Curso de DNA Forense

Programa de Educao
Continuada a Distncia

Curso de
DNA Forense

Aluno:

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2
Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores

Curso de
DNA Forense

MDULO I

Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos na bibliografia consultada.

3

SUMRIO

Mdulo I
Introduo
Breve histrico do DNA forense
Fundamentos de biologia molecular

Mdulo II
DNA genmico x DNA mitocondrial
Marcadores de variao gentica
Anlise do DNA forense: aspectos gerais
Estudo da metodologia aplicada identificao humana
Exame pericial em local de crime

Mdulo III
Coleta do material biolgico
Extrao de DNA
Quantificao de DNA
Reao de amplificao pela polimerase - PCR

Mdulo IV
Eletroforese e deteco dos fragmentos de DNA
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Eletroforese capilar

4

Mdulo V
Interpretao dos resultados
Anlise de outros perfis genticos
Cromossomo Y
DNA mitocondrial
Controle de qualidade dos laboratrios
Controle de qualidade externo: testes de proficincia em gentica forense
Consideraes finais
Glossrio
Referncias bibliogrficas

5

MDULO I

Introduo

A identificao humana pelo estudo do perfil gentico amplamente utilizada em
casos de caracterizao de vnculo gentico familiar, seja em processos cveis (ex.:
excluso ou no da paternidade), como tambm em processos criminais (ex.: cadveres e
materiais biolgicos encontrados na cena do crime).
Atualmente, a mdia tem contribudo de forma
significativa para a divulgao e popularizao dessa
tecnologia, que vem evoluindo sobremaneira nas
ltimas duas dcadas.
No entanto, algumas consideraes sobre
essa tecnologia no passam de mito, pois no se
pode concluir que o DNA resolve tudo, mas que a
anlise do perfil gentico pode auxiliar na
identificao humana fazendo parte das provas
periciais de um determinado caso criminal ou civil.

Segundo Butler (2005), os testes de DNA
para identificao humana podem ser utilizados para:
Casos forenses: anlise do DNA do
suspeito com aquele obtido da evidncia biolgica encontrada na cena do crime ou nas
vtimas;
Teste de paternidade ou caracterizao de vnculo gentico familiar:
excluso ou no de supostos pais, filhos, mes e outros membros da famlia;
Desastres em massa: identificao dos fragmentos humanos e dos corpos
encontrados em um desastre com inmeras vtimas;
Investigaes histricas;
Investigaes de pessoas desaparecidas;

6

Identificao de militares;
Banco de DNA de criminosos
ou de evidncias biolgicas.

Para isso, necessrio que alguns
conhecimentos sejam adquiridos para sua
posterior realizao laboratorial. Tais
conhecimentos tericos sero ensinados
nesse curso, que englobar desde os
fundamentos bsicos da biologia molecular
at a elaborao de protocolos para a
realizao do estudo do DNA forense.

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Breve Histrico do DNA Forense

Antes da utilizao do DNA para identificao humana, os genes e suas
estruturas foram estudados para outras finalidades, sendo resumidamente descrito a
seguir:
1856-1863: Gregor Mendel

Figura 1: Gregor Mendel

Considerado o pai da gentica moderna
Estabeleceu as regras da herana gentica
Realizou experimentos com 21.000 plantas hbridas para estabelecer o conceito
de herana gentica (Figura 2).

8

Figura 2: Resumo dos experimentos realizados por Mendel, com diversos tipos de plantas e sua
herana gentica, com a presena de genes dominantes YY e recessivos yy.

1900-1933: Thomas Hunt Morgan (Figura 3)

Figura 3: Thomas Hunt Morgan contribuiu para a gentica moderna ao descobrir a herana
cromossmica e a recombinao gentica.

9

Descobriu a herana cromossmica (Figura 4) e a recombinao gentica, na
qual os ocorre a troca de fragmentos cromossmicos antes da diviso celular
(Figura 5).

Figura 4: Representao esquemtica dos resultados dos experimentos de Morgan: herana de
genes ligados ao cromossomo X.

Figura 5: Esquema ilustrativo do mtodo de recombinao gentica dos cromossomos.

10

1944: Avery, MacLeod e McCarty (Figura 6)
Atriburam ao DNA a herana gentica

Figura 6: Fotografias dos pesquisadores que estudaram a herana gentica do DNA.

11

Grupos sanguneos: Antes dos testes utilizando-se cidos nuclicos, muitos
tipos de exames sanguneos eram utilizados para auxiliar na investigao de paternidade.
Esses testes, baseados em diferentes sistemas de grupos sanguneos ofereciam
resultados de at 70 a 90%, se todos fossem analisados e combinados. Os grupos
sanguneos recomendados pela Associao Mdica Americana eram os sistemas
eritrocitrios: ABO, Rh, MNs, Kell, Duffy, Kidd e o sistema sanguneo leucocitrio HLA
(PAGE-BRIGHT, 1982).

1953: James Watson e Francis Crick (Figura 7).

Descoberta da estrutura do DNA (Figuras 8 e 9)

Figura 7: Watson e Crick.

12

Figura 8: Frmula qumica de uma cadeia simples de cido nuclico e diagrama da molcula de
DNA.

Figura 9: Modelo original da molcula de DNA descrita por Watson e Crick em 1953.

13

1985 Alec Jeffreys (Figura 10):

Figura 10: Alec Jefreys em seu laboratrio a origem da anlise do perfil de DNA.

DNA fingerprint ou impresso digital de DNA (Figura 10 e 11) foi descrito pela
primeira vez por Alec Jeffreys, em 1985, e revolucionou a anlise do DNA visando a
caracterizao de vnculo gentico.
A identificao das regies polimrficas realizada empregando-se Polimorfismo
de Comprimento de Fragmentos de Restrio (Restriction Fragment length polymorphism
RFLP), no qual o DNA submetido digesto utilizando-se enzimas de restrio
especficas que cortam a dupla fita de DNA em regies determinadas. Os fragmentos so
separados eletroforeticamente, e posteriormente desnaturados, neutralizados e
transferidos do gel de eletroforese para uma membrana de nylon, em um processo
denominado Sourthen blotting. Mediante a presena de uma soluo de hibridizao com
sondas especficas contendo fsforo radioativo, os fragmentos de DNA fita simples iro

14

hibridizar e aqueles no correspondentes sero removidos. Aps a autorradiografia, os
VNTRs podero ser visualizados para anlise (Figura 11 e 12) (COMMITTEE ON DNA
TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1992; JEFFREYS, 1985).

Figura 11: Anlise da impresso digital de DNA por Alec Jeffreys.

15

Figura 12: Representao esquemtica da anlise de Repeties Consecutivas de Nmero
Varivel ou VNTR.

Desde ento, algumas tecnologias foram desenvolvidas incluindo a anlise de
Repeties Consecutivas Curtas ou STRs (Edwards et al, 1991) por gel de poliacrilamida
corados por prata (Nelleman et al, 1994) ou analisados por equipamentos
semiautomticos que utilizam gel de poliacrilamida e realizam a leitura por laser dos
fragmentos amplificados pela PCR com iniciadores marcados com fluorforos que emitem
fluorescncia (Kimpton et al, 1993; Gill et al, 1995).
Atualmente, a eletroforese por capilar (Pearce et al, 1993) amplamente utilizada
e possui o mesmo princpio que a eletroforese em gel analisados por laser, com a

16

diferena de que possui capilares para a separao eletrofortica dos fragmentos de DNA
(Butler, 2005). H tambm relatos da utilizao de microchips de DNA para a anlise de
STRs (Radtkey et al, 2000; Huang et al, 2004; Divine e Allen, 2005; Bienvenue et al,
2005), podendo tambm ser um potencial para a anlise futura dos STRs (Figura 13).

Figura 13: Eventos histricos no mundo e no Brasil relacionados anlise de DNA forense.

O Projeto Genoma concludo agora pode identificar pelo sequenciamento do DNA
humano a localizao de genes, revelando que h provavelmente cerca de 20.500 genes
humanos. Tal fato revelou ao mundo informaes detalhadas sobre a estrutura,
organizao e funcionamento do conjunto completo de genes humanos. O Consrcio

17

Internacional para Sequenciamento do Genoma Humano publicou o primeiro rascunho do
genoma humano na revista Nature, em fevereiro de 2001, com a sequncia de todo o
genoma de trs milhes de pares de bases, cerca de 90% completo. A surpreendente
concluso desta primeira verso era de que o nmero de genes humanos pareceu ser
significativamente menor do que estimativas anteriores, a qual variou de 50.000 genes a
140.000 (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008).
A sequncia completa foi concluda e publicada em abril de 2003. Aps a
publicao da maioria do genoma, em fevereiro de 2001, Francis Collins, diretor do
Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Human Genome Research
Institute NHGRI), observou que o genoma poderia ser pensado em termos de um livro
com vrias utilizaes: Trata-se de um livro de histria, uma narrativa da viagem da
nossa espcie atravs do tempo. um trabalho manual, com um projeto para construo
incrivelmente detalhado de cada clula humana. E um livro-texto transformador da
medicina, com informaes que daro aos profissionais da sade novos poderes para
tratar, prevenir e curar as doenas (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH
INSTITUTE, 2008).
As ferramentas criadas atravs do Projeto Genoma tambm esto sendo
utilizadas para caracterizar o genoma de outros organismos usados extensivamente em
pesquisa biolgica como ratos, moscas e frutas. Tal pesquisa importante porque a
maioria dos organismos tem genes muito semelhantes ou homlogos, possuindo
funes similares. Estes objetivos so necessrios e continuaro a exigir uma variedade
de novas tecnologias que tornaro possvel e relativamente rpido construir um primeiro
esboo do genoma humano, assim como aperfeioar este projeto (NATIONAL HUMAN
GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008).

18

As tcnicas utilizadas no projeto genoma incluem:
Sequenciamento de DNA;
O emprego da tcnica de anlise de Fragmentos de
Restrio dos Polimorfismos de Comprimento (RFLP);
Cromossomos artificiais em levedura (YAC);
Cromossomos artificiais em bactria (TAS);
A reao em cadeia da polimerase (PCR);
Eletroforese.
Fonte: An Overview of the Human Genome Project.
Disponvel em http://www.genome.gov/12011238

19

Fundamentos de Biologia Molecular

O DNA (cido desoxirribonuclico) armazena toda a informao gentica, sendo
encontrado nos cromossomos do ncleo e nas mitocndrias, a maior parte localizada no
primeiro (Figuras 14 e 15).

Figura 14: A clula a unidade bsica de todos os indivduos vivos.

20

Figura 15: DNA a molcula da vida: do cromossomo a cadeia dupla de DNA.

21

O DNA pode ser extrado de amostras de sangue, de esfregaos bucais, de
saliva, de osso, de dente, de tecidos e rgos, de fios de cabelos, de smen, entre outros
materiais biolgicos (Brettell et al, 2005) (Figura 16).

Figura 16: Amostras biolgicas para anlise do DNA forense.

22

As molculas de DNA caracterizam-se por polmeros de alto peso molecular,
compostos de unidades bsicas de nucleotdeos contendo 2-desoxirribose ligados entre
as posies 3 e 5 de carbonos por ligaes fosfodister. A estrutura do DNA uma dupla
hlice de cadeias complementares opostas, na qual as duas molculas so mantidas
juntas por fracas pontes de hidrognio (Figuras 17 e 18) (Watson & Crick, 1953).
A)

23

B)

Figura 17: A) Representao esquemtica da dupla hlice da molcula de DNA segundo Watson
& Crick, 1953; B). Estrutura qumica da molcula de DNA, com sua natureza antiparalela com o carbono 3
com o carbono 5. As bases C e G so ligadas por trs pontes de hidrognio e as A e T, por duas.

24

Figura 18: Representao esquemtica da molcula de DNA.

A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina atravs de duas ou
trs unies de hidrognio respectivamente. Essas bases nitrogenadas (adenina - A, timina
- T, citosina - C e guanina G ou g) (Figura 19), ao se ligarem com o acar, constituem o
nucleosdeo; sendo que o ltimo ligado com um grupamento fosfato, constitui o
nucleotdeo, que a unidade bsica de repetio na fita de DNA (Watson & Crick, 1953)
(Figura 20).

25

Figura 19: Estrutura qumica das bases nitrogenadas e suas respectivas pontes de hidrognio.

26

Figura 20: O nucleotdeo e par de bases (base pair - bp)

Determinados fragmentos de DNA especificam a sntese de RNA em um
processo denominado transcrio. O cido ribonuclico (RNA) um polmero linear
composto de cadeia de unidades de ribose ligadas pelas posies 3 e 5 por intermdio
de grupamentos fosfodister, tendo como funo a sntese protica e tambm pode
constituir o genoma de alguns vrus. O gene uma unidade de transcrio que consiste
de um segmento de DNA especfico que se estende do incio do stio de transcrio ao
stio de trmino de transcrio. O RNA especifica a sntese de polinucleotdeos que
formaro as protenas, sendo tal processo denominado traduo, ocorrendo nos
ribossomos, nas mitocndrias e cloroplastos (Figuras 21, 22 e 23) (Beard & Armentrout,
1967; Srinivasan & Yathindra, 1977).

27

Figura 21: Fluxograma da transcrio e translao.

28

Figura 22: Mecanismo de produo de aminocidos pelas clulas.

29

Figura 23: Ilustrao da transcrio e translao.

As regies de um gene que codificam protenas so denominadas xons e
aquelas que no a realizam, ntrons. Cada xon codifica uma poro especfica da
protena completa. Em algumas espcies, incluindo a humana, os xons so separados
por longas regies de DNA denominadas ntrons ou DNA lixo, que aparentemente no
esto associadas codificao de DNA (National Human Genome Research Institute,
2008) (Figura 24 e 25).

30

Figura 24: Diferenas entre os xons e ntrons. Observe a remoo da parte amarela,
correspondente ao ntron.

31

Figura 25: Diferenas entre os xons e ntrons.

32

Os alelos constituem as variantes de um gene em uma regio particular, ou lcus,
em um cromossomo. Diferentes alelos produzem variaes nas caractersticas individuais
como, por exemplo, cor do cabelo ou tipo sanguneo (National Human Genome Research
Institute, 2008) (Figura 26).

Figura 26: Alelos correspondentes cor dos olhos, ligados ao cromossomo X.

33

A duplicao celular ocorre atravs da mitose (Figura 27) e a formao de
gametas masculinos e femininos ocorre atravs da meiose (Figura 28).

Figura 27: A mitose responsvel pelo crescimento e desenvolvimento dos indivduos, bem como
a reposio de clulas injuriadas ou destrudas do corpo.

34

Figura 28: A meiose um processo de diviso celular pelo qual uma clula diplide (pares de
cromossomos, sendo um materno e outro paterno) origina quatro clulas haplides (um cromossomo),
reduzindo metade o nmero de cromossomos constante de uma espcie.

35

A transferncia das informaes genticas de uma gerao a outra ocorre atravs
da replicao do DNA, catalisada por enzimas denominadas DNA polimerases. Essas
enzimas mediam a sntese da nova fita de DNA in vivo, utilizando como molde (template)
a fita complementar da molcula existente. Inicialmente, a molcula de DNA tem as suas
fitas separadas pelo rompimento das ligaes de hidrognio que mantm a dupla hlice,
em um processo denominado desnaturao, que ocorre in vivo em pH alcalino. Alm da
fita molde, necessria a presena de um oligonucleotdeo iniciador ou primer, ou seja,
um pequeno fragmento de DNA simples, complementar a fita molde, desoxinucleotdeos
trifosfatados (dATP, dCTP, dGTC, dTTP), que sero incorporados fita duplicada. A
replicao do DNA ocorre em regies especficas denominadas origem de replicao
(Marmur & Doty, 1959).
Sucintamente, a replicao ocorre com a adio de um nucleotdeo fita de DNA
pela ligao de seu grupo fosfrico, presente no carbono 5' da desoxirribose, com a
hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do ltimo nucleotdeo presente na cadeia
replicada. Por esse motivo, descreve-se que a sntese de DNA ocorre no sentido 5-> 3
(Figura 29) (Marmur & Doty, 1959;). Todo o processo descrito acima ser a base do
princpio da amplificao do DNA in vitro denominada reao em cadeia pela polimerase
(Polymerase Chain Reaction PCR), que ser estudado nos tpicos adiante.

36

Figura 29: Posio 5- 3das fitas de DNA.

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MDULO II

DNA Genmico X DNA Mitocondrial

O conjunto completo de sequncias no material gentico de um organismo
denominado genoma, incluindo todos os cromossomos mais qualquer DNA presente nas
organelas. O genoma nuclear humano possui cerca de 3300 Mb, distribudos em 22
cromossomos autossmicos e 2 sexuais (Figura 30 e 31), compostos de 30 a 35 mil
genes, caracterizando por 1,5% a 2% de DNA codificante de protenas, sendo que 46%
do total constitui-se de sequncias de DNA repetitivas (Wiemann, 2001; Szymasky, 2005).

Figura 30: Cromossomos humanos.

39

Figura 31: Caritipo de um humano do sexo masculino.

A finalizao do sequenciamento do DNA humano (Tabela 1) trouxe alguns dados
que alteraram os valores esperados pela comunidade cientfica, como por exemplo, a
quantidade de genes. Estimava-se que o genoma humano possua mais de 80.000 genes,
mas aps o Projeto Genoma, estima-se que existam de 20.000 a 25.000 genes (Figura
32).

40

Tabela 1: Quantidade de nucleotdeos em cada cromossomo humano.

41

Figura 32: Resumo das caractersticas bsicas do genoma humano.

42
O genoma mitocondrial possui particularidades que o diferenciam do genoma
cromossmico, sendo sua herana materna. Sua estrutura circular de 16,5Kb lhe fornece
maior resistncia digesto enzimtica de uma nica clula h a presena de milhares de
mitocndrias, cada qual com uma cpia de DNA mitocondrial, sendo que 93% do seu
genoma codificante, no possuindo ntrons e com poucas regies repetitivas (Anderson
et al, 1981). Dentro de uma nica clula h inmeras cpias do genoma mitocondrial, ao
contrrio do genoma nuclear, que possui uma cpia por clula (Budowle et al, 2003)
(Figura 33, 34 e 35).

Adaptado de http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/july1999/dnaf1.htm. Acessado em 28/09/2008
Figura 33: Diferenas bsicas entre o DNA genmico ou nuclear e mitocondrial.

43

Figura 34: Representao esquemtica do DNA genmico ou nuclear e do DNA mitocondrial
(mtDNA).

44

Figura 35: Representao esquemtica do DNA mitocondrial (mtDNA), de acordo com as suas
regies hipervariveis.

