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Caracterizao da cintica da reao de hidrlise do pnitrofenil acetato a p-nitrofenol na ausncia e presena da enzima -quimiotripsina, efeito da temperatura e do pH

A. Alves Rodrigues A. I. Alves dos Reis Almeida B. N. Santana Pinto V. Leite

RESUMO: Para estudar a hidrlise do p-nitrofenil acetato (PNPA) a p-nitrofenol (PNP) em presena e ausncia
da enzima -quimotripsina (-CT), foram variados alguns parmetros para determinar as melhores condies da hidrlise, como pH em 7,4 e 10,0 e a temperatura em 25C, 35C 45C e 60C. Para fins comparativos foram feitas anlises com solues de tirosina (Tyr) e triptofano (Trp). Analisou-se a cintica da reao atravs de duas tcnicas; a espectrometria de absoro UV/Vis e fluorescncia. Com os resultados obtidos por essas tcnicas, foi estimada a energia de ativao para o pH 7,4 e 10, a ordem da reao, a velocidade mxima (Vmx) para a reao catalisada e a temperatura de desnaturao da -CT. As temperaturas de desnaturao encontradas foram T = 48,10,428 C para pH 7,4 e T = 48C para pH 10. Para pH 7,4 sem enzima Ea = 62 kJ/M , com enzima Ea = 22 kJ/M; para o pH 10,0 sem enzima Ea = 8,6 kJ/M, com enzima Ea = 28 kJ/M. A reao de primeira ordem.

PALAVRAS CHAVE: -quimiotripsina, PNPA, PNP, Cintica, pH e Temperatura

I. INTRODUO O objetivo da pesquisa realizar um estudo a respeito da hidrlise do PNPA a PNP considerando o efeito da temperatura e do pH. A fim de analisar a eficincia da -CT como catalizador foi feita a reao na presena e ausncia dessa enzima. A hidrlise do PNPA para PNP ocorre quando uma molcula de gua ataca o carbono da carbonila do PNPA, gerando por fim uma molcula de lcool e um cido carboxlico [Figura 1] [1].

Figura 1 Reao de hidrlise de um ster a acido carboxlico Essa reao influenciada pelo pH do meio e pela temperatura. Quando o pH 7 temos mais ons hidrxidos disponveis no meio, de forma que a reao deslocada no sentido dos produtos, logo a velocidade da reao aumenta. Com aumento da temperatura do sistema as molculas adquirem mais energia cintica, o que aumenta o choque entre elas, consequentemente h maior formao de produtos e aumento da velocidade de reao. A -CT uma protena encontrada no intestino bovino, composta por 245 aminocidos [2] e massa molar de 24800 g/mol [3]. Seu pH de funcionamento timo 8. Essa protena capaz de clivar ligaes peptdicas entre aminocidos, onde pelo menos um deles tenha cadeia lateral aromtica. A -CT tambm pode ser empregada para catalisar reaes de hidrlise de p-nitrofenil steres [3]. Por ser uma protena a -CT tem uma estrutura tridimensional que mantida por interaes fracas do tipo ligaes de hidrognio, pontes dissulfeto, interaes hidrofbicas, foras de van der Waals e interaes eletrostticas (pares inicos), as quais podem ser rompidas por agentes desnaturamtes, como o pH, temperatura e estresse mecnico. Com o aumento da temperatura a velocidade de vibrao molecular aumenta e as interaes fracas so rompidas. Alteraes no pH modificam o estado inico das cadeias laterais dos aminocidos o que interfere nas ligaes de hidrognio e nas interaes eletrostticas [4]. Foram empregadas tcnicas de espectrometria de absoro UV/Vis e fluorescncia em nossas anlises. O PNPA e PNP absorvem em diferentes comprimentos de onda na tcnica de espectrometria de absoro UV/Vis, o que possibilita analisar o andamento da hidrlise com a variao da absorvncia em um determinado comprimento de onda. A -CT possui trs aminocidos que so sensveis a tcnica de fluorescncia; a tirosina, o triptofano e a fenilalanina, pois estes possuem grupos aromticos. Assim podemos analisar a desnaturao da -CT consoante temperatura empregada. II. MATERIAIS E METODOS II.1 Aparelhagem Nesse experimento foram utilizados: pipetas volumtricas, pipetador automtico, bqueres, bales volumtricos, balana analtica, cuvette de quartzo, banho termosttico, termmetros, tubos de ensaio, eppendorfs, banho de gelo, espectrofotmetro de absoro UV/Vis, fluormetro, erlenmeyer.

