Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Componentes del Test ELISA para Chagas III. 2 Placas de ELISA para 96 determinaciones cada una, activadas con una mezcla de antgenos deT. cruzi. Cada placa est compuesta por doce tiras de ocho pocillos que pueden ser utilizados individualmente y es suministrada dentro de un sobre metalizado hermticamente sellado, que contiene un desecante en su interior. 6 autoadhesivos para sellar las placas. 1 bolsa plstica con cierre hermtico para guardar las tiras no utilizadas.
Las soluciones que componen el kit se detallan en la Tabla I: Tabla I: componentes del Test ELISA para Chagas II Solucin Descripcin Conjugado
Color
Dos frascos caf con 15 mL de anticuerpo anti-IgG humana conjugado a peroxidasa. Contiene 0,02% de timerosal Anaranjado como preservante. Un frasco con 120 mL de solucin amortiguadora salina pH 7,5 concentrada 25 veces. Incolora Contiene 0,02% de timerosal como preservante. Un frasco con 50 mL de solucin diluyente de muestra. Contiene protenas estabilizadoras y 0,02% de timerosal como preservante. Un frasco caf con 30 mL de solucin de tetrametilbencidina y perxido de hidrgeno. Un frasco con 2 mL de suero positivo para Chagas. Contiene 0,1% de azida de sodio como preservante. Un frasco con 2 mL de suero negativo para Chagas. Contiene 0,1% de azida de sodio como preservante. Un frasco con 30 mL de cido sulfrico 3N.
Violeta
V) PRECAUCIONES DE USO
Utilizar slo para diagnstico in vitro. Los sueros humanos utilizados como controles han dado resultados negativos para HIV, HBV y para HCV. Sin embargo, se recomienda manipularlos con las precauciones
requeridas para muestras potencialmente infecciosas. Ningn mtodo actualmente conocido garantiza la ausencia de agentes infecciosos en derivados de sangre. Todos los reactivos y componentes deben estar a temperatura ambiente al momento de ser usados y deben refrigerarse (2 a 8C) luego de su uso. No abra el sobre que contiene la placa hasta que haya alcanzado la temperatura ambiente. Guarde las tiras no utilizadas junto al desecante, dentro de la bolsa plstica provista para tal efecto; asegrese que la bolsa quede bien cerrada. Los recipientes usados para preparar los reactivos deben estar limpios y libres de detergentes y cloro. Use puntas nuevas para cada muestra, control o reactivo. Evite tocar la pared del pocillo con la punta de la pipeta. Nunca pipetee directamente del frasco original. Nunca devuelva restos de reactivos no utilizados a los frascos originales. No mezcle reactivos provenientes de lotes diferentes. Siempre considere que la reproducibilidad de los resultados depende de la precisin del pipeteo, de la exactitud en los tiempos y temperaturas de incubacin y del lavado correcto de los pocillos. No utilice objetos metlicos que puedan entrar en contacto con las soluciones. No utilice muestras o reactivos contaminados ya que pueden producir resultados falsos.
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD
Use guantes cuando manipule muestras y reactivos. No pipetee con la boca. No coma, beba, fume o manipule lentes de contacto en el rea de trabajo. Limpie y desinfecte cualquier salpicadura o derrame de muestra o reactivo utilizando algn desinfectante como hipoclorito de sodio al 0,5%. Evite el contacto de la Solucin de Detencin con la piel y mucosas. Si ste u otro reactivo entra en contacto con la piel o mucosas, lave el rea afectada con abundante agua. Elimine todo el material contaminado en recipientes adecuados para desechos biolgicos. Estos pueden ser descontaminados en autoclave a 121C por 1 hora o tratados con hipoclorito de sodio 0,5% final durante 2 horas. Los restos de muestras, controles y reactivos aspirados deben tratarse con hipoclorito de sodio 0,5% final por 2 horas, antes de ser eliminados.
Las muestras que contienen precipitados o cogulos deben ser centrifugadas (en centrfuga clnica a 2500 rpm por 10 minutos) antes del anlisis.
No utilizar muestras con contaminacin microbiana porque pueden producir resultados falsos Las muestras se pueden conservar entre 2 y 8C hasta una semana antes del anlisis. Para perodos ms prolongados, se puede agregar 0,1% azida de sodio o mantener congeladas a -20C (o a temperaturas inferiores). No someta las muestras a ciclos reiterados de congelamiento y descongelamiento, ya que stos afectan su estabilidad.
No congele muestras en congeladores con deshielo automtico. Si utiliza muestras congeladas, debern ser homogenizadas y centrifugadas antes de su uso.