45
Marcadores de Variao Gentica

A variabilidade do DNA humano confere a diferena entre cada ser vivo, sendo
que pode ser denominada por polimorfismo se a variao gentica possuir frequncia
acima de 1% em determinada populao e mutao abaixo desse valor (Beiguelman,
2006). Jeffreys et al. (1985) foi um dos primeiros a analisar as regies de minissatlites do
DNA humano, possibilitando a investigao de paternidade e a identificao em casos
criminais. O polimorfismo dos minissatlites permite que ocorra a diferenciao dos
indivduos, aumentando a possibilidade de termos uma quantidade maior de alelos na
populao, desde que no sejam gmeos idnticos, posto que tero o mesmo perfil
gentico. Para a anlise do minissatlite, Jeffrey et al. desenvolveram o DNA fingerprint
(impresso digital de DNA). Ao utilizar a tecnologia de Southern blot, obtiveram um
padro de bandas especfico para cada indivduo, como se fosse uma impresso digital.
Os Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo de
comprimento de sequncia nica englobam os VNTR (Variable Number of Tandem
Repeats) ou repeties consecutivas de nmero varivel (Wyman e White, 1980; Jeffreys
et al,1985; Wolff et al,1989) ou minissatlites descritos no pargrafo anterior, e tambm os
STR (Short Tandem Repeats) ou repeties consecutivas curtas ou microssatlites
(Edward et al, 1991; Edward et al, 1992) (Figuras 36, 37 e 38).
A diferena entre eles o tamanho da sequncia que se repete, sendo que nos
microssatlites essa estrutura menor, pois possuem repeties constitudas de 2 a 9
pares de bases, e o minissatlite, de 10 a 64 pares de bases. Esse DNA satlite na
maioria das vezes no transcrito, consequentemente no est associado com a
expresso da informao gentica (Nelleman et al, 1994; Hamond et al, 1994; Gill et al,
1994; Urquart et al, 1994; Chakraborty et al, 1999).

46

Figura 36: Representao esquemtica comparando as VNTRs das STRs, segundo sua unidade de
repetio.

Figura 37: Representao esquemtica das repeties consecutivas do STR TPOX e seus
respectivos alelos.

47
Os Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de nucleotdeo nico
uma variao na sequncia de DNA que ocorre quando um nucleotdeo alterado por
outro em sequncias de DNA que podem ou no codificar genes (Delahunty, 1996;
Sobrino et al, 2005; Butler, 2005) (Figuras 38 e 39).

Figura 38: Representao esquemtica comparando os polimorfismos de sequncia com os de
comprimento.

48

Figura 39: Representao esquemtica de sequncias de DNA de trs indivduos distintos com a
presena de um SNP (polimorfismo de sequncia) e um STR (polimorfismo de comprimento), mostrando
suas diferenas.

Atualmente, os STRs e SNPs so empregados amplamente para a identificao
humana e possuem diferenas relevantes (Gill et al, 2004; Butler, 2005) (Quadro 1).

49
Quadro 1: Comparao entre os STRs e SNPs (adaptado de Butler, 2005).
STR SNP
Variam de 2 a 9 nucleotdeos que se
repetem consecutivamente
Troca de bases A/T, A/G, A/C, C/T,
C/G, T/G.
Apresentam-se em diversos alelos,
normalmente mais de 5
Normalmente 2
Detectado por separao
eletrofortica em gel ou capilar
Anlise por sequenciamento ou
hibridizao em microchip.
O FBI preconiza 13 STRs Estima-se que mais de 50 SNPs
seriam necessrios para a anlise (Gill
et al, 2004)
Vantagens:
Banco de dados populacionais
realizado no mundo todo
A presena de vrios alelos
facilita a identificao de
mutaes e misturas de DNA.
Vantagens:
Os produtos de PCR podem ser
menores, resultado em maior
chance de amplificao,
principalmente em amostras
biolgicas degradadas.
Aps devidamente otimizados e
estudados, pode-se analisar mais
de 1000 SNPs em um mesmo
microchip, mas essa tecnologia
ainda no amplamente
empregada.

50
A anlise dos SNPs tambm pode estar associada aos fentipos individuais,
havendo uma possibilidade futura de identificao de traos fsicos como, por exemplo, a
cor da ris (Frudakis et al, 2003). Sua grande aplicao na atualidade se d nas pesquisas
de farmacogentica e na indstria farmacutica, na caracterizao de doenas de origem
gentica e bioqumica (Wang et al, 1998).
Jobim et al. (2006) relata que os melhores STRs utilizados na identificao
humana so aqueles com maior polimorfismo (maior nmero de alelos), menor tamanho
(100 a 200 pares de bases), elevado ndice de discriminao e heterozigose, e baixa
frequncia de mutaes. Para isso, h a necessidade dos laboratrios realizarem a
frequncia gentica em pelo menos 100 indivduos no relacionados.

Anlise do DNA Forense: Aspectos Gerais

Para analisar uma amostra de material biolgico visando caracterizao de
vnculo gentico, seja familiar ou em casos criminais, qualquer contaminao de DNA
estranho, ou mesmo a inadequao das metodologias aplicadas, pode resultar tanto na
impossibilidade de estabelecer os perfis genticos como na inutilizao da amostra, posto
que principalmente em casos forenses a amostra pode ser nica. A primeira preocupao
no estudo do perfil gentico, visando identificao humana, avaliar o quanto as
metodologias de deteco utilizadas pelos laboratrios so vlidas, assim como seus
princpios moleculares e genticos.
Tendo em vista assegurar uma gerao de dados corretos e tecnologias
adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade essencial para os
laboratrios de anlises clnicas que realizam identificao humana pelo DNA. Todas as
metodologias de anlise de DNA forense devem ser submetidas a um programa de
validao visando assegurar a segurana, a reprodutibilidade e robustez da tcnica
(Klosterman, 2001). Resumidamente, a anlise de DNA forense ocorre da seguinte
maneira (Figura 40):

51

Figura 40: Esquema da sequncia dos mtodos a serem utilizados para o estudo do DNA forense,
englobando os estudos da Biologia, da Tecnologia envolvida e da Gentica aplicada.

Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogentica Forense (ISFG), que
atualmente denominada de Sociedade Internacional de Gentica Forense (ISFG),
publica recomendaes envolvendo polimorfismos de DNA, demonstrando o interesse em
avaliar a reprodutibilidade e exatido das metodologias utilizadas. O FBI acrescenta
alguns itens para o controle de qualidade dos laboratrios que trabalham com evidncias
de DNA forense, que inclui, alm desses cuidados, a realizao de peridicos testes de
proficincia (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manuteno da garantia de
qualidade. O teste de proficincia utilizado para monitorar o rendimento e identificar

52
tpicos que devem ser aperfeioados e a auditoria para averiguar a qualidade das
atividades realizadas pelo laboratrio (DNA Advisory Board, 2000).
Os exerccios propostos para laboratrios que realizam caracterizao de vnculo
gentico normalmente so constitudos de amostras biolgicas de indivduos me, filho e
suposto pai, com o intuito de comparar as estratgias utilizadas, seus protocolos
metodolgicos, assim como os resultados obtidos entre os participantes (Bjerre et al,
1997; Hallengerb e Morling; 2001).
No Brasil, tais testes de proficincia em identificao humana pelo DNA so
realizados pelo Grupo Espanhol e Portugus da Sociedade Internacional de Gentica
Forense (Grupo Espaol Y Portugus - International Society for Forensic Genetics), no
havendo um grupo especfico que realize testes de proficincia no pas. Esses testes
consistem na anlise de amostras de sangue e outro fluido biolgico que simulam um
caso forense para a manuteno da qualidade na anlise do DNA de amostras (ISFG,
2000).
As contaminaes das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratrio
podem resultar em uma incorreta interpretao do perfil gentico. Dessa maneira, o
desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos especficos
para o exame de DNA tornaram-se imprescindveis (Neumayer, 1998; INTERPOL, 2001).
Nos EUA o FBI implantou o CODIS - Combined DNA Index System, que tornou-se
operacional em 1998, e combina a cincia forense com a tecnologia eletrnica, formando
um banco de dados de perfis genticos de DNA extrado de evidncias biolgicas
coletadas na cena do crime e DNA de criminosos condenados por agresso sexual e
outros tipos de violncia fsica (Figura 41). Todos os estados americanos podem ter
acesso a esse banco de DNA e, dessa maneira, h a possibilidade de comparar os perfis
genticos de um suspeito em um crime com os perfis contidos no CODIS, averiguando se
o mesmo cometeu anteriormente outra infrao (FBI, 2002).

53

Figura 41: Inspeo visual de evidncia forense.

O CODIS selecionou 13 STRs para a anlise do perfil gentico: CSF1PO, FGA,
TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51,
e D21S11 (Budowle & Moretti, 1999) (Figura 42 e Tabela 2). Esse conjunto de loci
transformou-se uma referncia para outros pases do mundo, no que se refere cincia
forense (Sun et al, 2003).

54

Figura 42: STRs recomendados pelo Banco de DNA, vinculado ao FBI (CODIS), segundo a sua
distribuio nos cromossomos humanos. Fonte: http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/fbicore.htm.

55
Tabela 2 Informao dos 13 STRs recomendados pelo CODIS.

Nome do
Lcus
Localizao do
cromossomo
Unidade
de
repetio
Acesso
GenBank
http://www.n
cbi.nih.gov/
Genbank/in
dex.html
Variao
dos alelos
Nmero de alelos
observados
CSF1PO 5q33.1
c-fms pronto-
oncogene,
6 intron
TAGA X14720 6-16 15
FGA 4q31.3
-fibrinognio
3 intron
CTTT M64982 15-51,2 69
TH01 11p15.5
Tirosina hidroxilase
1 intron
TC|AT D00269 3-14 20
TPOX 2p25.3
Tiroide peroxidade
10 intron
GAAT M68651 6-13 10
VWA 12p13.31
von Willebrand
factor
40 intron
[TCTG]
[TCTA]
M25858 10-24 28
D3S1358 3q21.31 [TCTG]
[TCTA]
NT_005997 9-20 20
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22
D8S1179 8q24.13 [TCTA]
[TCTG]
G08710 8-19 13
D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14
D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43
D21S11 21q21.1 [TCTA]
[TCTG]
complexo
AP000433 24-38 70
Adaptado de Butler et al, 2005

O DNA working group of the European Network of Forensic Science Institutes
(ENFSI) e Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) (Gill et al,
2004) levantam a possibilidade futura da substituio do banco de dados de DNA
atualmente contendo os 13 STRs indicados pelo CODIS do FBI por um banco de dados

56
de DNA contendo informaes de SNPs. Entretanto, os autores citam que a curto e mdio
prazo no haver a substituio dos bancos de dados, inclusive das tecnologias
utilizadas, e sim a incorporao dos mesmos em estudos forenses visando
padronizao do seu uso assim como de sua anlise.
Essa normatizao possibilita maior facilidade em comparar tanto as frequncias
allicas populacionais como os resultados dos perfis genticos, mesmo que seja realizada
em outros pases. Visando futuramente implantar um banco de perfis genticos de
criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro j adotou os STRs sugeridos pelo
CODIS como referncia em percias criminais em seu Manual de Padronizao de
Exames de DNA em Percias Criminais (Secretaria Nacional de Segurana Pblica -
SENASP, 2006), que est sendo utilizado como referncia para os laboratrios que
trabalham com identificao humana.

57
Estudo da Metodologia Aplicada Identificao Humana

A anlise do DNA em caracterizao do vnculo gentico engloba desde o
domnio da metodologia de coleta do material biolgico at a interpretao dos resultados
obtidos (Butler, 2004) (Figura 43). Cada qual possui sua particularidade e cuidados
inerentes tcnica que podem oferecer vantagens e desvantagens, de acordo com o
objetivo almejado.

Figura 43: Esquema de todos os procedimentos envolvidos em caracterizao do vnculo
gentico.

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59
Exame Pericial no Local do Crime

Em 2000, a Agncia Federal de Investigao dos Estados Unidos (EUA), mais
conhecida como FBI (Federal Bureau of Investigation), elaborou um guia para a
investigao da cena do crime (TWGCSI Grupo de trabalho tcnico da investigao da
cena do crime, 2000). Esse manual visa padronizao das prticas adotadas para a
investigao da cena do crime dos policiais e peritos americanos, tornando-se referncia
em investigao da cena do crime, seja para o exame de DNA forense ou no. Eles
elaboraram esse manual dividindo em cinco sesses distintas: chegada cena do crime,
documentao preliminar, avaliao da cena, processando a cena, finalizando a
investigao da cena do crime.

1) Chegada cena do crime: Um dos cuidados mais importantes da percia
criminal a manuteno das evidncias fsicas e a preservao da cena do crime, que
deve ser realizada imediatamente aps sua constatao, e realizado normalmente pela
polcia local (Figura 44).

a) Anotar o local, a data, o tipo de ocorrncia, casas, veculos, eventos
ocorridos e elementos envolvidos;
b) No permitir que pessoas, veculos ou objetos saiam da cena do crime,
identificando possveis vtimas e suspeitos;
c) Aproximar-se da cena cuidadosamente e verificar a possibilidade de outros
crimes ao redor;
d) Realizar observaes iniciais (olhar, ouvir e cheirar) o ambiente e anot-los;
e) Observar a possibilidade de perigo de exploso e contaminao por
materiais perigosos ou txicos e, se necessrio, chamar policiais especializados para
analisar a cena do crime;

60

Figura 44: Esquema de isolamento da cena do crime.

f) No permitir que pessoas, veculos ou animais se aproximem da cena do
crime, evitando contaminaes e perigos como exploses;
g) Aps controlar as situaes de perigo e isolar a rea, a prxima ateno
chamar socorro mdico para dar assistncia mdica necessria aos feridos, minimizando
ao mximo a contaminao da cena do crime;
h) Anotar todas as etapas dos cuidados mdicos, desde sua hora de chegada
at os cuidados prestados;
i) Assegurar que evidncias como roupas, objetos e manchas encontradas no
corpo sejam preservadas pela equipe mdica;
j) Documentar todos os comentrios e testemunhos de pessoas envolvidas ou
presentes no local do crime ou ao seu redor;

61
k) Um oficial da polcia deve sempre que possvel acompanhar a vtima para o
hospital para garantir a preservao das evidncias ou mesmo documentar comentrios
feitos pelo paciente;
l) Lacrar a cena do crime com faixas e adesivos;
m) Controlar o fluxo de pessoas, inclusive peritos e outros policiais;
n) Se possvel, efetuar mensuraes e tirar fotografias com escalas, para
preservar as evidncias como pegadas, marcas de pneu no cho, etc , presentes na
cena do crime, caso chova, neve ou derreta (se for gelo);
o) No permitir que qualquer pessoa fume, masque chiclete, use o telefone ou
banheiro, coma ou beba qualquer coisa, mexa nos vidros e janelas, mude os mveis de
lugar, etc. Ou seja, no permitir que mexam em qualquer objeto presente na cena do
crime ou ao seu redor;
p) Toda a documentao e anotaes feitas pelo policial devem ser entregues
ao investigador de polcia para posterior estudo e anlise.

2) Documentao preliminar e avaliao da cena:

a) O investigador de polcia dever documentar todas as informaes
recolhidas pelo policial, organiz-las e identific-las com os dados da regio do crime
(delegacia, responsvel, cidade, estado, etc);
b) Continuar a manuteno da cena do crime descrita anteriormente,
documentando todas as pessoas que estiverem participando da investigao;
c) Definir estratgias para a anlise fotogrfica e recuperao dos vestgios
encontrados na cena do crime.

3) Processando a cena:

a) O investigador dever avaliar e posteriormente solicitar a presena de
peritos criminais, de acordo com a especialidade envolvida;
b) O controle da contaminao deve ser extremamente rgido, evitando-se o
contgio dos profissionais, das vtimas, da cena do crime, dos objetos, etc.;

62
c) Utilizar equipamentos de proteo individual (EPI), como luvas (obrigatrio),
gorros e protetores de sapato (se necessrio);
d) Todo material utilizado para coleta das evidncias deve estar devidamente
limpo ou at esterilizado, caso seja para coleta de material biolgico, e deve ser
corretamente acondicionado (Figura 45);

Figura 45: Envelopes e sacos de papel para coleta de evidncias e objetos encontrados na cena do
crime como roupas, celulares, documentos, etc.

e) Toda evidncia deve ser corretamente documentada, citando-se a
localizao, identificao e condies que se encontravam, fotografada com escalas de
referncia e/ou filmadas antes de ser removida da cena do crime;

f) Analisar e verificar a metodologia utilizada para a coleta da evidncia. Por
exemplo, cada mtodo requer equipamentos e materiais diferenciados para a sua
realizao. Sendo assim, para fazer a anlise de impresses digitais no se utiliza o
mesmo equipamento para exame de marcas de mordidas, e assim por diante;

63
g) Documentar qualquer intercorrncia ou dificuldade havida durante a coleta
do material;
h) Preservar adequadamente o material coletado com a finalidade de minimizar
sua degradao: refrigerado, congelado, local seco, local mido, etc.;
i) Encaminhar para os respectivos laboratrios periciais.

4) Finalizando a investigao da cena do crime:

a) Determinar quais evidncias foram coletadas;
b) Discutir com toda a equipe envolvida na cena do crime as intercorrncias e
evidncias.

------------------FIM DO MDULO II-----------------

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65
MDULO III

Estudo da Metodologia Aplicada Identificao Humana (Cont.)