II.2 REAGENTES Nesse experimento foram utilizados: tampo fosfato 10mM a pH = 7,4 com 0,15M NaCl, tampo fosfato 10mM a pH = 10 com 0,15M NaCl, tampo etanol 95:5 (% v/v) pH = 7,4, tampo etanol 95:5 (% v/v) pH=10, p-nitrofenol 1mM em gua:etanol 95:5, p-nitrofenil acetato 10mM em etanol, soluo de tirosina, soluo de triptofano e soluo de -CT.

II.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A partir da soluo de PNP inicial, preparou-se cinco solues de 5 mL cada, utilizando como solvente o tampo etanol a pH 7,4, com as seguintes concentraes: 110-5M, 2.510-5M, 510-5M, 7.510-5M e 110-4M. Foram tambm preparadas as mesmas solues, porm o solvente era o tampo etanol a pH 10. Utilizando um espectrofotmetro de absoro UV/Vis, foi feita uma varredura de 250nm a 500nm da soluo mais concentrada para cada um dos pHs, foi observado para ambos que a maior absorvncia ocorria quando = 401nm. Esse valor de foi fixado e ento foi medido a absorvncia das cinco solues em pH 7,4 e para as cinco solues em pH 10, dessa forma foram obtidas curvas de calibrao do PNP. Para analisar a hidrlise do PNPA a PNPA sem enzima, utilizou-se a soluo de PNPA inicial para preparar 2mL de solues de PNPA em tampo etanol pH 7,4 e tampo etanol pH 10 com as seguintes concentraes: 1,2103M, 0,610-3M. As solues e o tampo foram mantidas no banho de gelo, a fim de evitar que a hidrlise comeasse a ocorrer. Essas solues foram diludas vinte vezes em tampo arrefecido e foi retirado 1 mL dessas e colocado em um eppendorf no banho de gelo. Os erlenmeyers contendo o restante das solues foram colocados em banhos trmicos com diferentes temperaturas (25C, 35C e 45C). A tempos predeterminados retirou-se 1 mL de cada soluo e colocou-se em eppendorfs numerados no gelo. Esses foram submetidos a anlise do espectrofotmetro de absoro UV/Vis para determinar suas absorvncias. Alm disso, preparou-se 5mL de solues de -quimiotripsina, tirosina e triptofano com concentrao de 10 M cada, a soluo de -quimiotripsina foi guardada no gelo. O procedimento foi feito em duas temperaturas diferentes, para isso, tanto as solues de aminocidos como a soluo de enzima foram dividas em duas fraes iguais, sendo uma delas colocada num banho a 25C e a outra parcela a 60C. Em seguida foram feitas os espectros de absoro para determinar o mx de todas as solues, como a absorvncia foi superior a 0,1 para as solues de -quimiotripsina, essas foram diludas. Todas as solues foram utilizadas para fazer os espectros de fluorescncia, fixando-se o mx encontrado. Avaliou-se tambm a estabilidade da enzima atravs de uma rampa de temperatura. Procedeu-se de modo que as mesmas solues de aminocidos e enzima utilizadas anteriormente foram submetidas ao Fluormetro. Com base no mx encontrado na fluorescncia, fixou-se o par ex/ em no fluormetro, variou-se a temperatura de 25C a 60C com a velocidade de 1C/min e em seguida foi feito o arrefecimento at 25C com a mesma velocidade. Por fim analisou-se o efeito da -quimiotripsina na hidrlise do PNPA a PNP. A partir da soluo inicial de PNPA preparou-se solues em etanol com cinco concentraes: 2.5x10-4 M, 6x10-4 M, 1,2x10-3 M, 2,5x10-3 M, 5x10-3 M. A seguir foi preparado 10mL de uma soluo de -quimiotripsina a 200 M em tampo, todas as solues foram colocadas em banho de gelo. Uma amostra de tampo foi levada ao banho termosttico para cada temperatura utilizada no experimento; 25C, 35C e 45C. Em cada cuvette foi colocado 2,74mL de tampo, 100 L de -quimiotripsina 200 M e aps agitar por inverso se adicionou 150 L da soluo de p-nitrofenil acetato em etanol, colocou-se primeiro a soluo de PNPA mais diluda e posteriormente repetiu-se para as outras solues, incluindo a soluo inicial de PNPA com concentrao 1x10-2 M. II.4 MTODOS Para as anlises foi levado em conta a Lei de Beer- Lambert

