. La un nivel de temperatur care oscileaz ntre 2oCi 4oC, ntr-un mediu de diluie adecvat, mobilitatea aproape a ncetat. Dac se nclzete mediul, micarea spermatozoizilor reapare, sperma regsindu-i activitatea i puterea de fecundaie. n general, pentru conservarea la acest nivel de temperatur, se folosesc diluani salini pe baz de citrat, tartrat de Na i K sau de lapte ecremat, sau cel mai eficient, diluani sintetici n asociaie cu glbenuul de ou, a crei principal funcie este de a proteja spermatozoizii mpotriva ocului a frigore. La ap i armsar se evit includerea n diluant a glbenuului de ou care este nefavorabil pentru supravieuirea spermatozoizilor. Pe parcursul conservrii, la temperatura de refrigerare, spermatozoidul mbtrnete progresiv, mbtrnire care se manifest printr-o reducere a capacitii fecundante. Astfel, dac se consider capacitatea fecundant c este 100 n primele 24 de ore de conservare, se reduce la circa 80 n a doua zi, la 65 n a treia zi i la 50 n a patra zi (Parez M.,1969). n acest caz, centrele de
34

reproducie sunt obligate s renoiasc stocul de sperm la 2-3 zile pentru fiecare reproductor. n sperma conservat prin refrigerare, meninerea i prelungirea mobilitii spermatozoizilor se datorete: - mediului de diluie, care conine substane nutritive i protectoare; - reducerii metabolismului spermatozoizilor, datorit scderii temperaturii ntre 2oC i 4oC. Conservarea spermei prin refrigerare prezint, totui, unele avantaje: - permite difuzarea materialului seminal la punctele de nsmnri artificiale situate la o oarecare distan fa de unitatea productoare; - se pot constitui rezerve de sperm pentru dou-trei zile care pot fi expediate la solicitarea beneficiarilor, n caz de necesitate; - contribuie la intensivizarea progresului genetic, prin folosirea pe o scar mai larg a reproductorilor valoroi. Conservarea spermei prin refrigerare prezint i urmtoarele principale dezavantaje: - sperma este conservat pe o perioad limitat de timp (dou-trei zile); - dificulti n asigurarea temperaturii sczute pe timpul transportului i pe durata conservrii; - sunt pierderi apreciabile de material seminal, prin nlturarea dozelor care nu au fost inoculate n intervalul de timp de dou-trei zile; - cheltuielile mari cu transportul dozelor, care trebuie s se fac n permanen la un interval de dou-trei zile, pentru toate punctele de nsmnri artificiale deservite de centrul respectiv; - consum crescut de energie pentru meninerea unei temperaturi sczute, constante (2-4oC). c).Conservarea spermei prin congelare La temperaturi sub -15oC, modificrile biologice pe care le sufer celulele sexuale mascule n cursul timpului sunt abolite. Conservarea spermatozoizilor se face cu scopul de a opri metabolismul lor de o manier reversibil, ceea ce permite conservarea acestora pe o durat de timp practic indefinit. nsmnarea femelelor cu sperma conservat prin congelare reprezint un procedeu cu maxim eficacitate. Aceast tehnic se bazeaz pe meninerea sub form solid a spermei, spermatozoizii fiind adui ntr-o stare de via extrem de ncetinit, nivel la care reaciile chimice sunt aproape inexistente, motiv pentru care conservarea mobilitii i capacitii fecundante a spermatozoizilor se poate face n condiii optime, timp de zeci sau chiar sute de ani. Spermatozoizii i recapt mobilitatea i capacitatea fecundant n momentul revenirii la temperatura corporal. Agenii criogeni sunt reprezentai de zpada carbonic ce asigur o temperatur medie sczut (-79oC), de aerul lichid (-183oC) i azotul lichid (-196oC). Cel mai rspndit agent criogen n congelarea spermei este azotul lichid Pentru congelarea spermei la temperaturi foarte joase s-a mai folosit i aerul lichid, un amestec de oxigen i azot lichid, care asigur o temperatur de 183oC, care, n contact cu impuriti organice, prezint pericol de explozie, motiv pentru care n prezent nu se mai folosete. Pstrarea azotului lichid la unitile de producere a materialului seminal, la unitile beneficiare ct i pe timpul transportului se realizeaz n recipiente speciale numite containere. Dup modul de folosire sau destinaie, containerele pot fi clasificate astfel: - containere de punct, cu capacitatea de 5-35 litri; - containere de stocaj i transport, cu capacitatea de 35-50 de litri;
35

containere de depozit (stocaj), cu capaciti cuprinse ntre 100 i 750 de litri. Containerele sunt confecionate din material inoxidabil sau dintr-un aliaj special pe baz de aluminiu. La marea majoritate a containerelor, construcia se realizeaz dup aceleai principii tehnice: vas n vas cu perei multipli izolatori n vid (fig 3). Partea din dop care ptrunde pe gura sau gtul containerului, este confecionat din material plastic rigid, care nu optureaz ieirea vaporilor de azot, vapori ce rezult din fierberea lent, dar continu a azotului lichid. Containerele cu care sunt dotate punctele de nsmnri artificiale sunt de capacitate mic, numrul de doze ce pot fi depozitate depinznd de forma de ambalare a materialului seminal (fiol, paiet, granul). De regul, aceste, containere sunt prevzute cu 6 canistre Fig. 3 Schema interioar a containerului de cilindrice confecionate din punct (dup Gh. Liciu i O. Roca, 1998) 1 dop container; 2 - an prin care trece tija tabl inoxidabil, aliaj de canistrei; 3 capac; 4 loj; 5 cma aluminiu sau din material Pentru uurina interioar; 6 cma extern; 7 izolaie i plastic. vacuum; canistre; 9 tij; 10 limitator manipulrii, canistrele sunt prevzute cu o tij a crei canistre. extremitate sub form de mner, se sprijin n locauri speciale practicate la gura containerului. Autonomia containerelor este dat de timpul scurs din momentul efecturii plinului i pn n momentul cnd nivelul azotului lichid (cantitatea msurat n container) nu mai poate asigura conservarea n condiii bune a materialului seminal depozitat. Autonomia containerului este condiionat de tipul constructiv, frecvena manipulrilor, mod de exploatare i ntreinere etc i oscileaz ntre 21 i 180 de zile. Pentru determinarea ritmului zilnic de evaporare a azotului lichid, periodic se efectueaz cotarea azotului lichid din container. Fiecare punct de nsmnri artificiale este dotat cu un container n care se gsesc dozele de material seminal necesar, repartizat conform planului de potrivire a perechilor, aprovizionarea cu azot lichid fcndu-se de ctre Unitatile de Ameliorare si Reproductie in Zootehnie la intervale de timp corespunztoare gradului de autonomie a containerelor. Congelarea spermei prezint numeroase avantaje: - testarea reproductorilor dup descendeni; - exploatarea intensiv a celor mai valoroi reproductori; - depozitarea i folosirea spermei pentru un interval mare de timp; - se asigur n permanen sperma necesar pentru nsmnarea femelelor, la momentul optim, existnd n acest fel posibilitatea formrii de linii i familii cu un potenial productiv ridicat;
36

realizarea unor importante economii, prin folosirea raional, nelimitat n timp, a spermei congelate, comparativ cu sperma conservat prin refrigerare; - se poate transporta la puncte de nsmnare situate la distane mari, fiind nevoie doar de reaprovizionarea periodic cu azot lichid; - se reduc cheltuielile datorate transportului spermei; - se reduce preul de cost pe doza de material seminal; - permite nsmnarea femelelor la pune, n taberele de var i n zonele greu accesibile mijloacelor de transport; - favorizeaz schimburile internaionale de sperm. Primele ncercri de conservare a spermei au fost fcute n anul 1949 de Parkes, Smith i Polge. Stewart (1951) a nsmnat o vac cu sperma congelat la -79oC i a obinut un produs (I. Dumitrescu i colab.,1978). n anul 1952, Polge i L.E.A. Rowson au introdus n mediul de diluie glicerin i au constatat c aceast substan are rolul de a proteja, la temperaturi foarte sczute, spermatozoizii. Succesul acestei realizri a fost comunicat de Polge i colab. n 1952, la al II-lea Congres Internaional de Reproducie de la Copenhaga. Schema congelrii spermei propus de Polge i colab. n anul 1952, astzi este mult simplificat, fiind pstrate totui aceleai principii: - congelarea cu un diluant cu glicerol; - scderea rapid a temperaturii pn la -196oC; - meninerea spermei congelate la aceast temperatur (-196oC), pn n momentul folosirii; - decongelarea spermei, n vederea inoculrii, se face prin imersiunea brusc a dozei ntr-o baie la 320C, chiar n momentul ntrebuinrii. Pn n 1964, metoda congelrii spermei nu a suferit dect mici modificri cu privire la compoziia diluantului, cronologia diferitelor operaiuni i viteza de rcire. Erau atunci propuse dou soluii: congelarea n fiole de sticl de 1-2 ml, congelarea n paiete cu capacitatea de 1,0, 0,5 i 0,25 ml, ultimul tip de ambalaj fiind propus de R. Cassou. Extrema simplicitate, rapiditate i rezultatele foarte favorabile oferite de aceast metod au condus la introducerea congelrii spermei n paiete din material plastic de ctre numeroase ri, fiind adoptat congelarea spermei n azot lichid la temperatura de -196oC, mai uor de obinut i mai eficace dect temperatura de -79oC, asigurat de zpada carbonic, folosit pn atunci. n 1964, comunicrile lui Nagase i Niva au repus n discuie congelarea spermei bazate pe urmtoarele principii: - folosirea diluanilor pe baz de glucoz i fructoz, uor glicerolai (5%); - congelarea spermei diluat ntr-un raport strns (1/3-1/4); - congelarea rapid prin simpla depunere de picturi de sperm cu volum redus (0,1-0,2 ml) pe un bloc de ghea carbonic (-79oC); - rediluarea n momentul decongelrii ntr-o simpl soluie fiziologic de diluant. Rolul substanelor crioprotectoare Prezena glicerinei n mediul de diluie a spermei, creeaz condiiile congelrii spermei, fr modificri majore, care s afecteze viabilitatea i capacitatea fecundant a spermatozoizilor. Prin introducerea glicerinei n diluant, punctul de congelare a spermei coboar de la 0,53oC la -3oC, iar formarea cristalelor de ghea are loc la -10oC, comparativ cu 1,7oC n sperma brut. Cnd ncepe formarea cristalelor de ghea, temperatura tinde ctre punctul real de congelare, care se menine pn cnd congelarea devine complet. n acel moment
37

se stabilete un echilibru ntre sperm i agentul de rcire. O proporie de circa 7% glicerin n lichidul de diluie, determin coborrea punctului de congelare pn la -3oC, iar punctul de formare al cristalelor de ghea la -10oC. Cnd se congeleaz sperma ntr-un mediu lichid, cristalizarea ncepe n acea parte a lichidului care este cea mai apropiat de agentul de rcire i se continu n masa lichidului (Dumitrescu I. i colab., 1978). Cnd coborrea se face ncet, cristalizarea se desfoar lent, cristalele care se formeaz sunt mari, ceea ce antreneaz o cretere a concentraiei n sruri a fraciunii necristalizate i provoac ieirea unei pri din apa intracelular, diminund astfel formarea gheii intracelulare. n cazul n care coborrea temperaturii se face ntr-un ritm rapid, cristalele de ghea care se formeaz sunt mici, rezultnd o substan destul de omogen, n care cristalele sunt constituite numai din ap, fapt ce determin o concentraie de electrolii crescut, att intract i extracelular. n aceast situaie apa intracelular nu poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate crescut intracelular, iar aceste cristale i vor mri volumul n momentul congelrii i decongelrii, fapt care conduce la alterarea structurii spermatozoizilor. La un moment dat, aceast concentraie n sruri este att de ridicat nct lipoproteinele din structura spermatozoidului devin solubile, iar n timpul decongelrii permeabilitatea celular se altereaz n aa msur nct spermatozoidul moare. Acest efect se evideniaz n reducerea cu circa 50% a proporiei de spermatozoizi vii din sperma decongelat, astfel mobilitatea spermatozoizilor se reduce de la 70-80% nainte de congelare, la 30-40% dup decongelare. n concluzie, compuii hidrofili reprezentai de diveri polialcooli, (glicerol), ptrund uor n celula seminal prin simpla osmoz, ntrziind formarea cristalelor de ghea, prin coborrea punctului de congelare. Pe de alt parte, glicerina limiteaz efectele soluiei, nlocuind o parte din apa intracelular, atras de creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea rol protector fa de membranele celulare (hidraii de carbon, polivinil, pirolidon etc). 1.6.1. Conservarea spermei de taur A) Conservarea spermei la temperatura ambiant (laborator) La temperatura camerei (laboratorului) sperma de taur se poate conserva pentru o perioad scurt de timp (3-6 ore) i pentru o perioad mai ndelungat (34 zile). Conservarea de scurt durat se poate face fie sub form brut, fie sub form diluat. Sperma brut s-a folosit n perioada de nceput a introducerii nsmnrilor artificiale i const n inocularea imediat dup recoltare a spermei, fracionat n mai multe doze, n condiii de asepsie. Sperma diluat, pstrat la temperatura camerei, se poate folosi la nsmnare artificial ntr-un interval de maxim 6-8 ore. Conservarea pentru o perioad mai ndelungat a fost consemnat sub numele de anabioz acid (anabiosis = nviere, revenire la via). Diluantul preparat, se barboteaz timp de circa 10 minute cu un curent de CO2, n prealabil purificat prin trecerea succesiv printr-o soluie de bicarbonat de sodiu 15% i de permanganat de potasiu 3%, pn cnd pH-ul ajunge la 6,2-6,3. Acidifierea mediului se datoreaz formrii acidului carbonic: CO2+H2=H2CO3. Se dilueaz sperma care se pstreaz n ambalaje nchise ermetic la temperatura de18-20oC, timp de 3-4 zile. Datorit dezavantajelor pe care le prezint, aceast metod de conservare a spermei nu se mai aplic la taur.
38

B) Conservarea spermei de taur prin refrigerare (2-4oC) Aceast tehnic a fost folosit n perioada anilor 50-70, la taur, cu rezultate satisfctoare, nivelul sczut de temperatur fiind asigurat fie de zpada hidric, fie n refrigeratoarele obinuite. Tennica de conservare a spermei de taur prin refrigerare este suficient de simpl. Dup efectuarea diluiei finale, cu ajutorul unei seringi semiautomate, sperma se repartizeaz, cte 1ml, n fiole cu capacitatea de 1,5-2,0 ml care se nchid la flacr oxiacetilenic. Fiolele se grupeaz pe tije port-fiole, sau n recipiente din material plastic, pe ejaculate, care se introduc la frigider n vederea echilibrrii. Dup 3-4 ore se pot folosi la nsmnarea artificial a femelelor n clduri, iar pentru transport se folosesc fie frigidere tip, auto, fie termosuri zootehnice, n care se gsete ghea hidric, ce trebuie s nconjoare din toate prile dozele de sperm. La punctele de nsmnri artificiale, dozele cu sperm se transfer n frigidere. Expedierea dozelor cu material seminal se face mpreun cu un buletin i fi de utilizare. C) Conservarea spermei de taur prin congelare Cronologic vorbind, congelarea spermei de taur s-a fcut n dou variante, dup ritmul n care se trece peste punctul crioscopic: lent i rapid. Congelarea lent s-a fcut la nceput i se caracterizeaz printr-o coborre lent a temperaturii spermei, n special de la 35-37oC la -30oC. Fiolele cu sperm se introduc ntr-o baie de alcool etilic, plasat, la rndul ei, la o temperatur de 2-4oC. n baia de alcool se adugau la nceput cantiti predeterminate de zpad carbonic n scopul reducerii temperaturii dup un anumit ritm. Astfel, rcirea spermei ntre 5oC i -15oC se fcea cu un grad pe minut, iar de la -15oC la -30oC, scderea temperaturii se fcea cu dou grade pe minut. De la -30oC pn la -79oC sau -196oC (funcie de agentul criogen ntrebuinat) trecerea fiolelor cu sperm se fcea brusc. n prezent sunt aparate moderne, numite frizere, care n funcie de program, asigur un control electronic al ritmului coborrii temperaturii. n momentul de fa aceast metod nu se mai folosete datorit dezavantajelor pe care le prezint. Congelarea rapid a spermei este folosit n exclusivitate n prezent, fiind rspndit n cvasitotalitatea rilor dezvoltate economic i n curs de dezvoltare. n funcie de repartizarea n doze, congelarea rapid se poate face n fiole, paiete i granule. a) Congelarea spermei n fiole s-a practicat la nceputul folosirii spermei congelate de taur i constituie un procedeu care se mai folosete cu rezultate bune. Fiolele sunt fabricate din sticl neutr, rezistent la variaii foarte mari de temperatur, iar pe corpul lor se imprim datele necesare identificrii reproductorului sau codificrii necesare n practica de reproducie. Volumul util al materialului seminal diluat este de 1 ml, rezervndu-se un spaiu de dilatare a lichidului n timpul congelrii. Acest spaiu are rolul de a evita, dup decongelare, pierderea de material seminal prin refulare n momentul introducerii n fiol a pipetei de nsmnare. Congelarea spermei Dup diluia final a spermei se calculeaz necesarul de fiole pentru fiecare ejaculat n parte. Cu ajutorul unui dispozitiv automat sau a unei seringi semiautomate, sperma se repartizeaz, cte 1ml, n fiecare fiol. Fiolele se nchid la flacr oxiacetilenic, apoi se fixeaz n tije port-fiole, confecionate din aluminiu, fiecare tij fiind prevzut cu cte 6 locauri. Tijele se grupeaz pe ejaculate apoi se introduc ntr-un refrigerator, n vederea ehilibrrii, unde se menin 3-4 ore, funcie de specificul fiecrei uniti productoare. n acest interval de timp, spermatozoizii se adapteaz cu diluantul
39

folosit i noul nivel de temperatur, iar antibioticele incluse n diluant i fac efectul specific. Dup echilibrare, tijele port-fiole se introduc n plan orizontal, n vapori de azot lichid, care se formeaz deasupra azotului lichid stocat ntr-un container cu gura larg. La circa 3 cm sub nivelul azotului se gsete o sit confecionat din srm cu ochiurile mici sau dintr-un capac prevzut pe toat suprafaa cu orificii. Pe acest capac grilant se aaz tijele port-fiole, vaporii de azot lichid avnd o temperatur de -120oC pn la -130oC, unde se menin 8-10 minute, operaiunea fiind denumit precongelare. Dup acest interval de timp, tijele port-fiole, grupate pe ejaculate, se introduc n canistre metalice care se fixeaza in containerele c uazot lichid.. n aceste containere numite de prestocaj, dozele se menin pn a doua zi, cnd se verifica mobilitatea spermatozoizilor. Dac mobilitatea este de cel puin 30%, tijele port-fiole se transfer n containere depozit, cu capacitate de 200-500 l, unde se pstreaz, n azot lichid, pn n momentul livrrii ctre diverii beneficiari. In caz contrar, dozele ejaculatului in cauza se arunca. Ambalarea spermei n fiole prezint trei dezavantaje majore: pot exploda n timpul decongelrii, ocup un spaiu de depozitare prea mare, necesit o tehnologie de umplere cu o productivitate mai sczut. Din aceste motive, congelarea spermei n fiole este, n prezent, abandonat n aproape toate rile. b) Congelarea spermei de taur n paiete A fost elaborat n anul 1965 de ctre R. Cassou, n Frana i constituie una dintre cele mai moderne i practice forme de ambalare a materialului diluat, care confer eficacitate i productivitate sporite. Paieta este confecionat din clorur de polivinil care nu reacioneaz chimic cu mediul de diluie. Paieta are forma unui tub cilindric i este confecionat n dou variante: - paieta mijlocie, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 2,5-2,8 mm, grosimea paietei de 0,14-0,20 mm i volumul util de 0,54 ml; - paieta fin, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 1,7-2,0 mm i un volum util de 0,25 ml. Indiferent de tip, paietele au un capt deschis, iar cellalt astupat cu un dop uzinal constituit din dou straturi de bumbac ntre care s-a pus un strat de pudr polivinilic preparat cu alcool. Lungimea paietelor este aceeai (133 mm) i ntruct n timpul umplerii se las o bul de aer de 10 mm lungime, lungimea coloanei de sperm este de 103 mm. Pudra de alcool polivinilic, n contact cu un lichid polimerizeaz i se transform ntr-un gel care obtureaz complet lumenul, ceea ce-i confer garania unei protecii absolute a spermei congelate fa de germenii florei banale sau patogene prezente eventual n containerul de depozitare. Pentru imprimarea paietelor se folosete o main semiauto-mat, prevzut cu un bloc compostor i un set de litere i cifre (foto 9). Imprimarea se face cu cerneal special, rezistent la azot lichid i cu uscare rapid. Se folosete cerneal de diferite culori n funcie de culoarea paietelor care urmeaz a fi imprimate, astfel nct, contrastul s fie ct mai evident. Pe fiecare paiet se Foto 9 Main semiautomat imprim datele necesare pentru pentru imprimarea paietelor identificarea exact a probei de
40

sperm congelat, ntocmai ca pentru fiole. Dup umplere, captul deschis al paietelor se astup cu pudr de alcool polivi-nilic (dop de laborator) sau se nchide prin sudarea cu ultrasunete. La ambele tipuri de paiete, se asigur o bul de aer cu o lungime de circa 10 mm, absolut necesar pentru a compensa dilatarea coloanei de material seminal n timpul congelrii i pentru a favoriza omogenizarea coloanei de sperm dup decongelare. Tehnica de congelare a spermei n paiete Dup efectuarea diluiei spermei, conform raportului final de diluie, se calculeaz necesarul de paiete, care se imprim cu ajutorul mainii semiautomate. Fracionarea ejaculatului n doze de nsmnare se face, de regul, la temperatura de 2-4oC, manual sau automat. Umplerea manual a paietelor. Paietele, imprimate i uscate se prind n brri metalice cptuite cu cauciuc striat, dimensionate s cuprind exact 15 paiete mijlocii. Sperma este aspirat n paiete cu ajutorul unei pompe de vid cu presiunea coloanei de mercur de 30-50 cm. La cordonul de cauciuc al pompei de vid se racordeaz un pieptene de aspirare prevzut cu 15 locuri, corespunztoare numrului de paiete prinse n brar. La pieptenele de aspirare se ataeaz brara cu paiete, astfel nct, prinderea acestora s se fac cu captul prevzut cu dopul uzinal. La partea superioar a pieptenului se gsete un orificiu de admisie a aerului care se obtureaz cu degetul atunci cnd paietele sunt introduse cu captul deschis n sperm. Umplerea paietelor se face complet, fr a se lsa bula de aer. Dup umplere, paietele se scutur energic, ceea ce ndeprteaz surplusul de sperm pe o lungime de circa 10 mm. nchiderea paietelor se face prin apsarea lor cu captul deschis ntr-un vas care conine pudr de alcool polivinilic. Pudra ptrunde pe lumenul paietelor, astupndu-l. Apoi, paietele se introduc cu captul astupat de pudra de alcool polivinilic ntr-un recipient cu ap distilat, astfel nct pudra polimerizeaz i astup complet i acest capt al paietei. n acest fel, coloana de sperm este izolat etan de mediul exterior, protejnd-o de eventualele contaminri. Paietele se desprind din brara metalic, se terg cu un prosop uscat, apoi se aaz pe nite rame metalice speciale, cu capacitatea de 40-100 de paiete. Stativele cu paietele respective se introduc pentru echilibrare ntr-un dulap frigorific, la temperatura de Foto 10 Echilibrarea spermei ntr-o 2-4oC, unde se menin circa 3-4 ore (foto vitrin frigorific 10). Dup echilibrare, ramele cu paiete se introduc n vapori de azot lichid pentru precongelare, unde sunt meninute 7-8 minute (foto 11). Apoi se adun, se introduc n nite pahare din material plastic cu dimensiuni corespunztoare canistrelor, numite goblete, acestea se introduc etajat n canistre, care la rndul lor, se scufund n azot lichid n containerele de prestocaj (foto 12). Verificarea materialului seminal i depozitarea paietelor cu sperm se face ntocmai ca n cazul fiolelor (foto 13, 14 si 15).

41

Foto 11 Precongelarea spermei n vapori de azot lichid

Foto 12 Containere de prestocaj

Foto 13 Verificarea calitii materialului Foto 14 Depozitarea dozelor cu sperma seminal din containerele de prestocaj O variant mbuntit a umplerii manuale a paietelor este reprezentat de umplerea sub clopot de vid. Paietele sunt nchise ermetic pri sudare cu ultrasunete la unul din capete. Sunt apoi individualizate cu toate datele necesare. Se calculeaz strict necesarul de paiete, funcie de capacitatea acestora i de volumul total de sperm diluat. Cu captul deschis, paietele se introduc n paharul cu sperm diluat. La rndul lui, paharul se plaseaz sub un clopot de vid. Se pornete pompa de vacuum n vederea scoaterii aerului din paiete, (aspect ce se verific echinivelmetric cu ajutorul unei paiete introdus ntr-un pahar cu lichid colorat). Apoi se d drumul la aer, care, datorit presiunii mpinge sperma n paiete (foto 16). Paietele se nchid la captul liber cu ajutorul pulberii de alcool polivinilic. Urmtoarele etape ale congelrii sunt asemntoare celor menionate mai sus. Folosirea acestei metode impune efectuarea unui calcul precis al necesarului de paiete pentru fiecare ejaculat. n caz contrar, fie c paietele nu se umplu, fie c rmne material seminal neabsorbit n paiete.