Coleta do Material Biolgico

As amostras de material biolgico devem ser minuciosamente colhidas, seja
quando dispostas na cena do crime ou quando forem de indivduos devidamente
identificados. importante que todas as pessoas que manipulam as amostras tenham
conhecimentos especficos baseados na literatura especializada, e ainda possuam
treinamento em boas prticas de manipulao em laboratrios forenses, com rgida
formao em controle de qualidade (NTERPOL, 2001). Amostras que no estiverem
adequadamente identificadas e documentadas podem ser questionadas; aquelas que no
forem corretamente coletadas so passveis de no serem analisadas; outras, se no
forem devidamente acondicionadas podem sofrer contaminao e se no forem
criteriosamente preservadas pode ocorrer decomposio e deteriorao (FB, 2003).
O FB (1999, 2001) e a NTERPOL (2001) elaboraram normas para os
laboratrios forenses que participam da formao dos bancos de DNA internacional,
englobando principalmente a metodologia de coleta de evidncias biolgicas para anlise
do DNA, assim como aspectos importantes para o treinamento de pessoal que sero
descritas adiante. O material biolgico presente na cena do crime pode aparentar invisvel
a olho nu, dessa maneira, utiliza-se reagente como o luminol que no interfere na anlise
do DNA para deteco de amostras com vestgios de sangue, sendo que reage com o
ferro presente na hemoglobina, exibindo uma quimioluminescncia (GROSS et al, 1999).
Outros kits de reagentes so empregados: aqueles que contm antgeno prstata-
especfico para smen (HOCHMESTER et al, 1999) e para saliva, o teste de deteco de
amilase por Phadebas (WLLOTT & GRFFTHS, 1980) etc. Diversos cuidados devem
ser tomados para a documentao das amostras coletadas na cena do crime: fotografar o
local de remoo das evidncias, realizar anotaes da sua disposio e de
caractersticas pertinentes (SO PAULO, 1999; NTERPOL, 2001 ; FB, 2003;

66
BONACORSO, 2005). Amostras de sangue podem ser coletadas dos indivduos,
encontradas em corpos, objetos e superfcies (Figura 46). Qualquer que seja o material
biolgico a ser coletado, o manipulador dever utilizar luvas ou pinas estreis (Figura 46
e 47). A coleta de sangue em indivduos hgidos dever ser realizada em dois tubos de
5mL contendo EDTA como anticoagulante, devidamente identificado e a seguir
refrigerado.
Recomenda-se que os objetos, superfcies ou corpos que possuem as amostras
de sangue sejam recolhidos se possvel, alm de realizar esfregaos nas formas lquidas
ou, se secas, umidificar a regio com gua estril, seguida de esfregao. Em ambos os
casos aconselha-se esperar secar os esfregaos (Figuras 48 e 49) para depois serem
embalados em envelope de papel limpo (Figura 47), evitando que a umidade facilite o
crescimento de bactrias e fungos. Amostras de smen, de saliva e urina, ou de objetos
que os contm, podem ser utilizadas e seguem a mesma metodologia descrita
anteriormente. Tecidos, dentes, ossos e fios de cabelos tambm podem servir de fonte de
clulas para anlise de DNA (FB, 2003). A estocagem do material deve ser em
refrigerador a 4C ou em freezer a -20C, no entanto, para longos perodos, estocar a -70
a -80C (BUTLER, 2005).

67

Figura 46: Amostras de sangue sendo coletadas de um objeto perfuro-cortante faca
frequentemente utilizado em agresses fsicas e homicdios.

68

Figura 47: manipulao de material contendo amostras biolgicas com luvas.

Figura 48: esfregao bucal utilizado para a coleta de saliva e clulas descamadas da mucosa oral,
para a extrao de DNA.

69

Figura 49: Coletor estril apropriado para coleta de materiais biolgicos presentes na cena do
crime.

O armazenamento do material biolgico mido em sacos plsticos deve ser de no
mximo 2 horas ou, quando possvel, permitir que seque antes do acondicionamento final.
Cada tipo de amostra de material biolgico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua
coleta e disposio individualmente descrito (Secretaria de Segurana Pblica de So
Paulo SSP-SP, 1999; NTERPOL, 2001). A degradao do DNA de amostras biolgicas,
utilizadas em investigao criminal, pode ocorrer decorrente de um processo natural de
exposio ao meio-ambiente. Luz, umidade, temperaturas elevadas, bem como
contaminaes bacterianas ou fngicas levam degradao qumica do DNA humano
(SCHNEDER et al, 2004).
A comisso de DNA da nternacional Society For Forensic Haemogenetics SFH
sugeriu algumas recomendaes para a anlise de DNA pela PCR, incluindo que essa
contaminao pode ser evitada, atendendo a certos cuidados durante todo o processo de
anlise de DNA, que vo desde a coleta e armazenamento do material biolgico do qual

70
ser extrado o DNA, at o prprio local de preparao da PCR. As contaminaes das
amostras pelos investigadores e pessoas do laboratrio podem resultar em uma incorreta
interpretao do perfil gentico. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de
normas de procedimentos e treinamentos especficos para o exame de DNA tornaram-se
imprescindveis (NTERPOL, 2001).
Visando o estabelecimento de normas para coleta e exame de materiais
biolgicos para identificao humana, a Secretaria de Segurana Pblica do Estado de
So Paulo (SSP-SP) baixou a Resoluo SSP-194, em 2 de junho de 1999 (So Paulo,
1999):

Considerando:
a) a necessidade de normatizar os servios periciais relativos
coleta de materiais biolgicos para exames de identificao humana,
tanto nos locais de crime quanto na pessoa humana, viva ou morta;
b) que os procedimentos a serem seguidos pelos rgos policiais e
periciais oficiais devem estar em consonncia com os ditames da
legislao em vigor, e
c) que imprescindvel a correta preservao das amostras para
no haver contaminaes ou outros prejuzos (p. 104).

Continuando na mesma Resoluo, em seu anexo cita os cuidados que devemos
ter para a coleta, armazenamento e anlise do material biolgico para a extrao de DNA.
Os cuidados incluem utilizao de luvas descartveis; instrumentos de coleta,
armazenamento e anlise devem ser estreis; a documentao completa do vestgio
eleito para a coleta, incluindo-se fotografias da regio, tipo de armazenamento, entre
outros; o armazenamento do material biolgico mido em sacos plsticos deve ser de no
mximo 2 horas ou, quando possvel, permitir que seque antes do acondicionamento final.
Cada tipo de amostra de material biolgico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua
coleta e acondicionamento individualmente descrito.

71
EXTRAO DE DNA

A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vrios fatores,
podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para a sua extrao. Aps a
coleta do material biolgico, o DNA da amostra dever ser separado de outras
substncias celulares antes de ser examinado. Protenas celulares, contaminaes
qumicas e microbiolgicas diminuem o poder discriminatrio das anlises utilizando o
DNA (BUTLER, 2005; HOFF-OLSEN et al, 1999; JUNG et al, 1991).
A escolha do uso de diferentes mtodos de extrao de DNA est relacionada ao
tipo de material envolvido e influencia diretamente o sucesso da anlise dos STRs. A
maioria dos procedimentos de extrao de DNA compreende a lise celular, seguida da
remoo das protenas celulares precipitadas e por fim a precipitao do DNA com sua
final eluio. Existem diversos mtodos para obteno de DNA: a extrao orgnica, que
a mais tradicional, empregando-se a proteinase K para lise celular e fenol clorofrmio

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73

PROTOCOLO DE EXTRAO DE DNA DE SALIVA PELO MTODO
ORGNICO (Anzai et al.; 2001).

A amostra de saliva coletada e colocada em tubo estril submetida
centrifugao para a separao das clulas de sua parte aquosa, removendo-
a. As pontas contendo o algodo dos swabs que contm a saliva coletada
sobre a pele foram colocadas em um tubo estril, sendo imediatamente
iniciado o processo de extrao, sem nenhum preparo prvio. Em seguida,
adiciona-se 700L do tampo de lise para saliva (10mM TRS pH8,0; 10mM
EDTA; 0,1 M NaCl; 2% SDS) e posteriormente 35l de Proteinase K 20mg/mL.
Aps agitao, a tampa do tubo deve ser vedada com Parafilm e incubada
por uma noite a 56
o
C.
A seguir, a Proteinase K inativada a 95
o
C por 10 minutos,
adicionando-se 700L de fenol tamponado com pH 8,0 e homogeneizando-se
com movimentos manuais leves por 5 minutos. Centrifuga-se e o
sobrenadante transferido para outro tubo, utilizando uma micropipeta com
ponteira estril. Acrescenta-se fenol/ clorofrmio/ lcool isoamlico (25:24:1)
na mesma quantidade do sobrenadante removido, homogeneiza-se,
centrifuga-se e remove-se o sobrenadante novamente para outro tubo.
Adiciona-se ao sobrenadante cerca de 2 ou 3 vezes o volume recuperado,
lcool 100% e 10% do volume em acetato de sdio 5M. ncuba-se durante
uma noite a -20
o
C.
No terceiro dia de extrao, centrifuga-se a mistura. Dispensa-se o
etanol, e ao precipitado adiciona-se 1mL de etanol 70%, homogeneizando-se
cuidadosamente. Centrifuga-se e novamente removido o lcool. Seca-se
totalmente o "pellet". Ressuspende-se o "pellet" com 100L de T.E. (Tris-base
100mM, pH 7,6; EDTA 10mM, pH 8,0).

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76
A tcnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira fase, a lise
celular, seguida de desnaturao ou inativao de protenas. Com solventes orgnicos o
DNA posteriormente separado de macromolculas, como as protenas atravs de
solubilizao em gua, e em seguida precipitado com etanol. Outras metodologias com o
mesmo princpio, inclusive kits comerciais, podem ser utilizadas para cada tipo de
amostra biolgica. H diferentes metodologias para a extrao de DNA de sangue total
(Salazar et al., 1998; Schneider, 1998), de esfregaos vaginais e de amostras de smen
(Schneider, 1998), de saliva total e de materiais contendo saliva (Walsh D et al., 1992;
Sweet et al., 1996; Hochmeister et al., 1998; Anzai et al., 2001, Anzai-Kanto, 2005); de
dente humano (Oliveira, 2000), de osso (Hagelberg et al., 1991; Alves, 2000) (Figura 53);
de material parafinado (Mesquita et al., 2001), tecidos removidos de cadveres
(Hochmeister, 1998) (Figura 51), entre outros.

Figura 53: Cadver em avanado estado de putrefao, submergido em mar por
aproximadamente 1 ms. O material biolgico coletado para a extrao de DNA foi a cabea do fmur e
tecido da parte interna do trax, utilizando a poro interna da amostra para evitar a contaminao do DNA
externo.

77

A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vrios fatores como
condies da amostra e da conservao, sendo necessrio utilizar critrios para escolha
da metodologia de extrao para cada tipo de amostra (HAGELBERG et al., 1991;
HOCHMESTER, 1998; SALAZAR et al., 1998; SCHNEDER, 1998; ALVES, 2000; ANZA
et al., 2001; MESQUTA et al, 2001; OLVERA et al, 2002).
O DNA pode ser obtido inclusive de clulas nicas, como as bucais. O isolamento
de DNA micromanipulado de cada uma das 226 clulas utilizadas, a alterao da
concentrao de iniciadores, a utilizao de AmpliTaqGold e reao de PCR com 34
ciclos, possibilitou que Findlay et al. (1997) obtivessem sucesso ao amplificar o DNA de
cada uma dessas clulas. AmpliTaqGold tem uma estabilidade temperatura maior do
que outras taqs, como a taq polimerase comum. Ao amplificarem individualmente o DNA
de cada clula, obtiveram amplificao em 91% (206), sendo que em 50% (114) o perfil
gentico (7 loci) foi completo, em 64% (144) amplificou-se 4 a 6 loci. Os autores insistem
no rigoroso controle da contaminao, posto que mesmo tomando esse cuidado em sua
Extrao de DNA Do Sangue (Salazar et al, 1998)

As amostras de sangue foram submetidas lise celular com 1000L
do tampo Tris-1 (Tris HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl
2
10mM EDTA 2mM
pH 8,0) contendo Triton X-100 a 2.5%. Aps a centrifugao, os ncleos
celulares foram lisados com 220L do tampo Tris-2 (Tris-HCl 10mM pH8,0,
KCl 10 mM, Mg Cl
2
10mM, EDTA 2mM pH 8,0, NaCl 0,4 M) contendo SDS a
1%. As protenas foram removidas por precipitao salina com 100% seguindo
de lavagem etanol 70%, por 3 vezes. Posteriormente o DNA foi ressuspendido
em 100L do tampo TE (Tris-HCl 10 mM e 1mM EDTA, pH 8,0) e mantidos a
20
o
C.

78
pesquisa obtiveram 28% com alelos adicionais aos verdadeiros alelos, e 11% somente
com alelos adicionais.

Quantificao de DNA

A quantificao do DNA aps a sua extrao importante para o aperfeioamento
da qualidade do produto de DNA resultante da PCR (nternacional Society for Forensic
Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poder saturar a
reao, fazendo com que aparea artefatos de tcnica e amplificaes inespecficas que
podem dificultar a sua anlise. J a sua falta poder acarretar a perda de um dos alelos,
quando o indivduo heterozigoto, ou mesmo na no amplificao dos mesmos (Butler,
2005).
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas aps a extrao, alm
de verificar a possibilidade de degradao (JUNG et al, 1991; HOFF-OLSEN et al, 1999).
O DNA pode ser quantificado por espectrofotometria em espectrofotmetro (Figura 54 e
55) a 260 nm, sua pureza pela relao 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada
em gis de agarose. No entanto, esses mtodos avaliam a quantidade geral de DNA, seja
ele humano ou de outro tipo. Quando se refere s amostras utilizadas em investigao
criminal ou passveis de degradao e contaminao, recomenda-se a utilizao da
quantificao de DNA de humano (NTERNACONAL SOCETY FOR FORENSC
HAEMOGENETCS - SFH, 1992).

79

Figura 54: Espectrofotmetro utilizado para quantificao de cidos nuclicos.

Figura 55: Espectrofotmetro utilizado para quantificao de DNA que utiliza apenas 1L de
produto de extrao de DNA.

80
Essa quantificao pode ser realizada por hibridizao de uma sonda utilizando-
se um determinado lcus (D17Z1) em uma amostra de DNA imobilizada de uma
membrana de nilon dot blot (WALSH et al., 1992; ANDERSEN, 1998), e por kits
comerciais como, por exemplo, o AluQuant human DNA quantitation system (WAYE et
al, 1989; HOFF-OLSEN et al, 1999; MANDREKAR et al., 2001; SCHNEDER et al, 2004;
BUTLER, 2005). Apesar dessas tcnicas serem mais complexas e caras que a
espectrofotometria, elas quantificam somente o DNA humano, pois possuem sondas
especficas para o mesmo. Tal caracterstica pode ser imprescindvel em casos forenses
que haja a possibilidade de contaminao de DNA externo. No entanto, muitas vezes no
utilizada, pois h a necessidade de 5 a 10L de produto de DNA, o que muitas vezes
no obtido.
Uma metodologia que est substituindo as outras tcnicas de quantificao por
utilizar pouca quantidade de DNA, ser especfico para DNA e inclusive possibilitando
verificar a presena de inibidores da enzima polimerase a quantificao de DNA por
PCR em tempo real. Principalmente em casos forenses que existe nfima quantidade de
DNA, est sendo altamente recomendada. Consiste no emprego de marcadores
especficos marcados com fluorescncia que so utilizados para a amplificao de
regies do genoma humano. No entanto, para fins didticos, ser explicado aps a
explicao da reao em cadeia pela polimerase (PCR), pois envolve a amplificao do
DNA. A amostra biolgica sendo preservada adequadamente e realizada em timas
condies de extrao e quantificao obtm-se quantidades maiores ou menores de
DNA (Tabela 3).

81
Tabela 3: Quantidade de DNA extrado de diversos tipos de material biolgico (Butler,
2005).

Tipo de amostra Quantidade de DNA
Sangue total 20000 ~ 40000 ng/mL
Mancha de sangue 250 ~500 ng/cm
3

Lquido seminal 150000 ~ 300000 ng/mL
Esfregao de material vaginal ps-coito 10 ~3000 ng/esfregao
Fio de cabelo com bulbo 1 ~750 ng/fio
Plo com bulbo 1 ~10 ng/plo
Saliva total 1000 ~10000 ng/mL
Esfregao bucal 100 ~1500 ng/esfregao
Urina 1 ~20 ng/mL
Osso 3 ~10 ng/mg
Tecido 50 ~500 ng/mg

82
Reao de Amplificao pela Polimerase - PCR

Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi a PCR, tendo
como seu inventor Kary Mullis (Figura 56), recebendo o Prmio Nobel por essa
descoberta (NTERPOL, 2001). A PCR consiste na amplificao seletiva de uma
sequncia-alvo de DNA especfica a partir de uma coleo heterognea de DNA,
empregando-se um par de oligonucleotdeos iniciadores que so complementares a uma
certa extenso em ambas as fitas do DNA a ser amplificado (Saiki et al, 1985). Vrias
sequncias de iniciadores de diversas regies do DNA humano j foram estabelecidas
possibilitando a amplificao de seus respectivos STRs nas reaes de PCR
(Polymeropoulos et al., 1991; Polymeropoulos et al., 1992; Nishimura & Murray, 1992; Li
et al., 1993; Moller et al., 1994; Urquhart et al., 1994; Urquhart et al., 1995; Jin et al.,
1997). A sequncia-alvo de DNA, cuja continuao originalmente conhecida,
denominada DNA molde.

Figura 56: Kary Mullis inventou a PCR, permitindo que sejam amplificados in vitro fragmentos
de molculas de DNA.

83
A PCR envolve trs etapas: desnaturao, hibridizao e extenso. A
desnaturao ocorre quando a molcula de DNA aquecida acima da temperatura de
90C, na qual as pontes de hidrognio da dupla hlice se rompem, ocorrendo a separao
das cadeias complementares. Os iniciadores se ligam especificamente s sequncias de
DNA complementares no processo de hibridizao, mediante uma temperatura que pode
variar de 45 a 72C e deve ser previamente otimizada, estando relacionada temperatura
de melting (Tm), que medida atravs de uma frmula especfica que envolve a
quantidade de C e G em sua sequncia.
A prevalncia de ligao dos iniciadores ocorre pela sua alta concentrao no
meio da reao. A enzima termoestvel denominada DNA polimerase direciona o
posicionamento dos precursores do DNA dNTP iniciando a sntese de novas fitas de
DNA. Com um novo aumento de temperatura, a enzima DNA polimerase catalisa a
reao, incorporando o nucleotdeo na posio terminal do iniciador, complementando as
bases do DNA molde, promovendo a extenso da fita (Saiki, 1985, Sambrook et al, 2001)
(Figura 57, 58 e 59).

84

Figura 57: Esquema da reao de PCR, com visualizao dos fragmentos.

85

Figura 58: Representao esquemtica da PCR com detalhamentos dos reagentes que a
envolvem.

86

Figura 59: Esquema representativo de exemplo de ciclagem para uma PCR convencional.

A PCR realizada em equipamentos denominados termocicladores que
controlam e variam a temperatura automaticamente para cada programa pr-estabelecido
pelo pesquisador (Figura 60).

87

Figura 60: Exemplo de termociclador utilizado para a PCR.

A reao de PCR preparada utilizando-se diversos reagentes que devem
possuir concentraes especficas para cada tipo de anlise. Atualmente, existem
diversos kits de PCR contendo todos os reagentes pr-padronizados que facilitam a
utilizao da PCR em laboratrios forenses. No entanto, de grande importncia que o
pesquisador entenda todo o processo de amplificao e seus reagentes. O reagente que
vai direcionar a otimizao de cada reao ser o primer ou iniciador, que flanquear a
regio do DNA a ser copiada, sendo um oligonucleotdeo sintetizado quimicamente e
adicionado reao em altas concentraes (Butler, 2005).

