MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

APOSTILA DE AULAS PRTICAS

ANLISE MICROBIOLGICA DE GUA E ALIMENTOS

Profa. Dra. Sandra Maria Oliveira Morais Veiga Prof. Dr. Luiz Carlos do Nascimento Tcnica de Laboratrio: Patrcia L. N. Carvalho

ALFENAS 2013

NORMAS DE CONDUTA NO LABORATRIO

Laboratrio Anlises microbiolgicas e fsico-qumicas. Normas: minimizar os riscos de contaminao: Alimentos/Amostras e Manipuladores Normas Gerais e de Higiene Pessoal: 1. Ocupar sempre o mesmo lugar. 2. Usar avental, luvas e sapato/tnis nas aulas prticas. 3. OBSERVAO IMPORTANTE: antes de iniciar os trabalhos prticos e aps a realizao dos mesmos, LAVAR AS MOS COM GUA E SABO. 4. Lavar imediatamente quaisquer ferimentos provocados durante o trabalho. 5. Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver se contaminado; indicando o material ou a cepa com a qual estava trabalhando. 6. Ter o mximo de cuidado para que no ocorram acidentes e/ou auto-contaminaes. 7. Observar rigorosamente o horrio das aulas prticas. 8. Qualquer dvida quanto colocao dos materiais: forno, estufa, banho-maria etc. recorrer aos professores ou aos funcionrios da disciplina. 9. Contribuir com adequada organizao do Laboratrio e realizar os trabalhos prticos com dedicao para um melhor aproveitamento.

Observaes importantes: Nosso trabalho realizado em equipe e, portanto, todos devem contribuir com o melhor de si, para que possamos chegar a eficincia, ou seja, devemos trabalhar de forma inteligente e no exaustiva. Toda equipe precisa ser harmoniosa e se espelhar no vo dos gansos (solidariedade).

PROCEDIMENTOS ROTINEIROS: 1-Esterilizao uso de agentes fsicos e/ou qumicos para eliminar totalmente os organismos vivos presentes em um material. 2-Desinfeco uso de agentes qumicos germicidas para destruio da infecciosidade potencial de um dado material, no implicando, portanto, na eliminao total dos organismos vivos.

LAVAGEM DAS MOS

I. INTRODUO Mos: 1848 Semmelweis importncia da lavagem das mos. Microbiotas: Residente: bactrias Gram (estafilococos coagulase negativa Staphylococcus epidermidis), no facilmente removveis, entretanto podem ser inativadas por antisspticos. Localizam-se nas fendas das mos, no interior do folculo piloso e principalmente, em volta e sob as unhas. So de baixa virulncia. (problemas imunodeprimidos ou quando se realizam procedimentos invasivos) Transitria: bactrias Gram e o estafilococo coagulase positiva (S. aureus), sendo que estes micro-organismos so passageiros e viveis apenas por um curto perodo de tempo. Superfcie da pele, junto s gorduras e sujidades (contaminantes). Esta microbiota frequentemente responsvel pelas infeces hospitalares e contaminao de alimentos, podendo ser reduzida com a lavagem bsica das mos. Higiene das mos a) Lavar as mos no incio e fim dos trabalhos prticos. b) Lavar as mos aps o contato com materiais contaminados, tendo utilizado ou no luvas. c) Retirar adornos: anis, pulseiras, relgios. TCNICA Lavagem bsica: a) Abrir a torneira b) Ensaboar as mos, punhos e antebraos, fazendo frico por 30 segundos, especialmente entre os espaos interdigitais e unhas. c) Enxaguar com gua corrente d) Secar com papel toalha e) Fechar a torneira com o prprio papel Antissepsia: lcool 70%p/p ou 77%v/v, glicerinado, friccionando at secar espontaneamente. II. OBJETIVO Realizar a lavagem bsica das mos e antissepsia. III. MATERIAL gua corrente, sabo lquido e antissptico ou degermante (PVPI), papel toalha.

NORMAS PARA A COLETA DE AMOSTRAS DE GUA -Lavar as mos -Sempre que possvel verificar cloro (0,2 a 2,0mg/L) e pH (6,0-9,5) -Utilizar recipiente de boca larga, estril, com capacidade para 250mL. -No abrir os frascos at o momento da colheita. -Colher assepticamente 200mL da amostra. -Os frascos para coleta de gua clorada devem ser adicionados de tiossulfato de sdio (0,1mL de soluo a 1,8% (2%) para cada 100mL de amostra) -Identificar a amostra -Transporte: caixa isotrmica, tipo isopor, com gelo. -Tempo entre a coleta e o incio das anlises: at 24h para guas tratadas, 12h para guas no tratadas e 06 para guas muito poludas (em refrigerao). -Ideal: 02h. Tipos de Coleta: 1 Torneira Limpar a parte externa com etanol a 70% e flambar, deixar a gua fluir por 2 a 3 minutos, coletar a amostra assepticamente. 2 Reservatrios utilizar o prprio frasco de coleta com auxlio de uma pina de braos longos.

PIPETAGEM COM AUXLIO DE PRAS

I. INTRODUO De acordo com as normas tcnicas para preveno da transmisso de doenas nos servios de sade (Ministrio da Sade, 1989), as pipetas mecnicas ou eletrnicas devem ser usadas de rotina, no sendo permitido pipetar material biolgico com a boca. gua e os alimentos no representam materiais biolgicos, porm podem estar contaminados com micro-organismos patognicos. II. OBJETIVO Treinar pipetagens com auxlio de pras ou pipetas mecnicas (pipetador do tipo seringa). III. MATERIAL Pipetas, peras, bquer, gua destilada e papel absorvente.

ANLISE BACTERIOLGICA DA GUA 1 - CONTAGEM DE AERBIOS MESFILOS (CONTAGEM PADRO EM PLACA E SUBSTRATO DEFINIDO) I. INTRODUO

Antigamente aspectos fsicos Avanos da bacteriologia prova concreta de que a gua poderia veicular doenas. Doenas causadas por agentes fsicos, qumicos e microbianos. Doenas infecciosas e parasitrias. Via oral clera, febre tifoide, febre paratifoide disenteria bacilar, disenteria amebiana hepatite infecciosa, poliomielite, helmintose, Tuberculose. Via cutnea esquistossomose, leptospirose conjuntivites, otites, micoses Ensaios: A pesquisa de agentes etiolgicos no usual / problemas. Indicadores de contaminao: Indicadores qumicos: NH3, NO2. Indicadores biolgicos: algumas bactrias ou grupos. Indicadores biolgicos de contaminao da gua: 1-Bactrias heterotrficas aerbias mesfilas 2-Coliformes totais e termotolerantes (fecais) 3-Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis) 4-Pseudomonas aeruginosa 5-Clostrdios sulfito-redutores

M qualidade sanitria da gua Perigo de infeco.

CONTAGEM DE BACTRIAS HETEROTRFICAS (AERBIOS MESFILOS) Bactrias heterotrficas utilizam nutrientes orgnicos e energia qumica derivada de reao de oxidoreduo. Aerbios mesfilos micro-organismos heterotrficos aerbios que crescem bem a uma temperatura mdia de 35C. Indicam a qualidade microbiolgica da gua e alimentos. Nmero elevado sinal que podem existir bactrias patognicas na gua ou alimento analisado. Contagem de bactrias heterotrficas - determinao da densidade de bactrias que so capazes de produzir unidades formadoras de colnias (UFC), na presena de compostos orgnicos contidos em meio de cultura apropriada, sob condies pr-estabelecidas de incubao: 35,0, 0,5C por 48 horas; Importncia da quantificao das bactrias heterotrficas na gua: Acusa um aumento repentino do n de micro-organismos presente num poo ou manancial Verifica a eficincia do tratamento da gua (etapas/todo) Completa as informaes sobre a qualidade da gua de um novo manancial Deve ser realizada em 20% das amostras do S.A.A. (sistema de abastecimento de gua) colhidas para pesquisa de coliformes O limite mximo aceitvel de 500 UFC/mL. Em 20% das amostras mensais para anlise de coliformes totais nos sistemas de distribuio, deve ser efetuada a contagem de bactrias heterotrficas e, uma vez excedidas 500 unidades formadoras de colnia (UFC) por mL, devem ser providenciadas imediata recoleta, inspeo local e, se constatada irregularidade, outras providncias cabveis. 4

II. OBJETIVO Realizar o exame bacteriolgico da gua atravs da: Contagem Padro em Placa e Substrato Definido. 1-CONTAGEM PADRO EM PLACA (CPP): -Diluies seriadas 10-1, 10-2 e 10-3 -Diluente: gua peptonada a 0,1% ou Salina a 0,85% -Inocular em profundidade por meio da tcnica pour-plate em placas e adicionar o gar padro ou nutriente. Depositar 1mL do inculo no centro da placa e adicionar 15 a 20mL do meio de cultura fundido e resfriado a 45C. Realizar movimentos circulares, 8 a 10 vezes, a fim de homogeneizar o inculo. Esperar aproximadamente 15 minutos para solidificar o gar Incubar as placas invertidas, em estufa bacteriolgica a 35C/48h. Proceder a leitura e interpretao das mesmas. Material: Tubos de ensaios de tamanhos variados, placa de Petri, vidro com rolha esmerilhada para coleta de gua, pipetas, bico de Bunsen, gua peptonada estril (ou Salina estril). Meio de cultura: gar para contagem padro (PCA).

Mtodo: Plaqueamento em profundidade (Pour-Plate).