PROCEDIMIENTO
1. 2. Antes de comenzar el ensayo, permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente. Diluya la solucin de lavado 25X con agua destilada o desionizada. Si va a utilizar una tira de 8 pocillos, prepare 50 mL de solucin de lavado tomando 2 mL de la solucin 25X y agregando 48 mL de agua. La solucin diluida es estable por dos semanas almacenada a 4C. Ponga en el soporte los pocillos correspondientes al nmero de muestras a analizar. Incluya dos pocillos para el control positivo y dos para el control negativo. Agregue a cada pocillo 200 L de diluyente de muestra. Agregue 20 L de cada muestra o control. Al agregar las muestras, el diluyente de muestra virar de color de acuerdo a la Tabla II.
3. 4. 5.
Tabla II: viraje del color del diluyente de muestra. Tipo de muestra Sin muestra Suero o plasma Color Violeta Azul
Muestras hemolizadas o turbias alterarn el color final sin afectar el resultado. El cambio de color es proporcional al volumen de muestra agregado. Un viraje de menor intensidad, indicar que se dispens un volumen inferior o que la muestra no se encuentra en las condiciones adecuadas. 6. Selle la placa con el autoadhesivo provisto, para impedir la evaporacin de los reactivos, e incube por 30 minutos a 37 1C. 7. Saque el adhesivo y lave la placa. Para sto elimine el contenido y agregue a cada pocillo 350 L de solucin de lavado diluida. Elimine la solucin y repita esta operacin 4 veces ms. Protocolo recomendado para lavador automtico de tiras: Realice cinco ciclos de lavado dispensando 350 L de la Solucin de Lavado diluida. Asegrese cuando sea posible que: a) el pocillo se llene con la Solucin de Lavado. b) la Solucin de Lavado no rebalse en ningn momento. c) el tiempo de remojo sea 30 segundos. d) no quede lquido remanente en los pocillos al final del lavado. Para esto se recomienda, si es posible, realizar un aspirado cruzado (crosswise) en el ltimo paso. Siempre hay que mantener limpio el equipo enjuagando con abundante agua destilada al final de cada jornada de trabajo.
8.
Despus de lavar invierta la placa y golpela suavemente sobre papel absorbente para eliminar cualquier exceso de lquido en los pocillos. Si la base de los pocillos se moja, limpie con papel absorbente para evitar la formacin de precipitados que podran interferir con la lectura. No hay que permitir que la placa se seque. 9. Tome slo el volumen de conjugado que va a utilizar y depostelo en un recipiente limpio. Agregue 100 L de conjugado a cada pocillo. No se debe pipetear el conjugado directamente del frasco original ni devolver el conjugado sobrante al frasco original. 10. Tome slo el volumen de conjugado que va a utilizar y depostelo en un recipiente limpio. Agregue 100 L de conjugado a cada pocillo. 11. Lave de manera similar a lo descrito en los puntos 7 y 8. 12. Agregue 100 L de sustrato a cada pocillo e incube la placa en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. 13. Detenga la reaccin agregando 100 L de Solucin de Detencin a cada pocillo.
c)
Determinacin de resultados Una muestra ser positiva cuando su absorbancia sea mayor que el cut off. Un
suero ser negativo cuando su absorbancia sea menor que el cut off. Las muestras cuya absorbancia se encuentre en un rango de cut off 10%, deben considerarse dudosas y debern ser analizadas nuevamente en duplicado. Si al menos uno de los replicados mantiene una lectura en esta zona, considere la muestra como positiva. En casos excepcionales en los que no se cuente con un lector colorimtrico, se puede realizar un lectura visual. Los pocillos positivos sern de color amarillo y podrn diferenciarse de los pocillos negativos, los que sern incoloros o presentarn una leve coloracin amarilla. Este tipo de lectura no permite verificar los criterios de validacin, por lo que se recomienda slo en situaciones excepcionales.
VALIDACION
DE
LOS
RESULTADOS
Para que la prueba sea considerada vlida debe cumplirse lo siguiente: La densidad ptica de cada control negativo debe ser menor o igual a 0,2. Si la densidad ptica de uno de los controles negativos es mayor a 0,2, y la lectura del otro control est en los rangos habituales y se cumplen los criterios de validacin, descarte ese valor. La diferencia entre los controles positivos dividida por el promedio de ellos, debe ser menor o igual a 0,21 (equivalente a un coeficiente de variabilidad de 15%). El promedio de los controles positivos dividido por el promedio de los controles negativos debe ser mayor o igual a 5. Este lmite evita la prdida de sensibilidad en los casos que los valores del control positivo sean bajos.
LIMITACIONES
Todas las muestras dudosas o positivas, deben repetirse en duplicado. Las muestras repetidamente reactivas pueden ser confirmadas por tcnicas tales como: IFI, Western Blot, Xenodiagnstico o PCR. El diagnstico de la enfermedad de Chagas debe basarse en una combinacin de resultados incluyendo la historia clnica, la deteccin del parsito y ensayos serolgicos posteriores. Muestras con contaminacin microbiana o de personas con otras parasitosis o enfermedades autoinmunes pueden producir resultados falsos. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infeccin con T. cruzi. La respuesta inmune humoral no es detectable durante las primeras semanas luego de la infeccin por ningn mtodo existente en el mercado (8).