88
Tabela 4: reagentes utilizados em uma PCR com a respectiva concentrao tima.
Reagente Concentrao tima
Tris-HCl, pH 8,3 (25C) 10 a 50 mM
Cloreto de Magnsio 1,2 a 2,5 mM
Cloreto de Potssio 50 mM
Desoxirribonucleotdeos trifosfatados
(dNTPs)
200 M de cada
nucleotdeo(dATP, dTTP, dCTP,
dGTP)
DNA polimerase termoestvel 0,5 a 5 U
Soro de Albumina Bovina (BSA)* 100 g/mL
Primers ou Iniciadores 0,1 a 1,0 M
DNA 1 a 10 ng de DNA
No utilizado em todas as reaes

As ciclagens da PCR variam de acordo com os reagentes empregados,
principalmente com a enzima polimerase, que altera a temperatura de extenso, os
primers, que muda a temperatura de hibridizao; e com a amostra de DNA, pois
apresenta-se em pouca quantidade, podendo aumentar o nmero de ciclos. S para ter
uma idia da variao das condies de ciclagem para kits diferentes utilizados em DNA
forense foram colocados na tabela 5 exemplos de parmetros de duas empresas
distintas.

89
Tabela 5: Parmetros utilizados para a ciclagem da PCR em kits de PCR multiplex
comercialmente disponveis no mercado, e que so os mais utilizados mundialmente.
Passo do protocolo AmpFlSTR kits
(Applied
Biosystems)
GenePrint STR Kits
(Promega
Corporation)
Desnaturao inicial 95C / 11
minutos
95C / 11 minutos
Quantidade de ciclos 28 ciclos 30 ciclos
Desnaturao 94C / 1 minuto 94C / 30 segundos
(ciclo 1 a 10)
90C / 30 segundos
(ciclo 11 a 30)
Hibridizao 59C / 1 minuto 60C / 1 minuto
Extenso 72C / 1 minuto 70C / 1 minuto
Extenso final 60C / 60
minutos
60C / 30 minutos
Final 10C at sua
remoo do
equipamento
4C at sua remoo
do equipamento

As vantagens da utilizao da PCR na cincia forense so a sua sensibilidade,
pois capaz de amplificar sequncias a partir de quantidades nfimas da sequncia-alvo
de DNA e at mesmo do DNA de uma nica clula; e sua robustez, permitindo a
amplificao de sequncias especficas a partir de material biolgico degradado (SFH,
1992, NTERPOL, 2001; Sambrook, 2001). No entanto, tal eficincia e sensibilidade
implicam tambm na ateno aos cuidados para evitar-se a contaminao de DNA
externo, que pode ocorrer durante todo o processo de anlise do DNA (nternacional
Society For Forensic Haemogenetics SFH, 1992).
Kwok & Higuchi (1989) elucidaram vrios cuidados pertinentes preparao do
material para a PCR, objetivando evitar a contaminao das amostras:

90

A preservao do DNA forense para a amplificao pela PCR tambm envolve o
controle da temperatura, da umidade, o valor do pH, a presena de cido hmico e flvico
e microorganismos. A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado de
milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem
preservado em ambientes secos e com o mnimo crescimento de microorganismos
(Figura 61). A presena de cido flvico e hmico pode comprometer a amplificao pela
PCR pelo fato de inibir os efeitos da enzima polimerase utilizada na reao. O pH neutro
ou levemente alcalino na amostra tambm ajuda na preservao do DNA. Os

o isolamento fsico da rea de preparao da PCR e de seus produtos
utilizados;
no levar para a sala de PCR qualquer tipo de material biolgico ou produto
de DNA.
autoclavar a gua deionizada e outras solues, com exceo dos iniciadores,
dNTPs (desoxirribonucleotdeos trifosfatos), tampo comercial e Taq DNA
polimerase;
aliquotar reagentes;
utilizao de luvas descartveis que devem ser constantemente trocadas;
ter cuidado ao abrir os tubos pois parte do produto da PCR pode estar na sua
tampa, possibilitando o seu desperdcio;
misturar os reagentes da PCR em um nico tubo, aliquot-los em tubos
individuais e por ltimo adicionar o DNA individualmente em cada tubo;
e finalmente a escolha correta de controles negativos e positivos, que podem
auxiliar na deteco de contaminantes.
Kwok & Higuchi (1989)

91
microorganismos podem metabolizar o DNA por completo, se em grande quantidade
(Burger et al., 1999).

Figura 61: Esqueletos encontrados em uma vala e que foram utilizados na Herzegovina para a
identificao humana de indivduos mortos durante a 2 Guerra Mundial.

Regies especficas de amplificao so escolhidas de acordo com o objetivo da
anlise. Atualmente, as regies mais utilizadas so as STRs para a identificao humana.
Edwards et al (1991) relata que as melhores STRs empregadas na identificao humana
so aquelas com maior polimorfismo (maior nmero de alelos), menor tamanho (100 a
200 pares de bases), elevado ndice de discriminao e heterozigose e baixa frequncia
de mutaes. Esses dados so levantados por estudos populacionais de regies distintas,
que sero descritos posteriormente.
A PCR permite que mais de uma regio possa ser copiada simultaneamente se
adicionado mais de um iniciador sense e antissense em uma nica reao. A amplificao

92
simultnea de duas ou mais regies de DNA conhecida por PCR multiplex (Figura 62).
Para essa reao a temperatura de hibridizao dos iniciadores deve ser compatvel e a
complementaridade excessiva das regies deve ser criteriosamente analisada, para
prevenir a formao de dmeros de iniciadores que no hibridizao com o DNA
(EDWARDS & GBBS, 1994).

Figura 62: Kit Multiplex de duas empresas distintas comercialmente disponveis para a realizao de
PCR em uma nica reao.

H diversas vantagens da PCR multiplex para DNA forense: 1) diminui o tempo
de preparo e a quantidade de reagentes utilizados; 2) diversos loci podem ser
amplificados em uma nica reao, empregando-se pouca quantidade de DNA,

93
aumentando a chance de sua amplificao. Atualmente h diversos conjuntos multiplex
disponveis no comrcio, facilitando a padronizao e comparao dos resultados entre
os laboratrios forenses (LEVEDAKOU et al., 2002; WALLN et al., 2002; KRENKE et al,
2002; COLLNS et al, 2004) (Quadro 1).

Quadro 1 - Os loci mais utilizados no FB e NTERPOL distribudos segundo os kits
comerciais multiplex:
Fornecedor
Applied Biosystems
http://home.appliedbiosystems.com
Promega
http://www.promega.com
PRODUTO

AmpFLSTR Power-
Plex
Power-Plex
16
SGM Plus Profiler
Profiler
Plus
Cofiler
dentifier
D21S11 (1)(2) X X X X
FGA (1)(2) X X X X X
VWA (1)(2) X X X X X X
THO1 (1)(2) X X X X X X
D3S1358 (1)(2) X X X X X X
D8S1179 (1)(2) X X X X
D18S51 (1)(2) X X X X
D16S539 (2) X X X X X
TPOX (2) X X X X X
CSF1P0 (2) X X X X X
D13S317 (2) X X X X X
D7S820 (2) X X X X X X
D5S818 (2) X X X X X
D19S433 (3) X X
D2S1338 (3) X X
Penta D (3) X
Penta E (3) X
Amelogenina (1) X X X X X X X
(1) SSOL Conjunto Padro de Loci da NTERPOL, idntico Conjunto Padro Europeu - ESS, com uma exceo:
para o SSOL a amelogenina opcional
(2) Os 13 lcus do Sintema de ndice de Combinao de DNA - CODS do FB
(3) Lcus que fazem parte do grupo dos mais utilizados mundialmente segundo a NTERPOL
Fonte: http://www.interpol.int/public/Forensic/DNA/loci.asp. Acesso em: 22 Maio 2006.

94
Outra tcnica que deve ser comentada seria a utilizao da PCR em tempo real,
que, no momento, est sendo aproveitada em cincia forense para determinar a
quantidade de DNA humano vivel para a amplificao. A PCR em tempo real amplia
regies especficas de DNA. Diferencia-se da PCR tradicional, pois possui sondas
marcadas com fluorforos proporcionando deteco em tempo real dos fragmentos
amplificados, sendo simultaneamente quantificados (Figura 63). Dessa maneira, no h
necessidade da utilizao de gis e anlise por Southern Blot como nas outras tcnicas
quantitativas descritas anteriormente (ANDREASON, 2003).
Entretanto, para a realizao da PCR em tempo real necessrio equipamento
especfico e sondas adequadas. O DNA humano pode ser especificamente quantificado
para posterior anlise do perfil gentico pelas STRs, assim como verificar a presena ou
no de inibidores da enzima polimerase (APPLED BOSYSTEMS, 2006).

Figura 63: Esquema representativo da PCR em tempo real, na qual sondas com fluorescncias
so utilizadas para a amplificao de uma regio especfica de DNA. Aps a hibridizao da sonda com a
molcula de DNA, a enzima taq polimerase atua amplificando a regio alvo, liberando um fluorforo que
ser analisado em tempo real pelo equipamento termociclador, sendo conectado a um computador que
atravs de programas especficos realiza a interpretao dos dados.

-------------FIM DO MDULO III-------------

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96
MDULO IV

Estudo da metodologia aplicada identificao humana (cont.)

Eletroforese e deteco dos fragmentos de DNA

Os fragmentos de DNA amplificados por PCR so identificados aps a
eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da coloraco com prata, ou pela deteco
de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no PCR so marcados com
fluorocromos, possibilitando a anlise por sequenciador automtico (Gill, 1992; Sullivan et
al, 1992; Frgeau e Fourney, 1993).
A eletroforese uma metodologia amplamente empregada para a separao,
isolamento, anlise e manipulao dos cidos nuclicos. Os cidos nuclicos possuem
uma carga geral total negativa, devido aos seus grupamentos fosfato do arcabouo,
consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, eles
migraro em direo ao nodo em um campo eltrico (Aaji e Borst, 1972; Southern,
1979). Em condies apropriadas de tampo, voltagem e miliamperagem, os fragmentos
pequenos migraro mais facilmente do que os maiores (Figura 64 e 65).

97

Figura 64: Fragmentos de DNA carregados negativamente migram ao plo positivo mediante a
presena de um campo eltrico especfico.

98

Figura 65: Esquema da corrida de eletroforese com visualizao dos fragmentos de DNA e das
partculas de gel e dos poros, seguida de imagem dos fragmentos de DNA corados com brometo de etdeo
exposto a luz ultravioleta.

A variao do tipo e concentrao do gel propicia diferentes caractersticas de
separao, permitindo distintas resolues e anlises. Em caracterizao de vnculo
gentico utiliza-se eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese capilar para a
anlise das imagens. Em incluso ou excluso de paternidade, compara-se os alelos
presentes no filho com o do suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatrio materno e
o outro paterno (Figura 66). O mesmo acontece em incluso de suspeitos de um crime, no
qual compara-se o DNA encontrado na vtima, como ocorre com marcas de mordida ou
presena de smen, ou na cena de um crime. Pode ocorrer uma mistura de amostras
biolgicas contendo DNA da vtima e do agressor. Dessa maneira, confronta-se o DNA da
vtima com o dos suspeitos e, sucessivamente, com o DNA das amostras presentes na
cena do crime (Figura 67). Tais anlises so realizadas em pelo menos 13 STRs distintos

99
(Jobim et al, 2006; Budowle & Moretti, 1999; NTERPOL, 2001; Secretaria Nacional de
Segurana Pblica - SENASP, 2006).

Figura 66: Esquema representativo da anlise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida
corado com prata contendo DNA de amostras biolgicas da me, do filho e do suposto pai, de um STR
amplificado pela PCR analisados juntamente com marcadores allicos.

Figura 67: Esquema representativo da anlise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida
corado com prata contendo DNA de amostras biolgicas da vtima, do material biolgico coletado de uma
marca de mordida, e de trs suspeitos distintos de um STR amplificado pela PCR, analisados juntamente
com marcadores allicos.

100
Diversos tipos de equipamentos podem ser utilizados para a sua realizao,
podendo ser horizontais e verticais, grande e pequenos, sendo sua indicao prpria para
cada tipo de procedimento que queira realizar. Generaliza-se da seguinte maneira:

- Cubas horizontais: gel de agarose
- Cubas verticais: gel de poliacrilamida

Gis de agarose e poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade de formas,
tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um nmero diferente de configuraes.
As escolhas desses parmetros dependem primeiramente no tamanho dos fragmentos a
ser separados. Gis de poliacrilamida so mais eficientes em separaes de pequenos
fragmentos de DNA (5-500pb), que o caso da anlise do DNA forense. O poder de
resoluo extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco
to pouco quanto 1pb (par de base) em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser
separados uns dos outros. Apesar de serem corridos rapidamente e acomodarem
comparativamente grandes quantidades de DNA, gis de poliacrilamida possuem a
desvantagem de serem mais difceis de preparar e manusear do que eletroforese capilar.
Gis de poliacrilamida so corridos em uma configurao vertical de uma corrente eltrica
constante (Sambrook et al, 2001).

Gel de Agarose

Gis de agarose possuem menor poder de resoluo do que gis de
poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separao. DNAs de 50pb at alguns
megabases em extenso podem ser separados em gis de agarose de diferentes
concentraes e configuraes. Pequenos fragmentos de DNA (50-20000pb) so
melhores resolvidos em gis de agarose corridos em conformao horizontal em um
campo eltrico de fora e direo constantes. Os fragmentos de DNA so comparados
com marcadores de tamanho ou ladders ou padres (Figura 68) (Sambrook, 2001).

101

Figura 68: Diferentes marcadores de tamanho molecular ou Ladders utilizados em eletroforese
em gel de agarose ou at mesmo de poliacrilamida.

No entanto, atualmente, os gis de agarose s so utilizados em DNA forense
para a checagem do produto amplificado antes da sua eletroforese por capilar (Figura 69).

102

Figura 69: Gel de agarose a 2% corado por Brometo de Etdeo, fotografado durante exposio
luz ultravioleta, contendo um marcador de 100 pares de bases (primeira coluna: cada banda equivale ao
peso molecular de 100 em 100 pares de bases). Os produtos de PCR de aproximadamente 220 pares de
bases so visualizados em todas as outras colunas. Na quarta coluna, verifica-se que no existe banda,
caracterizado pela no-amplificao do controle negativo da PCR (que no possui DNA).

De forma generalizada, cubas horizontais so utilizadas em gel de agarose e as
verticais em gel de poliacrilamida. Sistemas para eletroforese em gel horizontal (Figura
70) consistem de uma caixa que dividida em dois compartimentos e contm uma
plataforma no meio, que servir de suporte para o gel, que ficar totalmente submergido
em tampo. Os eletrodos presentes em cada compartimento fornecero os campos
eltricos. A corrente resultante atravessar o gel e o tampo que circunda o gel. Com
isso, a espessura do gel e a quantidade de tampo a ser colocada dever ser controlada
para a obteno de resultados reprodutveis. O resfriamento promovido pelo tampo
que circunda o gel, que fica recirculando para prevenir o desenvolvimento de gradiente de
pH e tambm mantm a temperatura controlada e uniforme (Sambrook et al, 2001).

103

Figura 70: Cubas de eletroforese horizontal de diferentes tamanhos.

Para cada sistema de cubas e plataformas h diferentes tipos de pentes para a
formao de poos no gel de agarose com capacidade volumtrica diferenciada para a
deposio das amostras. De acordo com a quantidade de agarose colocada na
plataforma, altera-se a sua altura, possibilitando uma maior capacidade de volume do
poo (tabela 6).

104
Tabela 6: Capacidade de amostragem para Cuba Horizon 58 relativa espessura do gel
(Biometra. nstruction Manual - Horizon 58 Horizontal Gel Electrophoresis)

Os cuidados para o preparo do gel de agarose esto dispostos a seguir:
Protocolo de preparo do gel de agarose em cuba Horizon 58 (Biometra.
nstruction Manual - Horizon 58 Horizontal Gel Electrophoresis)

1) Montar as peas do equipamento de acordo com a figura abaixo:

Disposio dos componentes da cuba de eletroforese horizontal (Biometra. nstruction
Manual -Horizon 58 Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus)

105

2) Preparar o gel de agarose:

a) Escolha a porcentagem do gel de agarose, a quantidade de soluo que
colocar na plataforma (Tabela ABAXO);
b) O gel de agarose 1% equivale a 1g de agarose para cada 100mL. Calcular a
quantidade de agarose a ser pesada e volume total de tampo a ser utilizado.
Coloque a agarose e o tampo 1x ou 0,5x em um Erlenmeyer;
c) Pese o frasco contendo a soluo e anote o valor;
d) Dissolva a agarose em TBE por aquecimento em forno microondas ou banho
de gua quente, misturando ocasionalmente. Os cristais de agarose devem
estar totalmente dissolvidos;
e) Pesar o frasco novamente e acrescentar gua deionizada para compensar a
evaporao;
f) Pipetar ou verter a quantidade desejada de soluo na plataforma;
g) Assegure que agarose foi distribuda por toda superfcie e, se necessrio,
remova as bolhas;
h) Espere que a soluo esfrie at sua total solidificao.

3) Eletroforese do gel de agarose:

a) Adicione de 100 a 150 mL de tampo na cuba sobre o gel polimerizado;
b) Remova cuidadosamente o pente e o vedador;
c) Remova as bolhas que eventualmente estejam entre o tampo e o gel;
d) Pipete as amostras cuidadosamente na parede do casulo. As amostras devem
conter quantidade suficiente de glicerol ou sucrose para serem mais densos
que o tampo;
e) Feche a tampa da cuba de eletroforese;
f) Conecte a cuba em uma fonte para eletroforese;
g) Ligue a fonte e selecione a voltagem desejada. Pequenas bolhas formaro
perto dos eletrodos quando a cuba est corretamente conectada;
h) A voltagem e o tempo requeridos de acordo com o tampo utilizados esto
dispostos na tabela abaixo. A corrente e o tempo de eletroforese variam de
acordo com o volume de tampo, espessura do gel e voltagem aplicada. Para
voltagens acima de 175V ocorre suficiente aquecimento do gel levando a
desnaturar o gel de agarose. necessrio o resfriamento a 4C da unidade
durante a eletroforese. Gis contendo menos que 0,5 de agarose tambm
devem ser resfriados durante a eletroforese por serem muito fracos.

106

Tabela: Tempo de eletroforese para gis de agarose 1% a voltagem constante. As
mensuraes foram realizadas com gel submergido de 1 a 2 mm e com corrente
variando de 5 a 125mA. O tempo requerido para um tampo de corrida migrar 6,5cm
da origem. Para o gel de 1%, o tampo utilizado pelo fabricante migra
concomitantemente com fragmentos de DNA de aproximadamente 200bp em TBE 1X
e 400bp em TAE 1X.