RESULTADO:

CONCLUSO:

2- Substrato Definido (SimPlate)

CONTAGEM GLOBAL EM PLACA

+ 15mL de Plate Count Agar (PCA) liquefeito e resfriado a 45C

9mL de diluente (gua peptonada 0,1% ou salina estril)

+ 15mL de Plate Count Agar (PCA) liquefeito e resfriado a 45C

+ 15mL de Plate Count Agar (PCA) liquefeito e resfriado a 45C

2- TECNOLOGIA DO SUBSTRATO DEFINIDO QUANTIFICAO DE BACTRIAS HETEROTRFICAS GUA SimPlate (IDEXX)O SimPlate tambm pode ser utilizado para contagem de bactrias heterotrficas em gua. Esta metodologia baseia-se no do Substrato Definido, a qual detecta bactrias viveis na gua por meio de enzimas sabidamente presentes nesses micro-organismos. O SimPlate utiliza vrios substratos combinados ao MUG para as mltiplas enzimas bacterianas, que produzem fluorescncia quando metabolizados pelas bactrias heterotrficas presentes na gua. A amostra e o sistema reagente so adicionados na placa SimPlate e incubados. Posteriormente, a leitura feita com o auxlio de uma lmpada de UV, verificando as cavidades fluorescentes. O nmero de cavidades fluorescentes deve ser correlacionado em tabela especfica para a determinao do Nmero Mais Provvel de bactrias heterotrficas / mL de amostra analisada. A tcnica SimPlate corresponde tcnica da contagem padro em gar 35 37C por 48 horas de incubao.

Material:
Tubos com o substrato definido para amostras de 10 mL Placas SimPlate estreis Pipetas de 10mL Incubadora Lmpada UV (365nm e 6 Watts) Tabela especfica

Procedimento de anlise:
1-Adicionar 10mL de amostra ao tubo contendo o meio de cultura; 2-Transferir o contedo do tubo para o centro da placa SimPlate; 3-Fechar a placa e fazer movimentos circulares a fim de espalhar a amostra nas cavidades. Bolhas nas cavidades no interferem no resultado; 4-Inverter a placa e incubar a 35C por 48 horas; 5-Aps 48 horas, retirar as placas da incubadora e contar as cavidades fluorescentes, colocando uma lmpada de UV 365 nm sobre a placa; 6-Observar a contagem correspondente na tabela de converso. Essa tabela utilizada para corrigir a contagem em funo do volume inicial de amostra, j que descartamos o excesso da mesma com o meio de cultura no algodo absorvente da placa.

Observaes:
1-Os procedimentos devem seguir tcnicas asspticas; 2-Amostras contendo cloro devem ser tratadas com tiossulfato de sdio; 3-Caso seja necessrio, os resultados podem ser lidos at 72 horas depois de iniciado a anlise; 4-Depois da incubao, as placas podem conter bactrias viveis, portanto devem ser esterilizadas; 5-Caso necessrio, as amostras podem ser diludas antes da anlise, desde que se obtenha um volume final de 10mL para se transferir para os tubos. O resultado lido na tabela dever, portanto, ser multiplicado pelo inverso da diluio realizada; 6-O resultado obtido na tabela j est ajustado para 1 mL da amostra. Portanto, o resultado o NMP/mL de amostra, com ou sem diluio. III. RESULTADO:

IV.

CONCLUSO:

1. No tubo de ensaio com o meio SimPlate for HPC, adicionar 10mL da amostra de gua. Tampar e agitar para dissolver. 2. Colocar o contedo do tubo no centro da placa do SimPlate. 3. Fazer movimentos circulares, at que preencha todos as cavidades. 4. Inclinar a placa mais ou menos 120, para verter o excesso no algodo absorvente. 5. Inverter a placa e incubar durante 24-48 h, 350,5 C. 6. Contar o nmero de cavidades que apresentar fluorescncia sob lmpada de U.V. 7. Consultar a tabela de N.M.P. do SimPlate, para encontrar o nmero de UFC de bactrias heterotrficas/mL de gua.

2 - PESQUISA QUALITATIVA DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES Bacteriologia convencional para coliformes totais e termotolerantes: Ensaio presuntivo, prova de confirmao, prova completa. Enterobactrias Coliforme (fermentador) No fermentador Bethesda Ballerupi 1. Coliformes coliformes totais (bactrias do grupo coliforme) - bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presena de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produo de cido, gs e aldedo a 35,0 0,5 C em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima -galactosidase. A maioria das bactrias do grupo coliforme pertence aos gneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vrios outros gneros e espcies pertenam ao grupo; coliformes termotolerantes - subgrupo das bactrias do grupo coliforme que fermenta a lactose a 44,5 0,2C em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal; Escherichia coli - bactria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, com produo de cido e gs a 44,5 0,2C em 24 horas; produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, no hidrolisa a uria e apresenta atividade das enzimas galactosidase e glucoronidase, sendo considerada o mais especfico indicador de contaminao fecal recente e de eventual presena de organismos patognicos; Vantagens: Encontram-se normalmente no intestino do homem e de animais de sangue quente (so eliminadas regularmente) Apresentam-se nas excretas, na proporo de 300 milhes de bactrias por grama Apresentam-se em alta prevalncia no esgoto, sendo prontamente isoladas em guas, recentemente poludas por matria fecal So de fcil cultivo e identificao Os testes necessrios so de baixo custo So mais resistentes na gua que as outras bactrias patognicas provenientes das fezes Desvantagem: Reside na existncia de coliformes termotolerantes (fecais) e ambientais, que devem ser diferenciados atravs de provas complementares. Etapas da pesquisa: Ensaio presuntivo para coliformes totais (Teste de Presena ou Ausncia) Caldo lauril sulfato triptose ou Caldo lactosado (enriquecimento) Falso (+) bastonetes aerbios Gram do gnero Bacillus Bastonetes anaerbios Gram do gnero Clostridium Leveduras e fungos filamentosos Sinergismo bacteriano. Ensaio confirmativo para coliformes totais: Meios seletivos e indicadores (Caldo lactosado Biliado Verde brilhante, Teague ou EMB e ENDO) Prova para coliformes termotolerantes (meios seletivos) Caldo E.C. ou C.L.A.B. Repicar as colnias do Teague ou ENDO, ou 1 a 2 alas de platina do C.L.B.V.B. para o E.C. e incubar em B.M. a 44,5 C por 24h. Dos coliformes, s os de origem fecal desenvolvem e produzem gs. 10

II- OBJETIVO: Realizar o ensaio presuntivo, confirmativo e completo para coliformes totais e termotolerantes (fecais) e deste modo, avaliar possvel contaminao da gua por matria de origem fecal. III- MATERIAL E MTODO: Caldo lactosado, Caldo Lauril Sulfato Triptose, Caldo Lactosado Biliado Verde Brilhante, Endo-C gar, Teague e Caldo E.C. Mtodo: Fermentao da Lactose e caractersticas das colnias. OBS : Atualmente, utiliza-se o Caldo lauril Caldo Lactosado Extrato de carne...................................3-5g sulfato triptose (Caldo LST) Peptona ................................................... 5g Meio rico que facilita o crescimento de gua destilada .................. ...............1000mL micro-organismos. Oferece a Lactose como Lactose: 1% fonte de carbono, e ainda o lauril sulfato que Aquecer para dissolver, ajustar pH a 7,4 ou 7,6 e inibe consideravelmente a microbiota filtrar. acompanhante. Distribuir em tubos e esterilizar em autoclave a 121C - 20'. Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2% (*Este meio j fornecido desidratado) Peptona especial .................................10g Modo de preparo: dissolver 40g em 1 litro Lactose ...............................................10g de gua destilada. Autoclavar a 121C por Bile bovina dessecada ........................20g 20'. Depois de esfriar, distribuir nos tubos. Verde brilhante ............................0,0133g Endo-C gar Peptona meat ......................................10g Lactose ...............................................10g Teague ou EMB gar simples ................................ 100mL Lactose ...............................................1g* Eosina 2% ........................................ 2mL Azul metileno 0,5%.......................... 2mL CaldoE.C. Bacto tryptose ............................................... 20g Bacto lactose ................................................... 5g Bacto-bile salts n3 ....................................... 1,5g Phosphate dipotassium .................................... 4g Potassium dihydrigen phosphate .................. 1,5g Cloreto de sdio .............................................. 5g Este meio fornecido desidratado. Caldo Lactosado cido Brico (substitui o E.C.) Proteose peptona ........................................... 10g Lactose ............................................................ 5g Fosfato cido de potssio (K2HPO4) ............ 3,5g Fosfato bicido de potssio (KH2PO4) ......... 1,5g cido brico ............................................... 3,25g

Sulfite de sodium ..............................2,5g Fuscina bsica ...................................0,4g gar..................................................20,0g Preparar uma soluo de lactose a 10% e acrescentar ao meio depois de pronto. Modo de preparo: autoclavar a 121C por 20. Distribuir em tubos.

Modo de preparo: dissolver 37g em um litro de gua destilada e autoclavar a 121C por 20 minutos. Distribuir em tubos. pH final 7,2. Observao: Na falta do caldo E.C. Medium, possvel substitu-lo pelo Caldo Lactosado cido Brico.

Modo de preparo: depois de adicionado em 1 litro de gua destilada, autoclavar a 121C por 20. Distribuir em tubos com o tampo manchado de azul, para que possa ser diferenciado do Caldo Lactosado Simples.

