Laporan Praktikum Biokimia

Hari/tanggal : Selasa/26 November 2013 Waktu : 11.00-12.40 WIB PJP : Puspa Julistia Puspita,S.Si,M.Sc Asisten : Lusianawati, S.Si Resti Siti Mutmainah, S.Si

ENZIM I Kelompok III Muhamad Ivan Abror Fika Muthia Kanza Rika Ussy Perdani J3L112184 J3L112049 J3L112107

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2013 Pendahuluan Enzim amilase adalah suatu katalisator organik yang dihasilkan oleh sel. Enzim ini berfungsi memutuskan ikatan kimia dengan penambahan air (Kusnawijaya 1993). Berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, amilase dibedakan menjadi alfa-amilase, beta-amilase, dan glukoamilase. Enzim -amilase (alpha-amylase, 1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase, pancreatic alpha-amylase, -amilase, PA) adalah salah satu enzim yang berperan dalam proses degradasi pati. Struktur molekuler dari enzim ini adalah -1,4glukanohidrolase. Bersama dengan enzim pendegradasi pati lain, pulpulanase, amilase termasuk ke dalam golongan enzim kelas 13 glikosil hidrolase (E.C.3.2.1.1). Enzim -amilase memiliki beberapa sisi aktif yang dapat mengikat 4 hingga 10 molekul substrat sekaligus (Lehinger 1998). Enzim -amilase (E.C 3.2.1.2) merupakan enzim golongan hidrolase kelas 14 yang digunakan dalam proses sakarifikasi pati. Sakarifikasi banyak berperan dalam pemecahan makromolekul karbohidrat. Pemecahan makromolekul

karbohidrat ini akan menghasilkan molekul karbohidrat rantai pendek atau molekul karbohidrat yang lebih sederhana. Enzim Glukoamilase (E.C 3.2.1.3) adalah salah satu enzim kelas 15 yang berperan dalam proses sakarifikasi pati. Serupa dengan enzim beta-amilase, glukoamilase dapat memecah struktur pati yang merupakan polisakarida kompleks berukuran besar menjadi molekul yang beukuran kecil. Enzim ini umumnya bekerja pada suhu 45 60 C dengan kisaran pH 4,5 5,0 (Lehinger 1998). Faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu, pH, dan indikator. Aktivitas enzim meningkat bersamaan dengan peningkatan suhu hingga mencapai suhu optimum, laju berbagai proses metabolisme akan meningkat hingga batas suhu maksimal. Prinsip biologis utama adalah homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan keadaan normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktivitas banyak enzim. Selain itu, adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan aktivitas enzim (Maryati 2000).

Tujuan Percobaan

Percobaan bertujuan menentukan pengaruh suhu dan pH pada aktivitas enzim amilase saliva. Mengetahui perbedaan hidrolisis pati matang dan pati mentah oleh enzim amilase.

Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan tabung reaksi, pipet tetes, lempeng tetes, gelas piala, penangas air dan penangas es. Bahan-bahan yang digunakan air liur (saliva), akuades, kanji 1%, pereaksi iod, pereaksi benedict, HCl, asam asetat dan Na-karbonat 0,1%.

Prosedur Percobaan Pengaruh suhu pada aktivitas amilase saliva. 2 ml saliva dan 2 ml akuades dimasukkan ke dalam 4 tabung reaksi. Campuran kemudian dikocok. Tabung pertama diletakkan pada penangas es dengan suhu 10oC. Tabung kedua diletakkan pada suhu kamar. Tabung ketiga diletakkan pada penangas air dengan suhu 37 C. Tabung keempat diletakkan pada penangas air dengan suhu 80 C. Masing-masing tabung diletakkan selama 15 menit pada setiap perlakuan. Setelah 15 menit, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 2 ml larutan kanji 1%. Campuran kemudian dikocok. Masing-masing tabung diletakkan kembali pada suhu yang berbeda selama 10 menit. Selanjutnya dilakukan uji iod dan uji benedict. Uji iod dilakukan dengan 2 tetes saliva pada setiap perlakuan diteteskan pada lempeng tetes. Kemudian pada lempeng tetes ditambahkan larutan iod encer. Perubahan warna yang terjadi diamati. Uji benedict dilakukan dengan 1 ml saliva dan ditambahkan pereaksi benedict. Larutan kemudian dipanaskan selama 15 menit. Perubahan warna yang terbentuk diamati. Pengaruh pH pada aktivitas amilase saliva. Sebanyak 2 ml HCl, 2 ml asam asetat, 2 ml akuades dan 2 ml Na-karbonat 1 % dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Setelah itu ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 2 ml larutan kanji 1% dan 2 ml saliva. Campuran dikocok kuat dan diletakkan pada penangas air bersuhu 37 C selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan uji iod dan uji benedict. Uji iod dilakukan dengan 2 tetes saliva diteteskan pada lempeng tetes. Kemudian pada lempeng tetes ditambahkan larutan iod encer. Perubahan warna