4) Ps-eletroforese:

a) Aps desconectar os cabos da fonte de eletroforese, desconecte os cabos da
cuba, aba a tampa e retire a plataforma contendo gel do tampo;
b) Remova o gel com cuidado para a colorao;
c) Remova o tampo da cuba e descarte-o apropriadamente, no reutilizando.
Enxgue com gua destilada;
d) Remova qualquer tipo de resduo de agarose das peas utilizadas e enxgue
com gua destilada.

5) Colorao do gel de agarose: brometo de tdeo (Vide a seguir).

Voltagem (V) Tampo (1x) Tempo de eletroforese (a)
25 TBE 5h
TAE 5h
50 TBE 2,25h
TAE 2,25h
75 TBE 1,5h
TAE 1,4h
100 TBE 1h
TAE 56min
125 TBE 45min
TAE 42min
150 TBE 36min
TAE 34min
175 TBE 29min
TAE 27min
200 TBE 24min
TAE 22min

107
cidos nuclicos submetidos eletroforese atravs de gis de agarose podem ser
visualizados por colorao e com luz UV a 300nm. Dois mtodos so utilizados para essa
finalidade: a colorao por brometo de etdio e por SYBR gold:
O brometo de etdio preparado como uma soluo estoque de 10mg/ml em H
2
O e
estocado temperatura ambiente em frascos mbar ou enrolados em papel alumnio. O
corante geralmente incorporado ao gel de agarose e tampes eletroforticos em
concentraes de 0,5g/ml. A vantagem de se acrescentar o brometo de etdio na
preparao do gel que pode-se examinar os fragmentos de DNA durante a corrida ou ao
final dela. A desvantagem a reduo da mobilidade eletrofortica em ~15%, alm da
maior contaminao do equipamento pelo brometo. Quando efetua-se a corrida na
ausncia do corante, DNAs com formas de plats finos so conseguidos (Sharp et al.
1973; Sambrook et al, 2001).
O brometo de etdio (Figura 71) contm grupos planares tricclicos que intercalam
entre as bases do DNA, com pequena ou nenhuma preferncia sequencial. Em solues
saturadas de alta fora inica, aproximadamente uma molcula de etdio intercala a cada
2.5pb (Waring 1965). Aps insero na hlice, o corante fica perpendicular ao eixo
helicoidal e faz ligaes de Van der Waals com as bases acima e abaixo (Figura 72)
(Lepecq, 1966). A UV absorvida pelo DNA em 254nm e transmitida para o corante;
radiao a 302nm e 366nm absorvida pela prpria ligao ao corante. Em ambos os
casos, a energia retransmitida a 590nm. O brometo de etdio pode ser usado para
deteco de RNA e DNA, mas a afinidade maior para o DNA (Sambrook et al, 2001).

Figura 71: Estrutura molecular do brometo de etdeo com seu respectivo nmero de registro - RN.

108

Figura 72: Estrutura molecular do DNA aps intercalao do brometo de etdeo.

O brometo de etdeo um potente mutagnico, pode ser absorvido pela pele,
irritante para os olhos, boca e trato respiratrio superior. Deve ser estocado longe de
agentes oxidantes em um local resfriado, seco e em recipiente indestrutvel e fechado.
nmeras precaues para manuseio e descarte devem ser realizadas para reduzir a
contaminao tanto do pesquisador como ambiental:

109

Cuidados para a manipulao e descarte do Brometo de Etdeo

Equipamentos de Proteo Individual

Luvas: Utilizar luvas de nitrila para prevenir contaminao das mos. Luvas
descartveis (como 4, 6 ou 8 mil azul luvas de nitrila) usadas em operaes de
laboratrio suprem apenas uma barreira de contato e devem ser descartadas
imediatamente quando h suspeitas de contaminao. Luvas descartveis no podem
ser usadas para proteo de materiais qumicos perigosos sem utilizao de duas
luvas devido ao potencial de formar buracos mnimos. Luvas de ltex descartveis
so passveis de apresentar defeitos e buracos mnimos e no so recomendadas.

culos: Utilize culos de proteo aos qumicos com escudo lateral.

Trajes de laboratrio: Sempre use calas compridas, sapatos fechados e
aventais quando manusear materiais perigosos.

Procedimentos de Emergncia e Primeiros Socorros: Providencie ajuda de
primeiros socorros at que auxlio apropriado chegue ao local.

Ingesto: Se a pessoa estiver consciente, lave a boca com gua. No induza
vmito. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada at que auxlio mdico
chegue.

Inalao: Remova a vtima do local de exposio a um local arejado
imediatamente. Se a respirao cessar, tenha uma pessoa qualificada que possa
fazer respirao artificial. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada at que
auxlio mdico chegue.

Contato com a pele: Remova roupas contaminadas (incluindo os sapatos)
imediatamente. Lave o local afetado com sabo e detergente suave com grande
quantidade de gua at que nenhuma evidncia de qumico esteja presente (pelo
menos 10 a 20 minutos). Chame um mdico se voc notar irritao nos olhos ou no
trato respiratrio.

Contato com os olhos: Lave os olhos imediatamente com grande quantidade
de gua ocasionalmente levantando as plpebras inferiores e superiores at que no
haja evidncias de remanescentes qumicos (no mnimo 15 a 20 minutos). Remova
lentes de contato. Chame um mdico imediatamente. Se voc notar irritao de uma
exposio excessiva, v imediatamente avaliao de um oftalmologista.

110

Descontaminao de substncias txicas: brometo de etdio

A prtica de processos referentes biossegurana essencial para a
manuteno da sade das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos e
substncias txicas para o ser humano. No caso dos microorganismos fundamental
o uso de fluxos laminares ou outras tcnicas de conteno (como o do bico de
Bunsen) que impeam a sua disperso durante a manipulao. Outra prtica muito
importante que todos os materiais derivados de cultivos de microorganismos devem
ser submetidos esterilizao (por exemplo, autoclavagem) antes de serem
descartados. Por outro lado, tambm importante eliminar ou minimizar os riscos de
contaminao do ambiente, solues, bancadas, equipamentos, utenslios (pinas,
esptulas, etc.) ou vidrarias por substncias txicas para o organismo humano.

O processamento de substncias com alto potencial txico ou mutagnico,
como o Brometo de Etdio (EtBr), tem sido um dos grandes problemas da maioria dos
laboratrios. O Brometo de Etdio (EtBr) comumente utilizado nos laboratrios para
corar cidos nuclicos submetidos eletroforese em gel de agarose ou a gradiente de
Cloreto de csio. A ao do EtBr como corante se deve a sua capacidade de
intercalar entre as bases dos cidos nuclicos e fluorescer sob luz ultravioleta. Este
carter intercalante do EtBr tambm responsvel pelo seu alto potencial
mutagnico, pois pode gerar alteraes na estrutura do DNA as quais podero ser
permutadas durante o processo de duplicao. Dessa forma, a leitura errada das
sequncias de bases do DNA pode resultar em mutao.

111

Tratamento de solues concentradas de EtBr (at 10mg/ml)

Existem vrias tcnicas para o tratamento de descontaminao do EtBr. A mais
simples e fcil de ser aplicada na rotina baseada no tratamento de solues de EtBr
com Permanganato de Potssio em condies de acidez. Durante esse tratamento
haver oxidao do EtBr pelo Permanganato resultando na formao de um
precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta mistura neutralizada com NaOH e
descartada (Sambrook et al., 1989). O protocolo, como descrito em Sambrook et al.
(1989) o seguinte: adicionar, se necessrio, gua na soluo concentrada at diluir
a concentrao de EtBr para 0,5mg/ml.
Em seguida adicionar KMnO
4
0,5M equivalente a 1 volume da soluo que ser
descontaminada. Misturar cuidadosamente e, em seguida, adicionar 1 volume de HCl
2,5M. Misturar com ateno e deixar descansando por vrias horas temperatura
ambiente. Para finalizar, neutralizar essa mistura adicionando 1 volume de NaOH
2,5N. Novamente misturar e a soluo poder ser descartada na pia sob gua
corrente.
Este mtodo de descontaminao de solues concentradas de EtBr (10mg/ml)
capaz de reduzir a atividade mutagnica em at 3.000 vezes como foi descrito por
Quillardet & Hofnung (1988).
Obs.: No caso da gua utilizada no descoramento de gis, onde existe uma
baixa concentrao de EtBr, utilizar Hipoclorito de sdio (gua sanitria comercial) na
proporo de 1:2, antes de descartar na pia. Os resduos slidos (gis e papis) so
secos temperatura ambiente e posteriormente incinerados em forno de alta
temperatura.

Referncias Bibliogrficas:
QULLARDET, P.; HOFNUNG, M. Ethidium bromide and safety readers
suggest alternative solutions. Letter to editors. Trends in Genetics, Amsterdam, v.4,
p.89, 1988.
SAMBROOK, J.; FRTSCH, E.F.; MANATS, T. Molecular Cloning: a
laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989. 3v.

112
Atualmente, existem outros tipos de alternativas que esto sendo incorporadas ao
mercado, como o SYBR gold, que o nome comercial para um corante ultrassensvel
com alta afinidade pelo DNA e uma grande ligao fluorescente com o cido nuclico.
Esta ligao fluorescente >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o
Brometo de Etdio (figura 73). Assim, <20pg de DNA de dupla hlice pode ser detectada
no gel de agarose e a colorao de gis de poliacrilamida com este corante pode captar
100pg de DNA de fita nica ou 300pg de RNA. SYBR gold apresenta mximo de
excitao em 495nm e possui um pico secundrio em 300nm. A emisso fluorescente
ocorre em 537nm (Tuma et al, 1999).
Gis corados com SYBR gold no deixam background na hora da revelao e
podem ser fotografados diretamente sem descolorao prvia. O SYBR gold no pode ser
acrescido ao gel antes da eletroforese, pois sua presena no gel endurecido pode causar
distoro das bandas de DNA e RNA (Sambrook et al, 2001).

Figura 73: A sensibilidade do SYBR Gold maior do que a do brometo de etdeo, sendo que a
ligao fluorescente >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etdio.

113
Gel de Poliacrilamida

Os gis de poliacrilamida foram muito utilizados para a anlise de regies
polimrficas do DNA para o exame do perfil gentico em identificao humana. No
entanto, atualmente os laboratrios utilizam a eletroforese capilar, como ser depois
apresentado e estudado. Mas para que haja melhor compreenso da eletroforese capilar
existe a necessidade de estudarmos a eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi
primordial para a sua realizao em equipamentos contendo capilares.
Gis de poliacrilamida so mais eficientes em separaes de pequenos
fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resoluo extremamente alto e fragmentos
de DNA que diferem em tamanho por to pouco quanto 1pb em comprimento ou 0,1% de
sua massa podem ser separados uns dos outros (por exemplo, 1pb em 1000pb).
Comparado com o gel de agarose (Figura 68), a separao dos fragmentos menores,
como de 100 em 100 pares de bases, maior (Figura 74), melhorando a anlise do
fragmento, principalmente se possuem variao de poucas bases. Outras vantagens em
relao aos gis de agarose que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem
que haja perda na resoluo e o DNA recuperado dos gis de poliacrilamida so
extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Gis de
poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difceis de preparar e manusear
do que gis de agarose (Sambrook et al, 2001).

114

Figura 74: Gel de poliacrilamida a 8% corado com prata contendo produto de PCR, cujo tamanho
varia de 270 a 280 pares de bases.

Monmeros de acrilamida so polimerizados em longas cadeias de uma reao
iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presena de N-N-
metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligaes cruzadas (figura 75). A porosidade
do gel resultante determinado pelo tamanho das cadeias e graus de ligaes cruzadas
que ocorrem durante a reao de polimerizao. A porcentagem de monmeros de
acrilamida utilizados na preparao do gel so determinadas pelo tamanho dos
fragmentos de DNA a serem analisados (Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971;
Holmes et al, 1991; Sambrook et al, 2001).

Este material de

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115
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116
Tabela 7: Utilizao do gel de poliacrilamida de acordo com a sua porcentagem de
monmeros de acrilamida e da razo acrilamida e bis-acrilamida (modificado de
http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/6).

H diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas indicaes. Gis
de poliacrilamida desnaturantes so utilizados para separao e purificao de
fragmentos de DNA de fita nica. So polimerizados na presena de um agente
(formamida ou uria) que suprime o pareamento de bases em cidos nuclicos, saturando
as pontes de hidrognio. DNAs desnaturados migram atravs desses gis em uma razo
que praticamente independente da composio de bases e sequncia. Entre os usos da
poliacrilamida desnaturante esto o isolamento e anlise de cada fita de DNA, anlise de
produtos de digesto por nuclease S1 e anlise de produtos de reaes de
sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001).
Gis de poliacrilamida no desnaturantes so utilizados na separao e
purificao de fragmentos de DNA de dupla-fita, no sendo utilizados, atualmente, para a
anlise do perfil gentico. Entretanto, a mobilidade eletrofortica tambm afetada pela
composio de bases e sequncia, de modo que os dplices de DNA de mesmo tamanho
podem diferir na mobilidade em mais do que 10%. Os gis de poliacrilamida no
desnaturantes so usados frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente
purificados e para deteco de complexos de protena-DNA (Sambrook et al, 2001).
Razo Acrilamida: Bis Gel % DNA / RNA
nativo (bp)
DNA / RNA
desnaturado
(bp)
Protena (kd)
19: 1 4 100-1500 70-500 100-200
6 60-600 40-400 40-150
8 40-500 20-200 20-100
10 30-300 15-150 15-70
12 20-150 10-100 8-60
20:1 5 200-2000 70-800 >150
6 80-800 50-500 50-200
8 60-400 30-300 30-125
10 50-300 20-200 20-100
12 40-200 15-125 10-70
20 < 40 < 40 <30

117
So utilizados os mesmos tampes descritos para o gel de agarose. A
porcentagem de monmero de acrilamida a ser escolhida para utilizao estar
relacionada com a faixa de separao dos cidos nuclicos a serem analisados. (Tabela
8).

Tabela 8: Faixa efetiva de separao da eletroforese em gel de poliacrilamida e o valor
em bp correspondente migrao da colorao xileno cianol e azul de bromofenol
(Sambrook et al, 2001).

O equipamento utilizado para a eletroforese em gel de poliacrilamida composto
por duas placas de vidro separadas por espaadores de at 2 mm, devidamente
montadas em um sistema composto de uma caixa para tampo que entrar em contato
com a parte inferior, e outra parte com a superior. A nica conexo entre o tampo da
caixa superior e inferior o gel (Figura 76 e 77). Quanto mais alta a voltagem para a
eletroforese, a menor espessura do gel e/ou maior porcentagem de poliacrilamida, h um
aumento da resistncia do gel, aumento demasiadamente a temperatura. Com isso,
recomenda-se a utilizao de placas com sistema de resfriamento ou aquecimento em
eletroforese desnaturante em poliacrilamida, contendo uma placa de metal para dissipar o
calor ou para seu aquecimento (Wartell et al, 1990; Sambrook et al, 2001).
Concentrao de
monmero de
acrilamida (%)
Faixa efetiva de
separao (bp)
Xyleno cianol FF Azul de Bromofenol
3.5 1000-2000 460 100
5.0 80-500 260 65
8.0 60-400 160 45
12.0 40-200 70 20
15.0 25-150 60 15
20.0 6-100 45 12

118

Figura 76: Equipamento para eletroforese em gel vertical. Permite voltagens acima de 1500V.
Fonte: http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/13

119

Figura 77: Equipamento para eletroforese em gel vertical para voltagens at 250V e 50mA.
(Biometra. nstruction Manual - Model V-16 and V-16-2 Vertical Gel Electrophoresis Apparatus). Fonte:
http://www.biometra.de/electrophoresis-native.0.html

Existem diferentes tipos de tampes de corrida, como aqueles que contm Tris-
acetato e EDTA (pH8,0; TAE), Tris-borato (TBE) ou Tris-fosfato (TPE) em concentraes
de ~50mM (pH7.5-7.8). Segundo Sambrook et al (2001), TAE possui a menor capacidade
tamponante e TBE e TPE so mais caros do que o TAE, mas possuem maior capacidade
tamponante. Para fragmentos de baixo peso molecular, entretanto, a resoluo melhor
nos tampes TBE ou TPE (tabela 9).

Tabela 9: Tampes para eletroforese (Sambrook et al, 2001)

Tampo Soluo de trabalho Soluo estoque/litro
1X 50X
40mM Tris-acetato 242gTris-base
1mM EDTA 57,1ml cido actico glacial
100ml EDTA 0,5M (pH8.0)
1X 10X
90mM Tris-fosfato 108g Tris-base
2mM EDTA 15,5ml cido fosfrico (85%, 1,679g/ml)
40ml de EDTA 0,5M (pH8.0)
0,5X 5X
45mM Tris-borato 54g Tris-base
1mM EDTA 27,5g cido-brico
20ml de EDTA 0,5M (pH8.0)
TAE
TPE
TBE

120

Os tampes de corrida ou loading buffers (Tabela 10) possuem 3 finalidades:
aumentar a densidade das amostras, assegurando que ela afunde no
pocinho;
colorir as amostras, facilitando sua visualizao;
contm corantes que movem para o nodo em um campo eltrico em taxas
previsveis.
Azul de Bromofenol migra atravs do gel de agarose ~2.2 vezes mais rpido do
que o Xileno Cianol e, corridos em tampo TBE 0,5X, cruza aproximadamente na mesma
velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em comprimento, enquanto o xileno cianol
percorre aproximadamente na mesma velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em
extenso. Esta relao no muda muito para gis de agarose de porcentagem entre 0.5%
a 1.4% (Sambrook et al, 2001).

Tabela 10: Tipos de tampo de corrida para eletroforese (Sambrook et al, 2001)

A eletroforese capilar amplamente utilizada em anlise de DNA forense, por
permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas de maneira
automatizada, alm de necessitar de poucas quantidades de amostra para o processo de
injeo e podem ser facilmente reinjetadas, se necessrio. Separao eletrofortica em
capilar realizada em menos de 1 hora, se comparado com as muitas horas necessrias
para quela realizada em gis de poliacrilamida para identificao humana. Alm do
Tipo do Tampo Tampo 6X Temperatura de Estocagem
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
40%(p/v) sucrose em gua
15% Ficoll (tipo 400; Pharmacia) em gua
30% glicerol em gua
40%(p/v) sucrose em gua
V
4 C
temperatura ambiente
4C
4 C

121
tempo, a quantidade de passos para a elaborao do gel de acrilamida fazem com que
possa haver uma chance maior de erro durante a manipulao. A desvantagem o custo
inicial para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles
empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a eletroforese capilar
a mais empregada nos laboratrios de DNA forense (Butler, 2005) (Figura 78 e 79).