RESULTADO: CONCLUSO:

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3 IDENTIFICAO BIOQUMICA DE ENTEROBACTRIAS (PRESUNTIVO). I IMVIC (Provas Presuntivas de Identificao). 1- gua de peptona Indol Avalia a capacidade da bactria em decompor o Aminocido triptofano e produzir o Indol que relevado pelo Reativo de Kovaks, dando cor rosada ou vermelha ao meio (anel do indol). H2S Avalia a capacidade da bactria em produzir H2S atravs da utilizao de substratos que contm enxofre. revelado pelo precipitado negro que se forma no papel impregnado de acetato de chumbo, acoplado a tampa rosqueada. 2- Clark Lubs (Caldo Glicosado) VM / VP Cultiva-se a bactria em caldo glicosado (Clark Lubs) por 4 dias a 37 C e pelas reaes de VM e VP determina-se qual a via utilizada pelas bactrias para metabolizar a glicose: fermentao cido mista VM cidos + vermelho de metila vermelha (VM +) fermentao butileno glicoltica VP (Voges Proskauer) Acetoina (neutra) + alfa naftol + KOH vermelho fluorescente diacetila. 3- Citrato de Simmons - Citrato Avalia a capacidade da bactria em utilizar o citrato como nica fonte de C. Esta bactria precisa dispor da enzima citrato permease. O Citrato transportado para dentro da clula e vai ser intermedirio no ciclo de Krebs: Citrato
Citrato permease

c. pirvico e CO2 Na2CO3 Alcaliniza o meio

CO2 + Na

do meio

Verde Azul

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Meios de Cultura e Reagentes 01 gua de Peptona: Peptona .................................................. 15g Cloreto de sdio ....................................... 5g gua destilada ................................. 1000mL Ajustar o pH entre 7,4 e 7,6. Distribuir em tubos e esterilizar a 121 C durante 15 minutos. 02 Meio de Clarck & Lubs. Peptona ................................................. 0,5g Fosfato monocido de potssio ............. 0,5g gua destilada ................................... 100mL Autoclavar a 120 C durante 15 minutos. Deixar esfriar e acrescentar e 5 ml de soluo de glicose a 10 % previamente esterilizada por filtrao. Distribuir o meio em tubos de ensaio em pores de 10 mL. 03 gar Citrato de Simmons. (Este meio fornecido desidratado). Fosfato bicido de amnio ...................... 1g. Fosfato monocido de potssio ............... 1g. Cloreto de sdio ...................................... 5g. Citrato de sdio ....................................... 2g. Sulfato de magnsio ............................. 0,2g. Azul de bromotimol ............................ 0.08g gar....................................................... 15g. gua destilada ................................ 1000 mL Fundir o gar na gua destilada. Dissolver os outros componentes e acertar o pH em 6,9. Distribuir o meio em tubos de ensaio em volume suficiente para uma placa de Petri. Autoclavar a 121 C por 15 minutos. 04 Solues de Barrit A . Alfa naftol ............................................... 5g. lcool etlico absoluto ......................... 95ml 05 Soluo de Barrit B. Hidrxido de potssio ........................... 40g. Creatina ................................................ 0,3g. gua destilada .................................. 100mL Dissolver o hidrxido de potssio na gua destilada. 06 Soluo de Vermelho de Metila Vermelho de metila ............................... 0,1g lcool etlico 95 % ........................... 300mL gua destilada .................................. 200mL Dissolver o vermelho de metila no lcool. Acrescentar a gua destilada. 07 Reativo de Kovacs. lcool amlico..................................... 75mL p-dimetilaminobenzaldedo...................... 5g cido cloridrico concentrado ................. 25g Dissolver o p-dimetillaminobenzaldedo no lcool amlico e, a seguir acrescentar o cido cloridrico. 08 Tira de Papel de Filtro impregnada com soluo saturada de Acetato de Chumbo. Preparar uma soluo saturada de acetato de chumbo; Colocar as tiras de papel de filtro em uma placa de Petri grande e molhar as mesmas com a soluo de acetato de chumbo. Levar a placa com as tiras para secar na estufa a 37 C. Transferir as tiras secas para um vidro com tampa de baquelite rosquevel (vidro de maionese). Autoclavar a 121 C por 15 minutos.

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II - Outros meios: Meios c/ multiprovas bioqumicas Pessoa e Silva, BacTray e API 20E No Pessoa e Silva ou Rugai modificado: Tcnica: Com a agulha de platina longa picar a colnia suspeita. A seguir, introduzir no tubo, de modo a perfurar a camada de separao at atingir o meio de cultura inferior do tubo. Voltar a semear em estrias na superfcie inclinada do meio, tampar o tubo com o seu prprio tampo de algodo, incubar por 18-24h a 35-37 C. Aps a incubao, proceder a identificao comparando o tubo com o quadro padro de reaes. Pode-se observar: Produo do indol Produo de H2S Fermentao ou no da glicose e sacarose Desaminao do L triptofano Produo de gs Descarboxilao da L Iisina Hidrlise da Uria (urease) Motilidade Meio de Pessoa e Silva

API BACTRAY

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4 CONFECO DE LMINAS E COLORAO DE GRAM I. INTRODUO O Mtodo de Gram tem como princpio a composio da parede celular bacteriana. Bactrias Gram positivas (roxas) espessa lmina mucopeptdica (retm o iodopararrosanilina) Bactrias Gram negativas (vermelhas) fina lmina mucopeptdica e grande quantidade de lipdeos (retm a colorao de fundo) II. OBJETIVO Preparar as lminas e proceder a colorao de Gram, a fim de comprovar morfolgica e tintorialmente os micro-organismos isolados. MATERIAL Lminas, suportes para lminas, alas de platina, bico de Bunsen. Corantes: Cristal Violeta Fenicada, Lugol, lcool a 95 C, Fucsina Diluda. MTODO: GRAM Corar 1 minuto com sol. de Cristal violeta fenicada. Escorrer o corante e cobrir com lugol durante 1minuto. Lavar a lmina em um filete de gua corrente. Diferenciar com lcool absoluto a 95 (tempo delicado). Lavar em um filete gua corrente. Corar o fundo rapidamente com fucsina diluda (1/10). Lavar, secar e examinar.

III.

CORANTES: Cristal Violeta Fenicada: (Seg. Nicolle). Cristal violeta (ou violeta genciana) ........ 1g lcool a 95.................................. .......10mL Fenol fundido ........................................... 2g gua destilada ................................... 100mL Dissolver num Gral o corante no lcool. Adicionar aos poucos o cido fnico, misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homognea. Juntar a gua, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar aps 24 horas de repouso. Sol. de Lugol: Iodo .......................................................... 1g Iodeto Potssio ......................................... 2g H2O destilada .................................... 300mL * Dissolver os dois sais normalmente com a gua. Fucsina Fenicada (seg. Ziehl). Fucsina Bsica ......................................... 1g lcool a 95............................................ 10g Fenol Fundido .......................................... 5g H2O destilada .................................... 100mL OBS: Compras: dar preferncia para corantes no preparados a partir de fenol. RESULTADO

CONCLUSO

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5 PESQUISA QUANTITATIVA DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES 5.1- COLIMETRIA Determinao do Nmero Mais Provvel de coliformes totais em 100mL de gua (N.M.P.) I. INTRODUO Este mtodo baseia-se no conhecimento do tipo de distribuio das bactrias suspensas num lquido e na teoria das probabilidades. O resultado (NMP) sai em funo da combinao matemtica do nmero de tubos positivos em cada diluio. Na tabela de Hoskins esses clculos j esto prontos e basta comparar a combinao encontrada. Limite de confiana: 95%. A presena de coliformes na gua indica poluio ou contaminao. A ausncia evidncia de gua bacteriologicamente segura. Lembretes: gua com cloro residual: tiossulfato de sdio a 10% (0,1mL/100mL de H2O). gua com metais pesados: EDTA a 15% (0,3mL/100mL de H2O); Interpretao geral dos resultados: gua boa: N.M.P. = zero gua regular: N.M.P. = 2-11 coliformes totais p/100mL de gua. gua m: maior que 11 coliformes totais por 100mL de gua Legislao brasileira: Portaria 518 de maro de 2004. II. OBJETIVO: Colimetria: Determinar o nmero mais provvel de coliformes totais e termotolerantes (fecais) em 100mL de gua. MATERIAL: Bateria de 15 tubos de ensaio com tubos de Durhan, pipetas, bico de Bunsen e vidro com tampa esmerilhada para coleta de gua. Meio de cultura: Caldo Lactosado Biliado Verde Brilhante Mtodo: Fermentao dos tubos mltiplos

III.

IV.

RESULTADO:

V.

CONCLUSO:

Observao: o modo de preparo do meio de cultura utilizado nesta prtica j se encontra descrito em aulas anteriores.

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TABELA DE HOSKINS

Aps verificar os tubos de Caldo Lactosado Biliado Verde Brilhante, repicar os tubos com resultado positivo (turvao e produo de gs) em Caldo EC. Incubar a 44,5C, em banho-Maria, por 24h. Verficar o nmero de tubos postivos neste meio e prosseguir com a determinao do NMP/100mL na mesma Tabela de Hoskins.

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5.2-MEMBRANA FILTRANTE I. INTRODUO

A tcnica da filtrao em membrana torna possvel a determinao mais rpida das densidades de coliformes, utilizando maiores volumes de amostras do que no caso dos tubos mltiplos de fermentao. O processo fornece um resultado direto da concentrao de bactrias, ao invs de uma estimativa matemtica. Neste mtodo, realiza-se uma filtrao a vcuo, utilizando-se de membranas de filtro porosa, na qual as bactrias ficam retidas e sero cultivadas quando aderidas s placas com meios de cultura adequados. Poro da menbrana: 0,45 / Bactrias: 0,8 a 11 Aps a incubao, verifica-se o nmero de UFC/100mL de gua analisada. Pode ser realizado para os coliformes totais e para os Estreptococos fecais. O mtodo tem grande utilidade na vigilncia da gua tratada. * LIMITAES PARA O MTODO: Presena de turbidez (algas e outros materiais capazes de interferir na filtrao). Interferncia de grande nmero de micro-organismos que no seja do grupo coliforme.

* VANTAGENS: Maior preciso que o N.M.P. (resultado direto); Maior sensibilidade, permitindo examinar volumes maiores de gua que o N.M.P; Resultado em tempo mais curto; Filtrao da amostra no campo e envio da placa j com a membrana para o laboratrio de referncia. Objetivo

II.

Realizar o exame bacteriolgico, qualitativo e quantitativo da gua atravs da tcnica da membrana filtrante. III. MATERIAL E MTODO Filtros de acetato de celulose, portas filtros, equipamentos para filtragens a vcuo (bomba de vcuo), placas de millipore, placa de Petri comum, vidro c/ rolha esmerilhada p/ coleta de gua, pinas, lamparinas, lcool e membrana filtrante. Meios de cultura: ENDO-C-AGAR ou E.A.M. (Teague)= Cor Roxa / vinho acastanhado Enterococcus Agar = Cor Branco Amarelado (Estreptococos fecais). MTODO: Filtrao vcuo e bacteriologia. Observao importante: Sempre que mudar a amostra de gua exame, deve-se lavar o porta-filtro c/ gua destilada quente ou de preferncia, utilizar outro porta-filtro, j esterilizado (Autoclave ou Ultravioleta).