Foto 15 Diferite tipuri de containere pentru depozitarea dozelor cu sperm

Foto 16 Umplerea paietelor sub un clopot de vid

42

 Umplerea automat a paietelor se face cu ajutorul unor maini semiautomate a cror productivitate se situeaz la un nivel de 4000-13000 paiete pe or. Paietele imprimate cu toate datele necesare, sunt aezate pe un rastel adaptat la conveiorul mainii care transport paietele pn n dreptul orificiilor de umplere. La acest nivel se gsesc nite ace (1-3) racordate prin tuburi de material plastic, la recipientul cu sperm, iar pe partea opus exist acelai numr de ace, mai scurte, racordate la o pomp de vid. Dup umplere, paietele trec pe rnd prin dreptul unui emitor (Bronson) de ultrasunete, cu acionare vertical, care nchide etan captul paietelor. Pentru nchiderea paietelor se mai pot folosi bile mici, metalice sau din material plastic care se introduc forat pe lumenul acestora, nchizndu-se etan. Echilibrarea, precongelarea, congelarea, verificarea materialului seminal i stocarea sunt urmtoarele etape ale congelrii identice celor menionate la umplerea manual. Ambalarea spermei n paiete prezint avantajele: - permite o bun individualizare a dozelor; - se evit contaminarea spermei cu flora microbian existent n azotul lichid; - permite folosirea economic a containerului (maxim de doze n minim de spaiu), aplicabil mai ales n cazul ambalrii spermei n paiete fine; - necesit o tehnic de conservare i inoculare a spermei, simpl. c) Congelarea spermei n granule (pastile) A fost propus i experimentat de Nagase i Niva, n anul 1964 i reprezint singura form concentrat sub care se conserv materialul seminal, n contact direct cu agentul criogen (azotul lichid). Se bazeaz pe congelarea ultrarapid a spermei diluate ntr-un raport de diluie strns, n alveolele unui bloc de ghea carbonic, rezultnd granule de sperm congelate, cu volum de circa 0,1 ml. Sperma se dilueaz ntr-un raport de 1/2-1/4, apoi este lsat s se rceasc pe parcursul a 90 de minute la temperatura de 1-3oC. Echilibrarea spermei se face n frigider, timp de 4-5 ore. Materialul seminal diluat se depune, cu ajutorul unei seringi semiautomate, cte 0,1ml, n alveolele practicate n nite blocuri de zpad carbonic, la temperatura de -79oC. Placa de zpad carbonic se acoper cu vat steril i se las circa 7 minute, timp necesar congelrii.. La expirarea timpului de congelare, granulele sunt scuturate de pe placa de zpad carbonic (sunt suflate cu un curent de aer) i colectate ntr-un recipient cu azot lichid. Granulele care provin de la acelai reproductor, se ambaleaz mpreun n recipieni din material plastic, pe care sunt trecute toate datele necesare identificrii, apoi se aaz suprapus, pe o tij care se suspend n azot lichid. Se depoziteaz numai granulele provenite din probe care dup decongelare prezint cel puin 30% mobilitate i conin cel puin 10 milioane de spermatozoizi vii cu micri rectilinii/doz. Recipienii au o capacitate de 50-100 de granule. Acest procedeu de ambalare a materialului seminal are i unele dezavantaje legate de imposibilitatea individualizrii sigure a granulelor i a existenei riscului de contaminare cu ageni microbieni provenii din azotul lichid n timpul conservrii.

43

1.6.2. Conservarea spermei de berbec i ap La ovine i caprine se poate folosi cu bune rezultate pentru nsmnare sperma brut fracionat n mai multe doze (circa 10/ejaculat). n acest caz, nsmnarea femelelor trebuie s se fac imediat dup colectarea spermei care nu se mai dilueaz. Metoda d bune rezultate n ceea ce privete procentul de fecunditate al femelelor nsmnate. Sperma de berbec se conserv sub form lichid sau solid, asemntor spermei de taur, ns rezultatele obinute, prin nsmnarea femelelor cu sperm congelat, sunt mult mai slabe dect la taurine. Conservarea spermei sub form lichid este destul de rspndit, rezultatele obinute fiind bune. Temperatura de conservare a spermei diluate este de +15oC (Baril i colab.,1993) sau la 2-4oC. n cazul conservrii spermei la aceste niveluri de temperatur, sperma diluat se repartizeaz n fiole (1 ml), n flacoane sau n paiete. Pe timpul efecturii controlului i dilurii spermei, coborrea temperaturii trebuie s se fac progresiv ntre +32oC i +15oC, deoarece spermatozoizii sunt foarte sensibili la ocul termic, motiv pentru care trebuie evitate fluctuaiile rapide ale nivelului de temperatur. Conservarea i transportul materialului seminal ambalat n fiole i flacoane se fac ca la taur, iar distribuirea la fiecare punct de nsmnare se face la interval de dou zile. Sperma conservat n stare lichid poate fi ambalat i n paiete. Dup omogenizarea spermei diluate, umplerea paietelor se face fie manual, fie semiautomat (dac numrul de doze este mare), fie prin simpla aspirare bucal prin traversul dopului uzinal care permite trecerea aerului. Inchiderea paietelor se face ca la taur. Dozele se pstreaz la termostat reglat fie la +15oC, fie la 2-4oC. n cazul conservrii spermei la temperatura de +15oC, sperma trebuie s fie inoculat la intervalul a maximum 8-10 ore de la recoltare. Congelarea spermei de berbec pn n prezent nu a dat rezultate mulumitoare, datorit faptului c nivelul de fecunditate este mai sczut cu 20% fa de folosirea spermei brute, numrul de spermatozoizi necesari este foarte mare, iar tehnica procesului de congelare este costisitoare i complicat. Dup diluia final a spermei, calculndu-se un nivel de 4% glicerin, temperatura se reduce progresiv pn la 4oC, temperatur la care condiionarea se face n paiete i practic ncepe procesul de congelare a spermei. Imediat dup recoltare, se face diluia iniial n raport de 1/1 la temperatura de 28-30oC, care apoi se plaseaz n partea de jos a unui refrigerator (6oC). Dup 30 de minute, temperatura spermei scade pn la 13-15oC i dup circa dou ore ajunge la +6oC. n acest stadiu, sperma se scoate din vasul cu ap i se plaseaz direct n refrigerator sau camera frigorific, apoi la +4oC se adaug diluantul cu glicerin, astfel nct, n final, concentraia acesteia s fie de 4% (G. Baril i colab., 1993). Repartizarea spermei n paiete mijlocii (0,5 ml) se poate face manual, semiautomat sau chiar prin simpla aspirare bucal. Dup nchiderea paietelor i echilibrarea spermei, congelarea se poate realiza fie folosind o main automat, fie meninnd paietele circa 8 minute la 20 cm deasupra nivelului azotului lichid, n vaporii acestuia (-75oC) apoi prin imersarea direct n azot lichid. Congelarea spermei n pastile s-a dezvoltat n Australia printr-un procedeu asemntor congelrii spermei de taur. Dup diluia final a spermei, se coboar temperatura acesteia pn la un nivel de +4oC (asemntor celor mai sus precizate), apoi, picturi de 0,1-0,2 ml de sperm la +4oC sunt depuse direct n
44

alveolele practicate pe blocul de zpad carbonic (-79oC). Dup 3-4 minute, pastilele sunt colectate, introduse ntr-un recipient de plastic i apoi se scufund direct n azot lichid. La caprine, existena enzimelor n plasma seminal, care acioneaz asupra fosfolipidelor din diluant, cu liberarea de compui toxici pentru spermatozoizi, antreneaz etape diferite de conservare a spermei, comparativ cu ovinele. La ap, este recomandat de a se separa plasma seminal ct mai repede posibil dup recoltare. Pentru folosirea spermei proaspete, diluia direct a ejaculatului ntr-un diluant pe baz de lapte ecremat de vac este posibil, ns se interzice prezena glbenuului de ou n mediul de diluie. Dac diluantul conine glbenu de ou este absolut necesar s se fac splarea spermei nainte de diluie. Splarea spermei de ap se face prin folosirea unei soluii Krebs-Ringer-Fosfate (soluie de splare) care conine glucoz, apoi se centrifugheaz amestecul pentru a elimina plasma seminal. Sunt posibile dou splri succesive. Reducerea temperaturii se face astfel: dup recoltare, paharul colector se plaseaz ntr-o baie-marie la 28-30oC, imediat adugndu-se soluia de splare; centrifugare 15 minute, eliminarea supernatantului, adugarea celei de-a doua soluii de splare i iari centrifugare timp de 15 minute. n cazul conservrii spermei sub form lichid, dup circa 35-40 de minute de la recoltare, urmat de cele dou splri, se face diluia final la 20oC. Se omogenizeaz, apoi paharul cu sperm se introduce ntr-un vas plin cu ap (20oC) n refrigerator (+6oC). Dup circa 65 de minute, sperma se condiioneaz n paiete ca i sperma de berbec, ns trebuie s fie ntrebuinat n primele 8 ore de la recoltare, ceea ce limiteaz conservarea spermei de ap prin refrigerare la 13-15oC. n cazul congelrii spermei de ap, dup a doua splare i dou ore de la recoltare se adaug prima parte a diluantului glicerol (+4oC), dup 10 minute se adaug a doua parte a diluantului glicerol, iar dup alte 10 minute se adaug i a treia parte a diluantului glicerol tot la temperatura de +4oC. Dup 30 de minute, sperma se condiioneaz n paiete de 0,25 ml, se precongeleaz n vapori de azot (ca i sperma de berbec) i apoi se congeleaz n azot lichid (-196oC). Sperma de ap se poate conserva i n pastile, ntocmai ca sperma de berbec.

1.6.3. Conservarea spermei de vier Sperma de vier are unele particulariti, n raport cu cea a rumegtoarelor: volum mare, concentraie sczut n spermatozoizi, sensibilitate crescut la schimbrile de temperatur, plasma seminal bogat n electrolii, ceea ce ngreuneaz posibilitile tehnice de conservare (Feredean i colab., 1964). Dac sperma corespunde calitativ, imediat dup recoltare se dilueaz, la temperatura de 33-35oC, n raport de 1/1 i n condiii de izotermie. Se pstreaz la 18-20oC, 15-20 de minute pentru echilibrare. La diluarea spermei de vier, gradul de diluie variaz n limite mai restrnse dect la rumegtoare, 1/2-1/8. Sperma de vier diluat, se ambaleaz n recipiente de sticl sau de material plastic, cu capacitatea de 80-100 ml. Dac sperma se folosete imediat dup diluare, aceasta se repartizeaz direct n recipientul adaptat cateterului de nsmnare. Dac sperma diluat se conserv mai multe zile, ambalarea se poate face pentru cantitatea total (n sticle cu perei dubli) sau n doze a cte 100 ml, direct n recipiente de material plastic. n practica nsmnrilor artificiale la porcine, metodele de conservare a spermei sunt:
45

conservarea la temperatura de 15-20oC; conservarea n medii uor acide; conservarea la temperatura de 4-5oC; conservarea prin congelare.

A) Conservarea spermei la temperatura camerei (15-20oC) Sperma de vier, diluat i ambalat se poate pstra una-dou zile dac temperatura de pstrare este constant, conine substane saline, energetice i antibiotice. Ritmul de coborre a temperaturii spermei diluate va fi lent, fr variaii brute, atingerea temperaturii de conservare trebuind s se realizeze n 90120 de minute. La aceast temperatur sperma se pstreaz pn n momentul inoculrii, cnd trebuie renclzit pn la o temperatur apropiat de cea a corpului (37-40oC) (Feredean T. i colab., 1961). Conservarea spermei la temperatura de 15-20oC timp de 48 de ore, asigur un nivel de fecunditate al scroafelor nsmnate de circa 75% (Feredean T., 1977) Conservarea spermei n medii uor acide se bazeaz pe crearea anabiozei acide. Diluantul folosit conine bicarbonat de sodiu la care se adaug bioxid de carbon, cu rol n acidifierea mediului, prin formarea acidului carbonic. Aceast metod a fost adoptat pentru conservarea spermei de vier de ctre du Mesnill, du Buisson i Dauzier n anul 1959. Reactivarea spermatozoizilor se face prin simpla nclzire a spermei ce urmeaz a fi folosit sau prin adugarea unei substane chimice alcaline, ambele condiii regsindu-se n uterul scroafei. Diluarea se realizeaz la temperatura de 31-33oC, n final adugndu-se circa dou-trei volume de diluant la un volum de sperm, astfel nct s se obin 3-4 miliarde de spermatozoizi ntr-o doz de 40-50 ml. Sperma diluat se barboteaz cu un curent de CO2, timp de 10 minute, pn cnd pH-ul coboar la 6,2-6,4. Din recipientul n care s-a fcut barbotarea spermei diluate, aceasta se repartizeaz n fiole de sticl de circa 50 ml, care se nchid la flacr oxiacetilenic i se pstreaz la o temperatur constant de 15oC. n momentul folosirii, fiecare doz se dilueaz din nou cu acelai diluant inut la 30oC, pn la un volum final de 100 ml i apoi se folosete la nsmnarea scroafelor n clduri. Conservai astfel, spermatozoizii i prezerv capacitatea fecundant timp de 4-5 zile. Totui, datorit laboriozitii metodei i a promovrii n prezent a altor procedee de conservare a spermei nu se mai practic sau se aplic n mod cu totul sporadic. B) Conservarea spermei de vier la temperatura de 4-5oC La noi n ar, din anii 90, pe lng diluantul salin de tip SEMTEST Baloteti folosit pentru conservarea spermei timp de 48 de ore la temperatura de 15-20oC, se mai utilizeaz, cu rezultate bune, un mediu de diluie propus de Institutul de Biologie i Nutriie Animal Baloteti, pe baz de glbenu de ou. n cazul folosirii acestor medii de diluie, sperma diluat poate fi folosit la nsmnarea artificial a scroafelor timp de 4-5 zile de la data diluiei, cu condiia ca sperma s fie pstrat la frigider (+4oC). nainte de nsmnare, dozele de sperm se nclzesc pn la temperatura de 37oC. C) Conservarea spermei de vier prin congelare Congelarea spermei de vier a preocupat cercettorii n ultimele patru decenii, ns numai din anii 70 aceste cercetri s-au amplificat. Primele rezultate obinute cu sperm congelat, dup nsmnarea transcervical sunt ale lui Crabo i Grinarsson, n 1971, care au folosit ca lichid pentru decongelare plasma seminal de vier (Dumitrescu I. i colab., 1978). Crioconservarea spermei are drept consecin un anumit grad de distrugere a biomembranelor spermatozoizilor, prin trecerea n plasm a lipidelor, albuminelor, fermenilor, grupelor sulfhidrice,
46

afectarea echilibrului ionic etc (Nauk B.A., 1991). Gradul de stabilitate a spermei animalelor domestice la temperaturi foarte sczute este dependent, n mare msur, de comportarea albuminelor. Coninutul n aminaz a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de vier este mai sczut comparativ cu spermatozoizii rumegtoarelor. Experienele au demonstrat faptul c substanele albuminice i complexele acestora sunt mai stabile la temperaturi sczute dect lipidele. Spermatozoizii de vier conin mai multe fosfolipide comparativ cu spermatozoizii rumegtoarelor. Experienele ntreprinse au evideniat faptul c la temperaturi ultrasczute crete procesul de oxidare peroxidic a lipidelor din spermatozoizi. n ceea ce privete participarea glicerinei n mediul de diluie, cele mai bune rezultate, referitoare la nivelul fecunditii scroafelor nsmnate, s-au obinut atunci cnd concentraia crioprotectorului n sperm a fost de circa 2-3%. O alt problem care reduce rspndirea nsmnrilor artificiale cu sperm congelat const n randamentul slab al acestei metode, supravieuirea spermatozoizilor se situeaz, n medie, ntre 30% i 40%, ceea ce nseamn c dintr-un ejaculat nu se pot face mai mult de 3-4 nsmnri. De asemenea, prolificitatea scroafelor nsmnate cu sperm congelat este mai sczut. Crioconservarea spermei de vier se practic n mai multe variante, neconcentrat sau concentrat, fie sub form de granule, fie sub form de paiete mari cu volum de 2,0-2,5 ml etc. Fiecare centru de recoltare, examinare i prelucrare i are propria metod de congelare, ns trebuie s precizm faptul c, datorit dezavantajelor menionate, la care se adaug i laboriozitatea accentuat a tehnologiei de congelare a spermei, crioconservarea spermei de vier nu d ntodeauna rezultate bune i de aceea nu cunoate o rspndire larg. Dintre metodele folosite n prezent, menionm pe cea care este rspndit n unele centre de nsmnri artificiale din SUA, Canada, Anglia, Germania, unde se congeleaz sperm de vier n scopuri comerciale (Dumitrescu I. i colab.,1978). Se folosete un diluant constituit din TES, TRIS, glucoz i glbenu de ou (20%), preparat cu 24 de ore nainte de folosire i meninut la frigider. nainte de folosire, diluantul se centrifugheaz, iar supernatantul se folosete ca diluant, fiind mprit n dou pri egale: o parte este folosit la temperatura camerei pentru prima diluie, dup ce i s-a adugat 2% glicerin, iar a doua parte se menine la frigider pentru a se realiza cea de a doua diluie. Mediul n care se face decongelarea este constituit din glucoz, citrat trisodic, bicarbonat de sodiu, sare disodic de EDTA, clorur de potasiu. Sperma, dup recoltare i examinarea calitativ, este lsat s se rceasc 2-3 ore la temperatura laboratorului, timp n care se adaug antibioticele necesare. Sperma se transfer n fiole de centrifug, apoi se centrifugheaz 10 minute la 1500 rotaii /minut pn cnd sperma se separ de plasma seminal. Supernatantul este eliminat apoi se adaug n eprubete o cantitate mic de diluant fr glicerin, la 200C. Spermatozoizii sedimentai sunt amestecai uor cu o baghet de sticl i sperma n suspensie se transfer ntr-un cilindru gradat de 100 ml. Se adaug din nou o cantitate de diluant fr glicerin, n aa fel nct s se ajung la jumtate din volumul final. Cilindrul gradat cu sperm diluat se plaseaz ntr-un vas de 250 ml care conine circa 50 ml de mediu lichid la 20oC i amndou se introduc la frigider timp de dou ore, astfel nct temperatura amestecului de sperm s scad la 8oC. Se face a doua diluie cu diluant ce conine 2% glicerin, adugndu-se diluantul pn ce se ajunge la volumul final, diluia fcndu-se n condiii de izotermie.

47

Sperma se depune n excavaiile practicate n blocul de zpad carbonic, formndu-se pastile de 0,1-0,2 ml fiecare. Dup 3-5 minute, pastilele din sperm se colecteaz ntr-o plnie cu azot lichid, se apreciaz calitatea spermei i dac mobilitatea spermatozoizilor este de minimum 20% pastilele se transfer n eprubete (150/16 mm) marcate cu datele necesare identificrii vierului, apoi fiolele se trec ntr-un container cu azot lichid. Fiecare fiol conine 10 pastile cu sperm. La noi n ar, un colectiv de specialiti de la SEMTEST Baloteti, a folosit congelarea spermei de vier n paiete din plastic cu capacitatea de 2,5 ml, cu 2,5 miliarde de spermatozoizi/paiet, care s-a precongelat n vapori de azot lichid. n ara noastr nc nu este elaborat o tehnologie specific de lucru care s garanteze o fecunditate corespunztoare a femelelor nsmnate. 1.6.4. Conservarea spermei de armsar La armsar, sperma se recolteaz la interval de dou zile, se examineaz i cea care corespunde calitativ se dilueaz imediat la +32oC, astfel nct s se asigure o concentraie de 20X106 spermatozoizi/ml, doza fiind format din 20 ml, ceea ce nseamn c se asigur circa 400 de milioane de spermatozoizi mobili/doz. Cele mai eficiente antibiotice folosite sunt penicilina i gentamicina. Dintr-un ejaculat pot rezulta n medie 30 de doze. Scderea temperaturii trebuie s se fac treptat. Astfel, sperma diluat la +32oC se menine 20-30 de minute la temperatura laboratorului i apoi dozele cu sperm se introduc la frigider. Sperma este distribuit n fiole sau cel mai frecvent n tuburi cu volum de 20 ml. Fiolele sau tuburile se nchid ermetic i se menin la frigider, capacitatea fecundant fiind asigurat doar pe un interval de 24 de ore (conservarea prin refrigerare). Conservarea spermei prin congelare Oricare ar fi mediul de diluie, se constat o mortalitate ridicat a spermatozoizilor la congelare, dar i o reducere a capacitii fecundante a spermatozoizilor mobili (Palmer E. i colab., 1984). Rezistena spermatozoizilor la congelare variaz mult cu particularitile individuale ale armsarilor. Cel mai ridicat procent de supravieuire a spermatozoizilor la congelare s-a observat la armsarii care dau o sperm concentrat i cu volum redus. Congelarea spermei se realizeaz prin diluare i scderea temperaturii. Sperma diluat pentru congelare se ambaleaz n tuburi metalice sau din material plastic, pstrate n azot lichid. Tuburile metalice sunt confecionate din aluminiu, au o lungime de 12 cm, diametrul de 2,5 cm, nchise ermetic. Mediul de diluie preconizat de Busch i colab.,1982 are urmtoarea compoziie: ap bidistilat 10 ml, glucoz 11 g, EDTA (sare de etilen-diamintetraacetil- bisodic) 100 mg, hidrocarbonat de sodiu (soluie apoas 2%) 0,2 ml, soluie de citrat de sodiu 0,25 ml, glbenu de ou 2 ml, glicerin 3,5 ml, 500000 U.I. penicilin i 0,5 g streptomicin. Sperma este lsat s sedimenteze, iar fraciunea bogat n spermatozoizi meninut n baia-marie la 32oC, se amestec cu diluantul meninut la aceeai temperatur. Sperma se pstreaz la temperatura camerei timp de 30 minute, apoi se introduce n tuburile de aluminiu cu o capacitate de 20 ml. Dup umplere, tuburile se nchid ermetic, se in la frigider (24o) dou ore pentru echilibrare. Sperma se dilueaz la aceast temperatur n raport de 1/3-1/4. Tuburile se introduc n vapori de azot lichid (precongelare) la temperatura de -120oC, unde se menin 3-6 minute, apoi sunt scufundate direct n azot lichid (-196oC).
48

a) Congelarea spermei n tuburi de material plastic Martin i Klug (1979) au folosit tuburi cu o capacitate de 4 ml. Diluarea se face n doi timpi: n prima etap se face diluia n raport de 1/1, la temperatura de 30-32oC, apoi amestecul se centrifugheaz 5 minute (1000 rotaii/minut). Supernatantul se nltur, apoi sperma rmas se amestec cu un alt diluant la temperatura de 2-4oC, urmeaz echilibrarea 3-4 ore la acest nivel de temperatur, apoi sperma se repartizeaz n tuburi din material plastic care se nchid i la cellalt capt cu pudr de alcool polivinilic sau prin alt procedeu. Congelarea se face n acelai fel ca pentru tuburile de aluminiu. b) Congelarea spermei n granule (pastile) nu a dat rezultate satisfctoare pn n prezent, fecunditatea iepelor nsmnate cu sperm congelat n granule oscilnd ntre limite foarte largi (11-60%, Oshida i colab., 1966; Knoop, 1976), fapt ce a dus la aplicarea din ce n ce mai redus a acestui procedeu. Tehnologia prevede diluia i centrifugarea spermei, nlturarea supernatantului, iar sperma rmas se repartizeaz n alveole practicate pe un bloc de zpad carbonic i apoi introducerea n tuburi i scufundarea n azot lichid unde se pstreaz. 1.6.5. Conservarea spermei de psri Sperma diluat i poate menine capacitatea fecundant circa 24 de ore dac temperatura de pstrare se situeaz la un nivel de 12-15oC, la coco i curcan, cu condiia ca oxigenarea spermei s fie meninut tot timpul pstrrii. Congelarea spermei la psri ntmpin unele dificulti: - degradarea membranei spermatozoizilor cauzat de apariia de microcristale i deshidratarea care intervine n momentul congelrii spermei; - fenomene de toxicitate datorate creterii concentraiei intracelulare a soluiilor. Sperma se dilueaz n raport de 1/1, se rcete progresiv pn la 4oC cnd se adaug restul cantitii de diluant care conine substan crioprotectoare (glicerol, DMSO-dimetil sulfat oxid, dimetil acetamid 4%). Congelarea propriu-zis se face n azot lichid, sperma fiind ambalat n fiole, paiete sau pastile. Cele mai bune rezultate s-au obinut cu sperma conservat n paiete. Stocajul are loc n azot lichid. Lake, respectnd aceste condiii, a obinut o fecunditate de 93%, ns a efectuat 4 nsmnri artificiale n 10 zile, ceea ce a totalizat 1,2 miliarde de spermatozoizi, cam de 6-10 ori mai mult dect atunci cnd se folosete sperma brut. Rezultatele lui Sexton, care a folosit DMSO se situeaz la un nivel mai sczut (40-60%), cu variaii mari de la un mascul la altul. 1.7. Inocularea spermei Constituie ultima etap n biotehnologia nsmnrilor artificiale i const n depunerea materialului seminal, n prealabil recoltat, examinat, prelucrat i conservat sau brut, pe traiectul cilor genitale ale femelelor n estru. Inocularea prin mijloace artificiale trebuie s in seama de particularitile fiziologice ale locului de depunere a spermei prin mont, sperma urmnd a fi depus cel puin la nivelul segmentului genital femel unde este depus fiziologic. Prin nsmnare artificial se ntrebuineaz numai sperma care a corespuns unor parametri minimi de calitate i care provine de la reproductori valoroi.
49