Figura 78: Esquema representativo de eletroforese capilar: o capilar um tubo de fibra de vidro
com aproximadamente 50 m em dimetro e completado com uma soluo de polmero viscoso
especfico para tal finalidade, que funciona como o gel das eletroforeses descritas anteriormente. As
amostras so colocadas em uma bandeja e injetadas para o capilar aplicando-se uma voltagem de cerca de
15000 volts, que separar o DNA em poucos minutos. Os fragmentos de PCR com fluorforos so
analisados assim que passam pela janela de deteco e so excitados por um laser especfico. Os dados
so automaticamente computadorizados e permitem um armazenamento e rpida anlise.

122

Figura 79: Manipulao do sequenciador automtico, que possui o sistema de eletroforese capilar.

-----------FIM DO MDULO IV-----------

Curso de
DNA Forense

MDULO V

Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos na Referncia Consultada.

MDULO V

Interpretao dos Resultados

Aps a visualizao, d-se a anlise dos resultados comparando os fragmentos
de DNA amplificados das amostras do pai, me e filho em caso de paternidade; ou das
amostras encontradas na cena do crime, em corpos ou vtimas com as de suspeitos
(NTERPOL, 2001; BUTLER, 2005). No entanto, durante a PCR, um grande nmero de
artefatos pode ocorrer e interferir na interpretao e genotipagem dos alelos presentes na
amostra de DNA, sendo visualizadas somente aps a eletroforese.
Entre esses artefatos (Figura 80) incluem:

os produtos stutters (WALSH et al, 1996)
adio de nucleotdeos no pertencentes ao DNA alvo, denominados picos "N
N peaks ou adenilao (CLARCK, 1988; Clayton et al, 1998).

Figura 80: Artefatos de tcnica que podem prejudicar a anlise dos alelos aps a eletroforese:
stutters e picos N.

124

Produtos de stutters (Figura 81):
Definio: Picos que se caracterizam pela perda de uma repetio
consecutiva em relao ao alelo verdadeiro, resultante de um
"deslizamento da sequncia durante a sntese de DNA, isto , durante
a amplificao. A enzima polimerase no amplifica uma sequncia,
aparentando um deslizamento.
Os picos de stutters dificultam a anlise de misturas de DNA.

Adio de nucleotdeos que no fazem parte da sequncia de DNA - Picos N
ou adenilao (Figura 82):
Definio: A enzima Taq polimerase frequentemente adiciona um
nucleotdeo extra no final do produto de PCR, sendo o mais frequente a
Adenina (A), denominando-se ADENLAO.
Excesso de amostra de DNA na PCR pode resultar em uma incompleta
adenilao.

Figura 81: Definio de stutter e seus dois tipos. Verifique o "deslizamento de uma sequncia repetitiva.
125

Figura 82: Adio de nucleotdeos que no fazem parte da sequncia de DNA: durante uma
PCR, a enzima taq polimerase pode acrescentar uma adenina (A) na poro 5 da dupla fita de DNA que
est em excesso na reao. Esse artefato resulta na adenilao, que aparece no eletroferograma como dois
picos bem prximos um do outro sendo um A- e outro A+, que correspondem s fitas da sequncia de DNA.
O eletroferograma em azul mostra a diferena no resultado quando se utiliza uma grande quantidade de
DNA para a sua amplificao, resultando aps a eletroforese em adenilao (para os STRs DES1358 e
VWA) e picos fora da escala - off-scale (para o STR FGA).

Outros fatores podem estar presentes na anlise da STR e devem ser
criteriosamente analisados, para serem diferenciados de artefatos. Segundo Butler
(2005), so eles:

microvariaes allicas (Figura 83 e 84)
126

Figura 83: Microvariao allica: variaes da sequncia repetitiva que no fazem parte dos
alelos incorporados no marcador allico (allelic ladder), sendo que eles podem ou no estar descritos na
literatura. A eletroforese do fragmento correspondente a um STR denominado DYS635, comparado pelo
programa automaticamente com o marcador ou padro allico acima, que possui diversos alelos para o
mesmo STR. Verifique que o alelo da amostra 1 no est exatamente abaixo do alelo 22, que corresponde
a 258 pares de bases e sim a 257, que significa que existe uma base a menos na sequncia, que poder
ser analisada no encadeamento. Aps o sequenciamento do DNA (caixa amarela), observa-se a falta de
uma timina (T) na sequncia total (vide abaixo da figura a sequncia completa, sendo que [TCTA]
4
igual a
TCTA TCTA TCTA TCTA; e assim por diante).

127

Figura 84: Quantidade de microvariaes allicas descritas para cada STR, sendo que existem,
no total, 476 variantes descritas em todos os STRs dispostos no quadro. Entre parnteses encontra-se a
quantidade de microvariaes allicas de cada STR. Exemplo: CSF1PO(19) para o STR denominado
CSF1PO tem-se 19 microvariaes allicas descritas mundialmente. Dados atualizados pelo site at 06 de
outubro de 2008.

padro tri-allico (Figura 85 e 86)

Figura 85: Caracterstica do trialelo das STRs D18S51 (alelos 14, 15 e 22), TPOX (alelos 8, 10
e 11) e D21S11(alelos 29, 30 e 31).

128

Figura 86: Quantidade de TRALELOS descritos para cada STR, sendo que existem, no total,
177 padres triallicos diferentes descritos em todos os STRs dispostos no quadro. Entre parnteses
encontra-se a quantidade de trialelos de cada STR. Exemplo: CSF1PO(7) para o STR denominado
CSF1PO tem-se 7 trialelos diferentes descritos mundialmente. Dados atualizados pelo site at 23 de
outubro de 2008 pelo site STRBase.
129

perda de um alelo (Figura 87 e 88):

Figura 87: Perda de alelo caracterizado pela pouca quantidade de amostra de DNA na reao de PCR.

130

Figura 88: Perda do alelo decorrente da presena de mutao na sequncia do DNA, que esto
localizadas em regies que hibridizam com os primers durante a PCR.

131

mutaes (Figura 89):
Ocorre aproximadamente 1 em 1000 meioses;
ncide mais frequentemente com o alelo paterno do que materno;
VWA, FGA eD18S51 possuem altas taxas;
TH01, TPOX e D16S539 possuem menores taxas.

Figura 89: Mutao observada em um trio (me, pai e filho): observe a ausncia do alelo paterno
obrigatrio do caso direita, na qual no h o alelo 14 ou 18 e sim um alelo diferente 13.

132

Figura 89: Lista de STRs e taxa de mutao. A mutao dos STRs utilizados em identificao
humana baixa. No entanto, dever ser analisada, principalmente se ocorrer em testes de paternidade,
devendo ser incorporada ao laudo pericial a taxa de mutao.
133

Havendo uma correlao entre as amostras, verifica-se a significncia do
resultado. A importncia da evidncia de DNA dada por meio da probabilidade de que a
casualidade tenha ocorrido. Para isso, tem-se antecipadamente a frequncia dos perfis
genticos de uma populao (Figura 90). Caso o perfil gentico seja extremamente raro
em uma dada populao, pode-se dizer que a evidncia extremamente forte, caso
contrrio, pode consistir em uma mera casualidade. A constncia de um perfil gentico
em uma determinada populao calculada com base na multiplicao das frequncias
do gentipo de cada locus (EVETT & WER, 1998).

134

Figura 90: Quadrado de Punnett mostrando a frequencia de dois alelos "A e "a, para "p
frequncia do alelo "A e q, de "a. Lembrando que a soma de p e q deve ser sempre 1. A frequncia de
cada combinao allica ser calculada pela frmula 2pq para heterozigotos e p
2,
para homozigotos.

A constncia do perfil gentico de cada indivduo foi calculada com base na razo
de verossimilhana ou Likelihood Ratio (LR) (Evett & Weir 1998) (Figura 91). A seguir
foram colocados exemplos de clculos de perfil gentico para treino e fixao.
conveniente lembrar que no exemplo inserimos somente 3 loci e no os 13 recomendados
pelo FB; somente para servir de exemplo, facilitar o entendimento e compreenso acerca
da importncia de se estabelecer a frequncia allica populacional.

135

136

LR = 1/P

P frequncia do perfil gentico de um indivduo, calculada a partir da multiplicao
das constncias allicas de N locus:
P= P
1
.P
2
.P
3
.P
N
,

A frequncia para cada locus P
N
, sendo "i e "j alelos de um gentipo cujas
constncias allicas "q que so determinadas previamente, calculada:
P
N
= q
i
2
, para i=j
P
N
= 2q
i
q
j
, para ij

Figura 91: Demonstrao do clculo da frequncia do perfil gentico

EXEMPLOS DE CLCULOS DE PERFIL DE DNA UTILIZANDO-SE COMO
EXEMPLO DUAS POPULAES DISTINTAS

BASEADO NA FREQUENCA ALLCA DE CAUCASANOS AMERCANOS
Perfil de DNA Frequncia allica do
banco de dados
Frmula Frequncia
Locus Alelos Vezes que o
alelo foi
observado
Tamanho
do banco
de dados
Frequncia
D13S317 11
14
205
29
604 p = 0,34
q = 0,05
2pq 0,03
TH01 6
6
140 604 p = 0,23

p
2
0,05
D18S51 14
16
83
84
604 p = 0,14
q = 0,14
2pq 0,04

Frequncia do perfil para a populao caucasiana = razo de verossimilhana (LR) = 1/P
P a multiplicao de todas as frequncias allicas = 0,03 x 0,05 x 0,04 = 0,00006
OU
LR = 1/0,00006 = 1 em 16666
Pode-se dizer que o perfil gentico em questo pode ser encontrado em 1 em 16666
pessoas dentro da populao de caucasianos americanos

BASEADO NA FREQUENCA ALLCA DE HSPNCOS AMERCANOS
Perfil de DNA Frequncia allica do
banco de dados
Frmula Frequncia
Locus Alelos Vezes que o
alelo foi
observado
Tamanho
do banco
de dados
Frequncia
D13S317 11
14
66
13
280 p = 0,24
q = 0,05
2pq 0,02
TH01 6
6
60 280 p = 0,21

p
2
0,04
D18S51 14
16
39
38
280 p = 0,14
q = 0,14
2pq 0,04

Frequncia do perfil para a populao caucasiana = razo de verossimilhana (LR) = 1/P
P a multiplicao de todas as frequncias allicas = 0,02 x 0,04 x 0,04 = 0,000032
OU
LR = 1/0,000032= 1 em 31250
Pode-se dizer que o perfil gentico em questo pode ser encontrado em 1 em 31250
pessoas dentro da populao de hispnicos americanos

137

138
Variaes nos alelos dos loci mais utilizados na identificao humana j foram
descritas nas diversas populaes (RUTBERG et al, 2001; BUTLER, 2005). Entretanto, a
determinao da frequncia gentica em um grupo tnico pode estar sujeita a
divergncias, principalmente na populao brasileira, que fruto de uma grande
miscigenao (MOURA-NETO & BUDOWLE et al, 1997; SOARES-VERA et al.
2000,2001 ).
Whittle et al (2004) analisou a frequncia allica de 19 STRs distintas utilizando o
perfil gentico de 13.000 indivduos brasileiros. Constatou que a frequncia da presena
de perda de alelos e da taxa de mutao observada podem contribuir significativamente
para a discriminao gentica dessa populao.
Pimenta et al (2006) avaliaram 12 STRs de 752 indivduos de So Paulo que
foram divididos em categorias de cor de pele e analisando os dados no houve
diferenciao gentica significativa entre os trs grupos. Esse resultado alerta o perigo em
classificar a populao brasileira pela cor de pele com seu ancestral geogrfico (PENA,
2005).

Anlise de Outros Perfis Genticos

Dependendo do tipo e finalidade de anlise do perfil gentico de um indivduo,
alm dos STRs descritos anteriormente, alguns outros marcadores so utilizados para a
investigao do DNA forense (Figura 92):
DNA do cromossomo Y: linhagem paterna
DNA mitocondrial: linhagem materna
SNPs (Polimorfismos de base nica): so necessrios pelo menos 50
SNPs diferentes para a anlise do perfil gentico de uma pessoa.

Figura 92: Diferena entre os STRs (por exemplo, aqueles recomendados pelo CODS-FB), que
so autossmicos; os STRs do cromossomo Y, que so herdados somente para os filhos do sexo
masculino; e do DNA mitocondrial, que so herdados pela me e repassados aos filhos, sendo idnticos
entre parentes da linhagem materna.

Cromossomo Y

Segundo Butler (2005), os STRs do cromossomo Y so utilizados:
Verificao da linhagem paterna, para analisar migraes populacionais,
pois so transmitidos de pai para filho sem alterao, a no ser em casos especficos de
mutao;
Pesquisa histrica e genealgica da linhagem paterna;
Anlise do perfil gentico em testes de paternidade, aumentando o poder de
discriminao, principalmente quando o DNA do pai biolgico no obtido;
Em casos de estupro, no qual existe vestgio biolgico masculino para a
anlise de DNA em um corpo do sexo feminino;
139

Verificao de contaminao da amostra biolgica por DNA do sexo
masculino.

No entanto, existem algumas consideraes na sua utilizao:
Uma combinao entre o perfil gentico da evidncia e do suspeito
significar que qualquer parente do sexo masculino da linhagem paterna, como tios,
primos, avs, irmos, etc possam ter contribudo com a amostra biolgica;
A presena de parentes do sexo masculino em acidentes em massa pode
ser facilmente analisada pelo cromossomo Y (Figura 93).

Figura 93: O DNA do cromossomo Y poder auxiliar na identificao de pessoas desaparecidas
que possuem parentesco de linhagem paterna.
140

Diversos STRs do cromossomo Y j foram estudados, conforme demonstra a
figura 94 e tabela 11. Tais STRs do Y j foram incorporados em dois kits comerciais:
PowerPlex Y (Figura 95) e Y-filer (Figura 96).

Figura 94: Diversos STRs, segundo sua localizao no cromossomo Y.
141

142

Tabela 11: STRs do cromossomo Y, segundo seu acesso no GenBank , a sequncia de
repetio, seus alelos e o tamanho do fragmento de PCR. Fonte: Butler (2005).

Nome do
marcador
Acesso ao
GenBank
Repetio Alelos Tamanho do
produto de PCR
DYS19 X77751 TAGA 8-16 178-210 bp
DYS385 93950 GAAA 10-22 252-300 bp
DYS388 G09695 ATT 12-17 128-143 bp
DYS389
DYS389
G09600
G09600
(TCTG) (TCTA)
(TCTG) (TCTA)
: 7-13
:23-31
239-263 bp
353-385 bp
DYS390 G09611 (TCTA) (TCTG) 18-27 191-227 bp
DYS391 G09613 TCTA 8-13 275-295 bp
DYS392 G09867 TAT 7-16 236-263 bp
DYS393 G09601 AGAT 9-15 108-132 bp
YCA AC006370 CA 19-25 192-204 bp
DYS434 AC002992 ATCT 8-11 110-122 bp
DYS435 AC002992 TGGA 9-13 210-228 bp
DYS436 AC005820 GTT 10-15 128-143 bp
DYS437 AC002992 TCTA 8-11 186-202 bp
DYS438 AC002531 TTTTC 6-12 203-233 bp
DYS439 AC002992 AGAT 9-14 238-258 bp
Y-GATA-A4 G42670 AGAT 11-14 242-254 bp
Y-GATA-A7.1 G42675 ATAG 7-12 161-181 bp
Y-GATA-A7.2 G42671 TAGA 8-12 174-190 bp
Y-GATA-A8 G42672 TCTA 8-14 219-244 bp
Y-GATA-A10 G42674 TATC 11-14 160-172 bp
Y-GATA-C4 G42673 TATC 11-16 251-271 bp
Y-GATA-H4 G42676 TAGA 10-13 362-370 bp

Figura 95: STRs do cromossomo Y contidos no kit multiplex PowerPlex Y, da Promega
Corporation, segundo sua regio de amplificao e cor de fluorescncia.

143

Figura 96: STRs do cromossomo Y contidos no kit multiplex AmpFlSTR Y-Filer da Applied
Biosystems, segundo sua regio de amplificao e cor de fluorescncia.

No Brasil, frequncias allicas dos STRs do cromossomo Y foram realizados para
o clculo do perfil gentico. Gis et al (2007) analisou 12 STRs do cromossomo Y
includos no sistema PowerPlex Y (Promega). A diversidade gentica dessas STRs foi
de 0,6746 e a diversidade haplotpica 0,9996. A comparao entre os resultados obtidos
demonstrou que a variao dentro de cada grupo maior que a variao entre os grupos.

144

145

DNA Mitocondrial

O DNA mitocondrial teve suas caractersticas descritas no mdulo 2 desse curso,
mas ser exposta a metodologia de anlise da sua sequncia.

O DNA mitocondrial utilizado para (Butler, 2005):
Verificao da linhagem materna, para analisar migraes populacionais, pois
so transmitidos pela me a todos os filhos;
Pesquisa histrica e genealgica da linhagem materna;
Anlise do perfil gentico em testes de caracterizao de vnculo gentico,
aumentando o poder de discriminao, principalmente quando o DNA do pai
biolgico no obtido, e sim de parentes da linhagem materna;
Anlise de materiais degradados e em nfima quantidade, como mmias,
ossadas e material arqueolgico, pois o DNA mitocondrial, por ser circular,
conserva-se melhor do que o DNA genmico.

O mtDNA foi sequenciado pela primeira vez por Anderson et al (1981), que
tornou-se a referncia durante muito tempo, sendo denominada sequncia de Anderson
ou de Cambridge (Figura 97). Atualmente, utiliza-se a fita leve do mtDNA, que possui
menor peso molecular ao ser comparado com a fita pesada, da sequncia de Anderson
ou Cambridge. A fita pesada ainda possui uma quantidade maior de guanina (Butler,
2005).

Figura 97: Sequencia de referncia das regies HV1 e HV2 do mtDNA.

O mtDNA possui polimorfismos de base nica ou SNPs que variam de indivduo
para outro, sendo necessrio o sequenciamento de toda a regio a ser analisada. Para a
reao de sequenciamento necessrio:
146

Com isso, iremos abranger um pouco mais sobre a anlise da sequncia de
mtDNA, aps a realizao da PCR. A prxima etapa a purificao do produto de PCR,
para a remoo de nucleotdeos no incorporados, primers, enzima polimerase, tampo e
outros reagentes presentes na PCR que possam interferir na reao de sequenciamento.
Usualmente, realizam-se purificaes a base de etanol e lcool isoproplico, permitindo
que todo produto de PCR seja precipitado e totalmente utilizado na reao de
sequenciamento (Butler, 2005).
A reao de sequenciamento uma reao de amplificao de fragmentos de
DNA que correspondem fita sense ou antissense separadamente, ao contrrio da PCR.
Para tal finalidade, alm dos dNTPs utilizados na PCR, utilizam-se
didesoxirribonucleotdeos (ddNTPs) que no permitem a incorporao de outros
nucleotdeos, como demonstra a figura 98:
147

Figura 98: processo de seqenciamento do DNA com ddNTPs marcados com fluorforos.