A= lc
Onde A = absorvncia, = coeficiente de absortividade molar (L. mol-1. cm-1), c = concentrao (mol.L-1) e l = caminho ptico = 1 cm Foi empregada a ferramenta Solver do Microsoft Excel 2010 para criar linhas de ajuste para as seguintes equaes: Equao cintica para reaes de primeira ordem

[PNP]= (1- exp(-kt)) x [PNPA]0


Equao cintica para reaes de segunda ordem

[
Equao de Michaelis-Meten:

]=[

A]

[ [

A] A]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

=
Equao de Arrhenius:

l
III. RESULTADOS

=l A

Ao fazer a curva de calibrao do PNP foi possvel obter o valor da absortividade molar que dada pela inclinao da reta. Todos os resultados obtidos esto expostos na tabela abaixo.

Amostra a pH 7,4 1 2 3 4 mdio

Absortividade molar () 12565 16322 15196 16322 157591770 5 6 7 ---

Amostra a pH 10

Absortividade molar () 19216 18107 18036 --18107662

mdio

Tabela I: Absortividades molares a pH 7,4 e pH 10 O Grfico I apresenta a curva de calibrao feita para amostra 3, o valor de obtido pelo coeficiente angular da reta. As outras amostras foram submetidas ao mesmo tratamento.

Curva de calibrao PNP


amostra 3
1 Absorvncia 0,8 0,6 0,4 0,2 0,391 0,175 2,00E-05 4,00E-05 6,00E-05 0,781 y = 15196x + 0,0184 R = 9,99E-01 Absorvncia Linear (Absorvncia)

0 0,00E+00

Concentrao mol/L

Grfico I: Curva de Calibrao do PNP para a amostra 3

A partir da Lei de Beer-Lambert obtiveram-se as concentraes de PNP formado ao logo do tempo de hidrlise e criou-se um grfico. Para descobrir a ordem da reao utilizou-se um modelo de equao de primeira ordem, a ferramenta Solver do Excel ajustou a equao ao grfico ao variar o valor da constante de velocidade (k). Atravs desse ajuste obteve-se um valor para a constante de velocidade de primeira ordem e tambm a soma dos quadrados das distncias entre os pontos experimentais e os de ajuste. No Grfico II e no Grfico III as concentraes experimentais foram encontradas considerando = 151961770 L.mol-1.cm-1 na equao de Beer-Lambert.

Velocidade da hidrlise do PNPA


4,00E-05 3,50E-05 3,00E-05 [PNP] (M) 2,50E-05 2,00E-05 1,50E-05 1,00E-05 5,00E-06 0,00E+00 0,00 3.000,00 6.000,00 9.000,00 12.000,00 Tempo (s)

Experimental Ajuste de 1 ordem

Grfico II: Velocidade de hidrlise do PNP para amostra 3 e ajuste de 1 ordem

Amostra 1 2 3 4 5 6 7

pH 7,4 7,4 7,4 7,4 10 10 10

K1 1,62E-05 5,08E-05 8,67E-05 7,60E-05 1,81E-02 1,88E-02 1,45E-02

Tabela II: Constantes de velocidade para ajuste de 1 ordem Utilizando novamente o Solver fez-se tambm o ajuste para uma reao de 2 ordem, que pode ser visto no grfico abaixo.