yang terjadi diamati. Uji benedict dilakukan dengan 1 ml saliva dan ditambahkan dengan pereaksi benedict. Larutan kemudian dipanaskan selama 15 menit. Perubahan warna yang terbentuk diamati. Hidrolisis pati matang oleh amilase saliva. Saliva sebanyak 0,2 ml diteteskan pada tabung yang berisi larutan pati. Campuran kemudian dikocok dan disimpan pada suhu 37 C. Setiap selang waktu 5 menit setetes larutan dipindahkan ke lempeng tetes dan ditambahkan dengan pereaksi iod. Perubahan warna dicatat dan penambahan pereaksi iod dihentikan setelah tidak terbentuk warna biru lagi. Dilakukan uji benedict dengan sisa saliva ditambahkan pereaksi benedict dan diletakkan pada penangas air selama 15 menit. Perubahan warna yang terbentuk diamati. Hidrolisis pati mentah oleh amilase saliva. Sedikit tepung pati dimasukkan ke dalam tabung reaksikemudian 5 ml akuades ditambahkan dan dikocok. Ke dalam tabung ditambahkan 10 tetes saliva dan disimpan pada suhu 37 C selama 20 menit. Setiap selang waktu 5 menit setetes larutan dipindahkan ke lempeng tetes dan ditambahkan dengan pereaksi iod. Perubahan warna dicatat dan penambahan pereaksi iod dihentikan setelah tidak terbentuk warna biru lagi. Dilakukan uji benedict dengan sisa saliva ditambahkan pereaksi benedict dan diletakkan pada penangas air selama 15 menit. Perubahan warna yang terbentuk diamati.

Data dan Hasil Percobaan Tabel 1 Data dan hasil pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim amilase saliva Hasil pengamatan Perubahan wana Iod Benedict Iod Benedict 10 + Kuning Biru kehijauan Suhu kamar + Kuning Biru kehijauan 37 + Kuning Biru kehijauan 80 + Biru Biru Ketrangan: (+) mengandung amilum atau maltosa (+) tidak mengandung amilum atau maltosa Suhu oC

Gambar 1 Hasil uji iod pada saliva

Gambar 2 Hasil uji benedict saliva pada suhu 10oC (a), suhu ruang (b), 37 oC (c), dan suhu 80 oC (d) Hasil pengamatan Perubahan wana pH Iod Benedict Iod Benedict HCl + Biru Biru Asam asetat + Biru Biru Akuades + Kuning Biru kehijauan Na2CO3 + Kuning Biru kehijauan Keterangan : (+) = keadaan pada saat pH optimum ( - ) = keadaan pada saat pH tidak optimum

Gambar 3 Hasil Uji benedict dan iod pada saliva Tabel 3 Data hasil hidrolisis pati matang dan pati mentah oleh amilase saliva Bahan Pati matang Waktu menit ke 1 2 3 4 5 10 1 2 3 4 5 10 13 Hasil pengamatan Iod Benedict + + + + + + + + + + + + + + + + Perubahan warna Iod Benedict Biru Biru Biru Biru Biru Kuning kehijauan Kuning Biru Biru Biru Biru Biru Biru Kuning

Pati mentah

Biru

Keterangan : (+) = hasil uji positif ( - ) = hasil uji negatif

Gambar 4 Hasil uji iod pada pati matang

(a)

(b)

(c)