Funcie de locul unde se depune, inocularea poate fi: - vaginal, care se aplic la mioare i viele; - cervical, aplicabil la oi si vaci; - uterin, practicat la iap i scroaf; - tubar, se aplic la psri. 1.7.1. Inocularea spermei la vac Indiferent de forma de proprietate a efectivelor de taurine, nsmnarea artificial presupune existena unei scheme organizatorice adecvate, structura organizatoricsi atributiile institutiilor fiind prezentate n primul capitol. 1.7.1.1 Punctul de nsmnri artificiale la vaci (P.I.A.V.) Punctul de nsmnare artificial a vacilor este subunitatea-verig a ntregii reele de reproducie a animalelor, prin a crei activitate se concretizeaz ntregul proces de reproducie la taurine din sectorul de stat, asociativ sau individual. Punctul de nsmnare artificial a vacilor este amenajat la nivelul fiecrei comune sau ferme de vaci, este ncadrat cu un tehnician sau operator nsmntor cruia i revin sarcinile pe linia reproduciei i seleciei efectivelor de animale arondate punctului de nsmnri artificiale. n condiiile extinderii iniiativei particulare n creterea i exploatarea efectivelor de taurine, funcioneaz i operatori nsmntori, autorizai de instituiile abilitate n acest sens, care s efectueaza pe cont propriu aciunile de nsmnare a animalelor. De regul, punctul de nsmnare artificial este amplasat ntr-un adpost al fermei sau pe lng circumscripiile sanitar-veterinare, fiind dotat cu instrumentarul si aparatura necesare aplicarii insamantarii artificiale. Aprovizionarea cu material seminal congelat la nivelul punctelor de nsmnare artificial se face prin serviciul specializat la nivelul UARZ sau a Centrelor de Reproducie i Selecie a Animalelor. 1.7.1.2. Descoperirea femelelor n clduri i stabilirea momentului optim al nsmnrii Identificarea femelelor n clduri constituie o aciune important pentru succesul nsmnrii artificiale. Modificarile morfofiziologice ale segmentelor aparatului genital si de comportament au fost descrise in cadrul disciplinei de Reproductie, capitolul Ciclul sexual. Semnul concludent al strii de estru se consider atunci cnd femela respectiv accept, fr tendina de a fugi, saltul altor femele sau masculi cu care st mpreun, acest moment considerndu-se a fi optim pentru nsmnarea artificial. Vulva, vestibulul vaginal i vaginul sunt congestionate, labiile vulvare sunt edemaiate, dispar pliurile vulvare, clitorisul se evideniaz. Printre labiile vulvare se scurge un mucus translucid, filant, care poate s se ntind de la comisura inferioar a vulvei pn la pmnt. La mijlocul perioadei de estru, cantitatea de mucus crete i are o elasticitate maxim, ceea ce constituie alt semn specific de clduri (fig. 4). Descoperirea vacilor n clduri trebuie s se fac cu mult profesionalism pentru a se evita pierderile de cicluri, care se pot ridica la 20-30%. Depistarea trebuie
50

s se fac de dou ori pe zi , dimineaa i seara.n complexele de vaci, depistarea cldurilor ridic unele probleme nu numai datorit efectivului mare de animale care trebuie urmrite zilnic, dar i datorit semnelor clinice, deseori mai terse. Pentru creterea eficienei n descoperirea vacilor n clduri se pot folosi n astfel de uniti, masculi biostimulatori (epididimotomizai, deferotomizai sau cu deviere de penis).n acest caz se consider suficient un taur biostimulator pentru 100-200 de vaci.n majoritatea cazurilor, descoperirea femelelor n clduri se face numai pe baza modificrilor morfo-fiziologice i de comportament din stadiul de estru. De asemenea, n alegerea momentului optim al nsmnrii, este necesar s se urmreasc cu atenie evoluia perioadei puerperale, astfel nct s se previn mbolnvirile, care sunt frecvente n aceast etap, iar puerperiumul s se desfoare fiziologic. Majoritatea autorilor recomand ca nsmnarea artificial s se fac cel mai devreme ntre 45-50 de zile de la ftare, n funcie de modul cum decurge perioada puerperal, de nivelul produciei de lapte etc, tiut fiind c femelele care dau o producie mare de lapte se nsmneaz prima dat dup un interval de cel puin 60 de zile de la parturiie. nsmnarea vacilor descoperite n estru trebuie s se fac imediat dup depistarea cldurilor i apoi s se repete dup 8-10 ore, avnd n vedere durata estrului, momentul ovulaiei, viabilitatea gameilor pe traiectul cilor genitale femele.

51

Fig. 4 Perioada optim pentru nsmnarea artificial a vacilor

1.7.1.3. Pregtirea femelelor pentru nsmnare Const n notarea de ctre operatorul nsmntor a numrului matricol, grajdul i lotul din care fac parte vacile ce urmeaz a fi nsmnate. Identitatea femelei este cutat n registru, cu care ocazie este analizat i interpretat starea ginecologic a femelei. Cu aceast ocazie se nscrie nsmnarea n registru i se face i programarea urmririi peste 18-23 de zile a eventualei reintrri a femelei n clduri. Pregtirea instrumentarului pentru nsmnare ine seama de tehnica de nsmnare folosit i de modul n care este ambalat materialul seminal (refrigerat, congelat n paiete, fiole sau granule). n cazul n care se practic metoda colposcopic de nsmnare, speculul va fi sterilizat prin fierbere, timp de 10-15 minute, se verific funcionarea sursei de lumin, se asigur lubrifierea cu vaselin neutr. Pentru nsmnare, speculul vaginal se nclzete pn la aproximativ 45-50oC, apoi se lubrifiaz cu vaselin neutr. Se pregtete pipeta de nsmnare si registrul de nsmnare, ap cald, o soluie aseptizant, mnuile de plastic, etc. n instituia n care se practic nsmnarea tactil-recto-cervical (rectovaginal) se pregtesc evidenele, soluiile i substanele aseptizante, mbrcmintea de lucru i mnuile de plastic pentru exploraie.n funcie de materialul seminal folosit, se va pregti o pipet din sticl sau din material plastic, un pistolet Cassau sau o pipet universal de tip SEMTEST. 1.7.1.4. Reanimarea spermatozoizilor Presupune scoaterea dozei de nsmnare din cutia care se gsete n termosul cu ghea i lsarea ei la temperatura camerei timp de cteva minute, ntr-un stativ de lemn pregtit special n acest scop (n cazul n care se folosete sperma conservat prin refrigerare). n cazul folosirii spermei conservate prin congelare se recomand: - decongelarea ct mai rapid a dozei cu material seminal; - ntre decongelare i nsmnare curba de temperatur a spermei s fie n continu cretere; - un interval de timp ntre decongelare i nsmnare ct mai scurt (maximum 15 minute); - instrumentarul folosit pentru nsmnare s aib aceeai temperatur ca sperma; - canistrele din containere s nu fie ridicate la o nlime mai mare de 3-4 cm sub nivelul superior al containerului. Extragerea dozei trebuie fcut foarte rapid, prin intermediul unei pense. Indiferent de prelucrarea iniial a spermei congelate i forma sub care se gsete, pentru decongelare este nevoie de un termos cu o baie marin de 36-40oC i un termometru. n funcie de modul de prezentare a spermei congelate, pentru reanimarea spermatozoizilor este necesar parcurgerea unor etape de lucru specifice. n cazul conservrii spermei n fiole, se parcurg etapele: - pregtirea bii marine la 38oC; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei pn la gtul containerului, extragerea fiolei, cufundarea ei n baia marin; - decongelarea materialului din fiole dureaz 2 minute; - tergerea i uscarea fiolei;
52

- deschiderea fiolei prin secionarea gtului acesteia; - aspirarea spermei n pipet; - nu se decongeleaz n acelai timp mai multe fiole, iar absorbia materialului seminal decongelat se face cu instrumentarul nclzit. n cazul conservrii spermei n paiete se au n vedere urmtoarele etape de lucru: - pregtirea bii marine la temperatura de 34-37oC; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei pn la cel mult 3-4 cm sub nivelul superior al containerului, scoaterea paietei, scuturarea ei de eventualele resturi de azot i cufundarea n baia marin; decongelarea dureaz 13 secunde pentru paieta mijlocie i 8 secunde pentru paieta fin; - reaezarea canistrei i nchiderea containerului; - nclzirea, prin frecare cu hrtie sau vat, a pipetei sau pistoletului de nsmnare; - scoaterea paietei din baie, uscarea ei prin tergere cu tifon sau prosop; - transferarea bulei de aer ctre captul astupat cu dopul de laborator prin lovirea uoar a corpului paietei; - introducerea paietei n pistoletul sau pipeta de nsmnare; - tierea captului paietei cu o seciune perpendicular pe axul longitudinal, la mijlocul bulei de aer. Se recomand s nu se decongeleze mai multe paiete n acelai timp. n cazul conservrii spermei n granule se parcurg etapele: -pregtirea bii marine la temperatura de 38-40oC; aezarea pe stative, n baia marin a unor fiole goale deschise cu o capacitate de 2,0-2,5 ml, asemntoare celor folosite la ambalarea materialului seminal refrigerat; -introducerea n fiecare fiol a cte 1,0 ml soluie de citrat de sodiu 2,9% steril (soluie extender) n care se decongeleaz granulele; att fiolele cu soluia extender, ct i fiolele goale trebuie s fie introduse n baia marin la jumtatea nlimilor; -deschiderea containerului, ridicarea canistrei pn la gtul containerului; ridicarea ambalajului cu granule pn la nivelul de unde se extrage cu pensa dopul de pnz-tifon (granulele se gsesc tot timpul sub nivelul azotului din container); -rcirea vrfului pensei sau tijei linguri, timp de 10-15 secunde, n azot lichid; extragerea cu ajutorul pensei rcite a unei singure granule i plasarea rapid a acesteia n fiola cu soluie-extender; -agitarea uoar a fiolei pentru omogenizarea spermei cu diluantul. 1.7.1.5. Tehnica inoculrii spermei Inocularea materialului seminal se realizeaz prin dou metode: metoda colposcopic (sau cu speculul vaginal); metoda tactil-recto-cervical (sau recto-vaginal). Metoda colposcopic Inocularea materialului seminal prin aceast metod se bazeaz pe introducerea pipetei de nsmnare pe lumenul cervical, prin conductul vestibulovaginal tunelizat cu ajutorul unui specul bivalv, trivalv sau tubar. Unele modele de specul tubar sunt prevzute cu surse propri de lumin. La celelalte modele, pentru
53

iluminarea conductului vaginal i a zonei pericervicale se ntrebuineaz o lamp frontal sau lantern. La inocularea spermei prin aceast metod se va proceda astfel: - vaca n clduri se contenioneaz ntr-un stand i se execut toaleta organelor genitale externe cu ap i spun; - speculul vaginal, dezinfectat, nclzit i lubrifiat cu vaselin neutr sterilizat, se introduce cu partea lit n fanta vulvar. Introducerea se face din jos n sus, ntr-un unghi de aproximativ 35-40oC, prin micri uoare i repetate n plan vertical, asociat cu mpingerea prudent ctre nainte. Dup introducerea complet a speculului, se efectueaz o rotire de 90oC (pentru speculul trivalv) dup care se ndeprteaz valvele; - se lumineaz conductul vestibulo-vaginal cu ajutorul lmpii frontale sau a sursei proprii de lumin; - se examineaz conductul vestibulo-vaginal, floarea involt i se localizeaz deschiderea cervical, dup care se introduce pipeta de nsmnare n conductul cervical; - depunerea spermei se face n partea anterioar a cervixului prin presarea ntre degete a suzetei sau prin apsarea tijei piston urmat de un uor masaj clitoridian. Avantaje: - posibilitatea examinrii mucoasei vestibulo-vaginale i cervicale i buna observare a caracteristicilor mucusului cervical; - permite localizarea cu uurin a cervixului; permite depistarea unor eventuale anomalii sau afeciuni ale vaginului i cervixului; - este mai estetic i mai comod pentru operator. Dezavantaje: - necesit contenionarea femelelor ntr-un stand special pentru nsmnare; - impune dezinfecia speculului pentru a se evita transmiterea germenilor patogeni de la un animal la altul; - prin aplicarea acestei metode nu se obin informaii privind starea uterului i a ovarelor, stadiul de evoluie al foliculilor ovarieni etc; - introducerea speculului cu brutalitate creaz reflexe de inhibiie sau poate stresa animalul. Datorit acestor dezavantaje, aceast metod este mai puin folosit n prezent. Metoda tactil-recto-cervical (recto vaginal) Impropriu denumit i bimanual, aceast metod este aproape generalizat n practica nsmnrilor artificiale la taurine. Aceast metod, sigur i eficace, permite executarea nsmnrii la animalele legate la iesle, n grajd, n adposturi cu stabulaie liber sau n padocuri. Se deosebete de metoda colposcopic prin aceea c depunerea materialului seminal n organele genitale femele se realizeaz numai cu ajutorul pipetei (pistoletului) de nsmnare, fr a folosi speculul vaginal. Metoda tactil-recto-cervical necesit ns o pregtire corespunztoare a personalului autorizat s efectueze nsmnarea, care trebuie s cunoasc topografia i modificrile morfofiziologice ale organelor genitale. Persoanele neinstruite n acest scop pot cauza, prin manipulri brutale, rupturi, lezionri sau perforri ale conductului genital, iar datorit necunoaterii topografiei organelor

54

genitale, materialul seminal poate fi depus ntr-un fald al mucoasei vaginale sau pericervicale, ratndu-se n acest fel nsmnarea. Inoculara materialului seminal prin aceast metod necesit efectuarea urmtoarelor operaiuni: - vidarea rectului, cu un uor masaj pentru eliminarea contraciilor rectale, operaiuni care se efectueaz cu mna protejat de o mnu de polietilen; - se apreciaz forma, topografia, dimensiunile, sensibilitatea i consistena coarnelor i corpului uterin; - se ndeprteaz labiile vulvare i se deschide vestibulul vaginal prin compresiunea exercitat prin traversul rectului; - se introduce pipeta printre labiile vulvare sub un unghi de 30-40oC n conductul vaginal; - se urmrete, cu mna introdus n rect, micarea de naintare a pipetei pn la nivelul orificiului vaginal al cervixului, pentru a se preveni introducerea vrfului pipetei ntr-un fald al mucoasei vaginale; - dac uterul este normal, se continu naintarea pipetei prin cervix, dup ce anterior, a fost localizat deschiderea acestuia cu ajutorul degetului mic de la mna introdus n rect; - se fixeaz cervixul, urmrind cu degetele trecerea vrfului pipetei pn ce ptrunde n corpul uterin pe o distan de 2-3 cm; - materialul seminal se depune la extremitatea anterioar a cervixului i n corpul uterin prin compresarea suzetei ntre degete sau mpingerea tijei-piston; - inocularea spermei prin aceast metod se ncheie prin efectuarea unui uor masaj clitoridian pentru a se preveni spasmul uterin i a facilita descrcrile hormonale necesare ascensiunii spermatozoizilor pe traiectul cilor genitale femele (foto. 17). n unele cazuri se poate practica nsmnarea tactilcervical, care const n introducerea unei mini protejate de o mnu n conductul Foto 17 Inocularea spermei la vac vestibulo - vaginal, reperarea prin metoda tactil recto cervical cervixului, iar cu cealalt mn se introduce cu precauie, pipeta de nsmnare pn la nivelul orificiului cervical. 1.7.2. Inocularea spermei la oaie i capr 1.7.2.1.Organizarea punctului de nsmnare artificial la ovine (P.I.A.O.) Organizarea i desfurarea aciunii de nsmnare artificial la ovine i caprine se realizeaz sub coordonarea i ndrumarea Direciilor Judeene de Ameliorare i Reproducie i a Centrelor teritoriale de profil, care asigur dotarea i funcionarea laboratorului de recoltare, prelucrare i difuzare a materialului seminal i a punctelor de nsmnare artificial. (P.I.A.O. i P.I.A.C.). Punctele de nsmnri artificiale sunt amplasate astfel nct efectivele de oi pe care le
55

deservesc s nu se deplaseze la punat pe o raz mai mare de 1,0-1,5 Km. De altfel, aciunea de nsmnare artificial se pregtete temeinic cu cel puin 1,52,0 luni de zile nainte de a fi declanat campania i se va desfura pe durata a cel puin dou-trei cicluri de clduri (45-50 de zile). n ara noastr, este rspndit nsmnarea artificial cu sperm brut sau diluat, motiv pentru care, n aceeai unitate trebuie s se gsesc, pe lng efectivul de femele i efectivul de berbeci pepinieri, donatori de material seminal pentru efectuarea nsmnrii oilor. Berbecii folosii la nsmnri artificiale sunt alei dintre: - cei provenii din import, cu certificat de origine i productivitate; - cei testai ca amelioratori aparinnd raselor importate i indigene zonate, precum i exemplarele cu performane proprii superioare din efectivul valoros, apreciate la bonitare. Perioada de pregtire a berbecilor pepinieri dureaz circa ase sptmni i const n asigurarea unei raii de hran adecvate cerinelor nutritive pentru reproducie, aprecierea comportamentului sexual i a calitii spermei. Se asigura cte un reproductor adult pentru 100 de femele n cazul nsmnrii cu sperm brut i 300 de femele n cazul folosirii spermei diluate i conservat prin refrigerare. Pregtirea oilor i caprelor pentru campania de nsmnri artificiale const n asigurarea unei furajri stimulative i difereniate, n funcie cu starea lor de ntreinere.nrcarea oilor i caprelor mulgtoare se practic cu circa o lun naintea declanrii campaniei de nsmnri artificiale prin ntreruperea treptat a mulsului. Se verific i individualizarea femelelor, acolo unde este cazul completndu-se crotaliile pierdute. Pe baza examenului individual, zootehnic i sanitar-veterinar, se constituie loturile (turmele) pentru nsmnarea artificial, avndu-se n vedere rasa, vrsta, starea de ntreinere. Mrimea unei turme trebuie s fie de 300-400 oi. Cu circa o lun naintea campaniei de nsmnri artificiale, oile i caprele vor fi ntreinute pe puni bune, raia de baz fiind suplimentat cu nutreuri concentrate, aa-numitul flushing care influeneaz pozitiv nivelul indicilor de reproducie. Efectivul mediu deservit de un P.I.A.O. este de 1000-1200 de femele, cu durata aciunii pe perioada a 50-60 de zile. Pentru o bun activitate, P.I.A.O. sau P.I.A.C. trebuie s dispun de urmtoarele spaii i utiliti: o camer pentru laborator, un spaiu pentru recoltarea spermei i nsmnarea artificial a femelelor descoperite n clduri, padocuri pentru berbeci ncerctori, oile depistate n clduri, oile nsmnate artificial, berbecii pepinieri i arcurile n care se face depistarea oilor i caprelor n clduri. Laboratorul va fi dotat cu un minim necesar de aparatur pentru examenul prelucrarea i refrigerarea spermei. Camera de recoltare-nsmnare este dotat cu: un stand pentru contenia oilor ce urmeaz a fi nsmnate, cu dimensiuni i tipuri constructive adaptate acestei specii, vaginuri artificiale, autoclave pentru sterilizarea aparaturii folosite, speculum vaginal, surs de lumin, materiale consumabile necesare. 1.7.2.2. Depistarea oilor i caprelor n clduri Depistarea oilor n clduri constituie o activitate destul de complicat n aplicarea biotehnologiei nsmnrilor artificiale.
56

Dificultile sunt datorate faptului c oile triesc n crduri mari, n care sunt greu de urmrit individual. Semnele de estru sunt greu observabile pentru om, comparativ cu semnele mult mai evidente manifestate la taurine i cabaline. Izolarea oilor n clduri i recunoaterea lor pentru nsmnare artificial necesit un mare volum de munc, dereglri ale activitii curente din ferm, fapt ce a ngreunat, n multe ri, extinderea nsmnrilor artificiale la aceast specie. nsmnarea artificial se bazeaz pe descoperirea oilor n clduri prin intermediul berbecilor ncerctori. Berbecii i apii ncerctori trebuie s aparin aceleiai rase cu femelele care urmeaz a fi nsmnate. Acetia sunt autorizai i verificai sub raportul calitii materialului seminal pentru a putea fi folosii i la monta, dup ncheierea campaniei de nsmnri artificiale, oilor care nu au rmas gestante i manifest estrul n afara intervalului de timp alocat aa-numitei campanii de nsmnri artificiale. Alegerea oilor i caprelor n clduri se face de dou ori/zi, dimineaa i seara, perioade din zi cnd manifestarea cldurilor este mai intens, iar berbecii i apii sunt mai activi n cutarea femelelor. ncerctorul este un mascul cu reflexe sexuale bine exprimate, care este introdus printre oile care urmeaz a fi nsmnate, ns este mpiedicat s efectueze depunerea spermatozoizilor pe traiectul cilor genitale femele. Se consider c femela este n clduri i este reinut pentru nsmnare artificial, atunci cnd accept saltul berbecului sau apului, stnd linitit. Se folosesc trei feluri de berbeci ncerctori i anume: - berbeci normali, ns echipai cu un or care acoper furoul, mpiedicnd ptrunderea penisului n vaginul oilor pe care execut saltul (fig. 5); - berbeci cu penis deviat, la care, printro intervenie chirurgical, s-a schimbat direcia penisului spre partea lateral a corpului, astfel nct, s nu mai ptrund n conductul vestibulovaginal; acetia s-au dovedit a fi mai puin eficieni, deoarece imposibilitatea ejaculrii le confer un anumit grad de nervozitate I o mai slab eficien a descoperirii oilor n clduri; Fig. 5 Berbec ncerctor prevzut cu ort - berbeci vasectomizai, la care, tot chirurgical, s-a secionat epididimul sau canalul deferent, blocndu-se astfel eliminarea spermatozoizilor din testicul, nct pot monta, sperma fiind lipsit de spermatozoizi. Pentru a asigura o rat optim de depistare a oilor n clduri, ncrctura medie va fi de 30-40 de femele pentru un mascul.n vederea unei descoperiri cu un volum mai redus de munc, berbecul ncerctor se echipeaz, n zona pectoral, cu un cartu marcator special ce conine o vopsea lavabil, cartu, care, n momentul saltului, vine n contact cu crupa femelei, iar la coborre vopsete lna.n lipsa cartuului, oile depistate n clduri vor fi marcate cu ovisemn de ctre personalul muncitor. Femela se consider n clduri atunci cnd la apropierea berbecului sau apului ia poziie campat, urineaz des i ntoarce capul spre flanc, se imobilizeaz cnd masculul face saltul i caut berbecul sau apul. Pentru descoperirea oilor in calduri, acestea se introduc in padoc impreuna cu berbecii incercatori, modul de identificare fiind prezentat anterior. Dup ce berbecii ncerctori nu mai sunt activi n descoperirea oilor n clduri, se retrag din crd, se nchid separat i oile pornesc la punat.
57

Oile alese n clduri sunt inute ntr-un lot separat pn sunt nsmnate, inclusiv pn se repet nsmnarea. Un mijloc mai modern pentru provocarea i evidenierea estrului este reprezentat de sincronizarea cldurilor prin diverse procedee prin intermediul crora se poate determina inducerea cldurilor la un moment prestabilit (vezi capitolul Sincronizarea estrului). Aceasta nseamn c nsmnarea artificial se poate face, la oile supuse tratamentului de sincronizare, fr a se mai efectua alegerea celor n clduri.n funcie de tratamentul de sincronizare aplicat, nsmnarea tuturor oilor sincronizate, se face dup un anumit interval de timp, de la ncheierea tratamentului, strict prestabilit, cu rezultate satisfctoare. 1.7.2.3. Inocularea materialului seminal Inocularea spermei brute, diluat i consevat prin refrigerare sau congelare, se face prin trei metode: - colposcopic (specul vaginal); - vaginal (pericervical, fr specul); - tactil cervical. Lucrrile pregtitoare se refer la pregtirea aparaturii de inoculare, inclusiv sterilizarea instrumentarului necesar, pregtirea locului de lucru. Contenia oilor se poate realiza ntr-un stand cu orientare rabatabil ce permite ridicarea trenului posterior al oii i la parapet sau gard, fixarea oii fcndu-se cu/pe genunchiul unui ngrijitor. Mai rspndit este standul orizontal, aezat la sol iar pentru mai mult comoditate, operatorul se poate aeza ntr-un an practicat n spatele standului de contenie. Pentru inoculare avem nevoie de o sering, alctuit dintr-un corp metalic, piston i canul din sticl, pistonul fiind prevzut cu un cursor cu ajutorul cruia se regleaz volumul dozei. Se mai folosesc i alte pipete de nsmnare, cu canula schimbabil, semiautomat, cu o singur ncrctur putndu-se nsmna 20-30 de oi.n cazul folosirii paietelor cu material seminal congelat, dup decongelarea acestora, paietele se introduc n pistoletul special construit, asemntor celui folosit pentru taurine. Aparatura auxiliar const dintr-un specul vaginal, tri- sau bivalv i o surs de lumin. nsmnarea oilor se face imediat dup descoperirea n clduri i se repet la interval de 7-12 ore. Metoda colposcopic Dup pregtirea instrumentarului, femela n clduri se introduce n camera de nsmnare i se contenioneaz n stand. Se efectueaz toaleta regiunii perii vulvare i se aspir sperm n sering. Speculul, sterilizat si nclzit la temperatura de 38-39oC, se lubrifiaz cu vaselin neutr, se introduce n conductul vestibulo vaginal cu limea pe direcia fantei vulvare. Dup introducerea cu atenie, speculul se rotete cu 90o, se deschide i se repereaz orificiul cervica Fig. 6 Inocularea spermei la oaie (fig. 6). prin metoda colposcopic
58

n cazul folosirii spermei diluate, doza de nsmnare este de 0,2 ml, iar cnd se face nsmnarea cu sperm brut, doza este de 0,1 ml pentru oi i capre i de 0,2 ml pentru mioare. Numrul de spermatozoizi mobili/doz trebuie s oscileze ntre 200-250 de milioane. Femelele depistate n clduri se nsmneaz imediat cu repetare la 8-12 ore. Femelele cu cicluri prelungite (dou-trei zile) se nsmneaz n fiecare zi, pe toat durata cldurilor. Metoda vaginal (pericervical, fr specul) const n urmtoarea tehnic: -contenia femelei se face n standul cu orientare rabatabil sau prin simpla prindere a femelei de ctre personalul ajuttor i ridicarea trenului posterior; - toaleta regiunii vulvare i perivulvare; -introducerea pipetei de nsmnare intravaginal i prin micri de tunelizare, rotire i naintare pn la nivelul orificiului cervical, sperma depunndu-se pericervical (fig. 7). Metoda tactil-cervical, n Fig. 7 Inocularea spermei la oaie care dirijarea canulei seringii de prin metoda vaginal inoculare spre orificiul cervical se face cu ajutorul degetului arttor al operatorului, femela fiind ridicat de trenul posterior. Cnd se face nsmnarea artificial cu sperm brut, se folosete sperma cu mobilitate de cel puin 70%, cu un volum minim al ejaculatului de 0,6 ml i o concentraie de peste un miliard de spermatozoizi/ml. nsmnarea artificial cu material seminal congelat se practic foarte puin la aceste specii, ntruct rezultatele obinute sunt slabe. Pentru nsmnarea artificial a oilor cu material seminal congelat, n prealabil trebuie s se fac decongelarea, dup aceeai tehnic descris la taurine i apoi s se inoculeze.nainte de nsmnare se face controlul mobilitii spermei, care trebuie s fie de minim 35%. Tehnica de inoculare a spermei decongelate este identic cu cea aplicat la nsmnarea artificial cu sperm brut sau cu sperm refrigerat. O paiet conine 0,5 ml sperm, respectiv dou doze de nsmnare, o fiol conine circa 1 ml sperm (4-6 doze) iar o granul 0,1 ml (o doz). 1.7.3. Inocularea spermei la scroaf 1.7.3.1. Organizarea i dotarea punctului de nsmnare artificial (P.I.A.S.) cu activitate complex Optimizarea procesului de reproducie la porcine prin nsmnare artificial presupune urmtoarea structur organizatoric: - centrul de recoltare, prelucrare, conservare i difuzare a spermei, organizat n cadrul Centrului de Reproducie i Selecie a Animalelor, atunci cnd femelele sunt dispersate pe o zon mai extins, ceea ce necesit transportul dozelor de sperm pn la proprietarul scroafelor;
59