As sequncias posteriormente so alinhadas e analisadas em programas
especficos, como BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), comparando-
as com a sequncia referncia de Anderson (Figura 99). Pode tambm ocorrer
heteroplasmias que a presena de mais de um tipo de mtDNA em um nico indivduo
(Figura 100). Duas ou mais populaes de mtDNA podem estar presentes em um nico
indivduo, seja em diferentes tecidos, regies do corpo e idades. Com isso, necessrio
ter cautela ao analisar uma sequncia de mtDNA encontrada em amostra referncia e
evidncias forenses.

148

Figura 99: Alinhamento de duas sequncias de mtDNA de pessoas distintas (A e B) comparadas
com a sequncia referncia, demonstrando a posio da variao e sua nomenclatura.

Figura 100: Heteroplasmia encontrada na posio 16093 contendo o nucleotdeo T (vermelho) e
C(azul), que representado pela letra "Y no eletroferograma.

149

150
Controle de Qualidade dos Laboratrios

O FB acrescenta alguns itens para o controle de qualidade dos laboratrios que
trabalham com evidncias de DNA forense, que inclui alm desses cuidados a realizao
de peridicos testes de proficincia (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a
manuteno da garantia de qualidade. O teste de proficincia utilizado para monitorar o
rendimento e para identificar tpicos que devem ser aperfeioados, e a auditoria para
averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratrio (DNA Advisory Board,
2000).
O grupo espanhol e portugus da Sociedade nternacional de Gentica Forense
(Grupo Espaol Y Portugus - nternational Society for Forensic Genetics), objetivando a
padronizao das metodologias aplicadas e o controle de qualidade, realiza testes anuais
de controle e de proficincia inclusive para laboratrios brasileiros credenciados. Esses
testes consistem na anlise de amostras de sangue e outro fluido biolgico que simulam
um caso forense para a manuteno da qualidade na anlise do DNA de amostras (SFG,
2000).
No teste de vnculo gentico familiar, a quantidade de amostra coletada
normalmente previsvel e constante, no havendo muitos problemas com sua
quantidade e qualidade. Entretanto, h materiais biolgicos utilizados nestes testes que
so coletados post-mortem oriundos de corpos exumados ou putrefeitos. Nesse caso, o
material predominante est degradado da mesma maneira que as evidncias de material
biolgico encontrado na cena do crime. O produto obtido de provas forenses nico e
muitas vezes a garantia de sua qualidade s adquirida atravs de alguma forma de
controle independente e indireto (FB, 2001, NTERPOL, 2001).
Controles de qualidade internos e externos servem para esse propsito. Os
laboratrios forenses podem utilizar como controle interno, padres reconhecidos e
devidamente testados para tal finalidade. Controles externos devem ser introduzidos por
programas administrados por organizaes certificadas, que, inicialmente, preparam
padres de espcimes conhecidas, como sangue, e envia para todos os laboratrios
credenciados. A metodologia utilizada e os respectivos resultados devem ser informados

151
para o comit, que analisar os dados e avaliar as alteraes entre os laboratrios
(THOMPSON, 1974; KLOOSTERMAN, 2001; BLCK & PASSEY, 2003).

Controle de Qualidade Interno

Ao analisar uma amostra biolgica destinada caracterizao de vnculo
gentico, seja familiar ou em casos forenses, quaisquer contaminaes com DNA
estranho ou metodologias inadequadamente aplicadas podem resultar na impossibilidade
de obter o DNA para amplificao, o no estabelecimento dos perfis genticos e na
inutilizao da amostra. A primeira preocupao no estudo do perfil gentico para a
identificao humana avaliar o quanto as metodologias de deteco utilizadas pelos
laboratrios so vlidas, assim como seus princpios. Para assegurar resultados, um
programa de controle de qualidade fundamental para os laboratrios que realizam
identificao humana pelo DNA. Todas as metodologias de anlise de DNA forense
devem ser submetidas validao para assegurar a reprodutibilidade e a robustez da
tcnica (KLOSTERMAN, 2001).
Procedimentos inadequados que levem contaminao de amostras pelos
investigadores e os profissionais do laboratrio podem resultar em uma incorreta
interpretao do perfil gentico. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de
normas e procedimentos de boas prticas de laboratrios so imprescindveis, assim
como treinamentos especficos para o exame de DNA tornaram-se obrigatrios
(NEUMAYER, 1998; NTERPOL, 2001).
Desde 1992, a SFH faz recomendaes para a anlise de DNA pela PCR. A
contaminao pode ser evitada atendendo a certos cuidados durante todo o processo de
anlise de DNA. Eles vo desde a coleta e armazenamento do material biolgico do qual
ser extrado o DNA at o prprio local de preparao da PCR (SFG, 1992).
A preservao do DNA para a amplificao pela PCR tambm envolve o controle
da temperatura, da umidade, o valor do pH (BENDER, 2004), a presena de cido hmico
e flvico e microorganismos. A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado
de milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem
preservado em ambientes secos e com o mnimo crescimento de microorganismos. A

152
presena de cido flvico e hmico inibe a enzima Taq DNA polimerase. O pH neutro ou
levemente alcalino na amostra tambm ajuda na preservao do DNA. Os
microorganismos em grande quantidade podem degradar o DNA por completo (BURGER
et al., 1999).
O FB e a NTERPOL estabeleceram normas para os laboratrios forenses que
participam da construo dos bancos de DNA internacional. Relacionam-se,
principalmente, com procedimentos de coleta de amostras biolgicas para anlise do DNA
que podem ser consideradas evidncias, assim como vrios aspectos importantes para o
treinamento tcnico. No Brasil, a Secretaria de Segurana Pblica do Estado de So
Paulo e a Secretaria Nacional de Segurana Pblica SENASP elaboraram documentos
na tentativa de padronizar mtodos e cuidados de coleta e manuteno das amostras
pelos peritos criminais.
Sucintamente, a coleta do material deve ser realizada em condies asspticas e
o indivduo responsvel pela coleta estar devidamente paramentado para se evitar
contaminao em ambos os sentidos, como, por exemplo, utilizao de hastes com
algodo, tubos, frascos e envelopes plsticos ou de papel. Para a coleta de amostras
biolgicas umedecidas aconselhvel a posterior secagem em ambiente estril para o
seu acondicionamento. No entanto, se isso no for possvel, transporta-se imediatamente
para o laboratrio e congela-se a -20C, no mnimo (SO PAULO, 1999; FB, 1999 e
2001; NTERPOL, 2001; SENASP, 2006). No se deve descongelar e congelar as
amostras repetidamente, pois causaria a degradao do DNA.
A escolha de mtodos de extrao de DNA est relacionada ao tipo de material e
importante para que se obtenha sucesso no estudo das STRs. Dessa maneira, cada
laboratrio deve realizar testes e otimizaes de tcnicas especficas para cada tipo de
amostra forense (FB, 2001; NTERPOL 2001; BUTLER, 2005; BONACCORSO, 2005).
Em 1996, a maioria dos laboratrios entrevistados por uma filial da Sociedade
nternacional de Gentica Forense (53) realiza a purificao do DNA pelo mtodo
orgnico (67) seguido por no orgnico (33).
Hoff-Olsen et al (1999) avaliaram cinco mtodos de extrao de DNA de tecidos
humanos em estado de decomposio, que normalmente encontram-se altamente
degradados, para anlise das STRs. Os mtodos empregados foram: extrao orgnica

153
com fenol-clorofrmio, slica, filtro de fibra de vidro, nsta Gene Matrix e Chelex. O
mtodo da slica, alm de ser mais econmico, obteve melhores resultados ao comparar
com mtodo fenol-clorofrmio e resultou em um perfil gentico completo em 90 dos
casos contra 60. sso torna a slica o mtodo mais indicado pelos autores para a
extrao de DNA de amostras degradadas. O mtodo de Chelex no foi satisfatrio para
dentes, demonstrando que ele deve ser indicado principalmente para saliva, como
descreveu Sweet et al. Em casos como esse, emprega-se controle positivo constitudo de
amostra conhecida, para verificar se o mtodo foi eficaz (FB, 2001; NTERPOL, 2001).
Kwok & Higuchi (1989) e Neumaier (1998) descreveram vrias recomendaes
para assegurar a qualidade dos mtodos de biologia molecular em diagnsticos clnicos
referentes s fases pr-analticas e analticas, principalmente para a realizao da PCR.
Objetivando evitar a contaminao das amostras, recomenda-se o isolamento fsico da
rea de preparao da PCR, de seus reagentes e todos os materiais descartveis
utilizados na reao que devem ser previamente esterilizados. Outros cuidados so
fundamentais: os reagentes devem ser aliquotados; a utilizao de luvas descartveis
obrigatria e devem ser constantemente trocadas; deve-se ter cuidado ao abrir os tubos,
pois parte do produto da PCR pode estar na sua tampa, possibilitando o seu desperdcio;
a mistura dos reagentes da PCR deve ser feita em um nico tubo para posteriormente
aliquot-los em tubos individuais; deve-se adicionar o DNA individualmente em cada tubo
e, finalmente, a incluso obrigatria de controles negativos e positivos que auxiliam na
deteco de contaminantes.
Atualmente utiliza-se a linhagem de clula comercial K562 como controle positivo
(BERRE et al, 1997; FB, 2001; NTERPOL, 2001) ou uma amostra de DNA previamente
validada pelo prprio laboratrio ou externamente, como ocorre em kits de identificao
humana (LAFOUNTAN et al, 2001; KRENKE et al, 2002; LEVEDAKOU et al, 2002;
SCHLENK et al, 2004). Com o intuito de unificar os loci a serem utilizados em
identificao humana para a incorporao de perfis genticos de criminosos em seu
banco de dados (CODS), o FB indicou a utilizao de 13 loci para a sua anlise; a saber,
CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317,
D16S539, D18S51, e D21S11 (BUDOWLE & MORETT, 1999) (Tabela 12).

154
Tabela 12 nformao das 13 STRs recomendadas pelo CODS.

Nome do
Locus
Localizao no
cromossomo
Unidade
de
repetio
Acesso de
GenBank
Variao
dos
alelos
Nmero de
alelos
observados
CSF1PO 5q33.1
c-fms pronto-
oncogene,
6 intron
TAGA X14720 6-16 15
FGA 4q31.3
fibrinognio
3 intron
CTTT M64982 15-51,2 69
TH01 11p15.5
Tirosina
hidroxilase
1 intron
TCAT D00269 3-14 20
TPOX 2p25.3
Tiride peroxidase
10 intron
GAAT M68651 6-13 10
VWA 12p13.31
von Willebrand
factor
40 intron
[TCTG]
[TCTA]
M25858 10-24 28
D3S1358 3q21.31 [TCTG]
[TCTA]
NT00599
7
9-20 20
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22
D8S1179 8q24.13 [TCTA]
[TCTG]
G08710 8-19 13
D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14
D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43
D21S11 21q21.1 [TCTA]
[TCTG]
complexo
AP000433 24-38 70
Adaptado de Butler, 2005

155

Esse conjunto de loci tornou-se referncia para todos os pases no que se refere
cincia forense (SUN et al, 2003). Essa normatizao permitiu estudos de frequncias
allicas populacionais comparativas mais adequadas, possibilitando a universalizao dos
dados genticos com critrios homogneos. Com o objetivo futuro de implantar um banco
de perfis genticos de criminosos como o CODS, o governo federal brasileiro j adotou
as STRs sugeridas pelo CODS como referncia em seu Manual de Padronizao de
Exames de DNA em Percias Criminais (SECRETARA NACONAL DE SEGURANA
PBLCA - SENASP, 2005).
Esses loci contm repeties bem caracterizadas que podem ser facilmente
determinados com uso de uma referncia de tamanho de fragmento de DNA. As
vantagens da utilizao de marcadores de tamanho em anlise de DNA tm sido
observadas desde o incio das anlises de VNTRs (WYMAN & WHTE, 1980).
A reprodutibilidade do mtodo de deteco confirmada observando a
intensidade dos fragmentos do marcador podendo fornecer informaes relativas
possvel variao linha a linha na migrao eletrofortica de um mesmo material. O
marcador aplicado em linhas dispostas em regies distintas, destinado a abranger uma
maior regio do gel. A separao eletrofortica depende no somente do tamanho dos
fragmentos, mas tambm da sequncia do nucleotdeo (FRANK & KOSTER, 1979).
Dessa maneira, os marcadores de tamanho s garantem a eficcia da leitura do
comprimento do DNA quando o marcador e o fragmento de DNA desconhecido tm a
mesma continuao e o mesmo tamanho.
Se as sequncias do marcador e dos fragmentos das amostras no so os
mesmos, a migrao das amostras em relao os fragmentos do marcador podem ser
diferentes. sso se deve a parmetros ambientais como porcentagem de agarose ou
poliacrilamida, a quantidade de sais no tampo de corrida, a voltagem da eletroforese
(BUDOWLE et al, 1995; MSCCKA-SLWKA, 1997; SULLVAN, 1992) ou mesmo a
deteco da emisso de fluorescncia presente no fragmento amplificado, como ocorre
na utilizao de iniciadores marcados com fluorescncia (GRFFTHS et al; 1998;
WATSON et al, 2001).
nmeros marcadores de tamanho de fragmentos de DNA para eletroforese so
disponibilizados comercialmente: 10, 50, 100 bp e 1Kb (NVTROGEN, 2007), LS600

CXR presente no PowerPlex16 (PROMEGA, 2007) e GS500 L, no AmpFlSTRS
dentifilier (APPLED BOSYSTEMS, 2005); marcadores de peso molecular, como o
Low DNA Mass Ladder (NVTROGEN, 2005-2); marcadores ou padres allicos que
possuem os diversos alelos de um determinado locus (PUERS et al, 1993; SULLVAN et
al, 1992).
O marcador allico uma mistura artificial de alelos presentes em uma populao
de uma determinada STR (SAANTLLA et al, 1992, SULLVAN et al, 1992). Esses
marcadores allicos servem como padro de migrao para cada STR. Eles devem ser
ajustados para os diferentes tamanhos de mensurao presente em instrumentos e
condies de cada laboratrio (BUTLER, 2005) (Figura 101).

Figura 101: Marcador allico presente no Kit AmpSlTR dentifiler, da Applied Biosystems.
Verifique a presena de diversos alelos em uma mesma amostra e a sua separao eletrofretica. Os
marcadores so utilizados para a comparao com os produtos de amplificao.

156

157
Liu et al (1997) sugeriu a importncia da anlise do polimorfismo populacional que
encontraram aps o estudo da frequncia allica na populao japonesa e chinesa e a
construo do respectivo marcador allico para a STR ACTBP2. Alm de observarem
alelos raros dentro de cada populao, analisaram dois alelos que s foram encontrados
na populao japonesa, enquanto outros dois, somente na chinesa. Esse fato demonstra
a variao dos polimorfismos em populaes diferentes. Os autores encontraram tambm
algumas microvariaes allicas raras. Todas essas variaes foram incorporadas no
marcador allico construdo pelos autores, possibilitando uma maior discriminao allica.
Uma mistura de diversos marcadores allicos foi desenvolvida para a sua
utilizao em sistemas multiplex, e possuam as seguintes STRs: HUMTH01, D21S11,
D18S51, D8S1179, HUMVWA, HUMFBRA/FGA e amelogenina. Os produtos da PCR
possuindo os alelos amplificados foram sequenciados e posteriormente agrupados para a
sua anlise em um sistema automtico (GRFFTHS et al; 1998; WATSON et al, 2001).
Outro marcador allico multiplex foi desenvolvido por Fujii et al (2000) para as STRs
HUMTH01, D9S304 e D3S1744, e tambm homogeneizaram os produtos da PCR.
Outro fator que pode interferir na caracterizao dos alelos a quantidade de
DNA utilizada na PCR, podendo ser um fator crucial para sua amplificao correta.
Kobayashi et al (2004) ao analisar os produtos de DNA obtidos pela PCR da STR TH01
de amostras de DNA de diferentes concentraes constataram a perda de um alelo com
quantidades de DNA muito baixas. De 100pg a 10ng, o DNA foi corretamente amplificado,
mas quando analisou utilizou 10pg ou 1pg de DNA houve a perda de um dos alelos ou
no foi possvel detect-los, sendo que o indivduo era heterozigoto. Esse dado nos
fornece justificativas para analisar cuidadosamente a quantidade de DNA a ser colocada
para PCR, evitando a amplificao errnea dos fragmentos.

