Tcnica de Colorao de Gram

Esta tcnica permite subdividir as bactrias em dois grandes grupos: as designadas Gram+ (positivas), que tm a capacidade de reter o primeiro corante usado (cristal violeta), e as Gram- (negativas) que no conseguindo reter o primeiro corante, adquirem a cor do segundo, aps a lavagem com o solvente orgnico. Este facto deve-se diferena na espessura da camada de peptidoglicano existente na parede bacteriana. Assim, a camada espessa das Gram+, depois de colapsar sob o efeito desidratante do etanol, no permite a sada do corante, um complexo formado pelo cristal violeta e pelo iodo; contrariamente a camada fina das Gram- mesmo colapsada no evita a sada do corante ficando a clula incolor, e por isso a necessidade de usar um segundo corante contrastante - a safranina.

Reagentes: o Cristal violeta: 1. Soluo A: dissolver 2g de cristal de violeta em 20ml de etanol 95% (vol/vol); 2. Soluo B: Dissolver 0,8g de oxalato de amnio em 80ml de gua desmineralizada; 3. Misturar as solues A e B para obter o reagente de colorao cristal de violeta; 4. Deixar repousar 24h e filtrar por papel de filtro antes de usar. o Mordente - Iodo de Gram: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1,0g de iodo; 2,0g de iodeto de potssio; gua desmineralizada at 300ml; Triturar o iodo e o iodeto de potssio num almofariz; Adicionar a gua lentamente continuando a triturar; Guardar numa garrafa escura.

o Solvente de descolorao: 1. Etanol/acetona 80:20 (vol/vol). o Corante de contraste: 1. 10ml Safranina O 2,5% (p/vol) em etanol 95%; 2. 100ml de gua desmineralizada. Procedimento: Utiliza-se o mtodo de Hucker para a colorao de Gram. As clulas para a colorao so retiradas de uma cultura jovem em meio slido, seguindo os seguintes passos: 1. Secagem e fixao do esfregao com calor;

2. Imerso do esfregao no reagente de colorao (cristal violeta) durante um minuto; 3. lavagem com gua; 4. imerso com mordente (iodo de Gram) durante um minuto; 5. lavagem com gua; 6. lavagem com solvente de descolorao (etanol/acetona); 7. lavagem com gua; 8. imerso do esfregao em contrastante (safranina) durante 1 minuto; 9. lavagem com gua e montagem com lamela; secagem com papel de filtro; 10. Observar ao microscpio utilizando a objectiva de imerso.