- punctul de nsmnare artificial cu activitate complex: recoltare, prelucrare i nsmnare artificial, n complexele de creterea suinelor, n uniti i ferme familiale cu un efectiv de 300-400 de scroafe i scrofie de reproducie. n ambele cazuri trebuie s existe spaii i utiliti necesare unei bune activiti: - compartimente comune pentru vierii tineri, candidai pepinieri i cu boxe individuale pentru vierii folosii la reproducie (pepinieri); - sala de recoltare, prevzut cu una sau mai multe boxe de recoltare, instalaii cu duuri de mn cu ap cald, pentru toaleta general i local a vierilor; - laboratorul, dotat cu minim de aparatur i instrumentar, necesare pentru operaiunea de recoltare, examenul, prelucrarea, ambalarea i conservarea spermei; - compartimente comune pentru scroafele n ateptare i individuale pentru cele care trebuie nsmnate i nsmnate recent (dou-trei sptmni dup nsmnare). Sperma recoltat se examineaz n laborator, se dilueaz, repartizeaz n doze (100 ml) i se conserv la temperatura de 15oC sau la 4-5oC. Sperma brut proaspt, diluat sau diluat-refrigerat, se distribuie beneficiarilor, fiind transportat n termosuri zootehnice, care menin o temperatur constant pn la beneficiar (15oC sau 4-5oC). 1.7.3.2. Descoperirea scroafelor n clduri Depistarea femelelor n estru se face pe baza semnelor clinice, a manifestrii reflexului de imobilitate n prezena vierului ncerctor sau la apsarea pe spate de ctre om i prin mijloace electronice bazate pe modificarea caracteristicilor secreiilor vestibulo-vaginale (pH-ul i rezistena electric a mucoasei vestibulo-vaginale). Metoda cea mai simpl i cu bune rezultate const n prezentarea zilnic a femelelor cu modificri ale organelor genitale externe i de comportament, vierului ncerctor.n cazul n care scroafa accept saltul vierului, este sigur n perioada de estru. Dac accept acest salt de la prima ncercare, momentul declanrii estrului se stabilete prin media intervalului scurs de la controlul anterior. Dac accept saltul vierului dup a doua sau a treia ncercare, debutul estrului corespunde acestui moment. Cele mai bune rezultate se obin atunci cnd sunt deplasate scroafele (5-10) n boxa vierului i nu invers. n absena vierului ncerctor, starea de estru se poate stabili pe baza modificrilor de comportament ale scroafelor (nelinite, grohituri caracteristice, poft de mncare capricioas etc.) i ale organelor genitale externe (edemaierea i congestia vulvei). Un indiciu sigur al strii de estru este reprezentat de reflexul de imobilitate al scroafei la presiunea exercitat de ngrijitor n regiunea lombo-sacral sau a flancurilor, o proporie nsemnat (20-30%) nemanifestnd, totui, starea de imobilitate n absena vierului. 1.7.3.3. Stabilirea momentului optim de nsmnare nsmnarea scroafelor trebuie s se fac n momentul cel mai prielnic, nct spermatozoizii s ajung la locul fecundaiei naintea descinderii ovocitelor n urma dehiscenei foliculilor maturi. Cum ovulaia la scroaf are loc, n medie,
60

ntre 36 i 44 de ore de la debutul estrului, evideniat prin apariia reflexului de imobilitate la saltul vierului, nsmnarea cea mai eficace se consider c trebuie fcut dup un interval de 20-24 de ore de la manifestarea reflexului de imobilitate. Acest aspect presupune ca aciunea de descoperire a scroafelor n clduri s se desfoare cel puin de dou ori/zi, dimineaa i seara. Repetarea nsmnrii se face cu scopul de a prinde ovulaiile i la scroafele cu o durat mai mare a estrului. Cnd se fac dou nsmnri ntr-un ciclu de clduri, cel mai bine este ca prima inoculare s se fac la 15-20 de ore de la depistare, iar a doua la interval de 10-12 ore de la prima.n cazul depistrilor fcute de dou ori/zi (aa cum se practic cel mai frecvent) scroafele la care s-a stabilit starea de estru dimineaa, se nsmneaz n seara aceleiai zile, iar scroafele care au fost depistate seara, prima nsmnare se face n dimineaa zilei urmtoare. Repetarea nsmnrii se face, aa cum am menionat mai sus, dup 8-12 ore de la prima. Dac se face o singur depistare/zi (dimineaa), prima nsmnare artificial se face imediat dup stabilirea reflexului de imobilitate pentru vier i se repet dup alte 24 de ore de la prima nsmnare (Feredean T.,1978). A treia nsmnare artificial nu se recomand dect n cazul scroafelor cu clduri prelungite pn la 45 zile precum i pentru scroafele la care s-a constatat refularea spermei inoculat n nsmnrile anterioare. Scroafele cu estru prelungit (superestru) se recunosc prin prelungirea peste limita fiziologic a modificrilor organelor genitale externe i de comportament specifice strii estrale, ct i prin prezena reflexului de imobilitate la vier.n asemenea cazuri, a treia nsmnare artificial se poate face la interval de 10-12 ore de la a doua inoculare a spermei. 1.7.3.4. Aparatura i instrumentarul folosite pentru nsmnarea artificial a scroafelor Acestea sunt relativ simple. La noi n ar, n marea practic, se folosete instrumentar confecionat din material plastic compus dintr-un rezervor cu capacitate de 100 de ml si un racord flexibil, care face legtura cu un cateter (sond) semirigid, lung de 35-40 cm, prevzut cu o oliv, sau un adaptor tirbuonat la extremitatea care se introduce n lumenul cervical. Acest tip de cateter poate fi substituit cu unul confecionat din cauciuc, cu vrful tirbuonat refolosibil dup sterilizare (fig.8). Rezultate bune se obin i cu instrumentarul de provenien japonez, compus dintr-o sering de sticl cu o garnitur metalic i cu piston din cauciuc semirigid cu capacitate de 80 ml. La seringi se ataeaz un cateter de cauciuc (40cm lungime, 0,7-1,0 cm diametru). Tija Fig. 8 Instrumentar pentru nsmnarea cateterului este confecionat dintrun cauciuc semirigid, prevzut la scroafelor (dup O. Roca, 1994) vrf cu o poriune mult mai elastic.
61

1.7.3.5. Inocularea spermei Pentru nsmnarea artificial a scroafelor nu este necesar ca acestea s fie contenionate, mai ales pentru prima inoculare, care, de regul, corespunde cu reflexul de imobilitate .n unitile cu flux tehnologic industrial, dup depistare, scroafele sunt meninute n boxe individuale, unde se nsmneaz i rmn pn la un eventual ciclu de clduri (21 de zile). n cazul n care se folosete sperma brut, dup examinarea mobilitii spermatozoizilor, se repartizeaz (prin simpla aspirare) n recipientele din material plastic, ntr-un volum de 50 ml, iar recipientul, printr-un tub de legtur din material plastic se adapteaz la un cateter. Cnd se folosete sperma diluat, dup diluie este aspirat n recipientele din material plastic, sau n cazul seringilor, aspirat cu ajutorul acestora. Recipientul cu sperm se pstreaz o perioad scurt de timp, ntr-un termos sau ntr-o etuv reglat la 35-37oC. Pentru fiecare scroaf, se folosete sperma dintr-un recipient, care se scoate din termos sau etuv numai n momentul inoculrii.n cazul folosirii spermei diluate i conservate la temperatura de 15oC sau la 4-5oC, dozele cu material seminal se renclzesc la 35-37oC i se menin n termos sau n vas cu ap cald pn n momentul inoculrii. Operaiunea se face cu puin timp nainte de inoculare, iar dozele se extrag din termos numai n momentul nsmnrii. Se execut toaleta vulvei i a regiunii perivulvare cu un tampon de vat mbibat ntr-o soluie dezinfectant, cateterul se lubrifiaz cu vaselin neutr i se introduce n conductul vestibulo-vaginal, uor orientat n sus, pentru a nu fi introdus n meatul urinar (fig. 9). Cnd vrful cateterului ajunge la nivelul cervixului, se rotete uor spre stnga n vederea fixrii ct mai bine n conductul cervical (mai ales cateterele tirbuonate). Recipientul cu sperm se adapteaz la cateter, prin intermediul tubului de plastic, apoi se preseaz uor pereii acestuia, sincronizat cu timpii de relaxare a Fig. 9 Schema inoculrii spermei la musculaturii cervicale, eliminarea scroaf (dup O. Roca, 1994) ntregii doze de sperm durnd unudou minute. Doza de material seminal este de 100 ml sperm diluat sau de 50 ml sperm brut i un numr de 3-5 miliarde de spermatozoizi/doz. n cazul folosirii spermei conservate prin congelare, dozele cu sperm trebuie decongelate la o temperatur de 37-40oC, asemntor dozelor cu sperm de la rumegtoare, apoi se inoculeaz ca atare sau completate cu un diluant nainte sau imediat dup inoculare, funcie de recomandrile care nsoesc dozele de sperm congelate (paiete, tuburi, granule). 1.7.4. Inocularea spermei la iap Sperma de armsar poate fi inoculat sub form brut (imediat dup recoltare), diluat, proaspata sau conservat prin refrigerare sau congelare. Decongelarea tuburilor de sperm se face prin scoaterea lor din container i trecerea ntr-o baie-marie, la temperatura de 40oC, timp de 45-50 de secunde.
62

Dup deschiderea tubului la unul din capete, se introduce vrful canulei sau sondei n tub i se aspir sperma, care se inoculeaz ntr-un interval de timp ct mai scurt. Decongelarea granulelor se face prin introducerea lor ntr-un diluant, meninut la temperatura de 40oC. Dup diluare, se aspir sperma ntr-o sering special de nsmnare i se depune pe traiectul cilor genitale ale iepelor n clduri. Instrumentarul pentru inoculare este constituit din sonde, confecionate din material plastic i conectate la seringi sau recipieni din material plastic. Se mai pot folosi diverse pipete din sticl, lungi de 50cm i cu un diametru de 4cm, catetere sau canule din cauciuc. Ca instrumentar ajuttor este necesar un specul vaginal i o surs de lumin Inocularea spermei la iap ridic probleme legate de momentul inoculrii n perioada de clduri, moment care se stabilete cu mult greutate n practic. Exist numeroase oscilaii ale duratei ciclului sexual la iap, funcie de ras, clim, tehnologie de cretere, exploatare, alimentaie, zooigien etc. Iapa n clduri adopt frecvent poziia campat (specific montei), urineaz puin i des, deschide i nchide succesiv vulva, cu proiectarea clitorisului n afar, este nelinitit, foarte sensibil, uneori devenind retiv. n herghelii, depistarea iepelor n clduri se face prin intermediul armsarilor ncerctori la bara sau peretele de ncercare. Aici, se aduce armsarul i dac iapa este n clduri, va manifesta comportamentul sexual menionat i nu va ncerca lovirea armsarului. Msurile de protecie a muncii i a armsarului impun obligatoriu verificarea iepelor n clduri la bara sau peretele de ncercare, altfel, iapa poate lovi armsarul cu membrele posterioare, provocnd leziuni grave sau chiar fracturi ale membrelor care impun sacrificarea animalelor. Iapa care urmeaz a fi nsmnat, se contenioneaz cu ajutorul platlonjelor i iavaalei sau se introduce ntr-un stand special (travaliu). Inocularea materialului seminal presupune introducerea extremitii libere a sondei cateterului sau pipetei prin canalul cervical pn la nivelul cavitii uterine unde urmeaz a fi depus. Inocularea spermei se face prin dou metode: colposcopic sau cu speculul vaginal; manual sau tactil cervical. Metoda colposcopic pentru depunerea spermei la nivelul cavitii uterine a iepei n clduri, necesit folosirea canulei sau cateterului adaptat la sering, speculum vaginal, surs de lumin. n prealabil, se face toaleta vulvei i a regiunii perivulvare cu ajutorul unui tampon de vat sau tifon mbibat n soluie dezinfectant. Operatorul nsmntor deprteaz pereii vaginului cu ajutorul specului vaginal i apoi intruduce cateterul sau vrful sondei printre valvele speculului vaginal, prin canalul cervical, 10-12 cm i apoi se depune sperma. Metoda manual (tactil-cervical) presupune dirijarea vrfului sondei sau canulei n canalul cervical, cu ajutorul minii introdus n vagin, mna fiind protejat de o mnu din material plastic i lubrifiat cu vaselin neutr. Dup reperarea orificiului vaginal al cervixului, vrful sondei este dirijat n lungul degetului arttor, pe o lungime de 10-12 cm prin canalul cervical n cavitatea uterin. Prin apsarea recipientului cu sperm sau pe pistonul seringii, sperma se depune n uter. Prin aplicarea acestei metode exist riscul infectrii mucoaselor vaginale i cervicale cu flora microbian introdus n timpul explorrii vaginale. Doza de material seminal brut conine minim 0,5 miliarde spermatozoizi mobili iar volumul spermei brute este de 20 ml, iar a celei diluate 40-50 ml. Inocularea spermei se face imediat ce iapa a fost depistat n clduri cu repetare din dou n dou zile pn la ncheierea perioadei estrale, avnd n vedere
63

c durata medie a estrului este de 4-5 zile cu variaii cuprinse ntre 4 i 9 zile.ntro perioad estral, de regul se fac dou-trei nsmnri, la intervalul de timp menionat. Sperma proaspt ca i cea conservat prin refrigerare se admite pentru nsmnare artificial numai atunci cnd are o mobilitate minim de 60%, iar sperma congelat, o mobilitate minim de 35-40%. Avnd n vedere scopul creterii cabalinelor, mai ales pentru curse, n unele ri, nsmnarea artificial la aceast specie este interzis, fiind acceptat numai n cazul experienelor ntreprinse n centrele de cercetare (Frana). 1.7.5. Inocularea spermei la psri Inocularea spermei se face cu scop de cercetare, selecie, ameliorare i practic. Psrile pot fi nsmnate artificial numai n perioada de ouat, n afara acesteia, cloaca i oviductul neputnd fi exteriorizate. La gini i curci, nsmnrile artificiale pot fi utilizate singure sau combinate cu mperecherea natural. Organizatoric, activitatea de nsmnare artificial la gini, parcurge trei etape (Sauveur B. i colab., 1988). Etapa I-a const n recoltarea, condiionarea i inocularea spermei. Etapa a II-a necesit mai multe mii de femele i efectivul de masculi necesar nsmnrilor artificiale. Prin aceasta se urmrete intrarea ntr-un anumit program i ritm de munc suficient de rapid pentru a nsmna 250-300 de femele/or/persoan, ceea ce presupune o bun organizare a muncii. Etapa a III-a se refer la extinderea nsmnrilor artificiale la o scar mai mare cu asigurarea unui ridicat nivel de fecunditate i permanentizarea personalului care deja s-a specializat n efectuarea nsmnrilor artificiale. Dac se practic nsmnarea cu sperm brut, aceasta se pstreaz n tubul, fiola colectoare iar atunci cnd se dilueaz, soluia cea mai simpl este cea de a recolta sperma direct n fiolele care conin cantitatea necesar de diluant. Inocularea spermei presupune folosirea unei aparaturi extrem de simple, format n principiu, dintr-o sering din material plastic, cu capacitatea de 1 ml, divizat n 100 de pri, la care se ataeaz o canul din material plastic, cu o lungime de 6-8 cm.nsmnarea artificial poate fi executat i cu ajutorul unei seringi gradate, tip insulin i echipat cu o canul adecvat, sau sperma poate fi ambalat n paiete din material plastic care conin ntre 10 i 50 de doze. Cantitatea de sperm brut care se inoculeaz este de 0,05-0,1 ml la gini i de 0,03 ml la curci. Se mai folosete i inocularea cu material seminal diluat i congelat, aa cum s-a specificat la diluarea i conservarea spermei. Timpul optim de nsmnare la psri se refer la perioada sau chiar ora din zi, n funcie de ovulaie i formarea oului pe traiectul oviductului. Cele mai bune rezultate la curc se obin n cazul nsmnrii efectuate n a doua parte a zilei (orele11-17). La rae, n schimb, cele mai bune rezultate s-au obinut n urma nsmnrii efectuate ntre orele 9-11 dimineaa (Besulin, 1974; Davtian i colab., 1974 citat de I. Dumitrescu i colab.). Printre factorii care influeneaz rezultatele inoculrii spermei la psri, cei legai de organismul femelei au o importan deosebit, n specificul activitii zilnice i rolul complex al cilor genitale la psri. Rezerva de spermatozoizi n oviductul ginii este util pentru aproximativ o sptmn.

64

Tehnica inoculrii spermei La gini, inocularea spermei necesit aportul a dou persoane: una contenioneaz, iar cealalt efectueaz nsmnarea propriu-zis. Gina este prins cu mna stng de fluiere i ridicat la nivelul pieptului. Cu mna dreapt se rsfrnge coada pe spate i prin apropierea psrii de pieptul operatorului, coapsele ginii preseaz abdomenul i provoac deschiderea cloacei. Cu degetul mare al minii drepte se faciliteaz deschiderea oviductului pe partea stng a cloacei (G. Bltan i colab., 1969). Dup evidenierea oviductului, operatorul nsmntor introduce canula de la seringa de nsmnare pe o adncime de 2-3 cm i inoculeaz ntreaga cantitate de sperm, dup care presiunea asupra abdomenului nceteaz. Evidenierea oviductului se mai poate realiza i prin contenia ginii sub braul stng i apsnd abdomenul psrii spre cloac. Presarea se face pn la ieirea oviductului afar sub forma unui deget de mnu ntors spre vrf. Cel de al doilea operator execut nsmnarea la 1-3 cm de deschiderea oviductului (M. Pop, 1963). Pentru ginile crescute n baterii, ngrijitorul prinde pasrea de picioare i o contenioneaz cu partea posterioar spre deschiderea cutii sprijinind pieptul acesteia spre marginea bateriei. Cu mna stng ndoaie uor coada pe spate. Operatorul nsmntor apas cu mna la baza cloacei, provocnd prolabarea oviductului, iar cu mna dreapt introduce canula n oviduct i inoculeaz doza de sperm la o distan de 5-6 cm (tefnescu i colab.,1974). La curci, tehnica de inoculare, n general, este asemntoare cu cea folosit la nsmnarea ginilor. Dup contenionarea curcii i evidenierea deschiderii oviductului, sperma se depune pe lumenul oviductului la 4-5 cm de la deschiderea posterioar.

65

NTREBRI RECAPITULATIVE 1. Care sunt principalele avantaje ale aplicrii nsmnrilor artificiale la animale? 2. n ce const organizarea i conducerea activitii pe linia nsmnrilor artificiale n ara noastr? 3. Care sunt etapele seleciei masculilor de reproducie? 4. Ce semnific spermograma? 5. Enunai principiile dilurii spermei i detaliai tehnicile de diluare a spermei animalelor. 6. Care sunt avantajele i dezavantajele conservrii spermei la diferite niveluri de temperatur? 7. Care sunt metodele de inoculare a spermei la animalele domestice? TEME 1. 2. 3. 4. 5. Studiul aparaturii de recoltare a materialului seminal la rumegtoare, cabaline, suine i psri Principiile i tehnicile controlului spermei. ntocmirea spermogramei Diluia materialului seminal n vederea conservrii la temperatura laboratorului, prin refrigerare i congelare Modaliti de conservare a spermei la rumegtoare, cabaline, suine i psri Inocularea spermei

REFERATE 1. 2. 3. 4. 5. Biotehnologia nsmnrii artificiale la vac Biotehnologia nsmnrii artificiale la oaie i capr Biotehnologia nsmnrii artificiale la scroaf Biotehnologia nsmnrii artificiale la iap Biotehnologia nsmnrii artificiale la psri

66

CAPITOLUL II BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

2.1. Importana transferului de embrioni Importana transferului de embrioni poate fi zooeconomic i tiinific. Importana zooeconomic. Lucrrile de selecie i ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de numrul redus de produi care se obin de la o femel n cursul vieii sexuale i de intervalul dintre generaii. Transferul de embrioni d posibilitatea folosirii cu eficien crescut a rezervelor de ovocite de la animalele de nalt valoare zootehnic numite donatoare, prin provocarea maturrii i eliberrii mai multor gamei femeli (poliovulaie) cu obinerea unui numr mai mare de produi de la aceeai femel prin transferul embrionilor n uterul femelelor receptoare. Astfel, n decursul vieii sexuale este valorificat doar o infim parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexual. De exemplu, vaca ncepe perioada genital cu o rezerv de circa 150000 de ovocite ( n ambele ovare), rezerv care diminu la circa 21000 la vrsta de 2-3 ani i la circa 2500 la 12-14 ani. Numrul de ovocite eliberate n ntreaga via sexual nu depete 50, din care n condiii normale rezult maxim 10-12 viei. Prin asigurarea numrului corespunztor de animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obine, n medie 3-4 viei pe an, fiind cunoscute cazuri cnd n condiii de supraovulaie, de la o vac donatoare s-au obinut 30-35 viei. Transferul de embrioni se practic i pentru scurtarea intervalului dintre generaii. Prin instalarea gestaiei, femela intr n repaus productiv (sub raportul procreerii) pe ntreaga durat a gestaiei. n cazul practicrii transferului de embrioni, produii de concepie sunt transferai n alte organisme, ceea ce d posibilitatea obinerii de noi produi de la aceeai femel n intervalul de timp n care n mod normal, ar fi trebuit s fie gestant. Mai mult, n prezent se pot obine gamei i de la tineretul femel prepuber prin provocarea prin mijloace hormonale a maturrii i expulzrii ovocitelor, care vor fi apoi transferate n uterul femelelor receptoare. Scurtndu-se mult intervalul dintre generaii, se accelereaz ameliorarea efectivelor de animale. Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantin i eventualele restricii sanitar-veterinare n comerul cu animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodat, prin practicarea transferului de embrioni, se pot obine produi de la femelele valoroase dar cu diverse afeciuni genitale incompatibile cu meninerea gestaiei sau cu parturiia. De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp necesar crerii de noi rase de animale cu nsuiri morfo-productive performante care pot forma linii de femele consangvine n vederea folosirii lor la ncruciri industriale. n sintez, n practica de producie, transferul de embrioni se aplic pentru rezolvarea urmtoarelor probleme: - reproducerea accelerat a animalelor de prsil, de calitate superioar, a raselor rare, a animalelor din rezerva genetic a purttoarelor unor nsuiri valoroase