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MEIOS DE CULTURA: 01 Endo-C-Agar: Modo de preparo, em aulas anteriores.(ou Teague ) 02 Enterococus Agar: Bacto Tryptose ...................................... 20 g Bacto-Yeast Extract ................................ 5 g Bacto-Dextrose ....................................... 2 g Dipotassium Phosphate ........................... 4 g Sodium Azide ...................................... 0,4 g Bacto-Agar ............................................ 10 g 2,3,5-Triphenil tetrazolium Cl. (cloro trifenil tetrazolium) ............................. .............0,1 g * Este meio nos fornecido desidratado: Modo de Preparo: Dissolver 42 g. em um litro de gua destilada, aquecer em B.M. at ebulio. Aps dissolvido, ajustar pH = 7,2, distribuir em placas. Observao: Aps o crescimento das colnias e interpretao dos resultados, deve-se confeccionar lminas (Gram), a fim de confirmar os resultados encontrados. IV. RESULTADO:

IV.

CONCLUSO:

Observaes: Finalidades da Pesquisa do Grupo Coliforme 1- Fazer o controle de qualidade de guas destinadas: a) ao abastecimento pblico (sem ou com simples desinfeco, ou aps tratamento convencional); b) irrigao de hortalias e plantas; c) recreao de contato primrio (natao, esqui-aqutico, mergulho); d) piscicultura e a ostreicultura; e) dessedentao de animais, f) ao abastecimento industrial (alimento, medicamento), g) ao abastecimento de servios de sade e de alimentao. 2 Fazer o acompanhamento do ponto de vista bacteriolgico, dos sistemas: produtor, distribuidor, de reservao e da rede de distribuio. 3 Para localizar focos de contaminao e realizar sua conseqente eliminao. Finalidades da pesquisa do grupo Enterococcus: Estreptococos (Streptococcus faecalis ou Enterococcus faecalis) Cocos Gram (+), geralmente ocorrem aos pares ou em cadeias curtas, crescem bem na presena de sais biliares, suportam bem a temperatura de 45C, produzem cido a partir de glicose, lactose e do manitol. Vantagens: Fazem parte da microbiota intestinal normal Tcnicas de cultivo so simples e de baixo custo No se multiplicam de ordinrio, fora do intestino Confirmam a origem fecal do coliforme So mais resistentes a ao do cloro. Desvantagem: Esto no intestino, em nmero inferior ao dos coliformes

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5.3- SUBSTRATO CROMOGNICO DEFINIDO (COLILERT- IDEXX) Metodologia do Substrato Cromognico para a determinao do nmero mais provvel de coliformes totais e E. coli, semelhante tcnica descrita no Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 18 e 19 edio. I- Introduo: O teste para coliformes atravs do substrato cromognico utiliza substncias cromognicas hidrolisveis para a deteco de enzimas dos coliformes. Quando a tcnica cromognica usada, o grupo coliforme definido por todas as bactrias possuidoras da enzima B-D-galactosidase e capazes de quebrar o substrato cromognico. Ao contrrio dos mtodos de fermentao da lactose que permitem o crescimento de muitos micro-organismos aerbios e eliminam ou suprimem alguns no coliformes por meio de substncias qumicas inibitrias, esta tcnica contm nutrientes que so mais seletivos e especficos para crescimento de coliformes. O teste pode ser usado qualitativa ou quantitativamente e atualmente, o 3 mtodo de escolha para a determinao de coliformes totais, dependendo da origem da amostra. II- Princpio: Substratos cromognicos, tal como o orto-nitro-fenil-B-D-galactopiranosideo (ONPG), so usados para detectar a enzima B-D -galactosidase, a qual produzida por bactrias coliforme totais. A enzima B-D-galactosidase hidrolisa o substrato (ONPG) e produz a mudana de cor, o que indica e comprova um teste positivo dentro de 24 a 28 horas. OBS: Bactrias no coliformes, tal como Aeromonas sp e Pseudomonas sp, que produzem pequenas quantidades da enzima, so suprimidas e no produziro uma resposta positiva dentro de 28 horas, a menos que estejam presentes mais que 10.000 UFC/mL de amostra. Meio de cultura e seu mecanismo: O Sistema Colilert (IDEXX) composto pelos substratos definidos como ONPG- MUG. Nutrientes para coliformes totais (ONPG): Acar: B-D-galactopiranosdeo Enzima: B-D-galactosidase Radical orgnico cromognico: orto-nitro-fenil. Coliforme Total: hidrlise do ONPG, liberando o orto-nitro-fenol que apresenta colorao amarela; Nutrientes para E. coli (MUG): Acar: B-D-glucurondeo Enzima: B-D-glicuronidase Radical orgnico cromognico: 4-metil-umbeliferil E. coli: hidrlise do MUG, liberando o 4-metil-umbeliferone que produz fluorescncia.

III- Aplicaes: O teste recomendado para as anlises de gua tratada e gua natural. Inicialmente, os laboratrios planejaram usar esse procedimento, procurando determinar se havia reprodutibilidade, quando comparado aos testes padres, obtendo resultados satisfatrios. IV- Interferentes: gua natural contendo matria orgnica ou apresentando cor: deve-se comparar as cartelas incubadas com cartelas contendo apenas a amostra.. OBS: No se usa o teste substrato cromognico para identificar culturas presuntivas de coliformes ou colnias coliformes da membrana filtrante, porque o substrato pode ser parcialmente metabolizado 25

pelo inculo com produo de pequena quantidade de B-galactosidase produzida por no coliformes, causando falso positivo. V- Material: Seladora Quanti-Tray; Cartelas Quanti-Tray: 51 cavidades: faz contagem direta at 200,5 NMP; 97 cavidades de dois tamanhos: faz contagem direta de at 2419 NMP. Frasco estril de 100 mL para coleta de gua; Frasconete com meio de cultura desidratado (contendo substrato ONPG-MUG); Incubadora a 35 C; lmpada UV (365nm e 6 Watts); Tabela especfica.

VI- Tcnica: Adicionar o contedo dos frasconetes (Colilert) em 100 mL da amostra; Agitar o frasco no mnimo25 vezes para homogeneizar micro-organismos, flagelos que poderiam estar aderidos ao frasco; Passar a mistura (100 mL da amostra + Colilert) para a cartela; Introduzir a cartela contendo a mistura na seladora para a selagem; Incubar a cartela por 24 a 28 horas 35 C; Fazer a leitura sob luz natural e lmpada UV. VII- Resultados: Clula transparente na cartela = Clula amarela na cartela = Clula Fluorescente na cartela =

Negativo para coliformes Totais e E. coli Positivo para coliforme total Positivo para E. coli

VIII- Vantagens do Mtodo Colilert atravs da Cartela: Tempo de manipulao: 2 minutos; Deteco simultnea para coliforme total e E. coli; Resultados prontos em 24 horas; Resultados fceis de serem interpretados e no necessitam de confirmao; Deteco de um nico organismo em 100 mL de amostra; Recupera as bactrias lesadas e estressadas. IX- RESULTADO:

X- CONCLUSO:

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6 EXAME BACTERIOLGICO DOS UTENSLIOS DE MESA E DAS MOS I. INTRODUO Muitas vezes adquirimos doenas atravs dos utenslios que utilizamos e/ou dos manipuladores de alimentos. Por isso so muito importantes: Educao Sanitria, Legislao e fiscalizao. Mos e utenslios fazem parte da cadeia esquemtica de transmisso de doenas. Micro-organismos oriundos das vias areas excretas pele Mos Profissionais de sade/ Manipuladores de alimentos Artigos Superfcie, equipamentos e Utenslios de mesa DOENAS

Mos: 1848 Semmelweis importncia da lavagem das mos. Microbiota: Residente: bactrias Gram, que no so facilmente removveis, entretanto podem ser reduzidas por antisspticos. Localizam-se nas fendas das mos, no interior do folculo piloso e principalmente em volta e sob as unhas. So de baixa virulncia. (problema: imunodeprimidos em procedimentos invasivos) Transitria: bactrias Gram e o estafilococo, que so passageiras e viveis apenas por um curto perodo de tempo. Superfcie da pele, junto s gorduras e sujidades (contaminantes). Esta microbiota freqentemente responsvel pelas infeces hospitalares e pode ser reduzida com a lavagem bsica das mos. Profilaxia das doenas veiculadas pelas mos: Educao sanitria e treinamento Exame de sade Observao da GMP, regras bsicas de higiene pessoal e do meio ambiente (lavagem das mos, uso de luvas, acondicionamento e destino correto do lixo...) Lavagem das mos: Bsica: gua corrente e sabo Bsica + antissepsia: gua corrente e sabo; antissptico ou degermante. Materiais necessrios: Sabes; Sabonete; Sabo/sabonete antimicrobiano (barra pequena); Sabo lquido Antisspticos gua corrente (torneiras sensveis a aproximao, de nico toque, acionadas com o joelho) Papel toalha Lixeira com pedal Antisspticos a. Solues degermantes: PVPI a 10% (1% de iodo livre). Clorhexidina a 4% (4% de lcool etlico) b. Solues alcolicas para antissepsia das mos lcool iodado a 0,5% ou 1%, com ou sem 2% de glicerina lcool etlico a 77% v/v, com ou sem 2% de glicerina

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LAVAGEM DAS MOS NA REA DE PRODUO DE ALIMENTOS: Para higienizao das mos nas reas de processamento de produtos crus e cozidos, so necessrios: Sabonete lquido + antissptico ou degermante Papel toalha Lixeira com pedal Torneira com gua potvel. Freqncia: Os funcionrios devem lavar as mos sempre que: Chegar ao trabalho Utilizar sanitrios Tossir, espirrar, assoar o nariz Utilizar panos de limpeza Fumar Recolher lixo e outros resduos Tocar em sacarias, caixas, garrafas e sapatos Tocar em alimentos no higienizados ou crus Pegar em dinheiro Houver interrupo do servio Ao iniciar um novo servio Antes de tocar em utenslios higienizados Antes de colocar luvas Tcnica: Lavar mos e antebraos, friccionando-os por pelo menos 1 minuto.