Controle de Qualidade Externo: Testes de Proficincia em Gentica Forense

Atualmente so realizados diversos testes de proficincia: o Servio Cooperativo
de Testes (Collaborative Testing Services), o Colgio Americano de Patologistas (College
of American Pathologists), o nstituto de Pesquisas Sorolgicas (Serological Research
Institute), Grupo de Diagnstico Cellmark (Cellmark Diagnostics Internacional Quality

158
Assurance Survey) a Associao Americana de Bancos de Sangue (AABB), a Sociedade
Americana de Diretores de Laboratrios Criminais (ASCLD/LAB), o Grupo Europeu de
Perfil de DNA (EDNAP) e o Grupo Espanhol e Portugus da Sociedade nternacional de
Gentica Forense (GEP-SFG) (PETERSON et al, 2003).
O primeiro teste de proficincia em anlises clnicas relatado foi realizado em
1946 quando Belk e Sunderman distriburam espcies annimas para laboratrios de
hospitais para avaliar o desempenho e padronizar os resultados, que variaram entre os
laboratrios, avaliando-se a causa das discrepncias dos resultados e a qualidade do
trabalho realizado (BELK, SUNDERMAN, 1988).
Em 1974, a Fundao de Cincia Forense (Forensic Science Foundation)
conduziu um estudo que trouxe diversos problemas na anlise e interpretao dos
resultados. Uma combinao de grandes esforos dos laboratrios resultou no
aperfeioamento na educao e nas oportunidades de treinamento, implementao de
programas de certificao e creditao, bem como a realizao de testes de proficincia e
implementao de programas de controle de qualidade (PETERSON & MARKHAM, 1995
a e b).
A AABB publicou, em 1991, um conjunto de controle de qualidade em teste de
DNA utilizando-se RFLP. O Grupo de Trabalho Tcnico em Mtodos Baseados em
Anlise de DNA (TWGDAM) foi criado nos Estados Unidos em 1988 e realizou sua
primeira publicao de 1991 (PETERSON et al, 2003). Estabeleceu-se, nos EUA, um
conjunto de padres em controle de qualidade e testes de proficincia para aplicao em
laboratrios forenses. Em 1994, criou-se o Conselho de DNA (DAB) cujos membros
reportam-se diretamente ao diretor do FB (ESTADOS UNDOS DA AMRCA, 1994).
Desde 1989, a Sociedade nternacional de Hemogentica Forense (SHF), que
atualmente denominada de Sociedade nternacional de Gentica Forense (SFG),
publica recomendaes sobre anlise de polimorfismos de DNA descrevendo e discutindo
procedimentos para melhoria na reprodutibilidade e exatido das metodologias utilizadas.
O FB recomenda outros detalhes sobre o controle de qualidade dos laboratrios que
trabalham com evidncias de DNA forense, que inclui alm desses cuidados, a realizao
de testes peridicos de proficincia (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a
manuteno da garantia de qualidade. O teste de proficincia utilizado para monitorar o

159
rendimento e para identificar tpicos que devem ser aperfeioados, e a auditoria para
averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratrio (DNA ADVSORY
BOARD, 2000).
O nstituto Nacional de Padronizao e Tecnologia (NST) desenvolve e certifica
padres fsicos e qumicos para comercializao, manufatura e utilizao em pesquisas,
incluindo os utilizados em anlise de cidos nuclicos. Entre eles, aqueles utilizados em
diagnstico molecular de doenas infecciosas, genticas, cncer e, tambm, vnculo
gentico. O NST tambm conduz um abrangente teste de validao interlaboratorial para
anlises forenses e identificao gentica humana (BARKER, 2002).
A conduta de avaliao proposta para laboratrios que realizam vnculo gentico
normalmente so constitudos de amostras biolgicas de indivduos me, filho e suposto
pai, com o intuito de comparar as estratgias utilizadas, seus protocolos metodolgicos,
assim como os resultados obtidos entre os participantes (BERRE et al, 1997;
HALLENGERG & MORLNG; 2001).
A avaliao do DNA degradado por diversas condies foi realizada por vrios
laboratrios europeus. nicialmente, clulas foram degradadas em condies especficas
(BENDER, 2004) e encaminhadas para 50 laboratrios europeus, com o objetivo de
melhorar o entendimento sobre os diferentes parmetros que influenciam a tipagem pelas
STRs de DNA degradado. Abrange ainda a tentativa de otimizao para minimizar
problemas. Aps a anlise dos resultados de 38 laboratrios participantes concluram que
para superar os efeitos da degradao do DNA, protocolos da PCR devem ser otimizados
para todos os parmetros. Protocolos flexveis para a interpretao dos perfis allicos
devem ser desenvolvidos e, se necessrio, elaborados softwares para auxiliar na anlise
(SCHNEDER et al, 2004).
Em 2004, O NST (KLNE et al, 2005) realizou estudo de quantificao de DNA
entre 80 laboratrios que participaram do 14 Simpsio nternacional de dentificao
Humana que foi realizado em Phoenix, A, EUA. Oito amostras de DNA extradas foram
liofilizadas e entregues aos laboratrios objetivando: examinar os resultados avaliando a
performance dos laboratrios quando se utiliza concentraes baixas de DNA, fato
frequente em casos forenses, e examinar a consistncia das diversas metodologias
utilizadas entre os laboratrios. Ao final do estudo houve uma variabilidade de 20 nos

160
resultados utilizando-se 19 metodologias. Desses, 65 derivaram de tcnicas
abrangendo hibridizao Slot Blot e 21 da PCR em tempo real. Comparando-se os
resultados de todos os laboratrios houve uma variao de 20 com emprego de
tcnicas diferentes. Com isso, estabeleceu-se que o controle positivo externo que foi
gerado deveria ter os seus resultados comparados dentro de cada metodologia utilizada,
quando o material fosse aproveitado em testes de proficincia.
Um exerccio colaborativo foi realizado em 1989 por 12 laboratrios Europeus
utilizando-se VNTR pYNH24. Os resultados demonstraram que a correlao entre os
perfis genticos adquiridos podem ser alcanados tanto intra como entre os laboratrios,
sob condies mnimas de padronizao (SCHNEDER et al, 1991). Um dos primeiros
estudos em controle de qualidade das STRs foi realizado entre laboratrios participantes
de um encontro do TWGDAM em 1995. Empregou-se, inicialmente, um triplex que
amplificava as STRs CSF1PO, TPOX, TH01 e posteriormente foi acrescentado vWA,
tornando-se um quadruplex. Mesmo utilizando-se protocolos idnticos, inmeros fatores
contriburam para a variabilidade de tamanho dos alelos identificados que chegaram a
uma diferena de acima de 4bp. Entre todos os fatores discutidos, a instabilidade
eletrofortica dos equipamentos pode ser considerado como primordial (MCKA et al,
1999).
A anlise das STRs no substituiu de imediato os VNTRs. Em 1995 e 1996, um
grupo filiado Sociedade nternacional de Gentica Forense (BERRE, 1997) observou
que as VNTRs eram analisadas por RFLP e seus fragmentos identificados utilizando-se
sistema de cmera de deteco (57) e 14 ainda empregavam rguas para
mensurao. Um estudo semelhante foi realizado em 1997, 1998 e 1999 pelo mesmo
grupo, no qual houve uma diminuio na anlise de VNTR por de sondas de locus e
RFLP de 83 em 1997 a 66 em 1999, enquanto mais de 90 dos laboratrios j
utilizavam sistemas baseados na PCR. O coeficiente de variao foi de 1,3 na anlise
de VNTRs e de menos de 0,3 na anlise das STRs. Segundo os autores, esse baixo
valor se deu pela incorporao de conjuntos comerciais para anlise de STR, melhorando
a qualidade da mesma (HALLENBERG & MORLNG 2001).
No Brasil, os exerccios de controle de qualidade em identificao humana pelo
DNA so realizados pelo GEP-SFG e pela SLAGF, no havendo um grupo brasileiro

161
especfico que realize testes de proficincia. Desde 1992, o GEP-SFG realiza um
programa de controle de qualidade, sendo relatados como membros: 324 geneticistas
forenses de 118 laboratrios de 19 pases. Espanha, Portugal, Brasil, Argentina e
Colmbia so os pases mais representativos do grupo. A maioria dos laboratrios est
relacionada com testes de paternidade, sendo 58 envolvidos com casos criminais
(GOM et al, 2004).
As amostras includas nos testes de proficincia realizados pelo GEP-SFG de
2002 a 2005 (GARCA-HRSCHFELD et al, 2005; GME et al, 2004), variaram de cinco
a seis amostras diversificando entre: 100L de sangue, incluindo casos de teste de
paternidade; um fio de cabelo de 2 cm, realizado desde 2000; e amostras forenses
incluindo saliva, em 1997; amostras mistas, em 1998, 2000, 2003, 2004 e 2005; smen,
em 2002 e no humanas em 2001. O nmero total de erros variou de 0,6 a 2,3 em
diferentes anos, sendo que esse valor est concentrado principalmente em laboratrios
que utilizaram sistemas manuais de eletroforese e marcadores allicos construdos
internamente.
A SLSGF observou que a porcentagem dos laboratrios participantes que esto
obtendo resultados de anlise corretos vem crescendo progressivamente, variando de
48 em 1998 at 84 em 2004-2005 (PENACNO et al, 2005). sso demonstra uma
crescente melhoria da anlise e de formao de recursos humanos mais adequados.
Tambm j foram realizados testes de proficincia para a anlise de DNA mitocondrial
(SCHNEDER et al, 1999) e DNA do cromossomo Y (CARRACEDO et al, 1998;
CARRACEDO et al, 2001), observando-se a importncia e a crescente incorporao de
programas de controle de qualidade e testes de proficincia em identificao humana pelo
DNA pelos laboratrios.

Consideraes Finais

Os exames de DNA para caracterizao de vnculo gentico familiar ou anlise de
evidncias forenses tm evoludo de forma rpida e constante nos ltimos 10 anos. No
entanto, apesar da incorporao de tecnologias para a anlise de SNPs com microchips

(Figura 102), por exemplo, a anlise do perfil gentico dos STRs aps eletroforese capilar
a mais utilizada no mundo inteiro.

Figura 102: Microchip para anlise de SNPs, que pode ser utilizado para DNA forense.

Pode-se dizer que, mesmo com o desenvolvimento da tecnologia, os princpios
bsicos da anlise de DNA sero os mesmos, com a diferena que o equipamento, os
reagentes ou os mtodos podem diferenciar no nome ou no modelo. Por exemplo,
podemos citar a extrao de DNA que possui sempre a mesma "regra bsica: lise celular,
precipitao de protenas e isolamento do DNA. A lise celular sempre existir, mas poder
ser feita com diversos reagentes e diversos mtodos, que vo depender do tipo de
amostra a ser analisada, de suas condies fsico-qumicas ou biolgicas e do recurso
tecnolgico que possuir no laboratrio.
162

163
O investimento para construir um laboratrio de DNA forense bastante alto,
impossibilitando a troca imediata da tecnologia de anlise de STRs, mtDNA, Y STRs,
SNPs e miniSTRs. Para se ter uma idia, somente o equipamento de eletroforese capilar
novo que realiza a anlise de fragmentos de STR e de sequncias custa cerca de R
400.000,00 sem contar os reagentes, os kits e todos os outros equipamentos bsicos para
a sua realizao, podendo chegar a quase R 1.000.000,00 de investimento (informaes
baseadas no ano de 2008).

-----------FIM DO MDULO V-----------

164

GLOSSRO

ABI 310 Genetic Analyzer
nstrumento de eletroforese capilar produzido pela Applied
Biosystems, introduzido na comunidade cientfica em 1995.
Muitos laboratrios adotam, atualmente, o AB 3100 ou
AB3130 ou AB3130XL.
ABI 3100 Genetic Analyzer
nstrumento de eletroforese capilar produzido pela Applied
Biosystems, que possui todo o sistema computadorizado,
inclusive de injeo de polmero.
ABI (Applied Biosystems
Incorporation)
Companhia que produz e comercializa instrumentos e
reagentes utilizados em Biologia Molecular, localizado em
Foster City, Califrnia.
cido desoxirribonuclico
(DNA)
Material gentico de organismos, usualmente dupla fita,
fazendo parte da classe de cidos nuclicos identificados
pela presena de desoxirribose, um acar e quatro
nucleobases.
Alelo (frequncia)
A proporo quantitativa de um determinado alelo entre os
cromossomos dos indivduos de uma mesma populao.
Alelo
Uma forma alternativa de um gene ou de uma parte do DNA
localizado em uma determinada regio gentica (locus). Os
marcadores de STRs frequentemente possuem mltiplos
alelos.

165
Amelogenina
Um marcador utilizado para tipagem sexual, cujo gene
codifica o esmalte dentrio, ocorre em ambos os
cromossomos X e Y.
Amostra de referncia
Uma amostra (normalmente sangue ou saliva) obtida de uma
pessoa conhecida que utilizada para comparao com a
evidncia.
Amplicon
O produto de amplificao do DNA pela Reao em Cadeia
pela Polimerase (PCR).
Amplificao
Um aumento no nmero de cpias de um fragmento
especfico de DNA, podendo ser in vitro ou in vivo.
Artefato
Qualquer produto no relacionado ao alelo que pode ocorrer
durante o processo de amplificao do DNA. EX: stutters e
adenilao
Autossmico
Um cromossomo no envolvido em determinao do sexo,
como os 23 pares de cromossomos que possumos, sendo
que os outros dois cromossomos X e Y so sexuais.
Cincia forense
A aplicao de conhecimento cientfico para questes civis e
criminais, tipicamente atravs da apresentao de resultados
de evidncias.
CODIS
Abreviao de Combined DNA Index System ou Sistema de
ndexao de DNA Combinado, que um banco nacional de
dados de perfis genticos dirigido pelo FB, Estados Unidos.
Cromossomo
A estrutura no qual a informao hereditria fisicamente
transmitida de uma gerao a outra.

166
Cromossomos sexuais
Cromossomos que so diferentes nos dois sexos e esto
envolvidos na determinao do sexo: cromossomo X e Y.
Degradao
A fragmentao, ou a quebra da molcula de DNA, devido a
agentes qumicos ou fsicos.
DNA mitocondrial (mtDNA)
Molcula de DNA pequena, circular, de herana materna,
localizada na mitocndria e contm aproximadamente 16.500
nucleotdeos. A abundncia das mitocndrias em uma nica
clula facilita a sua amplificao pela PCR, mesmo em
amostras degradadas ou limitadas.
Eletroforese capilar
Uma tcnica de eletroforese para separao de molculas de
DNA pelo seu tamanho e baseia-se na migrao atravs de
um tubo capilar preenchido com um polmero viscoso.
Eletroforese
uma tcnica na qual as molculas so separadas pela sua
velocidade em um campo eltrico.
Eucarioto Organismo cujas clulas contm ncleo.
Evidncia biolgica
Amostra biolgica coletada na cena do crime, de pessoas ou
de objetos associados ao crime.
Excluso
O teste de DNA indica que um indivduo excludo (no
ocorre combinao de alelos em determinados loci), como a
fonte da evidncia de DNA. Em casos criminais, "excluso
no equivale a "inocente, pois existem outras provas que
so analisadas.

167
Fluorescncia
A emisso de luz de uma molcula consequente da sua
excitao por uma fonte de energia de luz. Na anlise de
DNA, marcadores fluorescentes permitem a deteco
simultnea de tamanhos similares de produtos de PCR
atravs da emisso fluorescente em diferentes cores.
Gene
Unidade bsica de hereditariedade, uma sequncia de DNA
em um cromossomo.
Genoma
Todo material gentico em um cromossomo de um
organismo particular.
Gentipo
Constituio gentica de um organismo, que caracterizado
por particularidades fsicas ou fentipo.
Hereditariedade A transmisso de caractersticas de uma gerao para outra.
Heterozigoto
ndivduo que possui diferentes alelos em um locus, em
cromossomos homlogos.
Homozigoto
ndivduo que possui alelos maternos e paternos idnticos em
um locus em cromossomos homlogos.
Identifiler
Um kit de PCR multiplex da Applied Biosystems que amplifica
simultaneamente 15 STRs, incluindo os 13 STRs
recomendados pelo CODS e o marcador sexual
amelogenina.
In vitro Procedimento realizado fora de organismo.
In vivo Procedimento realizado dentro de organismo.

168
Inconclusivo
Situao na qual nenhuma concluso poder ser dada em
um teste sendo resultante de uma entre muitas razes:
resultados no foram obtidos, resultados no-interpretveis
ou falta de amostra de referncia para confronto.
Loci de CODIS
Um conjunto de 13 STRs recomendados para a incluso de
um perfil de DNA no banco de dados do CODS/FB. Esse
conjunto tornou-se referncia mundial para a anlise de perfil
gentico de seres humanos visando a identificao humana,
sendo que os laboratrios utilizam no mnimo essas 13
STRs.
Loci Plural de Locus (vide Locus).
Locus
Localizao fsica especfica de um gene em um
cromossomo.
Marcador
Um gene ou sequncia especfica de DNA de uma regio
conhecida em um cromossomo utilizado como um ponto de
referncia em um mapeamento de outro loci.
Mutao
Qualquer mudana no hereditria na sequncia do DNA.
Uma alterao ou troca de um alelo em um locus gentico
resultando em uma inconsistncia entre o familiar biolgico
ou evidncias. Pode ser considerada tambm qualquer
alterao gentica com frequncia menor que 1 em uma
populao humana. Mas nesse curso adotamos o primeiro
conceito.
Ncleo
Organela celular em eucariotos que contm o material
gentico.

169
Nucleotdeo
Uma unidade de acido nuclico composto por fostato, ribose
ou desoxirribose e uma base purina ou piridina.
Par de base
Dois nucleotdeos complementares ligados por ponte de
hidrognio. Ex: adenina-timina; citosina-guanina.
PCR multiplex
Co-amplificao de mltiplas regies do genoma com mais
de um conjunto de primers (ou iniciadores) em uma nica
PCR, diminuindo a quantidade de DNA e reagentes a ser
empregado em uma PCR singular (que possui somente um
par de primers para amplificar somente um locus.
Perfil gentico
A anlise completa de no mnimo 13 loci de um nico
indivduo pode determinar o perfil gentico. No entanto, esse
perfil poder estar incompleto, principalmente em amostras
degradadas.
Poder de discriminao
O potencial de um marcador gentico ou conjunto de
marcadores em diferenciar duas pessoas escolhidas por
acaso.
Polimorfismo
Diferena na sequncia de DNA entre indivduos. Variao
gentica que ocorre em mais de 1 da populao pode ser
considerada polimorfismo na anlise de ligao.
Populao
Um grupo de indivduos que residem em uma mesma rea
em um mesmo perodo.
Power Plex 16
Kit multiplex da Promega Corporation que co-amplifica 15
STRs, sendo que 13 recomendados pelo CODS-FB, e mais
o marcador sexual amelogenina.

170
Primer (ou iniciador)
Uma cadeia polinucleotdica curta sintetizada artificialmente
que possui normalmente de 18 a 30 bases, que se hibridiza
em uma regio especfica do DNA e permite que a enzima
DNA polimerase inicie a sntese da fita complementar.
Probabilidade de excluso
(PE)
Uma porcentagem da populao que pode ser excluda como
potencial contribuidor em um resultado de mistura de DNA.
Reao em Cadeia pela
Polimerase (ou da
Polimerase) PCR
Processo in vitro que permite a amplificao de milhes de
cpias de um DNA especfico atravs de repetidos ciclos
envolvendo a enzima DNA polimerase.
Sequncias
complementares
As sequncias de cidos nuclicos formam uma estrutura de
dupla fita por pareamento de bases, como adenina-timina,
citosina-guanina. Por exemplo, a sequncia complementar de
GTACCG CATGGC.
SNP
Polimorfismo de base nica. Qualquer variao polimrfica
de um nucleotdeo. A maioria dos SNPs apresenta-se
biallicos com a frequncia do menor alelo a menos de 1.
STR
Repeties Consecutivas Curtas. Sequncia de DNA
arranjada em sucesso direta ou consecutivas na qual a
unidade de repetio varia de 2 a 6 pares de bases. Os STRs
normalmente ocorrem em regies no-codificadoras e o
nmero de unidades repetitivas pode variar de indivduo para
indivduo.
Teste de proficincia
Medidas que visam assegurar a qualidade utilizada para
monitorar a performance de um analista e identificar reas
nos quais melhorias so necessrias. Pode ser interno
(produzidos pelo prprio laboratrio) ou externo (produzidos
por outros grupos).

171
Zigoto
Clula formada quando um DNA nuclear do espermatozide
combina com o DNA nuclear do vulo, resultando em uma
clula diplide.

172

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