67

(producii ridicate, capacitate de utilizare intens a furajelor, prolificitate mare, longevitate productiv, rezisten la anumii factori nefavorabili etc.); - obinerea unui numr mare de descendeni de la femelele cu producii ridicate i cu durat prelungit de exploatare, n vederea crerii de familii cu aceste nsuiri; - raionalizarea importului i exportului animalelor valoroase, ca urmare a transportului embrionilor congelai, nlturndu-se astfel barierele sanitarveterinare i nlesnirea aclimatizrii materialului importat, dezvoltarea lui embrionar avnd loc n organismul primitoarelor; - obinerea de embrioni liberi de leucoz cu posibilitatea transferului acestora femelelor leuco-negative; - crearea unor bnci de embrioni n vederea pstrrii raionale a rezervelor genetice, ceea ce este mai economic dect ntreinerea unor efective numeroase din rezerva genetic. Importana tiinific Transferul de embrioni reprezint o biotehnologie prin intermediul creia se poate efectua, n condiii optime, un aprofundat studiu tiinific al proceselor intime legate de fecundaie i de influenele matern i patern asupra produsului de concepie. Totodat, poate fi studiat dezvoltarea embrionar la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normal, cauzele i factorii care genereaz mortalitatea embrionar. Produii obinui prin transferul de embrioni permit studierea influenelor factorilor genetici i ai mediului extern asupra dezvoltrii embrionilor, ereditatea grupelor sanguine, obinerea de animale mozaic de gene, a concentrrii mai multor caractere pe acelai individ, a instituirii unei profilaxii i terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeai linie, transferul de embrioni reprezint baza unei noi generaii de biotehnici care deriv din aceasta sau i sunt asociate: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia in vitro clonarea, transferul de gene, iar ingineria genetic folosete ca verig important, n metodologie, aceast biotehnologie. Micromanipularea i microchirurgia ovocitelor i a embrionilor permit desfurarea unei cercetri tiinifice interesante, i obinerea din punct de vedere practic a unor nalte performane n reuita transferului de embrioni, prin transferul jumtilor de embrioni. Sexul embrionului poate fi precizat cu mult acuratee, baza investigaiei fiind dat de transferul embrionilor. Reproducerea, fr contribuia genetic a partenerului, se poate realiza prin ginogenez, fiind deja obinui primii oareci homozigoi, (Groza I., 1996). Aspecte similare ridic androgeneza n care se poate induce bispermia, adic ptrunderea n ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioar a pronucleului femel i n consecin diviziunea va continua numai n zona masculin (Groza I., 1996). 2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vac La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducie larg rspndit n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stpnite, astfel nct aceast modern biotehnologie poate fi extins la aproape toate fermele de creterea vacilor din lume. Astfel, n Europa se obin anual circa 100000 de

68

produi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produi, extinderea biotehnologiei fiind limitat de costurile destul de ridicate. Transferul de embrioni constituie, totodat, baza unei noi generaii de biotehnici, care deriv din aceasta sau i sunt asociate, cum ar fi: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia ,,in vitro, clonarea, transferul de gene. Transferul de embrioni presupune parcurgerea urmtoarelor etape (fig. 10): selecia i pregtirea vacilor donatoare; selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare); sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare; inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare; recoltarea embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.
SELECIA DONATOARELOR SELECIA RECEPTOARELOR

TRATAMENTUL DE SUPEROVULARE PMSG tipul FSH-p doza schema de administrare SINCRONIZAREA CICLULUI SEXUAL CU AL DONATOARELOR I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR

TRANSFERUL EMBRIONILOR

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale 2.2.1. Selecia i pregtirea vacilor donatoare Vacile donatoare de embrioni trebuie s ntruneasc la cel mai nalt nivel caracterele zootehnice care intereseaz. De aceea, cnd se face selecia donatoarelor, se are n vedere evaluarea urmtoarelor criterii: performana reproductiv, superioritatea genetic i valoarea produsului obinut prin transfer embrionar. Vaca donatoare va fi mai performant reproductiv atunci cnd vrsta se situeaz ntre 3 i 10 ani, a nscut anual cte un viel, a rmas gestant n maxim dou cicluri sexuale, ciclurile de clduri au o succesiune fiziologic i nu a avut antecedente ginecologice (distocii, retenii placentare, infecii genitale etc.). Practic, criteriile care se au n vedere sunt: o stare ginecologic perfect, intervalul dintre parturiie i primul estru s fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiie-

69

nsmnarea fecund s fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaie s fie mai mic de 1,5. Superioritatea genetic const ntr-un ritm superior de cretere, nainte i dup nrcare i un randament ridicat la sacrificare. n cazul vacilor de lapte, nsuirile cu heritabilitate ridicat se refer la producia de lapte, procentul de grsime din lapte i conformaia corporal. Vacile donatoare trebuie s fie sntoase, ele suportnd mai multe intervenii de supraovulare i recoltare de embrioni. O atenie deosebit trebuie s se acorde alimentaiei raionale a acestei categorii de vaci. 2.2.2. Selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare) Vacile receptoare de embrioni trebuie s fie sntoase, fr afeciuni ginecologice, s aib aceeai talie cu donatoarele, s fie apte s nasc descendeni cu aceeai greutate la natere ca donatoarele, avndu-se n vedere c gestaia constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern. Cele mai bune rezultate se obin atunci cnd transferul de embrioni se face la tineretul femel n vrst de 18-20 de luni. 2.2.3. Sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare i receptoare de embrioni se poate realiza pe cale natural sau medicamentoas. n cazul sincronizrii femelelor prin mijloace naturale se urmresc, n lotul receptoarelor femelele care n mod spontan manifest estrul n acelai timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj const n fapul c sunt necesare multe animale receptoare n ateptare. Aceast modalitate de sincronizare s-a practicat n perioada de nceput a transferului de embrioni, cnd s-au folosit pentru transfer embrionii proaspt recoltai. n aceast situaie, n aceeai unitate trebuia s fie i vaci donatoare i receptoare, iar transferul embrionilor trebuia s se realizeze ntrun timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare). Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazeaz pe faptul c se urmresc succesiv dou-trei cicluri de clduri la vacile donatoare i se stabilete durata ciclului. n acest fel se poate calcula data apariiei ciclului care intereseaz n transferul de embrioni. n funcie de data previzibil, se acioneaz prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare n vederea inducerii cldurilor, sincronizate cu cldurile naturale ale donatoarei. n acest caz se acioneaz asupra donatoarei numai n ceea ce privete inducerea poliovulaiei. Sincronizarea medicamentoas a ciclului estral al femelelor donatoare i receptoare de embrioni se realizeaz pe dou ci: blocarea eliberrii hormonilor gonadotropi sau prin inducerea luteolizei. Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin retroaciune i exercit efectul negativ asupra hipotalamusului, diminund nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul Sincronizarea estrului).

70

2.2.4 Inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare Provocarea eliberrii concomitente la aceeai perioad de clduri a unui numr sporit de ovocite dect cel caracteristic speciei se numete poliovulaie (supraovulaie, superovulaie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament. Tratamentele actuale aplicabile in vitro se sprijin pe cunoaterea mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin ndeosebi n ultima faz a creterii i maturrii foliculare. Potenialul ovarian de foliculi teriari (cu antrum) rmne relativ constant (ns variabil cu individul) de la vrsta de dou luni pn la 12 ani (Nibart M., 1991). Fiziologic, la vac, un singur folicul ajunge la maturitate n preajma ovulaiei, n timp ce, n timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz. Injecia unui hormon cu activitate de FSH mpiedic atrezia unor foliculi i stimuleaz dezvoltarea i maturarea simultan a mai multor foliculi teriari, n cursul aceluiai ciclu estral. n prezent, dou scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iap gestant, liofilizat i standardizat - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit i Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare folicular (FSH) extras din hipofiza anterioar. PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante i are o dubl activitate: de tip FSH i LH, raportul FSH/LH variaz de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987). Perioada de njumtire destul de lung - 120 ore - a acestui hormon determin o uurin n folosire, o singur injecie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficient n provocarea poliovulaiei. La dou-trei zile de la injectarea PMSG se administreaz i.m. o doz de 500-750 g prostaglandin F2, cldurile aprnd la circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antreneaz i unele efecte negative traduse prin creterea folicular i secreia ridicat de estradiol i dup descrcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua nsmnare artificial (de ex. Neutra -PMSG intervet). Fecundarea ovocitelor se face, de regul, prin nsmnarea artificial a vacilor la un interval de 12 ore de la nceputul estrului cu repetare la 8-12 ore interval. FSH se prepar din extractele purificate parial, provenite din hipofiza mamiferelor - n principal de suine - care conine FSH i LH. Coninutul n cei doi hormoni i raportul dintre acetia variaz cu lotul. Perioada de njumtire foarte scurt (circa 70 minute a acestui hormon necesit injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, n vederea meninerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcie de preparatul comercial, raportul dintre FSH i LH, de regul variaz de la 1 la 0,5. Dozele totale care se administreaz, n vederea producerii poliovulaiei, variaz de la 28 mg la vielele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injeciile fcndu-se n ritm descresctor, intramuscular sau subcutanat. Preparatele care conin aceti hormoni au denumiri care difer cu unitatea productoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc. Ca i cealalt schem de tratament, injectarea prostaglandinei F2, n doz de 500-750 g se face la 48-72 de ore de la nceperea tratamentului, estrul aprnd la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin nsmnarea artificial a femelelor supraovulate de dou ori, la 12 i 24 ore de la apariia estrului.
71

Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaiei Preparatele medicamentoase care conin hormoni gonadotropi sunt injectate n faza luteal a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent ntre ziua a 9-a i a 13-a. Dou zile dup injecia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecie de FSH, se injecteaz un analog de PGF2 (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permind ovulaiile (fig. 11 i 12).
POLIOVULA}IE FSH p

ANTILUTEOTROP

IMPLANT NORGESTOMET 9 zile

POLIOVULA}IE PMSG ANTI-PMSG

ANTILUTEOTROP

IMPLANT NORGESTOMET 9 zile

Fig. 11 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni (dup M. Thibier i M. Nibart, 1991) O alt schem de tratament const n utilizarea progestinelor pe cale oral, parenteral, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele blocheaz axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Ct timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se gsesc sub aciunea temporar a progestinelor, femela nu va manifesta estru i nici nu va ovula. Dup suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descrcare rapid, compensatoare de Gn-RH, ceea ce va determina, n decurs de 5-7 zile, intrarea n clduri ovulatorii a femelelor tratate. n cursul unui astfel de tratament de blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, n ritm descresctor ncepnd cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecie intramuscular de PGF2.

72

PMSG PGF2

PMSG PGF2 Gn-RH

PMSG PGF2 HCG

FSH PGF2

Fig. 12 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni (dup I.C.P.C.B. Baloteti) n cazul ntrebuinrii preparatelor hormonale pe baz de PMSG, acestea se injecteaz, mpreun cu o doz de prostaglandin F2, n a 6-a - a 7-a zi de la introducerea implantelor, pesariilor etc., urmat de injectarea unei doze de anti PMSG concomitent cu a 2-a nsmnare artificial (fig. 11 i fig. 12). O schem mai simpl de provocare a poliovulaiei const n nceperea tratamentului cu hormoni gonadotropi n a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viele i n a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, ns numrul de embrioni obinui este mult mai redus. Rezultate bune n provocarea poliovulaiei s-au obinut prin injectarea unei doze de Gn-RH la vacile poliovulate nainte de prima nsmnare artificial sau concomitent cu aceasta, n vederea gruprii ovulaiilor. Prin provocarea poliovulaiei se pot obine de circa 8-10 ori mai muli embrioni, dect n cazul recuperrii unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator (foto 18).

73

Exist o variaie mare n ceea ce privete rspunsul la tratamentul poliovulator, din partea vacilor. Aceast variaie pronunat se datoreaz hormonului utilizat, puritii acestuia i de specificul individual al femelelor. Cercetrile au relevat faptul c circa 1020% dintre vaci nu rspund la tratamentul poliovulator, alte 20-25% rspund slab la un astfelde Foto 18 Ovare superovulate tratament (1-3 embrioni transferabili pe vac tratat) i doar 30-40% dintre vaci au un rspuns ideal la tratamentul de superovulaie furniznd 7-12 embrioni/vac/tratament iar 5-10% dintre femelele tratate furnizeaz mai mult de 20 de embrioni. n prezent, stimularea ovarian pare a fi atins un anumit plafon ntruct, se colecteaz, n medie 9-10 embrioni (limite ntre 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6 (limite ntre 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988). n ceea ce privete repetarea tratamentelor de superovulaie la aceeai donatoare, s-a constatat c tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani. Producia total de embrioni de la aceeai donatoare depinde de aceasta i de ritmul de colectare . Este necesar un interval de cel puin 60 de zile dup ftare n vederea nceperii tratamentului poliovulator. Unii cercettori constat o reducere a numrului de embrioni transferabili o dat cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explic prin formarea n organismul femelei tratate a anticorpilor antiPMSG i reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie s se fac la un interval de 5460 de zile i s se intercaleze tratamentele pe baz de PMSG i FSH-p. Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenate de vrsta femelelor, ras, mascul, sezon, nivelul produciei de lapte, starea general, etc. De regul, vielele produc un embrion viabil mai puin dect vacile adulte. 2.2.5. Fecundarea ovocitelor Ovocitele sunt fecundate n urma nsmnrii naturale sau artificiale. De regul, se efectueaz dou nsmnri artificiale la interval de 12-24 de ore de la nceputul cldurilor observate clinic sau, sistematic, dup 56 i 72 de ore de la injecia cu PGF2, sau dup 36 i 48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor. 2.2.6. Recoltarea embrionilor Embrionii sunt colectai atunci cnd se gsesc n cornul uterin, dup ieirea lor din oviduct (ntre zilele 4-5). Din motive sanitare i de congelare se prefer colectarea embrionilor nc inclui n zona lor pelucid (ies n a 9-a zi).
74

Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz ntre zilele 6-8 dup fecundaie, de regul n ziua a 7-a. Recoltarea embrionilor se face chirurgical i nechirurgical. Mult timp, metoda chirurgical a fost singura utilizat. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a dou etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital n plag i recoltarea propriu-zis a embrionilor prin splarea cu un lichid cu o compoziie special, a oviductelor (dup un interval de timp mai mic de 3 zile dup nsmnare) sau a coarnelor uterine (dup un interval de timp mai mare de 4 zile de la nsmnare). n prezent, metoda chirurgical de recuperare a embrionilor la vac este abandonat, datorit inconvenientelor pe care le prezint. Astzi, este generalizat metoda nechirurgical de prelevare a embrionilor, a crei principiu const n splarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, splare care se realizeaz n condiii de asepsie n a 7-a zi de la nsmnare. Tehnica nechirurgical de colectare a embrionilor s-a perfecionat continuu, firme specializate produc pe scar industrial mediul de recoltare, congelare, decongelare i ntreaga aparatur necesar recoltrii i transferului embrionilor. Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe operaii: contenia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei i a regiunii perivulvare, identificarea prezenei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de splare n lumenul coarnelor uterine, splarea acestora, recuperarea lichidului mpreun cu embrionii, identificarea i recuperarea embrionilor din lichidul recuperat i supus decantrii i aprecierea morfologic a acestora. n condiii de ferm, recoltarea embrionilor se face la locul unde se gsete femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practic anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2% sau cu 10 ml ludocain 1%, care blocheaz nervii coccidieni i ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se introduce ntre prima i a doua vertebr coccigian sau ntre ultima vertebr sacral i prima vertebr coccigian, anestezia instalndu-se dup circa 10-15 minute i dureaz n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul i uterul. Se introduce, cu precauiile de rigoare, mna n rect, acesta se videaz de coninut, apoi se apreciaz rspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpndu-se cu atenie ambele ovare i numrdu-se corpii galbeni (foto 19). n cazul n care rspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedeaz cu precauie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou sau trei ci, prin conductul cervical pn n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe lumenul acestuia un mandren (tij metalic), care se menine pn se ajunge n lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurcaia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer n scopul fixrii cateterului i pentru a mpiedica refularea din cervix a lichidului de splare. Vasul din sticl, ce conine lichidul de splare se suspend la 1,5 m de la sol i, prin cdere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului n coarnele uterine. Irigarea acestora se face continuu, calea de evacuare a lichidului este conectat, printr-un tub de plastic, la vasul de colectare a mediului recuperat (de splare). Recuperarea lichidului de splare se face prin calea de admisie (n cazul cateterului cu dou ci la care s-a adaptat o pies n forma literei y) prevzut cu canal de admisie i evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectat la un filtru de colectare a crui orificii au un diametru de 75 m, care are rolul de reinere a embrionilor, lichidul ce traverseaz filtrul fiind colectat ntr-un recipient situat sub filtru.

75

Mediul folosit la splarea unui corn uterin se folosete la splarea, n acelai mod, a celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se folosete pentru splarea unui corn uterin este de 300-500 ml, efectunduse irigri repetate i un masaj transrectal permanent al cornului uterin perfuzat. Exist diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diveri cercettori, care se bazeaz pe acelai principiu constructiv . ntre momentul recuperrii embrionilor i cel al inoculri lor n uterul receptoarelor, zigoii trebuie s fie meninui n via n condiii speciale i s fie manipulai n cele mai bune condiii tehnice i igienice. n ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluii tampon fosfat - PBS (Fosfat bufferet salin) pentru splarea Foto 19 Recoltarea embrionilor prin coarnelor uterine i pentru pstrarea metoda nechirurgical embrionilor recuperai. Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotic de 290 miliosmoli i conine multe sruri minerale, glucoz i protein (albumin bovin seric, 2-4 g/l, sau ser de viel fetal decomplementat 10%. Toate mediile, soluiile, serurile, enzimele i substanele crioprotectoare care vin n contact cu embrionii trebuie s fie sterile. Tot materialul care nu se arunc (sonde colectoare, filtre, recipieni din sticl, sonde de transfer, etc.) care necesit a fi sterilizate, se spal cu o soluie de detergent netoxic, se cltete n ap distilat, se usuc i se nvelete n hrtie n vederea sterilizrii. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (cldur uscat, cldur umed, substane antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperrii embrionilor depind n cea mai mare msur de abilitatea i antrenamentul operatorului. Proporia embrionilor recuperai, oscileaz n medie, ntre 60-70% comparativ cu numrul de corpi galbeni identificai pe ambele ovare. Dup colectarea embrionilor se injecteaz donatoarei o doz de PGF2, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitndu-se astfel gestaia multipl. 2.2.7. Cutarea i aprecierea calitii embrionilor Dup prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se ndeprteaz supernatantul iar stratul inferior n care se regsesc i embrionii recoltai, se transfer ntr-o plac Petri cadrilat cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agit n mediu din filtrul colector i se toarn n placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca i filtrul folosit la recuperarea embrionilor se cltesc de dou trei ori. Examenul embrionilor n lichidul recoltat trebuie s se fac n cele mai bune condiii de asepsie, curenie i la o temperatur constant a laboratorului
76

(20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucid avnd o grosime de 12-15 m. Pentru identificarea embrionilor, se examineaz la o stereolup (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare ptrat de la nivelul plcii Petri. (foto 21).

Foto 20 Placa PETRI cadrilat folosit la cutarea embrionilor

Foto 21 Cutarea embrionilor n lichidul de splare cu ajutorul stereolupelor

O dat identificai, embrionii sunt transferai cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet, n plci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm n care se gsete mediul de splare la care s-a adugat 20% albumin seric bovin (BSA). Operaiunea se repet de 3-5 ori, embrionii fiind transferai dintr-o plcu n alta, schimbndu-se de fiecare dat pipeta de aspirare. n cazul n care embrionii sunt destinai exportului, acetia sunt trecui prin zece astfel de bi de splare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare (PBS 40% BSA sau 10-20% ser de viel fetal) provoac o cretere a presiunii osmotice. Pentru a reduce ocul osmotic, embrionii sunt trecui succesiv i pe cte o durat de 5 - 10 minute n dou-trei bi cu mediu de conservare cu o concentraie crescnd n crioprotector: glicerol 0,7 M i apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Aceast trecere a embrionilor n mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatur cuprins ntre+20oC i +30oC. Dup ultima baie, adic n momentul n care este atins concentraia final n crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiionai pentru congelare, fie n fiole de sticl de 1,2 ml, fie n paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Exist bancuri de identificare ce permit pe de o parte nchiderea ermetic a paietei i care poart (sunt inscripionate) toate informaiile necesare. Pentru fiecare paiet trebuie s se menioneze: identificarea donatoarei, rasa, data colectrii, numrul de embrioni, centrul de producie. Procedura de umplere a paietelor comport trei compartimente lichide separate de bulele de aer. Aceasta limiteaz orice risc de pierdere a embrionilor n momentul manipulrilor efectuate cu umplerea sau evacuarea coninutului paietelor. Embrionii sunt ncadrai n mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat. n cursul examenului sub stereolup la un grosisment mai mic de 80, embrionul este ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl n vederea aprecierii morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfeciuni putnd scpa observaiei n anumite poziii ale embrionului. Zona pelucid garanteaz protecia embrionului, motiv pentru care ea trebuie s fie perfect integr, fr fisuri i perfect sferic. Gradul de dezvoltare embrionar n raport cu ziua colectrii este principalul factor luat n considerare.
77

Embrionii care prezint o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai. Embrionii colectai n a aptea zi de la debutul estrului trebuie s se gseasc n stadiul de morul compact/blastocist. Embrionii care conin 16 celule sau mai puin, nu se rein pentru transfer sau congelare, fiind ntr-o ntrziere mare a dezvoltrii. n stadiul de morul compact, limitele celulare sunt mai puin distincte ntruct blastomerele sunt strns legate ntre ele i dau un aspect de mure. Prezena ctorva celule detaate, n spaiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare ntruct majoritatea blastomerelor formeaz o mas sferic fr opacitate marcant. n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie s fie vizibile i s prezinte contururi bine delimitate. Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin i a unor granulaii la suprafaa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei ntrzieri n dezvoltare, absenei contururilor celulare sau unei opaciti marcante ale blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a cror aspect este ndoielnic sunt conservai una-dou ore apoi vor fi examinai din nou. Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morfologic i corespunztor vrstei (foto 22). Embrionul bun calitativ prezint unele imperfeciuni: zona pelucid oval, dimensiuni mai mici ale embrionului, ntrziere n dezvoltare cu o zi, puine celule extrudate, mici. Embrionul acceptabil este cel care este bine conturat, ns prezint unele anormaliti: un numr moderat de Foto 22 Embrioni buni pentru celule excluse, dimensiuni mai mici, congelare unele degenerri i ntrzierea cu o zi. Embrionul inferior prezint diverse degradri considerabile: celule veziculate, variabilitate mare n ceea ce privete dimensiunile celulelor, ntrzierea n dezvoltare cu dou zile, absena compactrii. Embrionul degenerat prezint degenerri evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezint structur simpl a gametului femel, fr celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. i colab.,1991). 2.2.8. Conservarea i deconservarea embrionilor Embrionii pot fi conservai cteva ore in vitro la 20oC ntr-un mediu de conservare: PBS adiionat cu 4 g/l albumin seric bovin, sau cu 10% ser de viel fetal decomplementat. n acest mediu, embrionii sunt meninui pn cnd sunt transferai la receptoare. n cazul n care transferul nu se realizeaz n 6-8 ore de la recoltare, se recomand congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o temperatur de 0o-4oC ntr-un mediu de conservare identic. n acest fel embrionii pot fi conservai una-dou zile fr ca viabilitatea s fie afectat. Conservarea de lung durat a embrionilor congelarea - rmne cea mai avantajoas metod de meninere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilitii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie s fie meninui n stare solid, n azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai sczute de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problem mai dificil constnd n atingerea acestor temperaturi fr a omor embrionii. n timpul
78

congelrii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheii intracelulare i concentraia salin ridicat. Pentru a prentmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de rcire const n deshidratarea parial a celulelor i evitarea ocului produs de concentraiile ridicate n sruri prin utilizarea unui Crioprotector, n general glicerol cu o concentraie de 1,5 M (sau 10% n volum) n mediul de congelare. Ca ageni criopro-tectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-glicol, glicerol, propilen-glicol. n prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe optimale de rcire (foto 23). Substanele crioprotectoare (n general polialcooli) sunt capabile s ptrund uor n celule printr-o simpl difuziune (osmoz), Foto 23 Model de freezer ntrziind formarea cristalelor de ghea prin coborrea punctului de nghe. Totodat, substanele crioprotectoare limiteaz efectele negative ale concentraiei saline ridicate, nlocuind o parte din apa intracelular atras prin creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea un rol protector fa de membranele celulare (hidrai de carbon, polivinilpirolidon), (Baril i colab., 1993). Viteza de coborre a temperaturii are importan mare n protejarea viabilitii embrionilor. Mediul care conine embrionii (extracelular) este mai bogat n ap dect mediul celular. Prin coborrea temperaturii, primele cristale de ghea se produc mai nti n mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraiei n soluie a fraciunii necristalizate. Aceast concentraie salin ridicat va provoca ieirea unei pri din apa celular, reducnd n acest fel formarea gheii intracelulare. Dac ritmul de rcire este prea rapid, apa intracelular nu poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate mare n interiorul celulelor i aceste cristale i mresc talia lor n timpul congelrii i decongelrii distrugnd structurile celulare. n cazul n care ritmul de rcire este lent, deshidratarea progresiv a celulelor antreneaz o cretere important a concentraiei n electrolii, n mediul celular, modificnd proprietile fizico-chimice (efectul soluiei), consecina fiind totdeauna pierderea viabilitii celulelor. Astfel, integritatea celulelor vii dup congelare este strns legat de dinamica apei intracelulare n timpul rcirii i deci de viteza de congelare. n cazul embrionilor, ritmul de rcire trebuie s corespund pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercetrilor ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirm faptul c acesta trebuie s se desfoare n dou etape diferite: o congelare lent, n dou trepte: la nceput 4oC/min pn la 6 7oC i 0,3-0,6oC/min ntre 7oC i 30 35oC, apoi o congelare rapid (brusc) de la -35oC pn la temperatura de pstrare -196oC. Timpul de ateptare al embrionilor din momentul recoltrii i pn la nceperea congelrii, nu trebuie s depeasc dou-trei ore. Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede urmtoarele: - alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun; - timp de la recoltare pn la nceperea congelrii: dou-trei ore;