Gamabar 5 Hasil uji benedict pada pati mentah (a), pati matang (b), dan uji iod pada pati matang Pembahasan Enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi dan bagian aktif enzim akan terganggu, sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang. Berdasarkan hasil percobaan dapat dilihat pada Tabel 1, pada suhu 10 OC , suhu kamar, dan suhu 37 OC reaksi dengan iod menghasilkan hasil yang negatif dengan terbentuknya warna kuning pada larutan dan uji

benedict menunjkkan hasil positif dengan terbentukknya warna biru kehijauan pada larutan. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim amilase masih dapat bekerja dengan baik, dengan cara menghidrolisis amilum menjadi maltosa sehingga pada saat dilakukan uji benedict yang digunakan untuk menentukan adanya gula preduksi memberikan hasil positif karena adanya maltosa yang merupakan gula preduksi dari hasil hidrolisis amilum. Amilum telah terhidrolisis secara sempurna menjadi maltosa sehinngga pereaksi dengan iod memberikan hasil negatif karena reaksi dengan iod untuk menentukkan adanya amilum. Enzim amilase didalam

tubuh manusia memiliki suhu optimum sekitar 37 oC (Lehninger 1982). Reaksi amilum dengan iod pada suhu 80OC menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya warna biru pada larutan dan uji benedict menujukkan hasil negatif dengan terbentuknya warna biru pada larutan, hal ini menunjukkan bahwa enzim amilase tidak dapat bekerja dengan baik karena telah terdenaturasi, sehingga amilum tidak dapat terhidrolisis menjadi maltosa dan adanya amilum dalam larutan menyebabkan reaksi dengan iod menunjukkan hasil positif dan tidak adanya maltosa menyebabkan uji iod menunjukkan hasil yang negatif. Perubahan suhu, kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim mula-mula meningkat karena adanya peningkatan suhu. Energi kinetik akan meningkat pada kompleks enzim dan substrat yang bereaksi. Namun, peningkatan energi kinetik oleh peningkatan suhu mempunyai batas yang optimum. Jika batas tersebut terlewati, maka energi tersebut dapat memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik yang lemah yang mempertahankan struktur sekunder-tersiernya, pada suhu ini, denaturasi yang disertai dengan penurunan aktivitas enzim sebagai katalis akan terjadi. Suhu optimal enzim bergantung pada lamanya pengukuran kadar yang dipakai untuk menentukannya. Semakin lama suatu enzim dipertahankan pada suhu dimana strukturnya sedikit labil, maka semakin besar kemungkinan enzim tersebut mengalami denaturasi.

Gambar 6 Kurva pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim amilase Hasil yang didapat pada uji pH terhadap aktivitas enzim amilase saliva menunjukkan bahwa, pada HCl dengan pH 1 dan asam asetat dengan pH 2 enzim amilase tidak dapat menghidrolisis amilum, hal ini ditunjukkan oleh hasil positif pada uji iod karena adanya amilum yang bereaksi dengan iod menghasilkan warna biru dan uji benedict yang menunjukkan hasil negatif karena amilosa tidak dapat

terhidrolisis menjadi maltosa, pada akuades dengan pH 7 dan Na2CO3 dengan pH 9 menunjukkan hasil negatif pada uji iod dan hasil positif pada uji benedict, hasil ini menunnjukkan bahwa enzim amilase dapat menghidrolisis amilum dengansempurna menjadi maltosa. Hasil yang didapat sesuai dengan pendapat Poedjadi (2009), pH optimum pada enzim amilase yang bersumber dari saliva atau pankreas berkisar antara 5,6 - 7,2, pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversibel karena menjadi denaturasi protein Laju rekasi berkurang di kedua sisi pH optimum untuk setiap kombinasi dari tiga alasan yang mungkin (Page 1989). Protein enzim dapat mengalami denaturasi akibat pH ektrem tinggi atau rendah. Protein enzim dapat memerlukan gugus-gugus asam amino yang terionisasi pada rantai samping yang mungkin aktif hanya pada suatu keadaan ionisasi. Substrat dapat diperoleh atau kehilangan proton dan reaktif dalam hanya satu bentuk muatan.