Velocidade de hidrlise de PNPA


4,00E-05 [PNP] (M) 3,00E-05 2,00E-05 1,00E-05 0,00E+00 0 5000 10000 15000 Tempo (s) Ajuste de 2 ordem Experimental

Grfico III: Velocidade de hidrlise do PNPA para a amostra 3 e ajuste de 2 ordem Como a soma dos quadrados das distncias entre os pontos experimentais e de ajuste para a reao de 1 ordem menor do que para a de 2 ordem, conclui-se que a reao de hidrlise de PNPA a PNP uma reao de 1 ordem. Obteve-se os espectros de fluorescncia para a tirosina, o triptofano e a -quimiotripsina as temperaturas de 25C e 60C para os valores de pH 7,4 e 10. Para uma melhor comparao dos resultados juntou-se os espectros a pH 7,4 no Grfico IV. Para pH 10 os resultados obtidos foram semelhantes aos do pH 7,4.

Espectros de Fluorescncia a 25C e 60C pH = 7,4


200 Intensidade (a.u.) 150 100 50 0 250 290 330 370 410 450 490 Comprimento de onda (nm) a-CT - 2uM - 25C Trp - 10uM - 25C Trp - 10uM - 60C a-CT - 1,4uM - 60C Tyr - 10uM - 25C Tyr - 10uM- 60C

Grfico IV: Espectros de Fluorescncia da enzima e dos aminocidos a 25C e 60C A tabela III expressa os valores de mx encontrados atravs da fluorescncia.

Solues mx a 25C mx a 60C

-CT 337

Triptofano Tirosina 357 304

355

357

304

Tabela III: Resultados obtidos a partir dos espectros de fluorescncia Com base nos mx obtidos, foram feitas rampas de temperaturas usando fluorescncia para as diferentes solues.

Rampa de Temperatura -CT 2uM e Trp 10uM pH 7,4


160 140 120 100 80 60 40 20 0 20 30 40 Temperatura 50 60 Intensidade (.au.)

Trp (25C - 60C) Trp (60C - 25C) a-CT (25 - 60C) a-CT (60C - 25C)

Grfico V: Rampa de Temperatura da -CT e do Trp de 25 a 60C e de 60 a 25C Com base nos pontos obtidos no grfico acima para a -CT, foi possvel estimar a temperatura de desnaturao e a frao desnaturada utilizando a funo distribuio normal como forma de ajuste. Este resultado pode ser visualizado no Grfico VI.

Temperatura de desnaturao -CT 2uM


e frao desnaturada pH 7,4
70 60 Intensidade (a.u.) 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Experimental Ajuste Frao desnaturada

Grfico VI: Temperatura de desnaturao e frao desnaturada para a amostra 8

Temperatura de desnaturao -CT 1uM


e frao desnaturada pH 7,4
50 Intensidade (a.u.) 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Ajuste Experimental Frao desnaturada

Grfico VII: Temperatura de desnaturao e frao desnaturada para a amostra 9

Temperatura de desnaturao -CT 1,3uM


e frao desnaturada pH 10
80 70 Intensidade (a.u.) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 0,2 0 0,8 0,6 0,4 Ajuste Experimental Frao desnaturada 1,2 1

Grfico VIII: Temperatura de desnaturao e frao desnaturada para a amostra 10

Amostras pH [-CT] Molar Temperatura de desnaturao (C) % da forma desnaturada a temperatura de desnaturao (C)

8 7,4 2,0x10-6 47,76 48,38

9 7,4 1,0x10-6 50,45 52,72

10 10 1,3x10-6 48,00 50,88

% desnaturada a 25C % desnaturada a 35C % desnaturada a 45C

0,00 0,12 22,58

0,00 0,00 7,41

0,00 0,05 22,49

Tabela IV: Dados obtidos atravs das rampas de temperatura Foi feito o estudo da velocidade da hidrlise do PNPA na presena da enzima. Preparou-se solues com seis concentraes diferentes de PNPA para cada pH a temperaturas predeterminadas e ento foi adicionada a enzima. A reao foi acompanhada atravs de espectrometria de absoro UV/Vis. Com os resultados obtidos, foram construdos grficos de [PNPA] por tempo para as diferentes solues, foram considerados os primeiros pontos como pode ser visto abaixo.