79

introducerea embrionilor n mediul de congelare la temperatura laboratorului (20oC); - introducerea embrionilor n paiete identificate (mediu, bul de aer, embrioni +mediu, bul de aer, mediu); - rcirea pn la -6oC sau -7oC cu o vitez de 4oC/minut; - inducerea cristalizrii (palier 5-10 minute); - rcirea pn la 30oC sau 35oC cu o vitez de 0,3 - 0,6oC/minut; - introducerea paietelor ce conin embrionii, direct n azot lichid i stocarea lor (-196oC). Paietele se vor pstra n permanen n azot lichid pn n momentul transferului la femelele receptoare. Durata stocrii embrionilor n azot lichid nu influeneaz supravieuirea ulterioar a acestora. Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului Embrionii congelai la -35oC nu sunt dect parial deshidratai, o anumit cantitate de ghea se formeaz inevitabil n celule, n momentul imersiei n azot lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare s se produc o cretere a acestor mici cristale de ghea care s distrug celulele, decongelarea trebuie s se fac n timp, ct mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid i se introduc direct ntr-o baie de ap la 37oC, unde se menin circa 30 de secunde. Imediat dup decongelare, nlturarea rapid a crioprotectorului este indispensabil supravieuirii embrionilor. Totui, celulele care conin o concentraie ridicat de crioprotector nu trebuie s fie introduse direct ntr-un mediu izotonic, ntruct diferena mare de presiune osmotic va provoca ptrunderea prea rapid a apei n celul, ceea ce va risca s explodeze. De aceea, este necesar o ndeprtare progresiv a crioprotectorului astfel nct ieirea acestuia i ptrunderea apei n celul s fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare. Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz o rehidratare lent a celulelor embrionare. Diluia crioprotectorului pe etape const n trecerea succesiv a embrionilor prin bi cu concentraii descrescnde n crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M i 0 M). Meninerea embrionilor n fiecare baie este de 5-10 minute. n acest caz concentraia mediului n crioprotector este invers celei din perioada congelrii. Dup nlturarea lichidului de rcire, calitatea embrionilor poate fi apreciat printr-un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). n urma examenului morfologic, de regul sunt eliminai ca necorespunztori calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelai. Diluia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conine sucroz are la baz accelerarea ieirii acestuia din celule. Molecula de sucroz avnd o greutate molecular mare (344) nu ptrunde n celule prin simpl difuziune; prezena sa n mediu creaz o mrire a presiunii osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerat a crioprotectorului din celule. Pentru aceasta, embrionii decongelai sunt introdui direct ntr-o soluie de PBS care conine 0,25-0,5 M sucroz, apoi n dou-trei bi succesive de PBS nainte de examinare i transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul sucrozei, direct n interiorul paietei. Pentru aceasta, n momentul introducerii embrionilor n paiete pentru congelare, alternana diverselor medii din paiet este: la mijloc embrionul n mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, nconjurat de bule de aer i apoi la exterior PBS+sucroz 0,25 M. Dup decongelare paieta se
80

scutur n vederea amestecrii mediilor pe baz de etilen glicol i cele pe baz de manoz, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului n afara celulei n cteva minute. Embrionii sunt transferai fr selecie prealabil, mpreun cu coninutul paietei direct n uterul femelelor receptoare. Aceast metod mai necesit unele verificri. Nivelul supravieuirii embrionilor dup decongelare este condiionat de mai muli factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor nainte de congelare, femela donatoare etc. Embrionii transferai n stadiul de morul realizeaz o proporie de supravieuire in vitro mai redus (64%), comparativ cu cei transferai n stadiul de blastocist (81%), (Martinez i colab., 1985). Congelarea nu trebuie aplicat dect embrionilor de bun calitate, caz n care procentul de supravieuire dup transfer fiind uor inferior (10%) fa de nivelul supravieuirii obinut dup transfer direct, fr congelare. Originea genetic a donatoarei pare a avea un rol nsemnat asupra aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelai efect denumit i efectul donatoarei a fost demonstrat prin faptul c procentul de supravieuire a embrionilor congelai n aceleai condiii poate varia de la 0 la 78% n raport cu donatoarea. 2.2.9. Transferul embrionilor O atenie deosebit va fi acordat seleciei femelelor receptoare, ntruct condiioneaz n mare parte rezultatele dup transfer. Aa cum s-a menionat n capitolul anterior, receptoarele trebuie s aib o activitate sexual ciclic, s fie bine dezvoltate corporal, fr afeciuni ale tractusului genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la viele n vrst de 18 luni cu condiia atingerii a cel puin 2/3 din greutatea corporal a adultului. Transferul embrionilor se face cu foarte bune rezultate i la vaci adulte n vrst de 3-6 ani dac funcia de reproducie s-a desfurat normal. Examenul femelelor receptoare se completeaz cu aprecierea ultimului estru, care trebuie s aib loc ntre parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea de sntate a conductului vestibulo-vaginal i al orificiului vaginal al cervixului). Pregtirea receptoarelor const ntr-o sincronizare ct mai perfect a ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie n clduri naturale fie n clduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele menionate anterior). O atenie special se va acorda depistrii ciclurilor (dimineaa, prnz, seara) apoi se determin momentul exact al nceputului estrului. naintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului se va face n vrful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaa cruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obinut i prin depunerea embrionului la circa 10 cm de la bifurcaia coarnelor uterine n lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. nainte i imediat dup transfer se va evita orice stres: vaccinri, tratamente antiparazitare, ecornri, lotizri, tuberculinri, recoltri de snge etc. Se va evita schimbarea brusc a regimului alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primvara 4 sptmni dup transfer. Variaiile climatice determin o cretere a mortalitii embrionilor dup transfer. n cazul folosirii embrionilor proaspei, receptoarele se in ntr-un grajd curat i ct mai aproape de donatoare. Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizeaz prin dou metode: chirurgical i nechirurgical.
81

Transferul chirurgical s-a aplicat n perioada de nceput i a constat n deschiderea cavitii abdominale (pe linia alb sau n flanc), exteriorizarea cornului uterin i depunerea embrionului pe cornul uterin corespunztor ovarului cu corp galben prin puncionarea peretelui acestuia. Este o metod laborioas, costisitoare, traumatizant pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei. Metoda actual care d cele mai concludente rezultate este cea nechirurgical. Aceast metod folosete calea vagin-cervix, asemntor nsmnrii artificiale. Pentru transfer se folosete un pistolet tip Cassou n care se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspt recoltat. Pentru a se evita contaminarea nveliului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul traversrii conductului vestibulo-vaginal, se fixeaz un al doilea nveli din material plastic care este secionat pe toat lungimea sa. Dup ce pistoletul ajunge n lumenul cervical, acest nveli protector se retrage. Pentru a nvinge rezisteana cervixului (n aceast faz cervixul fiind nchis) se folosesc uneori dilatatoare. La circa 10 cm de bifurcaie, pe cornul uterin corespunztor ovarului ce conine corpul galben, se depune embrionul, asemntor nsmnrii artificiale. Aceast metod este exclusiv folosit n present. Traversarea cervixului trebuie s se realizeze cu mare precauie n vederea evitrii lezionrii mucoasei acestuia. n vederea relaxrii cervixului, a evitrii contraciilor organelor genitale se efectueaz anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2%, sau alte preparate medicamentoase cu efect similar. 2.3. Biotehnologia transferului de embrioni la rumegtoarele mici Ca i la rumegtoarele mari, folosirea transferului de embrioni la rumegtoarele mici se practic cu scopul multiplicrii descendenei femelelor cu nalt potenial genetic, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni congelai i asigurrii bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercetri fundamentale n reproducia animalelor i biologia celular. Reglarea i controlul funciei de reproducie la rumegtoarele mici sunt influenate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35o, rumegtoarele mici au un sezon de reproducere limitat, care ncepe ctre sfritul verii i se ncheie ctre finele sezonului de toamn. n decursul unui an, funcia sexual la oaie se caracterizeaz prin alternarea a dou perioade:o perioad de anestru fiziologic, cuprins ntre sfritul iernii i nceputul verii;o perioad de activitate sexual, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprins ntre sfritul verii i nceputul iernii (10-14 sptmni dup cea mai lung zi). Anestrul fiziologic se datoreaz att factorilor materni (anestru de lactaie), ct i factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunnduse. Periodicitatea sexual sezonier este atribuit influenei modulatoare a fotoperiodismului, temperaturii, umiditii i alimentaiei asupra unui ritm ciclic anual de baz, condiionat genetic. Factorul principal n stimularea funciei sexuale la oi este reprezentat de reducerea progresiv a numrului de ore lumin, iar cel subordonat este scderea temperaturii i schimbarea alimentaiei. Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca animalele zilelor scurte. Fotoperiodismul regleaz funcia de reproducie la oi prin intermediul melatoninei, hormon secretat de glanda epifiz. Epifiza controleaz momentul apariiei maturitii sexuale i sezonul de reproducie. Melatonina regleaz funcia de reproducie prin schimbarea secreiei hormonilor gonadotropi. O dat cu micorarea zilei lumin, secreia melatoninei crete i activeaz funcia sexual.
82

Factorii de mediu trebuie s aib un anumit nivel pentru a influena pozitiv funcia de reproducie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativ 65-85%, durata zilei lumin - 4-7 ore. Ali factori ai mediului ambiant (relaiile dintre indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator n blocarea sau declanarea activitii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex. efectul mascul) permite s se controleze mai bine perioadele de reproducie. Gradul de ovulaie variaz n timpul sezonului de reproducie. Nivelul acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile inute la temperaturi sczute, n timpul verii, ncep sezonul de reproducie mai devreme dect cele care n sezonul estival, au fost inute la temperaturi obinuite acestui anotimp. Oile expuse stresului termic n orele de dinainte sau de dup estru, prezint tulburri de fecunditate. Variaiile raiei de hran (date de variaiile disponibilitilor alimentare) determin oscilaii ale nivelului de fertilitate. La latitudini medii, variaiile fotoperioadei rmn factorul principal care declaneaz activitatea reproduciei la oi (Thimonier J. i colab., 1986). 2.3.1. Alegerea donatoarelor i receptoarelor Femelele care intr ntr-un protocol al transferului de embrioni trebuie s fie selecionate naintea nceperii operaiilor propriu-zise. Prima selecie a donatoarelor se face dup valoarea lor genetic pa baza unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectiv. n general, n alegerea donatoarelor se are n vedere ca acestea s se fi nscut n sezonul de reproducie precedent, fr tulburri ginecologice, s nu fie gestante, cu ovare normale, capabile s rspund la tratamentul superovulator (examen fcut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie). n cazul repetrii tratamentelor de superovulare, se investigheaz, prin probe de laborator, prezena sau absena anticorpilor contra hormonilor folosii la tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza contra gonadotropinelor heterospecifice i nu mai rspund la administrarea preparatelor hormonale de acest tip. n cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie s aib o greutate corporal de cel puin 60% din greutatea femelei adulte i s fie n vrst de cel puin 8-10 luni. naintea lotizrii, donatoarele (ca i receptoarele) se supun mai multor teste serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta (bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus i de legislaia sanitar-veterinar din mai multe ri, care prevede pentru femelele donatoare s fie indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare i receptoare se va face cu cel puin dou luni naintea tratamentului, pentru a se evita efectele negative ale stresului de adaptare la un nou mediu i pentru a se instala o nou ierarhie n interiorul lotului reconstituit. Donatoarele i receptoarele trebuie s fie supuse unui tratament antiparazitar cu spectru larg cu cel puin o lun naintea nceperii tratamentului. n cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi n special dirijat contra infestaiei constatate. Alimentaia donatoarelor i receptoarelor se va face dup norme tiinifice. Creterea nivelului energetic alimentar pe durata a trei sptmni care precede folosirea la reproducie (flushing) provoac, la ovine, o cretere a nivelului ovulaiei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovulaiei i
83

o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovulrii. Practica flushing-ului este recomandabil att pentru donatoare ct i pentru receptoare i n special cnd alimentaia nu acoper n totalitate nevoile energetice. La receptoare, nevoile nutriionale suplimentare datorate gestaiei, nu sunt diferite de cele legate de o gestaie natural, dar ele trebuie luate n consideraie pentru a se evita avortul consecutiv subalimentaiei. n preajma ftrii, o supraveghere atent a femelelor previne mortalitatea perinatal i erorile de descenden (filiaie). Alegerea donatoarelor se face pe baza performanelor genetice, starea fiziologic i sanitar. Donatoarele, n general, trebuie s fie de vrst medie, s aib o carier de reproducie fr tulburri notabile, s fie sntoase n urma examenului clinic general i ginecologic, fcut la trei luni naintea transferului de embrioni. Se respect un interval de cel puin 5 luni ntre ultima ftare i nceputul tratamentului. Alegerea receptoarelor se face, n general, dup aceleai criterii ca donatoarele, valoarea genetic nefiind luat n consideraie. Nuliparele sunt cele mai recomandate. n momentul transferului, receptoarele trebuie s fie n vrst de 8-10 luni i cu o greutate de cel puin 60% din greutatea medie a femelei adulte din rasa respectiv (30-35 Kg). n cazul n care receptoarele sunt achiziionate, acestea se integreaz cresctoriei cu cel puin trei luni naintea nceperii tratamentului, pentru a se adapta la noile condiii, dup ce au fost alese pe baza unor criterii stricte, ntruct femelele destinate reformei prezint adeseori probleme de reproducie i sanitare. Cu trei luni naintea transferului embrionar i pn la ftare se evit orice tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc. 2.3.2. Sincronizarea estrului i ovulaiei la femelele donatoare i receptoare Tratamentele hormonale specifice donatoarelor i receptoarelor se fac pentru a induce estrul i superovularea (donatoarelor) sau ovulaia (receptoarelor) la un moment predeterminat. Aceste tratamente urmresc de fapt un control temporar al activitii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai puin, a mecanismelor endocrine care controleaz ciclul sexual. Donatoarele i receptoarele sunt supuse unei serii de intervenii, cronologic precise. nainte de provocarea hormonal a superovulaiei se impune stabilirea cu exactitate a momentului apariiei ciclului estral. Depistarea manifestrii cldurilor se face de dou ori pe zi (dimineaa i seara) prin folosirea berbecilor ncerctori de calitate. Pentru provocarea superovulaiei, se folosesc oi cu ciclu natural sau sincronizat. Pentru standardizarea strii fiziologice a donatoarelor la nceputul stimulrii i mai ales sincronizarea intrrii n estru la terminarea tratamentului stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfritul tratamentului progestativ, stimularea creterii foliculare se face prin administrarea hormonilor gonadotropi cu scopul creterii numrului de ovulaii/femel (superovulaie). Att pentru sincronizare (tratamente progestative) ct i pentru stimularea ovarin (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

84

2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare Difer prin substanele progestagene folosite i prin calea de administrare: a) injecii zilnice a cte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21 de zile la capr sau 12-14 zile la oaie; b) implante vaginale, reprezentate de burei de poliuretan impregnai cu 60 mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston (FGA) sunt n prezent cele mai folosite; c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub pielea de la nivelul suprafeei externe a urechii. Eficacitatea acestei ci de administrare a progesteronului este asemntoare celei a pesariilor vaginale. Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apeleaz la pesariile vaginale impregnate cu FGA. Durata tratamentului difer n raport cu specia i cu sezonul. La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandat a tratamentului variaz n funcie de perioada anului: 14 zile n timpul sezonului sexual i 12 zile nafara sezonului sexual. La caprine, durata tratamentului trebuie s fie de 17-21 zile (tratament lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) n asociere cu prostaglandinele. n cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai scurt dect cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injecie de PGF2 (50 g Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore naintea tratamentului progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi nc activi n momentul retragerii suportului de progestagen. d) sincronizarea estrului poate fi fcut fr a se realiza impregnarea printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincron prin dou injecii, la interval de 10-14 zile, de prostaglandin F2, (50-100 g de Cloprostenol etc). Aceast metod nu d rezultate la femelele neciclice (n afara sezonului sexual), iar pe de alt parte, procentul oulor divizate este mai slab la femelele donatoare dect n cazul unui tratament progestativ. 2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovarian Stimularea creterii foliculare pentru inducerea superovulaiei donatoarelor sau ovulaiei receptoarelor survine cel mai adesea la sfritul tratamentului progestativ, i este realizat prin injecii intramusculare de gonadotropine hipofizare sau extrahipofizare. Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovulaiei poate fi efectuat n cursul unui ciclu natural, prin nceperea stimulrii cu 48 de ore naintea momentului prezumat al luteolizei spontane, ns aceast metod este ineficace n perioada anovulatorie i dificil de aplicat n cazul tratamentului mai multor femele nesincronizate n prealabil. Administrarea gonadotropinelor are loc, n general, la finele tratamentului progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va determina o cretere a numrului de foliculi preovulatori i la ovulaia mai multor foliculi. Stimularea cu ajutorul PMSG const ntr-o injecie de 750-1500 U.I. PMSG efectuat 48 de ore naintea terminrii tratamentului progestativ. Durata relativ lung a activitii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG nc n circulaie n preajma estrului provoac o activitate folicular anormal n acest
85

stadiu care perturb mediul hormonal n timpul fecundaiei i a primelor faze ale dezvoltrii oulor. Aceste efecte au drept consecin general o slab producie de embrioni de bun calitate i ca urmare, acest hormon este din ce n ce mai puin folosit pentru inducerea poliovulaiei. Repetarea tratamentului superovulator cu PMSG determin o reducere accentuat a rspunsului ovulator. Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecvent metod folosit pentru provocarea superovulaiei la rumegtoarele mici. Cantitile de FSH care se administreaz pentru a obine superovularea sunt adesea exprimate n mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activitii unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 g de hormon FSH pur). Administrarea FSH-p se face n zilele 2, 3 sau 4 dup tratamentul progestativ, n doz de 12-24 mg/femel. Perioada scurt de njumtire (3-4 ore), face ca doza s fie repartizat n mai multe injecii pentru a determina superovularea. n intervalul de dou-patru zile de la ncheierea tratamentului progestativ se injecteaz FSH-p, 4-8 injecii, de dou ori/zi, la interval de 10-12 ore, n doze descrescnde (trei zile de tratament). Tratamentul de superovulare se poate face i cu extracte hipofizare de cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal gonadotropin) care determin un rspuns ovulator i o producie de embrioni similare celor observate dup tratamentul cu FSH-p la caprine i ovine, ns aceste preparate sunt puin disponibile. Pentru provocarea superovulaiei se poate asocia tratamentul pe baz de PMSG cu cel pe baz de FSH-p. Pentru aceasta, se asociaz 48 de ore naintea retragerii spongiilor vaginale cu o injecie de 12-18 mg de FSH-p ce se administreaz n 6 injecii sau ntr-o singur injecie concomitent cu administrarea de PMSG. Rspunsul superovulator este condiionat de mai muli fatori, ntre care menionm: rasa, individul, apariia anticorpilor n cazul repetrii tratamentului, tipul de hormon folosit etc. 2.3.2.3. Inducerea estrului i ovulaiei la receptoare Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci cnd transferul se face fr interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor i receptoarelor ncepe n acelai moment, astfel nct s se gseasc n acelai stadiu fiziologic n momentul transferului embrionar. O injecie de PMSG se face ctre sfritul tratamentului progestativ: injecia cu PMSG se face cu 48 ore naintea retragerii spongiilor vaginale la capr i n momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injecia se face cu 48 ore naintea retragerii bureilor vaginali impregnai cu progestagene, iar ovulaia se produce cu circa 12 ore mai trziu dect la donatoarele supuse aceluiai tratament asociat cu FSH-p. n acest caz, pentru receptoare se ntrzie terminarea tratamentului progestativ cu circa 12 ore n raport cu donatoarele care au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p. La oile receptoare, injecia de PMSG se face n momentul retragerii spongiilor vaginale. Oile intr n clduri dup circa 36 de ore, cu o ntrziere de 12 ore, n raport cu donatoarele tratate cu FSH-p. Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff. Dozele de PMSG variaz cu sezonul, vrsta i nivelul produciei de lapte (caprine).
86

La donatoare, variabilitatea momentului ovulaiei este un factor limitant al nivelului de fecunditate, mai ales critic n cazul folosirii spermei congelate. Principalul criteriu folosit pentru depistarea nceputului estrului este manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina practic debutul estrului, se folosete un mascul vasectomizat sau prevzut cu or, care este pus n prezena femelei la interval de 4-6 ore, ntre 20 i 60 de ore dup terminarea tratamentului progestativ. Insuficiena libidoului la mascul poate fi un factor limitant al eficacitii deteciei estrului. 2.3.3. nsmnarea femelelor donatoare Fecundarea donatoarelor poate fi fcut fie pe cale natural, practicndu-se monta liber sau dirijat, fie prin nsmnare artificial, cnd se poate ntrebuina sperma proaspt sau congelat care poate fi depus fie pe cale cervical sau direct n uter sub controlul endoscopic. n toate cazurile este important s folosim masculii cu o fertilitate ridicat. Monta a fost cea mai ntrebuinat metod de nsmnare a femelelor donatoare n cursul sezonului sexual att la ovine ct i la caprine, ns nu permite folosirea raional a masculilor valoroi, repartiia geografic a acestora fiind neuniform, acetia fiind concentrai n centrele n care se practic nsmnarea artificial (depozite ORSA), cnd se practic monta liber, masculii i femelele sunt lsai mpreun pe perioada estimat a cldurilor, pentru fiecare mascul repartizndu-se 3-4 femele. n cazul practicrii montei dirijate, fiecare femel descoperit n clduri trebuie s fie dat la mont de cel puin dou ori la interval de 10-12 ore. Momentul nsmnrii artificiale cea mai eficace este ntre 12 i 24 de ore de la nceputul estrului. Cnd se practic monta n contrasezon, absena sau slaba manifestare a libidoului masculilor sunt cauzele nerealizrii procentului de fecunditate normal la femelele donatoare, la care se adaug i puterea fecundant foarte sczut a spermei n aceast perioad. nsmnarea artificial permite valorificarea spermei masculilor a cror valoare genetic este cunoscut. Cercetrile au demonstrat faptul c transportul i supravieuirea spermatozoizilor n cile genitale femele sunt perturbate dup tratamentul progestativ i/sau cu prostaglandine asociate i a induciei ovulaiei (Evans i colab., 1984). Eficacitatea nsmnrii artificiale endo- sau exocervicale la rumegtoarele mici superovulate este sensibil redus comparativ cu animalele martor nesuperovulate. Nivelul oulor divizate obinute prin aceast metod este adeseori insuficient i inferior celui obinut dup mont. Mai mult, nivelul fecundaiilor este strns dependent de nivelul rspunsului ovulator la tratamentul de stimulare. La ovine, se folosete pentru nsmnare numai sperma proaspt. Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor nsmnate pe cale cervical. Doza de sperm este de 2x400x106 spermatozoizi total n sperma proaspt, sperma depunndu-se la intrarea n cervix. Anatomia cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de nsmnare. La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practic curent. Sperma se depune pe canalul cervical la 48 i 54 de ore (dou nsmnri artificiale) sau la 30, 48 i 54 de ore (trei nsmnri artificiale) dup sfritul tratamentului progestativ. Totui, procentul oulor fertilizate este sczut, datorit
87

faptului c nivelul ridicat de estrogeni dup un rspuns bun la tratamentul progestativ, inhib transportul spermatozoizilor pe cile genitale femele. nsmnarea artificial intrauterin, sub controlul endoscopic, este destul de rspndit la rumegtoarele mici. Aceast tehnic permite folosirea spermei congelate i obinerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Numrul de spermatozoizi mobili/doz prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la circa 80-100 milioane i se face o singur nsmnare artificial. nsmnarea artificial intrauterin se face la 48-60 de ore dup sfritul tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore dup nceputul estrului la capre sau la 32 de ore dup nceputul cldurilor la oi (87% embrioni viabili). 2.3.4. Recoltarea embrionilor Operaiile de colectare i transfer a embrionilor sunt eficiente sub anestezie general, femelele fiind supuse, n prealabil, unei diete alimentare i hidrice n cursul a 24 de ore care premerg intervenia chirurgical. Embrionii sunt recoltai prin splri succesive a celor dou coarne uterine n a 6-a sau a 7-a zi dup nceputul estrului. Acest interval de timp relativ scurt n care embrionii pot fi recoltai, este condiionat de mai muli factori: - trecerea embrionilor din lumenul oviductului n cel al coarnelor uterine se produce ncepnd cu a 4-a zi; - pentru raiuni sanitare, legislaia prevede ca embrionul s fie transferat nainte de a iei din zona pelucid, care poate surveni ncepnd cu a 8-a zi; - congelarea embrionilor se poate face cel mai bine cnd acetia se gsesc n stadiile de morul compact i blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de la nceputul estrului). Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2% albumin seric bovin sau de 10% ser de viel fetal meninut la 37oC. Embrionii sunt recoltai aproape n exclusivitate, fie prin laparotomie abdominal (metoda chirurgical), fie sub control endoscopic (colectare prin endoscopie sau laparoscopie). S-a ncercat colectarea embrionilor i prin mijloace nechirurgicale, pe cale cervical, asemntor ca la rumegtoarele mari sau la cabaline, ns rezultatele sunt foarte slabe, datorit traversrii dificile a conductului cervical i a imposibilitii manipulrii coarnelor uterine prin palpare rectal. Recoltarea prin metoda chirurgical se face pe femela sub anestezie general, contenionat pe o mas n decubit dorsal, cu o nclinare antero posterioar de 35-45o. Se face o incizie lung de 8-10 cm pe linia alb naintea atarii mamelei. Se exteriorizeaz coarnele uterine, se numr corpii galbeni de pe ambele ovare, pentru a se aprecia rspunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). n cazul n care recoltarea se face dup dou-patru zile de la debutul estrului, majoritatea embrionilor se regsesc n lumenul oviductului. Un cateter cu un diametru de 1 mm se introduce circa 2 cm pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de PBS sunt injectai cu scopul de a-i antrena n coarnele uterine. Apoi se spal coarnele uterine sau se recupereaz la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul injectat la baza coarnelor uterine . n cazul n care recoltarea embrionilor se face n zilele 6-7, se spal fiecare corn uterin cu ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se face o puncie
88

la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul punciei se introduce o sond Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este obturat, prin umflarea balonaului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter introdus la nivelul jonciunii utero-tubare se injecteaz 40-50 ml de PBS, recuperarea lichidului care antreneaz i embrionii fcndu-se prin sonda Folley. Mediul de splare poate fi injectat la nivelul sondei Folley i recuperat prin cateterul introdus anterior (perfuzie anterograd ) legat cu un tub steril plasat ntro baie marin la 37oC. Se procedeaz la splarea succesiv i separat a celor dou coarne uterine apoi se introduce un antibiotic n cavitatea abdominal i se nchide plaga de la nivelul coarnelor uterine i al peretelui abdominal. Aceast metod este cea mai rspndit la rumegtoarele mici. Nivelul de recuperare a embrionilor oscileaz ntre 70 i 90%, ns diminu mult atunci cnd se fac recoltri repetate de la acelai animal (52-24%) la ovine i 65-42% la caprine n cazul colectrilor 2 i 3. Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziat se contenioneaz pe o mas de operaie, n decubit dorsal, cu o nclinare anteroposterioar de 30-45oC. O prim puncie se face la 4-5 cm naintea glandei mamare i la 10-15 cm la stnga liniei albe. Se introduce o canul cu un diametru de 7 mm, care poart endoscopul. Se insufl aer filtrat n cavitatea abdominal pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canul, cu un diametru de 5 mm, se introduce n partea opus primei, n raport cu linia alb i prin care se introduce o pens atraumatic pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi numrai. Un corn uterin se prinde la nivelul ligamentului intercornual i se puncioneaz cu un ac avnd diametru de 2,5 mm. A treia canul, cu diametru de 5 mm, se plaseaz pe linia alb, la 15 cm de prinderea glandei mamare. Prin aceast canul se introduce o sond cu trei ci pn n lumenul uterului. Balonaul fixat la sond este umflat cu aer prin intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor uterine. Extremitatea cateterului este deplasat ct mai aproape posibil de jonciunea utero-tubar. Pensa se fixeaz la nivelul istmului pentru a se evita refularea mediului de colectare n oviduct. Mediul de colectare se injecteaz prin corpul sondei (40-50 ml pentru fiecare corn). Presiunea creat de lichidul introdus permite returul acestuia prin cateter. Se poate folosi i o sond cu dou ci. n acest caz, a doua puncie se face la vrful cornului uterin pe unde se inser un cateter de injecie, fixat la pensa atraumatic. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda plasat la baza coarnelor uterine. Proporia de embrioni recuperai prin endoscopie este inferioar cu 10-15% celei obinute prin chirurgie, ns repetarea colectrilor de la aceeai femel prin endoscopie nu provoac reducerea proporiei de embrioni colectai. 2.3.5. Examenul i aprecierea embrionilor Mediul de colectare recuperat dup cltirea coarnelor uterine este turnat ntr-o plac Petri cu fundul cadrilat care s uureze cercetarea embrionilor la o lup binocular. Embrionii depistai sunt aspirai cu ajutorul unei pipete fine sau a unei seringi racordat la un tub transparent din plastic i introdui ntr-o cutie Petri mai mic ce conine PBS filtrat i suplimentat cu 4% albumin seric bovin sau 10% ser de oaie sau de capr. Se apreciaz calitatea embrionilor recuperai.