PROCESSAMENTO DE UTENSLIOS DE MESA: Padres americanos (EUA/Canad) - permitido no mximo 100 bactrias/utenslio de mesa. Profilaxia tcnicas. Lavagem com gua e sabo Enxge desinfeco dos utenslios Fsica: calor gua fervente ou a 80C por 15 Mquina de lavar louas: Lavagem: 55 a 65C Enxge: 80 a 90C. Qumica Cloro a 1% por 30 e enxage Cloro a 0,02% por 60 e secar. lcool 70% - friccionar e deixar secar espontaneamente. OBJETIVOS: Verificar a presena de contaminao bacteriana nas mos e utenslios de mesa atravs do exame bacteriolgico dos mesmos. Avaliar a importncia da lavagem correta das mos. II. MATERIAL

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Utenslios de mesa, mos de voluntrios, tubos de ensaios e de Durhan, estantes, estufa a 37C, pipetas, tubos com 9mL de gua destilada fosfatada estril, placas de Petri, zaragatoa estril, bquer, tubos de ensaio com 4ml de gua tamponada fosfatada estril e bico de bunsen. Meios de cultura: gar Simples, Caldo Lactosado ou LST e Caldo Glicose Azida. (PCA)gar para a contagem padro e Caldo Lactosado preparo aulas anteriores Caldo Glicose Azida Meat extract....................4,8g Peptona from..................10g Casena15g Obs: acrescentar ppura de bromocresol.........0,013g Glicose.7,5g NaCl................................7,5 Azida sdica...................0,2g Se os Estreptococos estiverem presentes ocorre turvao do meio com viragem de cor (roxoamarelo) e surgimento de ppt branco. Para dar continuidade pode-se utilizar do caldo etil violeta azida. Mtodo: diluio seriada, fermentao e plaqueamento em profundidade.

III. RESULTADO

IV. CONCLUSO

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COLETA E PREPARO DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS PARA EXAME MICROBIOLGICO 1-Coleta da amostra: -Constitui a primeira fase da anlise do produto. -Planejar a coleta/remessa de acordo com a possibilidade do laboratrio de executar as anlises. -Colher as amostras, sempre que possvel, em sua embalagem original, e em quantidade nunca inferior a 200g ou 200mL por unidade amostral. -Na impossibilidade de atender o item anterior, a colheita de amostra deve ser feita em condies asspticas. -Deve-se proceder limpeza e a desinfeco da embalagem do alimento a ser analisado, com soluo de lcool iodado ou outro desinfetante, abrangendo uma rea que alcance pelo 10cm da extremidade da abertura. -O acondicionamento da amostra, quando retirada de sua embalagem original, deve ser feito em recipiente ntegro, previamente esterilizado e identificado, capaz de resguardar de qualquer alterao. -As amostras devem ser mantidas em condies que impeam o desenvolvimento de microorganismos, sem, contudo, impedir que estes continuem viveis at o momento da anlise. Assim, os alimentos deteriorveis devem ser mantidos sob refrigerao e os de baixa atividade aquosa (desidratados) em lugar seco e fresco. 2-Tipos de amostras Amostra indicativa: a amostra composta por um nmero de unidades amostrais inferior ao estabelecido em plano amostral constante na legislao especfica. Amostra representativa: a amostra constituda por um determinado nmero de unidades amostrais, estabelecido de acordo com o plano de amostragem. 3 Retirada da amostra Todo o material a ser utilizado para a retirada da amostra dever estar estril, seja por calor seco (estufa a 180C / 2 horas), seja por calor mido (autoclave a 121C / 15 minutos). Todos os procedimentos de anlise devem ser efetuados em condies asspticas (Capela de Fluxo Laminar ou prximo de um bico de bunsen com a chama a meia altura. 4 Preparo das diluies No preparo de diluies sucessivas podem ser utilizados diversos diluentes, tais como: solues de salina peptonada, citrato de sdio, ou salina a 0,85% estril. Para obteno da diluio inicial (1/10) procede-se da seguinte forma: Retirar assepticamente pores de 25g ou 25mL da amostra, colocando-se em homogeneizadores esterilizados. Adicionar 225mL do diluente escolhido. Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida. Posteriormente realizar diluio 1/10, 1/1000.....1/1000000. 5 Solues diluentes 5.1 Soluo salina a 0,85% Cloreto de sdio 8,5g gua destilada 1000mL 5.2 Soluo salina-peptonada Cloreto de sdio 8,5g Peptona 1,0g gua destilada 1000mL 1.3 Soluo de citrato de sdio Citrato de sdio 12,5g gua destilada 1000mL

Para todas as Solues: Dissolver os componentes em gua destilada, distribuir em frascos com volumes apropriados e esterilizar em autoclave a 121C / 15min.

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DILUIES SUCESSIVAS DE AMOSTRAS

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ANLISE DO LEITE I. INTRODUO 1. Leite: conceito: Denomina-se leite sem outra especificao, o produto normal, fresco, integral, oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condies de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas, excluindo o leite de reteno e o colostro. Leite de reteno: o produto de ordenha, a partir do 30 dia antes do parto. Colostro: o produto da ordenha obtido aps o parto. 2. Classificaes: Cru: aquele que no foi submetido ao todo ou em parte s operaes habituais de processamento (filtrao, refrigerao, congelamento ou pr-aquecimento) Pasteurizado: submetido filtrao, aquecimento, refrigerao, incluindo tcnicas para o transporte e distribuio ao consumo. Pasteurizao lenta: aquecimento 63-65C 30 resfriamento brusco* Pasteurizao curta durao: aquecimento 72-75C - 15-20 e resfriamento brusco entre 2 e 5C e envase logo em seguida. Esterilizado (UHT): O leite homoneizado e submetido a 130 - 150C por 2 a 4, resfriado a 32C e envasado assepticamente em embalagens estreis e hermeticamente fechadas. Conserva por 4 a 6 meses. Desidratado- p. 2.1 Classificao do leite pasteurizado (RIISPOA Regulamento de Inspeo Industrial e Sanitrio de Produtos de Origem Animal): Tipo A (leite de granja): a legislao prev, para a produo deste tipo de leite uma srie de recomendaes, dentre as quais, o padro bacteriolgico que deve ser de at 10.000 colnias/ml antes da pasteurizao e de at 500 colnias/ml aps, sendo que os Coliformes devem estar ausentes. Tipo B: o padro bacteriolgico deve ser de at 500.000 de colnias/mL antes da pasteurizao e de at 40.000 colnias/mL aps, sendo tolerado at 2 Coliformes/mL. Tipo C: o padro bacteriolgico chega at mais de 1.000.000 de colnias/mL antes da pasteurizao e deve ser de at 150.000 colnias/mL aps, sendo tolerado at 5 Coliformes/mL. Obs.: veja novas legislaes: ANVISA - Resoluo 12 de 02/01/2001 e MINISTRIO DA AGRICULTURA Inst Normativa n51/2002 3. Composio do leite: O leite de vaca possui as seguintes propores: gua ...................................................... 87% Carboidratos ......................................... 4,9% Lpides.................................................. 3,9% Protenas............................................... 3,2% Alm de vitaminas (B1, B2, niacina, B6, B12, cido pantotnico, cido flico, inositol, cido ascrbico, A, K, E), sais e ons inorgnicos (Ca, Mg, K, PO4, citratos, Cl-, SO4-2), lactatos, bicarbonatos; gases (CO2, O2, nitrognio), hormnios, enzimas (catalase, peroxidase, fosfatase etc.) e elementos em traos (Ba, Sr, Mn, Al, Zn, B, Cu etc.).

Coxiella burnetti bactria intracelular - causa febre Q (febre, dores musculares, cefalia, pneumonite intersticial, malestar - endocardite) leite contaminado ou inalao.
*

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4. Microbiota Bacteriana normal: Quando o leite deixa o bere do animal sadio, o produto contm poucas bactrias, que no vo desenvolver se o leite for obtido e conservado de modo correto. Esta Microbiota constituda pelos micro-organismos existentes no bere clinicamente sadio. Ex.: Streptococcus, Corynebacterium, alm do Lactobacillus, Micrococcus. A microbiota patognica do leite varia de acordo com o grau de contaminao e as fontes contaminantes, inclusive o prprio animal doente. Teoricamente o leite, por sua composio e suas propriedades fsico-qumicas, apresenta condies de albergar vrios agentes patognicos e constitui um importante veculo de transmisso de doenas. Bactrias do esterco, solo, poeira e da gua podem contaminar o leite, principalmente na ordenha manual. A obteno higinica do leite de fundamental importncia porque os micro-organismos contaminantes utilizam seus componentes e deixam metablitos em troca. 5. Vias de contaminao do leite: O leite contm micro-organismos oriundos do interior do bere da vaca e contaminantes provenientes de fontes diversas durante a produo e a manipulao. Muitos micro-organismos so incuos sade e muitos deles so mesmo utilizados em indstria de alimentos. Outros, como os provenientes de contaminao externa ou de doenas do gado podem causar doenas no homem ou alterar significativamente a composio do leite determinando o aparecimento de acidificao, odores indesejveis, espessamentos etc. A obteno higinica do leite de capital importncia, mesmo quando ele se destina parte do seu valor nutritivo, porque os micro-organismos presentes utilizam dos seus componentes e deixam em troca seus produtos metablicos. a) Animal doente ou portador de sujidades. b) Ordenhador (despreparo quanto aos cuidados higinicos; ser ele tambm, doente ou portador). O ordenhador deve ser pessoa que preze a limpeza e portadora de ficha de sanidade, vestir roupa limpa e usar avental e gorro branco. As mos e antebraos devem ser lavados com gua e sabo antes da ordenha, bem como trazer unhas aparadas e no fumar. c) Meio ambiente incluem aqui todos os fatores que possibilitam a introduo de micro-organismos no leite relacionados com o meio ambiente tais como, poeiras, vasilhames mal cuidados, gua de m qualidade usada nas lavagens, moscas, terra, esterco, plos, transporte de lates e equipamentos no higienizados. 6. Acidificao do Leite. A decomposio do leite se d quase que exclusivamente pela ao das bactrias de contaminao que mesmo com a pasteurizao ainda sobrevivem na ordem de 0,1 % da contagem inicial. O que ocorre que o leite vai acidificando at coagular. Em geral, a microbiota causadora da decomposio do leite no patognica para o homem; no entanto, no devemos esquecer das brucelas, M. tuberculosis, Streptococcus grupo A, Staphylococcus aureus e dos bacilos diftricos que podem estar presentes em nmero suficiente para vencer nossas resistncias orgnicas. A acidez do leite para consumo deve apresentar entre 15 a 20 Dornic( D) (pH = 6,6 a 6,8) Acidez superior a 20 D- leite cido (Constituio alterada microbiota bacteriana) Acidez Inferior a 15D leite alcalino (adulterado com gua). 7. Densidade. A densidade normal varia de 1.028 a 1.034. A densidade aumenta com a desnatagem e diminui com a aguagem. A densidade deve ser corrigida para 15 C. Ex.: Leitura de 1.026 a 12 C 15 12 = 3 x 0,2 = 0,6 1.026-0,6 = 1.025,4 Leitura de 1.026 a 30 C 30 15 = 15 x 0,2 = 3,0 1.026 + 3,0 = 1.029 36