Gmbar 7 Kurva pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase Hasil percobaan menunjukkan, pada pati matang menit ke 1, 2, 3, dan 4 uj iod maupun uji benedict menuhjukkan hasil positif ini menunjukkan bahwa enzim amilase masih dapat bekerja namun tidak optimum karena amilum tidak terhidrolisis secara sempurna menjadi maltosa sehingga uji iod dan benedict positif, pada menit ke 5 dan 10, uji iod menujjukkan hasil negatif dan uji benedict positif, hal ini menunjukkan bahwa enzim amilase bekerja secara optimum dengan menghidrolisis semua amilum menjadi maltosa. Hasil percobaan hidrolisis pati mentah pada menit ke 1, 2, 3, 4, 5, dan 10 menunjukkan hasil positif pada uji iod dan negatif pada uji benedict, hasil ini menunjukkan enzim amilase tidak dapat menghidrolisis amilum menjadi maltosa, sedangkan pada menit ke 15 uji iod

maupun uji benedict menunjukkan hasil yang negatif. Titik akromatik pati matang lebih cepat dicapai dibandingkan dengan pati mentah, pati matang mencapai titik akromatik pada menit ke 5 sedangkan pati mentah pada menit ke15. Titik akromatik adalah keadaan pereaksi Iodium tidak bersifat positif lagi. Pati matang sebelumya telah mengalami serangkaian perlakuan seperti pemanasan sedangkan pati mentah tidak, hal menyebabkan pati matang memiliki titik akromatik lebih kecil dibandingkan pati matang. Pati dapat dipecah menjadi unit-unit yang lebih kecil yaitu dengan memotong ikatan-ikatan glikosidiknya. Salah satu enzim yang dapat memotong ikatan tersebut adalah enzim G - amilase. Enzim G - amilase (G 1,4 glukanhidrolase atau EC 3.2.1.1). G - amilase adalah endo enzim yang kerjanya memutus ikatan G - 1,4 secara acak di bagian dalam molekul baik pada amilosa maupun pada amilopektin. Sifat dan mekanisme kerja enzim G - amilase tergantung pada sumbernya. Umumnya G - amilase memotong ikatan di bagian tengah rantai sehingga menurunkan kemampuan pati mengikat zat warna iodium. Hidrolisis dengan G - amilase menyebabkan amilosa terurai menjadi saltosa dan maltotriosa. Pada tahap selanjutnya maltotriosa terurai kembali menjadi maltosa dan glukosa. Cara kerja enzim G - amilase terjadi melalui dua tahap, yaitu : pertama, degradasi amilosa menjadi maltosa dan amltrotriosa yang terjadi secara acak. Degradasi ini terjadi sangat cepat dan diikuti dengan menurunnya viskositas yang cepat pula. Kedua, relatif sangat lambat yaitu pembentukan glukosa dan maltosa sebagai hasil akhir dan caranya tidak acak. Keduanya merupakan kerja enzim G - amilase pada molekul amilosa saja (Winarno 1983). Mekanisme hidrolisis pati adalah sebagai berikut :

Gambar 9 Mekanisme hidrolisis pati (Nora 2008)

Menurut Dwidjoseputro (1992) faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah suhu, karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Di samping itu, karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi dan bagian aktig enzim akan terganggu sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang. Selanjutnya adalah pH,umumnya enzim efektifitas maksimum pada pH optimum, yang lazimnya berkisar antara pH 4,5-8.0 pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversibel karena menjadi denaturasi protein. Konsentrasi enzim, seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut, pada suatu konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim. konsentrasi substrat, hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi kecepatan reaksi, walaupun konsenrasi substrat diperbesar. Zat-zat penghambat, hambatan atau inhibisi suatu reaksi akan berpengaruh terhadap penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan, dalam banyak sistem akibat suhu tes reaksi enzim adalah mirip dengan tabiat bahwa laju reaksi meningkat dengan kenaikan suhu dan akhirnya enzim kehilangan semua aktivitas jika protein menjadi rusak akibat panas. Banyk enzim berfungsi optimal dalam batas-batas suhu antara 25-37 0C.

Simpulan Berdasarkan hasil percobaan yang didapat dapat disimpulkan kerja enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Suhu optimum enzim amilase adalah pada suhu kamar sekita 37 oC dan pH optimum enzim amilase pada pH 7 sampai pH 9. Pati matang lebih cepat terhidrolisis dan mencapai titik akromatiknya dibandingkan dengan pati mentah.

Daftar Pustaka Dwidjoseputro D. 1992. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Lehninger, AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Penerjemah: Manggy Thenawijaya. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Principle of Biochemistry Maryati Sri. 2000. Sistem Pencernaan Makanan. Jakarta: Erlangga. Nora S. 2008. Laporan penelitian kandngan pati pada umbi-umbian. [terhubung berkala].http://eprints.undip.ac.id/13402/1/Laporan_penelian.pdf [ 30 November 2013] Poedjiadi A. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press. Winarno F. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.