89

Mediul de colectare i examen a embrionilor este meninut la o temperatur de +25+27oC, clasificarea embrionilor fcndu-se n urmtoarele categorii: nefecundai, degenerai, retardai sau morul compact, blastociti tineri, blastociti extini sau blastociti ieii din zona pelucid. Viabili se consider embrionii care au o form regulat, sferic, cu citoplasma omogen, nveli transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte important este i stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind c ncetinirea ritmului de diviziune constituie, n majoritatea cazurilor, dovada unui nceput de degenerare a embrionilor. Embrionii sunt clasai n exceleni, buni, de calitate medie sau necorespunztori. Numrul de embrioni degenerai crete considerabil cu vrsta acestora, ncepnd cu a 5-a zi de la nsmnarea artificial. Abaterile de la morfologia normal survin la animalele donatoare sub aciunea nefavorabil a unor concentraii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor degenereaz n stadiul de morul pn n ziua a 8-a. n practic se poate asigura un procent ridicat de ftri alegndu-se embrioni dup atingerea stadiului de blastocist. n momentul colectrii - n ziua a 7-a - unii embrioni de oaie i capr pot prezenta o uoar ntrziere n dezvoltare (morul compact) pe cnd alii sunt ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ieit din zona pelucid). La capre, dezvoltarea embrionar precoce apare cu o ntrziere de 12-24 de ore n raport cu cea observat la oi. n ziua a 7-a dup debutul estrului, proporia embrionilor n stadiul de blastocist ieit din zona pelucid este mai ridicat la oi dect la capre (oaie: 95%; capr: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril i colab., 1993). Embrionii care au o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai. n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton embrionar) trebuie s fie vizibile i s prezinte un contur bine delimitat. Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin, a granulaiilor la suprafaa celulelor, absena contururilor celulare vizibile sau prezena unei opaciti evidente a blastomerelor, constituie criterii de eliminare a embrionilor. Dup aprecierea calitii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecui prin 10 bi succesive de PBS n vederea nlturrii eventualelor bacterii sau virui. Aceast practic este recomandat de Societatea Internaional de Transfer Embrionar i confer o siguran sanitar pentru stocarea sau folosirea unui embrion sntos. 2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor ntr-un interval de timp care nu depete dou ore de la colectare, dup cltire, embrionii sunt trecui prin mai multe bi succesive de PBS adiionat cu glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5 minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asemntor celor precizate la bovine. Embrionii sunt condiionai n paiete mici (0,25 ml) i congelai treptat, scderea temperaturii mediului fcndu-se cu circa 1oC/minut pn la -7oC. n acest stadiu, cristalizarea este indus (vezi cele menionate la congelarea embrionilor bovini), apoi scderea temperaturii se face cu cte 0,3oC/minut pn la -35oC, dup care paietele sunt introduse direct n azot lichid.
90

Decongelarea se face, ca i la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu embrioni, timp de 30 secunde, ntr-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt trecui succesiv prin 3-4 bi de PBS, la care s-a adugat crioprotector n concentraie descrescnd (invers dect la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3 M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare progresiv a celulelor embrionare. Se apreciaz iari calitatea embrionilor, cei care au suferit n timpul acestor operaii fiind eliminai. 2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare Transferul embrionilor trebuie s se fac ntr-un interval ct mai scurt de timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se realizeaz aproape n exclusivitate chirurgical, laparoscopic. 2.3.7.1. Transferul chirurgical Dup anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm n lungul liniei albe, 3-4 cm naintea atarii glandei mamare. Se exteriorizeaz coarnele uterine, se examineaz ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmeaz s se fac transferul. Embrionii sunt aspirai ntr-un volum mic de PBS (30-50 l), aplicnd principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la bovine), de regul ntr-un cateter adaptat la o sering de 1 ml. Diametrul extern al capilarului-cateter trebuie s fie de circa 1 mm. Se puncioneaz cornul cu un ac cu vrful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul fr a leza mucoasa i se expulzeaz uor embrionii ctre treimea superioar a cornului uterin ipsilateral ovarului care prezint un corp galben funcional. De regul, se transfer doi embrioni n acelai corn uterin. Dup transfer se instil n cavitatea abdominal 1000000 U.I. penicilin, peritoneul i pielea fiind apoi suturate (foto 24).

Foto 24 Transferul embrionilor la oile receptoare (I.C.P.C.O.C. Palas-Constana)

91

2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic Receptoarea anesteziat este fixat n decubit dorsal pe o mas de contenie nclinat la 30-35oC. Se pregtete i dezinfecteaz cmpul operator, naintea glandei mamare. Se face o puncie n abdomen pe unde se introduce canula endoscopului. Se insufl puin aer prin canul pentru a se uura vizualizarea tractusului genital. O a doua canul este inserat n partea opus primei, n apropierea liniei albe, prin care se introduce o pens de manipulare atraumatic. Cu ajutorul acestei pense se controleaz rspunsul ovulator pe fiecare ovar i se alege cornul uterin pe care urmeaz s fie transferai embrionii, corespunztor ovarului care are corpul galben funcional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins n apropierea jonciunii utero-tubare i puncionat cu un ac lung de 30 cm i cu un diametru de 1,5 mm, n prealabil inserat sub linia alb. Embrionii sunt cundiionai ntr-un volum de 30-50 l (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer, lichid+embrion) ntr-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la o sering de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul i furtunul sunt introduse ntr-un tub metalic care asigur rigiditatea i maniabilitatea ansamblului. Printr-o a 3-a canul plasat pe linia alb la 15 cm de la ataarea glandei mamare, capilarul de transfer este introdus n cavitatea abdominal, apoi, prin punctul de jonciune n lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depui cu atenie. Dup retragerea instrumentelor, se pulverizeaz un antibiotic la nivelul celor trei locuri de puncie a peretelui abdominal. Dup cptarea dexteritii necesare, transferul prin endoscopie se poate face n 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult mai redus dect n cazul transferului pe cale chirurgical. Procentajul de reuit a transferului de embrioni prin cele dou metode variaz ntre 70,5% i 75,6% la caprine i ntre 69% i 74% la ovine. Pentru reuita transferului de embrioni la rumegtoarele mici, o condiie important const n sincronizarea ct mai bun a ciclurilor estrale la donatoare i receptoare, astfel nct, s existe concordan ntre particularitile dezvoltrii embrionului i modificrile mediului uterin.

92

NTREBRI RECAPITULATIVE 1. Definii i detaliai importana transferului de embrioni la animale. 2. Care sunt etapele transferului de embrioni? 3. Prin ce mijloace se poate realiza sincronizarea estrului i ovulaiei la femelele donatoare i receptoare de embrioni? 4. Care sunt schemele de tratament poliovulator la vaci? 5. Care sunt schemele de tratament poliovulator la oi? 6. Care sunt particularitile recoltrii embrionilor la vac? 7. Care sunt particularitile recoltrii embrionilor la oaie? 8. Care sunt criteriile dup care sunt evaluai calitativ embrionii recoltai de la femelele donatoare? 9. n ce constau tehnicile de conservare a embrionior? 10. Care sunt tehnicile transferului de embrioni la vac i oaie? TEME 1. Folosirea preparatelor hormonale pentru sincronizarea estrului si inducerea poliovulatiei la rumegatoare 2. Recoltarea embrionilor la taurine 3. Evaluarea embrionilor la rumegatoare 4. Congelarea embrionilor 5. Transferul embrionilor la receptoare REFERATE 1. Biotehnologia transferului de embrioni la taurine 2. Biotehnologia transferului de embrioni la ovine si caprine

93

CAPITOLUL III BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER DE EMBRIONI

3.1. Fecundaia in vitro Este o biotehnic de actualitate, prin intermediul creia procesele fiziologice de maturare a gameilor femeli i de capacitare a spermatozoizilor, fecundaie i cultur a embrionilor pn la stadiul transferului acestora n organismul femelelor receptoare, sunt dirijate i se produc, parial sau total, n afara organismului femelei (in vitro) n diferite medii de cultur. Aceast biotehnic, dei bazele teoretice i practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai nainte, a cptat un interes mai deosebit n ultimele dou decenii. Cu toate preocuprile destul de intense n acest domeniu, succesul nregistrat la mamiferele domestice este destul de limitat. La mamifere, fecundaia fiind intern, analiza intim a mecanismelor implicate n acest proces biologic este delicat i costisitoare. Fecundaia in vitro constituie o biotehnic ce permite studierea in vitro a interaciunilor dintre cei doi gamei sub rezerva reproducerii artificiale a condiiilor identice existente ,,in vivo. Dup cum s-a studiat la capitolul Fecundaie, elementele eseniale ale acestui interesant i complex proces, constau dintr-o serie de interaciuni ntre cei doi gamei care, n final, conduc la unirea lor i la combinarea genotipurilor. Principalele secvene ale fecundaiei se refer la: - fixarea spermatozoizilor de zona pelucid, urmat de strbaterea acestei membrane; - fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gamei; - ncorporarea spermatozoidului n ooplasm i activarea ovocitului; - singamia. n momentul ovulaiei, ovocitul este captat de pavilion i descinde de-a lungul oviductului. La majoritatea animalelor de ferm, celulele coroanei radiata sunt eliminate rapid dup ovulaie. Spermatozoizii dobndesc puterea lor fecundant n cursul naintrii prin tractusul genital femel. Numrul gameilor masculi care ajung la nivelul oviductului, n momentul ovulaiei, este foarte restrns, astfel nct raportul dintre spermatozoizi i ovocite la rumegtoare variaz de la 1 la 10. De asemenea, reacia acrozomului spermatozoidului se produce la nivelul zonei pelucide. n consecin, rolul oviductului este de a asigura dezvoltarea embrionului pn la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece n vrful cornului uterin. Cercetrile efectuate au relevat faptul c fluidul oviductului (sau lichidul tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele nsuiri fizico-chimice speciale: concentraie mai ridicat a ionilor de K+ i un nivel mai sczut al concentraiei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul secreiei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele schimburi cu lichidul peritoneal. n condiii naturale, embrionul prsete oviductul, n general, dup al 3lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specific.
94

Astfel, embrionii bovini se dezvolt n oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaic. Aceast dezvoltare a embrionului pn la stadiul de blastocist la nivelul oviductului chiar provenind de la alt specie, constituie un fenomen remarcabil. Primele rezultate obinute cu ovocite maturate in vivo au fost obinute n anul 1954 la iepuroaic, n 1969 la oarece i n 1980 la bovine (Marquant B. i colab.,1991). Primul produs obinut printr-o astfel de biotehnic este consemnat n anul 1959 la iepure, 1978 la om i n 1982 la bovine. n ceea ce privete produii rezultai prin fecundaia cu ovocite maturate in vitro, n 1972 s-au obinut primii zigoi de oarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltai de la nivelul epididimului; n anul 1973 s-au obinut produi la iepure prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi capacitai n uter; n anul 1986 s-au obinut primii miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculai; n 1986 s-au obinut primii viei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi conservai prin congelare (Marquant B. i colab.,1991). Dup aceste prime succese nregistrate, fecundaia in vitro s-a generalizat, dup cum s-a vzut, la toate mamiferele de interes zootehnic, ns obinerea unui nivel ridicat de fecundaie in vitro s-a nregistrat mult mai trziu. Nivelul relativ sczut de fecundaie nregistrat n perioada de nceput a aplicrii fecundaiei in vitros-a datorat n special, folosirii unei temperaturi inadecvate acestei etape. S-a demonstrat c temperatura central la mamifere este de 39oC ceea ce face ca nivelul procentului de fecundaie nregistrat la incubarea gameilor la 37oC s fie extrem de sczut. Etapele fecundaiei in vitro sunt: - obinerea ovocitelor; - maturarea in vitro a ovocitelor; - capacitarea spermatozoizilor; - fecundarea i cultura in vitro; - transferul embrionilor rezultai. 3.1.1. Obinerea ovocitelor Sursele posibile pentru ovocite sunt: - ovocite provenite prin puncia foliculilor maturi de la femele cu estru spontan sau superovulat, recoltate nainte sau imediat dup ovulaie; - ovocite obinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor sacrificate sau ovariectomizate; - ovocite rezultate din oviducte, imediat dup ovulaie. Prima i a treia surs de ovocite sunt limitate, deoarece numai un numr mic de foliculi se matureaz i ovuleaz spontan, sau numai un numr relativ restrns de foliculi pot fi activai prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi recoltate din foliculi maturi sau din oviduct n primele 6 ore de la ovulaie, plasate ntr-un mediu Krebs-Ringer i incubate la 38oC, umiditatea relativ de 100% i 5% atmosfer de CO2. Ovocitele obinute prin puncia ovarelor provenite de la animalele sacrificate la abator sau a ovarelor obinute prin ablaia acestora, constituie o surs important de gamei femeli, ns aceste ovocite necesit a fi maturate ,,in vitro. Puncia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu potenial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor n astfel de condiii se mai poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, n vederea prelevrii lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu
95

hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncia foliculilor, ghidat prin ecografie transvaginal permite colectarea fluidului folicular i a complexelor ovocite-cumulus. Aceast tehnic poate fi repetat de mai multe ori n cursul aceluiai ciclu, fr a afecta fertilitatea ulterioar a femelei donatoare. 3.1.2. Maturarea in vitro a ovocitelor Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea femelelor, reiau spontan meioza dac sunt plasate ntr-un mediu special de cultur, la 38oC, incubate ntr-o atmosfer de 5% CO2. Prezena unui cumulus compact i intact n momentul cultivrii ovocitelor favorizeaz reluarea meiozei pentru majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronic au artat c celulele cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traverseaz zona pelucid i stabilesc legturi funcionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legturi, parial sunt ntrerupte, dup 3 ore de cultur a ovocitului n mediul special, pentru ca dup 16-18 ore de cultur, contactele dintre celulele cumulus-ului i ovocit s dispar complet. Ruperea membranei nucleare se produce dup 6-12 ore de cultur i emiterea primului globul polar dup 24 de ore. Aceste transformri nucleare, ce deosebesc maturarea in vitro a ovocitelor, modificri observabile prin tehnici histologice, sunt nsoite de modificri citoplasmatice mult mai greu de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple experiene, c ovocitele cultivate n foliculul lor se matureaz asemntor celei observate ,,in vitro. La oaie, Staigmiller i Moor, 1984 (citai de Marquant B., 1991) au artat c adugarea unei suspensii de celule obinute din granuloasa foliculilor ovarieni n mediul de cultur, permite o maturare normal a ovocitelor. La vac, nivelul maturrii ovocitelor n medii cu sau fr adaos de celule din granuloas, nu variaz mult, ns prezena acestor celule permite restabilirea potenialului de dezvoltare a ovocitelor dup fecundaia in vitro. Ovocitele obinute prin puncia foliculilor dispui mai n profunzimea cortexului ovarian au un potenial de maturare i dezvoltare ulterioar mult mai slabe, comparativ cu ovocitele obinute prin puncia foliculilor mari, maturi, situai la suprafaa ovarului.

3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din momentul ejaculrii. Spermatozoizii trebuie s parcurg o perioad de pregtire, numit capacitare, care are loc in vivo, n tractusul genital femel. Capacitarea este o etap pregtitoare necesar, n urma creia spermatozoizii dobndesc capacitatea de a se fixa pe zona pelucid a ovocitului i sufer, apoi, reacia acrozomului. Studiile de microscopie electronic au artat c n decursul etapei de capacitare au loc dou fenomene mai importante: - modificri la nivelul membranelor spermatozoidului i acrozomic extern, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice i acrozomic extern, n momentul reaciei acrozomului. Prin orificiile create, se elimin o cantitate din
96

colesterolul care antreneaz o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide, asociate unei permeabiliti membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza acestei constatri, toate mediile de capacitare folosite au n comun prezena serului albuminic, care este un acceptor de colesterol; - modificarea micrii spermatozoidului care, din liniar (prin nurubare) traiectoria devine, mai mult sau mai puin circular, micare ce se datoreaz creterii permeabilitii pentru ionii de calciu. Amplitudinea micrilor cozii se mrete, spermatozoidul fiind calificat ca hipermobil. Diversele medii i tehnici ntrebuinate pentru capacitarea spermatozoizilor ,,in vitro au n vedere faptul de a permite spermatozoizilor s sufere toate aceste modificri i mai ales s le menin o mobilitate ridicat. Capacitarea spermatozoizilor s-a obinut prin incubarea acestora la 37oC, timp de una-dou ore, ntr-un mediu cu o for ionic crescut, ceea ce a dus la detaarea proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltat prin ejaculare de la taur, a permis obinerea unui procent de fecundaie ridicat i naterea de viei normali, dup transferul embrionilor obinui prin fecundarea gameilor n astfel de medii. Diversele studii ntreprinse pe aceast problem, au artat c fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro este mult diferit de cea realizat in vivo. n oviduct, n condiii naturale, fecundaia are loc n absena celulelor din cumulus, pe cnd in vitro ovocitele nude, n momentul contactului cu spermatozoizii sunt fecundate ntr-o proporie foarte sczut comparativ cu ovocitele nconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune c celulele din cumulus au probabil un rol n capacitarea in vitro a spermatozoizilor. Majoritatea cercettorilor care se ocup de aspectele fecundaei in vitro folosesc sperma congelat, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru spermatozoizi sunt cele care conin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina. Totodat, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiiile naturale, deoarece aceast substan se gsete pe traiectul cilor genitale dup ovulaie. S-a dovedit c spermatozoizii de taur posed receptori pentru heparin, acetia acionnd n funcie de doz i uureaz ptrunderea calciului n spermatozoid. Se mai folosete, n mediile capacitante, lichidul folicular, care, ntre altele, conine i heparin. Un nivel de capacitare satisfctor se obine atunci cnd se practic o concentraie ridicat de spermatozoizi n mediu, care trebuie s fie de 3-4 miliarde spermatozoizi/ml, cnd nivelul fecundaiei atinge 87% dintre ovocite. 3.1.4. Fecundaia i cultura in vitro a embrionilor Fecundarea se realizeaz prin cultura timp de o zi ntr-un mediu special a 0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentraie ridicat, mpreun cu ovocite mature, n atmosfer de 5%CO2, 5%O2 i 90%N2. Dup 24 de ore de cultur mpreun cu spermatozoizii, ovocitele fecundate sunt transferate ntr-un mediu special n vederea dezvoltrii ulterioare. Ovocitele se examineaz la stereolup i sunt considerate ca fecundate atunci cnd se constat: - prezena spermatozoizilor n spaiul perivitelin; - prezena spermatozoizilor n ovoplasm; - prezena pronucleilor i apariia segmentaiei. In vivo, dup fecundaie, embrionul ncepe dezvoltarea sa n oviduct, nainte de a ajunge n uter (ziua 4-5 la rumegtoare), n stadiul de morul tnr.
97

In vitro, oricare este mediul de cultur folosit, zigoii se blocheaz n stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depirea stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoi n oviductul unei gazde intermediare (iepuroaic) i apoi transferul lor n uterul femelelor receptoare. Experienele au dovedit c cultura zigoilor de rumegtoare pe un strat de celule tubare a permis obinerea blastocitilor i a nou-nscuilor, dup transferul la femelele receptoare. Totodat s-a demonstrat c prin co-cultura zigoilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre acetia s depeasc stadiul de 8 celule (Marquant B. i colab.,1991). Oule fecundate in vivo, apoi cultivate in vitro pe un strat de celule prelevate din oviduct, unde evolueaz pn la stadiul de blastocist, au un aspect morfologic normal. Totui, studiul histologic atent a relevat faptul c aceti blastociti, comparativ cu cei prelevai in vivo sunt alctuii dintr-un numr redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. ns cultura embrionilor pe un strat de celule tubare, apoi uterine i adiionarea unui factor de cretere n mediul de cultur a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare pn la stadiul de blastocist ca i a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat in vivo. Aceste experiene demonstreaz faptul c oviductul nu ndeplinete un rol specific n trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive, deoarece blastocitii pot fi obinui i prin co-cultura cu celule trofoblastice, din cumulus, ca i cu celule prelevate din oviduct. 3.1.5. Transferul embrionilor obinui in vitro Se face n uterul femelelor receptoare, din aceeai specie, a crei ciclu sexual a fost sincronizat cu vrsta embrionilor obinui in vitro. Nivelul gestaiei n urma transferului sincron i asincron a embrionilor bovini cultivai in vitro arat c nivelul cel mai ridicat de gestaii s-a obinut atunci cnd femelele receptoare se gsesc n ceea ce privete ciclul sexual, n ntrziere cu una-dou zile, fa de vrsta teoretic a embrionilor (tab. 1). Embrionii obinui conin un numr mai redus de celule, cu toate c morfologic apar normali, de aceea nivelul gestaiei este mai ridicat atunci cnd receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual n ntrziere, n raport cu vrsta teoretic a embrionului. Aceasta evideniaz faptul c mediile de cultur folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor obinui in vitro transferai receptoarelor i a gestaiei sunt mai sczute comparativ cu cei obinui dup transferul de embrioni in vivo. Tabelul 1 Nivelul gestaiei dup transferul sincron al embrionilor bovini dup maturare, fecundare i cultur in vivo n condiiile transferului a cte 2 embrioni/receptoare (Kajihira i colab.,1990 cit. de Marquant B. i colab., 1991) Sincronism ntre stadiul de dezvoltare al embrionilor i stadiul ciclului sexual al receptoarelor -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 0 la +1
98