Velocidade inicial hidrlise PNPA 1,25E05 M


pH 7,4 35C com enzima
8,00E-06 [PNPA](M) 6,00E-06 4,00E-06 2,00E-06 0,00E+00 0 20 Tempo (s) 40 60 y = -5,89E-08x + 6,98E-06 R = 9,98E-01

Experimental Linear (Experimental)

Grfico IX: Velocidade inicial para a hidrlise de PNPA com enzima a temperatura 35C Todos os grficos obtidos apresentaram o mesmo comportamento, mas com velocidades iniciais diferentes, como se pode perceber na Tabela V.

Amostra 1 pH7,4 25C Amostra 2 H 7,4 35C Amostra 3 pH 7,4 45C Amostra 4 pH 7,4 45C Amostra 5 pH 10 25C Amostra 6 pH 10 35C Amostra 7 pH 10 45C [PNPA] Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) 1,25E-05 5,71E-08 4,14E-08 5,78E-08 7,86E-08 8,53E-08 8,84E-08 1,03E-07 3,00E-05 7,00E-08 5,43E-08 7,97E-08 1,08E-07 7,23E-08 1,50E-07 1,52E-07 6,00E-05 8,25E-08 6,13E-08 1,29E-07 1,31E-07 1,28E-07 6,44E-08 2,21E-07 1,25E-04 8,24E-08 --2,00E-07 1,99E-07 1,64E-07 1,52E-07 2,84E-07 2,50E-04 9,28E-08 --1,95E-07 1,24E-07 1,81E-07 2,20E-07 3,88E-07 5,00E-04 8,54E-08 6,77E-08 1,98E-07 1,34E-07 2,19E-07 2,28E-07 4,05E-07
Tabela V: Velocidades iniciais obtidas a diferentes condies de temperatura e pH para seis concentraes de PNPA. A velocidade inicial corresponde ao valor negativo da inclinao da reta. Utilizando a equao de MichaelisMenten e os grficos de velocidade inicial em funo da [PNPA] foi possvel determinar as constantes k2 e KM.

pH 7,4 35oC
2,00E-07 Velocidade (mol/s) 1,50E-07 1,00E-07 5,00E-08 0,00E+00 0,00E+00 1,00E-04 2,00E-04 3,00E-04 4,00E-04 5,00E-04 6,00E-04 [PNPA] (M)

k2 e KM

Ajuste Experimental

Grfico X: Grfico obtido atravs da equao de MichaelisMenten para k2 e KM Os grficos para as demais amostras so semelhantes ao anterior, porm os valores de k2 e KM so diferentes. Foi tambm possvel obter a velocidade mxima das reaes utilizando a equao de Michaelis-Menten novamente.

1,50E+07 1,20E+07 1 / V (s/mol) 9,00E+06 6,00E+06 3,00E+06 0,00E+00 0,00E+00

Vmax pH 7,4 35o C

y = 1,00E+02x + 5,00E+06 R = 1,00E+00

Experimental Linear (Experimental)

2,00E+04

4,00E+04

6,00E+04 (mol-1)

8,00E+04

1,00E+05

1 / [PNPA]

Grfico XI: Grfico obtido atravs da equao de MichaelisMenten para Vmx A Tabela VI mostra todos resultados de k2 , KM e Vmx

Amostra

Temperatura (C)

pH

K2

KM

Vmx

11 12 13 14

25 35 45 45

7,4 7,4 7,4 7,4

1,35E-02 1,03E-02 3,00E-02 2,34E-02

7,49E-06 8,17E-06 2,00E-05 1,08E-05

9,01E-08 6,86E-08 2,00E-07 1,56E-07

15 16 17

25 35 45

10 10 10

3,36E-02 3,44E-02 6,85E-02

4,31E-05 3,91E-05 6,07E-05

2,24E-07 2,28E-07 4,46E-07

Tabela VI: Valores de k2, KM e Vmx para diferentes valores de pH e temperatura Utilizando os valores de k1 para a reao sem enzima e k2 para a reao com enzima, foi possvel descobrir as energias de ativao para pH 7,4 e pH 10. Para tal utilizamos a equao de Arrhenius.