8. Fiscalizao Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento DIPOA Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal RIISPOA regulamento de Inspeo Industrial e Sanitria de Produtos de Origem Anima, incluindo os decretos 1812/96; 2244/97. Instr normativa n 51, de 18/09/2002 Regul tcnico de produo, identidade e qualidade do leite. Instru. Normativa n62, de 2011, do MAPA (altera a Instr. Normat. 51/2002/MAPA). Ministrio da Sade ANVISA - Resoluo N 12, de janeiro de 2001. RIISPOA Regulamento de Inspeo Industrial e Sanitria de Produtos de Origem Animal Artigo 475 conceito. Denomina-se leite, sem outra especificao, o produto normal, fresco, integral, oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condies de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. Artigo 476 Considera-se leite normal, o produto que apresenta: 1. Caracteres normais; 2. Teor de gordura mnimo de 3% (trs por cento); 3. Acidez em graus Dornic entre 15-20D (quinze e vinte); 4. Densidade a 15C (quinze graus centgrados), entre 1.028 e 1.034; 5. Lactose mnimo de 4,3% (quatro e trs dcimos por cento); 6. Extrato seco desengordurado mnimo 8,5% (oito e cinco dcimos por cento); 7. Extrato seco total mnimo 11,5% (onze e cinco dcimos por cento); 8. ndice crioscpio mnimo -0,55 (menos cinqenta e cinco graus centgrados); 9. ndice refratomtrico no soro cprico a 20C (vinte graus centgrados) no inferior a 37 Zeiss. Artigo 543 Considera-se fraudado, adulterado ou falsificado o leite que: 1. For adicionado de gua; 2. Tiver sofrido subtrao de qualquer dos seus componentes, exclusive a gordura nos tipos C e magro; 3. For adicionado de substncias conservadoras ou de quaisquer elementos estranhos sua composio; 4. For de um tipo e se apresentar rotulado como de outro de categoria superior; 5. Estiver cru e for vendido como pasteurizado; 6. For exposto ao consumo sem as devidas garantias de inviolabilidade. Artigo 517 Entende-se por pasteurizao o emprego conveniente do calor com o fim de destruir totalmente a microbiota patognica sem alterao sensvel da constituio fsica e do equilbrio qumico do leite, sem prejuzo dos seus elementos bioqumicos, assim como de suas propriedades organolpticas normais.

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EXAME BACTERIOLGICO DO LEITE CONTAGEM DE AERBIOS MESFILOS E COLIMETRIA

I- INTRODUO b)Contagem total de aerbios mesfilos: Quando se juntam um inculo de leite com certa quantidade de determinado meio de cultura em uma placa de petri e se incuba esta placa num perodo de tempo e temperatura de incubao adequados, surgiro colnias de micro-organismos que podero ser contadas. Utiliza-se o leite em diluies decimais crescentes para que as colnias cresam bem separadas, facilitando assim, a contagem. Esse o mtodo considerado mais exato para avaliar o contedo bacteriano total do leite, embora seja caro, demore bastante (24 a 48 h de incubao das placas) e exija pessoal tcnico treinado. c)Determinao quantitativa do grupo de Coliformes: Consiste em detectar na amostra do leite, determinado grupo de bactrias os Coliformes que podem ser de origem fecal. No Brasil, a Colimetria feita apenas no leite pasteurizado a fim de se avaliar a eficincia da pasteurizao bem como os cuidados higinicos e sanitrios da indstria. Uma amostra de leite colhida no varejo, que apresenta uma contagem de bactrias alta e nmero elevado de Coliformes, pode significar o seguinte: leite no foi corretamente pasteurizado leite foi corretamente pasteurizado, mas a conservao posterior foi inadequada em relao a temperatura e/ou tempo (distribuio/armazenamento) leite foi corretamente pasteurizado, mas a contagem inicial do produto cru era excessivamente alta. leite foi pasteurizado corretamente, mas ocorreu uma recontaminao nos processos finais de empacotamento. IIOBJETIVO Determinar o N.M.P. de Coliformes totais e realizar a contagem total dos mesfilos para a amostra de leite dada. MTODO Mtodo: Descoramento do azul de metileno; diluio seriada, fermentao dos tubos mltiplos e desenvolvimento de colnias. Tcnica: ver ilustrao.

III-

IV- RESULTADO

V-

CONCLUSO

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TABELA DE NMP (Alimentos em geral) NMP por grama ou mililitro de amostra Semeando pores de 1 0,1 0,01 em cada tubo N de tubos positivos 0,1 0,01 0 0 0 1 0 2 0 3 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 NMP 0,0 0,3 0,6 0,9 0,3 0,61 0,92 1,2 0,62 0,93 1,2 1,6 0,94 1,3 1,6 1,9 0,36 0,72 1,1 1,5 0,73 1,1 1,5 1,9 1,1 1,5 2,0 2,4 N de tubos positivos 0,1 0,01 0 0 0 1 0 2 0 3 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 NMP 0,91 1,4 2,0 2,6 1,5 2,0 2,7 3,4 2,1 2,8 3,5 4,2 2,9 3,6 4,4 5,3 2,3 3,9 6,4 9,5 4,3 9,5 12,0 16,0 9,3 15,0 21,0 29,0 24,0 46,0 110,0 >110,0

1,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1,0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 3 0 1,6 3 3 0 1 3 1 2,0 3 3 1 1 3 2 2,4 3 3 2 1 3 3 2,9 3 3 3 Fonte: Manual de anlises microbiolgicas de alimentos. 1.ed. FDA Washington.

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CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS Os fungos e leveduras provocam alteraes nos alimentos de origem animal e vegetal, principalmente quando armazenados temperatura ambiente. importante relatar que alguns gneros de fungos como, por exemplo, os Aspergillus, alm de danos fsico-qumicos nos alimentos, podem causar tambm problemas srios para a sade dos homens e animais, pois so responsveis pela produo de Aflatoxinas. Fungos filamentosos e leveduras so capazes de se desenvolverem em produtos com baixa atividade de gua (0,80 e 0,88). Algumas leveduras so osmoflicas e alguns fungos filamentosos so xeroflicos, sendo capazes de se multiplicarem em produtos com menor atividade de gua (cerca de 0,62); o grupo, portanto, de importncia em alimentos conservados pelo uso do acar, do sal e desidratados. Estes micro-organismos crescem dentro de uma ampla faixa de pH (2,0 e 8,5), tornando o grupo importante tambm para produtos cidos (frutas e produtos de frutas, conservas cidas, vegetais fermentados e outros). A temperatura tima de crescimento est entre 25 e 30C. Espcies psicrotrficas, especialmente de fungos filamentosos, so problemas como deteriorante de produtos refrigerados e congelados (carnes e derivados e produtos de laticnio). Em decorrncia da atividade pectinoltica e celuloltica de muitas espcies de fungos filamentosos, este grupo est freqentemente associado deteriorao de vegetais. Fungos filamentosos (bolores) So multicelulares e obtm sua alimentao de matria orgnica inanimada ou nutrem-se, como parasitas de hospedeiros. Esto bem difundidos na natureza (solo, ar, gua e matria orgnica em decomposio). Alguns so benficos ao homem, auxiliando na indstria alimentcia (maturao de queijosfermentao) e na indstria farmacutica (produo de antibiticos). Outros so prejudiciais, causando doenas em vegetais, animais e em humanos, e dentro deste grupo encontram-se aqueles produtores de micotoxinas. Leveduras (fungos no filamentosos) Como os fungos filamentosos, certas leveduras so benficas, sendo utilizadas na produo de pes, cervejas, vinhos e outras bebidas alcolicas em geral; na sntese de certas vitaminas, e outros produtos; entretanto existem aquelas que deterioram alimentos ou provocam doenas nos vegetais e animais. Estes fungos no filamentosos esto bem difundidos na natureza, sendo disseminados por insetos vetores, pelo vento e pelas correntes areas. Significado nos alimentos: A presena de fungos filamentosos e leveduras viveis e em ndice elevado nos alimentos, pode fornecer informaes, tais como, condies higinicas deficientes de equipamentos; multiplicao no produto em decorrncia de falhas no processamento e/ou estocagem; matria prima com contaminao excessiva.

Cultura: Os meios de cultura mais indicados so o gar batata dextrose (Potato Dextrose Agar) PDA acidificado ou PDA antibiticos ou ainda, PCA suplementado com 100mg/L de cloranfenicol. Recomenda-se que seja realizado o plaqueamento em superfcie, o que permite uma mxima exposio ao ar, benfica para os bolores (aerbios em sua maioria). As placas, aps semeadura com diluies apropriadas, so incubadas a 22 2C durante 03 a 05 dias, dependendo da quantidade de colnias desenvolvidas. No inverter as placas. So escolhidas para a contagem, placas apresentando entre 30 e 100 colnias. 42

Material -gua peptonada a 0,1% -gar Batata Dextrose (acidificado ou Suplementado com antibiticos). -Soluo aquosa de cido tartrico a 10% estril (utilizar 1mL para cada 100ml de meio) -Soluo de antibiticos (dissolver assepticamente 500mg de clorotetraciclina-HCL e -500mg de cloranfenicol em 100mL de tampo fosfato pH 7,2 estril, estocando em frasco escuro, sob refrigerao. Uma parte do material fica em suspenso, devendo ser agitado no momento do uso). -Soluo Tampo Fosfato pH 7,2: utilizar 34,0 g de KH2PO4 para 500mL de gua destilada, acertar o pH em 7,2 com NaOH a 1N (aproximadamente 175mL) e completar o volume com gua destilada para 01L. Esterilizar a 121C/15min e estocar em geladeira. Mtodo: -Diluio seriada e plaqueamento em superfcie. Tcnica: a) retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar as diluies sucessivas. b) inocular, em duplicata, 1,0mL de cada diluio em placas contendo o meio de cultura. c) espalhar com auxlio de ala de Drigalski. d) incubar as placas a 20-25C por 3 a 5 dias.