Numr de receptoare 8 22 17 27 13

Gestaii (%) 63 82 59 59 46

Pe ansamblul aplicrii acestei biotehnici, nivelurile gestaiei sunt mai slabe n raport cu numrul ovocitelor folosite, chiar atunci cnd zigoii sunt cultivai n oviductul unei gazde intermediare. 3.1.6. Importana, perspectivele i aplicaiile fecundaiei in vitro Contrar ameliorrilor tehnice aduse n ultimii ani acestei biotehnici, randamentul global rmnea relativ sczut, fapt ce a ncetinit ritmul aplicrii n practic pe o scar mult mai mare. Cercetrile ulterioare trebuie s fie orientate, mai ales, spre creterea randamentului diverselor etape, n particular cea a culturii embrionilor. Cu toate dificultile ntmpinate, fecundarea in vitro rmne un necesar i indispensabil stadiu pentru nelegerea diferitelor fenomene, ndeosebi a stadiilor dezvoltrii iniiale a embrionului. La bovine, folosirea pentru fecundaia in vitro a ovocitelor provenite de la femele fr valoare genetic (recoltate de la abator) permite stabilirea unui diagnostic precoce a fertilitii taurilor folosii la nsmnri artificiale. ntradevr, s-a pus n eviden o corelaie ntre nivelul dezvoltrii globale in vitro (numrul de blastociti/numr ovocite supuse fecundrii) i fertilitatea taurilor in vivo (nivelul NR% la dou-trei luni). Tehnica maturrii in vitro permite producerea la preuri sczute a unui numr mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor provenii de la vacile cu nalt potenial genetic, n cursul clonrii. Acest aspect este valorificat comercial de unele firme americane. Puncia foliculilor antrali, pe animalul n picioare, prin folosirea metodelor endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de ovocite de un nalt potenial genetic, ntr-un numr ridicat. Acest tip de colectare i maturare in vitro a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci cnd randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui numr de embrioni superior celui obinut n prezent prin superovulare, fecundaie in vivo i colectare transcervical a zigoilor. Prin practicarea acestei biotehnici exist posibilitatea reducerii numrului necesar de spermatozoizi pentru a obine o fecundaie, i n consecin, folosirea cu intensitate sporit a spermei provenit de la animale valoroase pentru fecundarea unui numr crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici (nsmnri artificiale i transfer de embrioni). Totodat, fecundaia in vitro va permite n viitorul apropiat intensivizarea procesului de ameliorare genetic a efectivelor de animale. Prin aceast biotehnic, se pot obine mai multe ovocite de la aceeai femel, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi provenii de la mai muli reproductori, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproductorilor masculi i femeli. Microinjecia de spermatozoizi n ovocitele maturate in vitro reprezint o alt cale de obinere de embrioni normali. Dup activarea ovocitei, oule au fost cultivate pn la stadiul de morul-blastocist i transferate la femele receptoare, obinndu-se, deja, unele rezultate. Posibilitatea de a avea, dup fecundaia in vitro, un numr crescut de embrioni ntr-un stadiu precis de dezvoltare prezint un mare avantaj pentru o alt biotehnic de reproducie, transgeneza. ntr-adevr, microinjecia artificial a unei gene se efectueaz n stadii precise de dezvoltare, n general n stadiul de doi pronuclei sau de dou blastomere. Deja, unele echipe de cercettori i-au propus
99

s foloseasc spermatozoidul ca vector al genei ce urmeaz a fi transferat, n cazul fecundaiei in vitro, rezultate ncurajatoare obinndu-se pe oareci. Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgenez), rezultatul este totdeauna un ou n stadiul de una-dou celule pe care trebuie testat dezvoltarea ulterioar prin tehnici mai puin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale chirurgical n oviductul unei femele receptoare. Maturarea ovocitelor, fecundaia in vitro i cultura embrionilor obinui sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, ns dirijarea acestor trei etape prezint importan pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare i transgenez. 3.2. Bisecia embrionilor Tehnicile de micromanipulare perfecionate i simplificate n ultimul timp, au fcut posibil microchirurgia embrionar. Micromanipulrile sunt facilitate de faptul c oule (zigoii) majoritii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o zon pelucid acelular. Zona pelucid ndeplinete mai mult atribuii referitoare la protecia fizic a zigotului. Rezistena acestei membrane permite meninerea oului n depresiunea extremitii unei micropipete fr a afecta structura intern a oului. Aceast nsuire uureaz mult intervenia microinstrumentelor. Prin practicarea tehnicilor de micromanipulare, n prezent se poate interveni pe zigot pentru: - obinerea jumtilor monozigote, prin bisecie; - sexarea embrionului; - producerea de himere; - obinerea de indivizi transgenici; - producerea clonelor. Bisecia embrionilor const n secionarea n dou jumti a zigoilor aflai n stadiul de morul trzie sau de blastocist tnr (6-8 zile) (foto 25). Aceast biotehnic are ca baz fiziologic constatarea c la mamifere, n mod natural, apar jumti i uneori chiar triplete monozigote. Primele studii fcute pe embrioni de oareci i iepure au artat c un blastomer protejat de propria zon pelucid este capabil de a se dezvolta i Foto 25 Bisecia embrionilor de a produce un individ normal. ns, un blastomer izolat, transferat fr zona pelucid sau reintrodus ntr-o zon pelucid larg deschis este incapabil de evoluie (Nibart M., 1991). Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secionarea n dou pri egale a embrionilor de 6-8 zile, stadiu n care rolul zonei pelucide nu mai prezint importan. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor instrumente, folosite n aa fel nct s lezioneze ct mai puin posibil zona pelucid i repunerea fiecrui demiembrion n cte o zon pelucid. Rezultatele obinute, exprimate n G% dup transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de produi pentru 25 de embrioni secionai. Numeroi autori au continuat bisecia
100

embrionilor bovini simplificnd tehnica, ce este format numai din dou microinstrumente. Voelkel i colab., (1948), Baker i Shea (1985), Picard i colab. (1985, cit. de Nibart M., 1991) .a. au demonstrat c nu mai este necesar repunerea embrionului ntr-o zon pelucid naintea transferului, ceea ce a simplificat mult metoda. Cu ajutorul a dou micromanipulatoare, unul purtnd micropipeta, cellalt microcuitul, un operator antrenat poate obine n cteva minute doi demiembrioni, viabili, n condiiile biseciei unice a embrionilor de bun calitate, apreciai n stadiul de morul compact-blastocist tnr. Dup transferul celor dou jumti la femelele receptoare, nivelurile gestaiei se situeaz ntre 50% i 65%, ns pentru majoritatea autorilor, nivelurile gemelaritii au fost de 50%. Nu s-au nregistrat diferene n nivelul obinerii de gemeni, indiferent dac acetia au fost repui amndoi n cornul uterin ipsilateral ovarului cu corp galben sau repus fiecare n cte un corn uterin al aceleiai receptoare. S-au obinut unele rezultate (50% gestaii) dup transferul jumtilor de embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4oC. Congelarea n azot lichid a jumtilor de embrion repuse n zona pelucid, a condus la obinerea unui nivel sczut de gestaii (20%). Dac nainte de congelare embrionii sunt meninui ntr-un mediu de cultur (2-24 de ore), nivelul gestaiilor obinute este mult mai ridicat. Rezultatele obinute arat c embrionii buni de 40-80 de celule, sunt capabili, prin bisecie, s dea doi demiembrioni care, transferai n uterul receptoarelor, s evolueze normal, cu toate c au de recuperat circa jumtate din celulele embrionului iniial. Rezultate n obinerea gemenilor monozigoi, sunt superioare cnd se lucreaz cu blastociti tineri, comparativ cu stadiul de morul tnr. ncercarea de a obine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secionarea embrionilor n stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfctoare, ceea ce arat c aceast biotehnic este limitat de numrul restrns de gemeni (2) ce pot fi obinui dintr-un singur embrion. Dac, de exemplu, considerm n medie pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni i doi medii), dup transferul acestora se obin n principiu trei viei. Prin bisecia celor trei embrioni buni i transferul fiecrei jumti la cte o receptoare, este posibil s se obin tot trei viei (50% gestaie) sau, per total 4 viei. Ctigul de un viel presupune existena a 8 receptoare, n loc de 5. Dac nivelurile gestaiei sunt mai sczute (50%-30%) sporul de un viel obinut pe o donatoare superovulat este anulat. n condiiile atingerii unor rezultate normale, prin practicarea biseciei embrionilor se pot obine, n medie, 4 viei pe donatoare n loc de trei viei, ceea ce presupune un ctig de 33% a numrului descendenilor provenii de la fiecare femel superovulat. n aceste condiii, o selecie bine dirijat, accept cu rezerve pstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza reduciilor majore survenite n variana genetic i n sporirea consangvinitii. n aceste circumstane, producerea unor familii biclonate pentru toi indivizii distinci genetic se poate face numai prin reducerea la jumtate a numrului unor astfel de indivizi, prin aceasta scznd nsi intensitatea seleciei. Continuarea bisecionrii embrionilor (clonrii) erodeaz intensitatea seleciei prin reducerea progresului genetic, mrete consangvinitatea, scderea intensitii seleciei nefiind compensat prin ctigurile obinute n precizia seleciei sau exactitii rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989).
101

Biotehnica biseciei embrionilor este totui bun pentru producerea adevrailor gemeni, necesari testrii unor preparate farmaceutice sau a furajelor, factorul genetic fiind nlturat. Obinerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegtoare i suine, constnd n amestecul de celule embrionare de la specii diferite. 3.3. Sexarea embrionilor Determinarea sexului embrionului nu este realizabil dect la vrsta la care se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerat ca o descoperire economic de mare importan i const n prelevarea ctorva celule care sunt investigate citogenetic, imunologic, enzimologic etc. n vederea determinrii sexului produsului de concepie nc din acest stadiu incipient de dezvoltare. Metoda genetic (cariotipic) se bazeaz pe recunoaterea citologic a cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnic ce permite efectuarea sexrii zigoilor, pornind de la un numr mic de celule prelevate de la zigoi i care s nu compromit dezvoltarea ulterioar a embrionului. Recent, folosirea unei sonde moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare s rspund tuturor ateptrilor. Unele echipe de cercetare acioneaz n direcia trierii spermatozoizilor purttori ai cromozomului x i y, pe baza diferenei acestora n ce privete coninutul n ADN. Aceast metod, mpreun cu fecundaia in vitro ar furniza un procedeu ideal care s rspund necesitilor zootehnice moderne. Metoda imunologic const n cutarea pe suprafaa celulelor masculine a antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali specifici pentru acest tip de antigen. Metoda enzimologic se bazeaz pe faptul c unele enzime celulare sunt codificate de ctre gene aparinnd cromozomului x. Cantitatea acestor enzime este , deci, de dou ori mai mare n celulele femele dect n celulele mascule. Determinarea activitii acestor enzime ntr-un blastomer izolat a permis sexarea embrionilor ntr-o proporie ridicat. Tehnica amplificrii ADN (PCR). Dup descoperirea posibilitilor de amplificare enzimatic dirijate de ADN-ul celular, unii cercettori au dezvoltat o tehnic de sexare prin amplificarea enzimatic (PCR-Polimerase Chaine Reaction) a secvenei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin biopsia embrionilor de bun calitate. Plecnd de la aceste celule, determinarea sexului se sprijin pe detectarea unei secvene specifice a ADN-ului cromozomului y printr-o sond molecular complementar. Aceast secven este amplificat de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforez i vizualizat prin fluorescen. Avnd n vedere tehnicile pentru sexare (evidenierea ADN specific) i sensibilitatea specific (amplificarea ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie s fie realizat n cele mai bune condiii igienice i tehnice. Sexarea embrionilor nainte de implantare, ofer posibilitatea stabilirii raportului de sexe ntr-o populaie, n sensul dorit de cresctori funcie de necesarul de animale de reproducie, carne, lapte etc.

102

3.4. Transplantarea nucleilor i obinerea de clone Clonajul embrionar const n producerea mai multor animale pornind de la un singur embrion. Acestea pot fi obinute prin simpla seciune sau disociere a unui embrion, n stadiul de preimplantare (bisecia embrionilor). Prin aceast metod s-au produs numeroase perechi de viei gemeni, ns foarte rar s-au putut obine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului permite obinerea unui numr mare de indivizi plecnd de la un singur embrion, avnd n vedere faptul c patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion tnr este identic, n sensul c poart aceeai informaie genetic. Transferul nucleilor celulelor provenite de la acelai embrion n mai multe ovocite enucleate i activate, este urmat de evoluia ovocitelor spre indivizi genetic identici. Posibilitatea obinerii de serii de animale identice genetic prezint interese multiple pentru zootehnie. Astfel, n activitatea de selecie, folosirea unor clone, chiar limitate numeric, ofer posibilitatea evalurii cu nalt precizie a valorii reproductorilor. Animale cu acelai genotip, ntreinute n ferme diferite, sunt exceleni subieci de studiere a influenei factorilor de mediu asupra performanelor acestora. Totodat, obinerea mai multor copii a reproductorilor foarte valoroi va contribui la creterea i difuzabilitatea progresului genetic, ns cu reversul micorrii patrimoniului genetic al efectivelor de animale. Pentru producie, plecnd de la rasele de carne, embrionii provenii de la un genitor cu o excelent conformaie (caracter cu coeficient mare de heritabilitate) vor putea fi multiplicai prin clonare i transplantai, cu producerea unor loturi de animale cu carcase omogene i de calitate superioar. De asemenea, pe termen lung, obinerea i comercializarea embrionilor clonai n mari serii, asociat cu maturarea in vitro vor permite scderea considerabil a transferului embrionar. Briggsi i King (1952) au artat c nucleii prelevai, n stadiul de blastul, la broasc i grefai n ovocite, pot s-i continue dezvoltarea pn la stadiul de blastul, iar n 1962 Mc Kinnel a obinut, prin aceeai metod, broate adulte. Pentru embrionul de mamifere, n 1986 Willadsen S., la Cambridge a obinut pentru prima dat trei miei dup transfer de nuclei, provenii de la un embrion n stadiul de 8 celule (Heyman Y. i colab., 1991). La taurine, s-au obinut de ctre diferite echipe de cercettori clone constituite din 8-9 viei, iar la iepure s-a obinut o clon de 6 indivizi, plecnd de la un embrion congelat n stadiul de morul. Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. i colab., 1991): - obinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii; - izolarea nucleilor embrionului donator; - reconstituirea de serii de embrioni monocelulari. 3.4.1. Pregtirea ovocitelor receptoare Prima operaie const n extragerea genomului maternal al ovocitei receptoare. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, n absena fecundaiei sau a activrii, se gsesc blocate n stadiul de metafaz II a meiozei. Retragerea nucleului poate fi realizat prin micromanipulare, ptrunznd cu vrful unei micropipete n interiorul celulei i aspirnd uor cromozomii. Pentru a se evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se ntmpl cel mai adesea, ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhib polimerizarea microfilamentelor i microfibrilelor scheletului celular.
103

Ovocitele prelevate in vivo, imediat dup ovulaie sau obinute prin maturare in vitro sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un tratament enzimatic cu hialuronidaz i apoi incubate n prezena cytochalasinei B (5-7 g/ml). Dup denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare n depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipet se puncioneaz zona pelucid, se aspir globulul polar mpreun cu o fraciune de citoplasm adiacent, coninnd cromozomii metafazici. 3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator Embrionul, selecionat ca donator de nuclei, este prelevat n stadiul de morul, cnd posed 16-64 de celule, funcie de specie i vrsta acestuia. n acest stadiu evolutiv, punerea n micare a genomului embrionar deja s-a produs. Se folosesc i embrioni congelai i care se gsesc n stadiul de morul. Embrionul donator este debarasat cu mult atenie de zona pelucid, folosind o soluie de tyrode acid. n acest stadiu, celulele au nceput deja s stabileasc ntre ele relaii funcionale (de exemplu gap-joncion). Pentru disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, ntr-un mediu lipsit de ioni de calciu, dup care blastomerele pot fi separate, fr leziuni, prin intermediul unor micropipete. 3.4.3. Reconstituirea embrionilor Dup separarea blastomerelor, n cel mai scurt timp se introduce fiecare blastomer n interiorul zonei pelucide a ovocitei receptoare, enucleate n prealabil. Dup introducerea blastomerului sub zona pelucid, fuziunea membranelor celulei donatoare i ovocitul receptor se realizeaz prin electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plaseaz ntre doi electrozi i este supus la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici provoac pori membranari, destabiliznd straturile de fosfolipide juxtapuse, iar membranele fuzionate permit astfel nucleului donator s ptrund n noul su mediu citoplasmatic. Pe de alt parte, stimularea electric activeaz ovocitul receptor, prin declanarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat. Electrofuziunea se realizeaz ntr-un mediu izotonic i se observ n urmtoarele treizeci de minute de la stimulare i estimat, fie prin umflarea nucleului donator n noul su mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare i apariia stadiului de dou celule. n prezent, unul din factorii limitani n aplicarea acestei biotehnici l reprezint numrul relativ redus de ovocite receptoare. Creterea numrului de ovocite ,,receptoare se poate obine prin maturarea in vitro a acestora, pornind de la ovarele recuperate n abator de la femelele sacrificate. Tot n plan practic, este de mare interes posibilitatea congelrii acestor ovocite, astfel nct s se dispun n orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant este reprezentat de numrul relativ redus de celule ale embrionilor de la care urmeaz s se transfere nucleii. Cu toate dificultile pe care le ridic, clonajul embrionilor creeaz o nou cale n optimizarea reproducerii animalelor.

104

3.5. Transgeneza Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiional, pe progresele nregistrate n selecia genetic, dirijarea reproduciei, echilibrul raiilor de hran, etc. Tehnicile geneticii moleculare ofer, n prezent, noi posibiliti care ncep a fi exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoaterea patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combinaii rezultate din mutaie i asocierea secvenelor de ADN ofer multe posibiliti de reprogramare a unei celule sau a unui organism ntreg. Astfel, dac o gen izolat este introdus ntr-o celul, aceasta va sintetiza o nou protein i caracteristicile acestei celule vor putea fi astfel modificate. De asemenea, dac o gen izolat este introdus ntr-un organism ntreg, nsuirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Aceast operaie poart numele de transgenez. Gena strin, introdus n noul organism, va fi transmis la descendeni obinndu-se n acest fel o linie de animale care au nsuiri biologice noi. Primele observaii n acest domeniu s-au fcut n 1981 pe oareci. Este posibil, prin transgenez, obinerea de noi animale, perspectivele deschise de aceast nou biotehnic fiind considerabile. Obinerea de animale transgenice include mai multe etape: - izolarea sau construcia genei de transferat; - colectarea embrionilor; - introducerea genei n embrioni; - transferul embrionului la o femel receptoare; - identificarea transgenei la nou-nscui; - msurarea expresiei transgenei; - stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice fondatoare. Izolarea sau construcia genelor se face prin tehnici genetice adecvate care permit att izolarea ct i mutarea dup voin a oricrei gene. O gen funcional material sau reconstruit conine totdeauna aceleai elemente: regiunea regulatore, regiunea codant i terminatorul. Astfel, regiunile care particip la reglarea transcripiei genei se situeaz n amonte de zona codant. Colecia de embrioni. Transgeneza fiind o operaie cu randament sczut, sunt necesari mai muli embrioni pentru a economisi la maximum femele donatoare. Embrionii pot fi obinui n mai multe moduri: - prelevnd ovare de la femelele sacrificate la abator; - prin maturarea ovocitelor in vitro; - prin practicarea fecundaiei in vitro. Introducerea genei n embrion se poate realiza prin microinjecie, prin folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels). Microinjecia const n injectarea direct a soluiei de ADN n pronucleul mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului n momentul injeciei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea oulor, ceea ce face dificil vizualizarea celor doi pronuclei. Virusurile, nainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor, sunt ,,a priori exceleni vectori pentru a introduce gene strine ntr-o celul. Retrovirusurile se ncorporeaz n genomul gazd, n general, ntr-o singur copie i fr rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei strine n celulele somatice n cultur i apoi se reintroduc aceste celule n individ. Utilizarea celulelor ES, const n izolarea celulelor unui embrion precoce i cultivarea lor n condiii n care celulele nu se difereniaz. Cnd aceste celule ES sunt reintroduse ntr-un embrion precoce particip la dezvoltarea embrionului, dnd natere la animale himere. O gen strin poate fi introdus, prin procedee
105

clasice de transfer, n celule ES, n cultur. Aceste celule reintroduse n embrion constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezult sunt mozaicate. Descendenii lor motenesc sau nu transgena numai dac celulele germinale parentale conin sau nu transgena. Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inser n genomul gazd n poziii imprevizibile. Introducerea transgenelor se mai poate realiza i prin alte mijloace. Unul dintre aceste mijloace const n a pune n contact ADN-ul i spermatozoizii i a proceda apoi la o fecundaie in vitrosau in vivo. O alt cale prin care gena strin poate fi transferat n celule n cultur, cu o eficacitate nalt, este electroporaia. Tehnica aceasta const n a supune celulele incubate n prezena ADN, la cmpuri electrice care destabilizeaz membrana i creeaz pori prin care ADN-ul ptrunde n celule. Aceast tehnic se folosete i pentru spermatozoizii i embrionii de mamifere. Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii moleculare. Ele constau n a hibrida un fragment de ADN complementar genei, radioactivat, cu ADN-ul celular total. Detecia produilor transgenici const n a evalua expresia transgenelor prin msurarea cantitii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene pot fi msurate n snge, dac sunt secretate, cu ajutorul testului RIA (radioimunoanaliz). Aceste metode permit s se determine n care organ, tip celular i moment al dezvoltrii, transgena se exprim. Tansgeneza a fost ncercat pe multe specii de animale, cu anumite succese. Randamentul biotehnicii, evaluat n numr de celule transgenice obinute, raportat la numrul embrionilor microinjectai, variaz mult cu colectivele de cercettori. O evaluare sumar a acestui randament arat c este nevoie de circa 10 oareci aduli pentru a spera obinerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel transgenic i 40 de vaci pentru un viel transgenic. Aceste rezultate arat c preul de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat. Prin transgenez s-a ncercat obinerea de animale cu un ritm de cretere accelerat, cu o producie de lapte mai mare i cu un coninut n protein mai ridicat, cu o producie de carne mai bun, cantitativ i calitativ, rezistente la diverse maladii etc. Cu toate rezultatele ncurajatoare obinute la diverse specii, aceast biotehnic se gsete doar la perioada de nceput, necesitnd multe ajustri, astfel nct randamentul obinut s micoreze preul de cost al produsului transgenic i care s fie conform cu normele sanitare i sanitar-veterinare internaionale etc. NTREBRI RECAPITULATIVE 1. 2. 3. 4. 5. Care sunt etapele fecundaiei in vitro? Care sunt importana i tehnica biseciei embrionilor? Care sunt metodele prin intermediul crora se pot sexa embrionii? Care sunt importana i etapele transferului de nuclei? Care este rolul transgenezei?

TEME 1. Biotehnici moderne de reproductie REFERAT 1. Realizri moderne n domeniul fecundaiei in vitro 2. Situaia actual i perspectivele clonrii i transgenezei
106

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4 2. Baril, G. i colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insmination artificielle ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma. 3. Baril, G. i colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO, Roma. 4. Bogdan, Al. i colab., 1981 - Reproducia animalelor de ferm. Edit.Scrisul romnesc, Craiova 5. Bogdan, Al. i colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea i prolificitatea n zootehnie, vol I i II, Edit Dacia, Cluj-Napoca 6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproduciei la animalele de ferm. Edit. Ceres, Bucureti 7. Bunaciu, P., 1977 - nsmnarea artificial a ginilor de reproducie ntreinute n baterii. Rev. de cretere a animalelor, nr. 10 8. Crlan, M., 1982 - Sincronizarea cldurilor i ovulaiei la taurine. Redacia de propagand tehnic agricol, Bucureti 9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetri cu privire la influena alimentaiei asupra supravieuirii embrionilor la caprine n condiiile efecturii transferului de embrioni. Tez de doctorat, Univ. Agron. i de Med. Vet., Iai 10. Drugociu, G. i colab., 1977 - Patologia reproduciei i clinic obstetrical. Edit. Did. i Ped., Bucureti 11. Dumitrescu, I. i colab., 1976 - Reproducia la bovine. Edit Ceres, Bucureti 12. Dumitrescu, I. i colab., 1978 - nsmnrile artificiale la animale. Edit. Ceres, Bucureti 13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureti 14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C, Bellvue, , USA 15. Feredean, T., 1974 - Reproducia la porcine. Edit. Ceres, Bucureti 16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit. Ceres, Bucureti 17. Gluhovschi, N. i colab., 1972 - Biologia i patologia reproduciei. Edit. Did. i Ped.,Bucureti 18. Groza, {t. I., 1996 - Actualiti i perspective n biotehnologia transferului de embrioni la specia ovin. Edit. Ceres, Bucureti 19. Halga, P. i colab., 1999 Alimentaia i reproducia la erbivore domestice. Edit. Dosoftei, Iai 20. Hansel, W. i colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet., Bucureti 21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333 22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315322 23. Liciu, Gh., Roca, O., 1988 - Ghid tehnic privind nsmnarea la ovine i caprine. Edit. Ceres, Bucureti

107

24. Liciu, GH.,Roca, O., 1998 Tehnica nsmnrii artificiale la bovine Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureti. 25. Liciu, GH., Roca, O., 1999 - Tehnica nsmnrii artificiale la suine - Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureti. 26. Mantea, {t., 1998 - Contribuii la biotehnologia transferului de embrioni la suine. Tez de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucureti 27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6 28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303312 29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290 30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia n reproducia animalelor. Edit. Ceres, Bucureti 31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproducia la ovine. Edit. Agro-Silvic, Bucureti 32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage 2000, nr. 1, p. 47-49 33. Roca, O ., 1994 - Biotehnica reproduciei la porcine prin nsmnare artificial. Edit. Ceres, Bucureti 34. Runceanu, L.,1995 - Reproducia i patologia reproduciei. Lito., Univ. Agron. Iai 35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris 36. Seiciu, Fl. i colab.,1989 - Reproducia normal i patologic la animalele domestice, vol. I i II, Edit. Ceres, Bucureti 37. Tnase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor i transferul de embrioni . Lito., Univ. Agron. Iai 38. Tnase, D.,1995 - Biologia i patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito., Univ. Agron. Iai 39. Vallet, J. Ch. i colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301 40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

108