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PESQUISA DE PSEUDOMONAS SPP.

I INTRODUO As Pseudomonas so bastonetes Gram (-), no fermentadores de lactose. Pertencem famlia pseudomonadaceae e constituem bacilos retos ou curvos, mveis com flagelo polar. So catalase e oxidase positivas. Esto amplamente distribudas na natureza, podendo ser encontradas em alimentos de origem animal e vegetal. A P. aeruginosa produz substncias txicas e patgeno oportunista. As pseudomonas so importantes em alimentos devido a sua intensa atividade metablica, sendo capazes de utilizar uma grande variedade de compostos orgnicos, alm de produzirem pigmentos hidrossolveis, enzimas proteolticas e lipolticas. Em aves evisceradas, mantidas a 10C ou abaixo, a deteriorao ocorre, principalmente por Pseudomonas e leveduras (Torulopsis e Rhodotorula). Odores so comuns em pedaos de frangos refrigerados, causados particularmente por Pseudomonas spp, embora espcies de alcaligenes tambm possam estar envolvidas. O uso de Pseudomonas aeruginosa como um indicador de contaminao fecal tem sido sugerido. A presena deste micro-organismo no trato intestinal das pessoas, assim como suas caractersticas fisiolgicas, levam a um possvel indicador de contaminao fecal. A Pseudomonas utilizada no controle de qualidade de guas minerais e de guas de servios de sade, UAN, servios de alimentao, indstrias de alimentos, medicamentos e cosmticos. II TCNICA 1 1- Filtrar 100mL da amostra ou do rinse (amostras slidas) em membrana de filtro porosa de 0,45m 2- Enriquecer o material retido na membrana em 100mL de Caldo BHI adicionado de nitrofurantona 35-37C / 24 horas. 3- Repicar para o gar Cetrimide e incubar a 42C / 18 a 24 horas. Colnias caractersticas de Pseudomonas podem desenvolver-se neste meio, nesta temperatura. 4- Realizar o teste da Oxidase atravs de tiras reagentes e verificar o crescimento em Meio OF. 5- Identificar atravs de provas bioqumicas o micro-organismo isolado (Sistema API e/ou BacTray). II TCNICA 2 1- Filtrar 100mL da amostra ou do rinse (amostras slidas) em membrana de filtro porosa de 0,45m 2- Acplar a membrana a uma placa de gar Cetrimide e incubar a 35-37C / 24 horas. Colnias caractersticas de Pseudomonas podem desenvolver-se neste meio. 4- Realizar o teste da Oxidase atravs de tiras reagentes. 5- verificar a hidrlise da casena em gar Leite P. aeruginosa.

Comportamento do micro-organismo Caldo turvao difusa com pelcula superficial, que posteriormente deposita. gar induto mido e brilhante. Culturas abandonadas h alguns dias a temperatura ambiente pigmentao de cor azul a esverdeado: Piocianina azul-esverdeado Fluoresceina ou pioverdina amarelo esverdeado fluorescente.

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PESQUISA DE SALMONELLAS SPP.

I INTRODUO O gnero Salmonella pertence famlia enterobactericeae e compreende bacilos gram negativos no produtores de esporos. So anerbios facultativos, produzem gs a partir de glicose (exceto S. typhi) e so capazes de utilizar o citrato como nica fonte de carbono. No fermentam a lactose. A maioria mvel, atravs de flagelos peretrquios, exceo feita S. pullorum e S. gallinarum, que so imveis. As Salmonellas spp so provenientes das prprias matrias-primas contaminadas, das tcnicas de processamento e tambm de manipuladores portadores intestinais do agente. Seu habitat natural o trato intestinal de seres humanos e dos animais. As doenas causadas por Salmonella podem ser dividas em trs grupos: -febre tifide, causada por S. typhi, que apresenta sintomas muito graves como septicemia, febre alta, diarria e vmito. -febres entricas, causadas por Salmonella paratyphi (A, B, e C), que so semelhantes febre tifide, porm com sintomas mais brandos -enterocolites (ou Salmoneloses), causadas pelas demais salmonelas, que caracterizam por diarria, febre, dores abdominais e vmitos. II TCNICA A metodologia empregada para a deteco de Salmonella spp, em alimentos, utiliza basicamente, as seguintes etapas: - pr-enriquecimento- - no qual recupera micro-organismos injuriados - enriquecimento seletivo - para favorecer a multiplicao das salmonelas e inibir ou restringir o desenvolvimento de outros micro-organismos presentes - plaqueamento seletivo - plaqueamentoem meios seletivos e indicadores, utilizando-se de meios slidos que tenham efeito inibidor da microbiota acompanhante, e que forneam indicaes, das colnias suspeitas do gnero Salmonella - Confirmao - Provas bioqumica das colnias, utilizando-se de meios que forneam indicaes sobre as caractersticas bioqumicas do micro-organismo TSI/LIA). provas bioqumicas complementares, para a comprovao do gnero Salmonella - provas sorolgicas para a caracterizao sorolgica da Salmonella. Tcnica de anlise: 1- 25mL ou 25g da amostra so adicionados a 225mL do diluente (gua peptonada tamponada 1%), realizando a homogeneizao. Posteriormente, incuba-se este a 35C / 24 horas. 2- Aps este tempo, sero transferida, em triplicatas, alquotas de 10mL do pr-enriquecimento para 90 mL de caldo selenito-cistina e tetrationato, que ser Incubado a 43C / 24 horas em banho-maria. 3-A partir do enriquecimento seletivo, repica-se os tubos positivos para o gar Rambach e SS ,fazendo-se estrias com auxlio de ala de platina. O meio ser incubado a 35-37C / 24 horas. 4- Transcorrido o perodo de incubao do plaqueamento seletivo, repicar as colnias suspeitas de Salmonella com auxlio da ala de platina, fazendo estrias na parte inclinada e inoculao em profundidade nos meios: gar TSI e gar lisina-ferro. 5- As colnias dos tubos que apresentarem crescimento sugestivo de Salmonella devem ser identificadas atravs de provas bioqumicas e sorolgicas. Princpios: No meio de Rambach, as colnias de Salmonella spp. so vermelhas, enquanto que S. typhi e S. paratyphi A, Proteus spp. e Shigella spp., apresentam-se incolores. Os Coliformes desenvolvem cor azul (E. coli, Citrobacter ) ou violeta azuladas (Klebsiella ).

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No SS, as colnias suspeitas de Salmonella so incolores, transparentes com ou sem o centro negro. No Hectoen, as cols de Salmonella so verde-azuladas com ou sem centro negro. No TSI, as Salmonella produzem H2S e gs; o pice do meio fica amarelo (cido - fermentao da dextrose); e a superfcie inclinada fica vermelha (no ferm da lactose e sacarose) No LIA, a maioria das Salmonella intensifica o violeta e produz H2S (fundo e rampa prpura com ou sem produo de H2S).

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PESQUISA E CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS SP

I INTRODUO Os Staphylococcus so cocos gram positivos, que se agrupam em forma de cacho de uva, no esporulados e imveis. Algumas cepas so produtoras de toxina e patognicas. So bactrias anaerbias facultativas, porm crescem melhor em condies aerbias. Tm como habitat natural as cavidades nasais, garganta e trato intestinal. Produtos de origem animal industrializados, carnes, ovos, leite, queijo pescado, massas alimentcias, cremes, maionese, doces de confeitaria com ou sem recheio so os alimentos mais propcios ao seu desenvolvimento. A intoxicao por Staphylococcus produzida pela sua toxina, que termorresistente. O perodo de incubao geralmente de 2 a 4 horas aps a ingesto do alimento contaminado. Os principais sintomas so: nuseas, diarria, contraes abdominais e cefalia. A durao de 1 a 2 dias. A presena de Staphylococcus sp nos alimentos interpretada, em geral, como indicativo de contaminao a partir da pele, boca, e das fossas nasais dos manipuladores de alimentos, bem como da limpeza e da sanificao inadequada dos materiais e dos equipamentos. II TCNICA 1- 25mL ou 25g da amostra so homogeneizadas com 225mL do diluente e a partir desta diluio inicial, faz-se as demais diluies 10-1, 10-2 e 10-3. 2- 0,1mL do material inoculado no meio de Baird Parker e espalhado uniformemente sobre a superfcie com auxlio de ala de Drigalsky. 3- As colnias tpicas sero contadas e identificadas atravs das provas bioqumicas auxiliares como coagulase, catalase e DNase. 4- Repicar as colnias tpicas para o caldo BHI e incubar a 35C / 24horas. 5- Prova da Coagulase: 0,3ml da cultura em caldo BHI sero juntados a 0,5 ml de plasma de coelho e incubados em Banho-maria a 37C / 1-4 horas (esta prova verifica a capacidade de certos microorganismos produzirem a coagulase, ou seja, coagular o plasma). 6- Prova da Catalase: a partir da cultura em caldo BHI, coloca-se uma gotcula deste inoculo numa lmina de microscpio e gotejar gua oxigenada. Observar o desprendimento de bolha (catalase positiva). 7- Transferir o tubo com crescimento em caldo BHI para o Banho-maria a 100C, mantendo por 15minutos. Transferir uma alada para o orifcio do gar azul de toluidina-DNA. Incubar a 35-37C / 1-4 horas. O aparecimento de um halo rosa ao redor do orifcio inoculado indica a presena da nuclease (DNase), caracterstica marcante para a identificao do S aureus. 8- OBS: As colnias tpicas de Estafilococos que se desenvolverem no gar Baird Parker podem ser tambm repicadas para o gar Chapman, pois neste meio crescem somente micro-organismos que possuem elevada tolerncia ao NaCl. Os S. aureus so diferenciados neste meio atravs dos seguintes critrios: degradao do manitol, produo de gelatinase, e formao de pigmento amarelo dourado (algumas cepas desenvolvem colnias de cor branca). Princpios: As colnias caractersticas de S. aureus no Baird Parker so negras, lustrosas, convexas, com 1 a 5 mm de dimetro, rodeadas por halo claro de 2 a 5 mm de largura. A formao de colnias negras circundadas por halo devida a reduo do telurito a telrico, e a liplise e protelise da gema,

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respectivamente.

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PESQUISA E CONTAGEM DE CLOSTRDIOS SULFITO-REDUTORES

O C. perfringens um bastonete reto, gram positivo, formador de esporos ovais, subterminais, A temperatura tima de crescimento 46C, crescendo no intervalo de 20 a 50C. Pode ser encontrado no solo, sedimentos marinhos, fezes e ferimentos. Sua presena no rara em carnes cruas, aves, sopas desidratadas, vegetais crus, etc. No alimento pode ser encontrado na forma esporulada ou vegetativa. A forma esporulada resistente ao frio e a temperaturas elevadas. A forma vegetativa destruda por temperaturas baixas e altas, sendo, porm a forma que causa toxinfeco alimentar quando em nmero elevado (acima de 103/g). Cabe assinalar que este micro-organismo no altera o produto de forma a ser perceptvel pelos caracteres organolpticos nas quantidades capazes de provocar toxinfeco alimentar. Nos meios de cultura especficos, os Clostrdios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro e precipita na forma de sulfeto de ferro, produzindo colnias pretas. Material: gua salina peptonada gar TSC Caldo BHI Perxido de hidrognio 3% Sistema de gerao de anaerobiose Estufas reguladas a 46C e 35C. Mtodo: Diluio seriada, plaqueamento em superfcie Identificao bioqumica, morfolgica e tintorial Tcnica: Esquema geral de anlise a) 25g ou 25mL da amostra so homogeneizados com 225mL gua salina peptonada. b) Realiza-se a diluio seriada at 10-3, utilizando tubos com 9,0mL de gua salina peptonada. c) Inocula-se as diluies em placas contendo gar Triptose Sulfito Cicloserina. d) Incuba-se a 46C por 24h, em jarra e kit para anaerobiose. e) Colnias pretas tpicas so quantificadas e repicadas posteriormente para o Caldo BHI e incubadas a 35C/24h. f) Realiza-se o teste da catalase (+) e Colorao de gram.

gua salina peptonada (H2Osp): NaCl Peptona gua destilada Autoclavar a 121C/15min. 8,5g 1,0g 1,0L Obs: para produtos gordurosos, utilizar 10,0g de Tween 80 para cada litro da soluo no momento do preparo.

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Bastonetes Gram positivos roxos Cl. Perfringens esporos ovais Cl. Botulinum esporos semelhantes raquete

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MINISTRIO DA SADE PORTARIA N. 2914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011 Dispe sobre os procedimentos de controle e de vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade

RESOLUO- RDC n 12, de 02 de janeiro de 2001. Regulamento tcnico sobre padres microbiolgicos para alimentos Leite de bovinos e de outros mamferos e derivados: Grupo de Tolerancia para Micro-organismo alimentos amostra indicativa a) Leite coliformes a 45C/mL 4 pasteurizado Salmonella sp/25 mL Ausente No deve apresentar micro-organismos patognicos e Aps 7 dias de causadores de incubao a 35-37 C alteraes fsicas, (embalagem fechada) qumicas e organolpticas do produto

Tolerancia paa amostra representativa n c m M 5 1 2 4 5 0 Aus -

b) Leite UHT

n: nmero de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente; c: nmero mximo aceitvel de unidades de amostras com contagens entre os limites m e M; m: separa o lote aceitvel do produto ou lote com qualidade intermediria aceitvel; M: separa o produto aceitvel do inaceitvel. Valores acima de M so inaceitveis.

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MINISTRIO DA AGRICULTURA INSTRUO NORMATIVA N 51, DE 18 DE SETEMBRO DE 2002 REGULAMENTO TCNICO DE PRODUO, IDENTIDADE E QUALIDADE DO LEITE Alterada pela INSTRUO NORMATIVA N 62, DE 29 DE DEZEMBRO DE 2011

Regulamento Tcnico de Produo, Identidade e Qualidade do Leite tipo A, o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Leite Cru Refrigerado, o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Leite Pasteurizado e o Regulamento Tcnico da Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu Transporte a Granel (apenas leite de vaca)
Leite Cru tipo A

Contagem Padro em Placas (UFC/mL) ** Contagem de Clulas Somticas(CS/mL)

Mx.. 1x104 De 01.1.2012 at 30.6.2014 4,8 x 105 A partir de 01.7.2014 at 30.6.2016 4,0 x 105 A partir de 01.7.2016 3,6 x 105

Leite Pasteurizado tipo A

Contagem Padro em Placas (UFC/mL) ** Coliformes - NMP/mL (30/35oC)** Coliformes - NMP/mL (45oC)** Salmonella spp/25mL**

n 5 5 5 5

c 2 0 0 0

m 5,0x102 m<1 ausncia ausncia

M 1,0x103

**Padres microbiolgicos a serem observados at a sada do estabelecimento industrial produtor Nota n (5): imediatamente aps a pasteurizao, o leite pasteurizado tipo A deve apresentar enumerao de coliformes a 30/35 C (trinta/trinta e cinco graus Celsius) menor do que 0,3 NMP/ml (zero vrgula trs Nmero Mais Provvel/mililitro) da amostra. Leite Cru Refrigerado
ndice medido (por A partir de 01.7.2008 A partir A partir de 01.7.2014 A partir de 01.7.2016 propriedade rural ou At 31.12. 2011 de01.01.2012 at at 30.6.2016 Regies: S / SE / CO por tanque Regies: S / SE / CO 30.6.2014 Regies: S Regies: S / SE / CO A partir de 01.7.2017 comunitrio A partir de 01.7.2010 / SE / CO A partir de A partir de 01.7.2015 Regies: N / NE at 31.12.2012 01.01.2013 at a 30.6.2017 Regies: Regies: N / NE 30.6.2015 Regies: N N / NE / NE Contagem Padro em Placas (CPP), expressa em UFC/mL (mnimo de 01 Mximo de 7,5 x 105 Mximo de 6,0 x 105 Mximo de 3,0 x 105 Mximo de 1,0 x 105 anlise mensal, com mdia geomtrica sobre perodo de 03 meses) Contagem de Clulas Somticas (CCS), expressa em CS/mL (mnimo de 01 Mximo de 7,5 x 105 Mximo de 6,0 x 105 Mximo de 5,0 x 105 Mximo de 4,0 x 105 anlise mensal, com mdia geomtrica sobre perodo de 03 meses)

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Leite Pasteurizado

Contagem Padro em Placas (UFC/mL) ** Coliformes - NMP/mL (30/35oC)** Coliformes - NMP/mL (45oC)** Salmonella spp/25mL**

n 5 5 5 5

c 2 2 1 0

m 4,0x104 2 1 ausncia

M 8,0x104 4 2

Testes Enzimticos: prova de fosfatase alcalina Negativo prova de peroxidase: Positiva Imediatamente aps a pasteurizao (leite pasteurizado tipo A ou leite pasteurizado) o produto assim processado deve apresentar teste negativo para fosfatase alcalina, teste positivo para peroxidase e coliformes 30/35C menor que 0,3 NMP/ml (zero vrgula trs Nmero Mais Provvel /mililitro) da amostra.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS APHA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for examination of water and wastewater. 18HT Edition. Washington, 1992. BEHMER, M.L.A. Tecnologia do leite. 15.ed. So Paulo: Nobel, 1984. BRASIL. ANVISA. RDC n12 Regulamento tcnico sobre padres microbiolgicos para alimentos. Braslia: ANVISA, 2001. BRASIL. ANVISA. Resoluo RDC n 216, de 15 de setembro de 2004. Regulamento tcnico de boas prticas para servios de alimentao. Braslia: D.O.U. - Dirio Oficial da Unio; Poder Executivo, de 16 de setembro de 2004. BRASIL. ANVISA. Resoluo RDC n 306, de 07 de dezembro de 2004. Regulamento tcnico para o gerenciamento de resduos de servios de sade. Braslia: D.O.U. - Dirio Oficial da Unio; Poder Executivo, de 10 de dezembro de 2004. BRASIL. Ministrio da Agricultura. Regulamento da inspeo industrial e sanitria de produtos de origem animal. Braslia, DF, 1980. BRASIL. MINISTRIO DA SADE. Lavar as mos: informaes para profissionais de sade. Braslia: Centro de Documentao do Ministrio da Sade, 1988. BRASIL. MINISTRIO DA SADE. Manual de processamento de artigos e superfcies em estabelecimentos de sade. Braslia, [1994?]. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria MS n 518, de 25 de maro de 2004. Norma de qualidade da gua para consumo humano. Braslia: Ministrio da Sade, 2004. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria MS n 2914, de 12 de dezembro de 2011. Procedimentos de controle e de vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade. Braslia: Ministrio da Sade, 2011. CARDOSO, W. M; SILVA, G. G.; CANO, V. Anlise microbiolgica de alimentos. MercK. 2ed, Rio de Janeiro, 1989. COOPERATIVA CENTRAL DE LATICNIOS ESTADO DE SO PAULO. Manual de laboratrio: anlise do leite in natura. So Paulo, verso de 11/08/95. FRANCO, B. D. G. M. & LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. So Paulo: Atheneu, 2002. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3.ed. So Paulo, 1985. SILVA, N ; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. So Paulo: Varela, 2001. SILVA, N.; CANTSIO NETO, R.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica da gua. So Paulo: Varela, 2005. SIQUEIRA, R.S. Manual de microbiologia de alimentos. Braslia: EMBRAPA-MERCK, 1995.

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