Energia de ativao a pH 7,4


3,12E-03 3,18E-03 3,24E-03 3,30E-03 3,36E-03 3,42E-03 0,00E+00 -1,00E+00 Ln K2 -2,00E+00 -3,00E+00 -4,00E+00 -5,00E+00 1 / Temperatura (K-1) y = -2,65E+03x + 4,73E+00 R = 4,70E-01 Experimental Linear (Experimental)

Grfico XII: Energia de ativao Descobriu-se que para a reao sem enzima Ea = 61527,09 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 8647,05 kJ/M para pH 10. Para a reao com enzima Ea = 22033,35 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 27853,48 kJ/M para pH 10.

IV. DISCUSSO A absortividade molar das solues em pH 7,4 e pH 10 foram diferentes. Isso deve-se ao fato que a valores de pH elevado o grupo hidroxila do PNP pode liberar um prton e ionizar o PNP, dando-lhe uma carga negativa que aumenta a absortividade. Para a reao sem enzima os valores de k1 em pH 10 so cerca de 1000 vezes maiores do que para pH 7,4. Tal fato ocorre devido a maior quantidade de OH- a pH 10, que chega a ser 800 vezes maior do que em pH 7,4. A reao de hidrlise do PNPA a PNP dependente do pH, logo como o pH maior a velocidade da reao aumenta. De acordo com o Grfico IV, quanto maior a temperatura menor a intensidade da fluorescncia independentemente do pH. Isso se deve ao fato de que a temperaturas mais elevadas as molculas podem perder energia de forma no radiativa. Alm disso, fica claro que a temperatura de 60C o mx da -CT se aproxima ao do triptofano. A -CT possui em sua cadeia polipeptdica resduos de triptofano, que aps a desnaturao so expostos e alteram o mx, uma vez que o principal responsvel pela fluorescncia dentre os aminocidos aromticos que compem a enzima. Assim a alterao do mx um indicativo da desnaturao da protena. Analisando o Grfico V, observou-se que independentemente do pH a -CT desnaturada com o aumento da temperatura e no h renaturao ao retornar a temperatura inicial. Um indicativo desse fato que a rampa de arrefecimento da -CT se assemelha a rampa do triptofano. Pelos Grficos VI, VII e VIII foi possvel obter as temperaturas e fraes de desnaturao da enzima, no h influncia significativa do pH na temperatura de desnaturao. Segundo a literatura [5], era esperado que com o aumento do pH a temperatura de desnaturao fosse menor, devido a ionizao da cadeia lateral da tirosina que desestabiliza a estrutura da enzima, porm esse fato no foi observado no experimento. O que pode ser justificado pelo fato da enzima ter um pH timo de funcionamento bsico e que a ionizao da cadeia lateral da tirosina mais significativa para valores de pH 10,1 que corresponde ao pKa da tirosina. Para as reaes com enzima, foi verificado que a Vmx aumenta ao elevar o pH. Entretanto, em pH 10 a velocidade global da reao maior quando no h enzima. Isso se reflete tambm nas energias de ativao. A pH 10 h grande quantidade de OH- no meio, de forma que a enzima acaba protegendo o PNPA do ataque da

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hidroxila, pois a velocidade com que a enzima atua no PNPA muito menor do que a velocidade com que ocorre o ataque da hidroxila.

V. CONCLUSO Percebeu-se que a reao sem enzima de 1 ordem. Concluiu-se que o pH no influencia significativamente na temperatura de desnaturao da enzima, e que at a temperatura de 45oC ainda h grande quantidade de enzima na forma nativa, o que possibilita que a reao possa ser catalisada at esse valor de temperatura. A -CT um catalizador eficiente para hidrlise de PNPA em pH 7,4, entretanto a utilizao dessa enzima em pH 10 no interessante.

VI. AGRADECIMENTOS Agradecemos a Deus pela pacincia e graa para realizar este trabalho. Agradecemos aos integrantes dos grupos que disponibilizaram seus dados para nossa pesquisa. Agradecemos a CAPES pela oportunidade de intercmbio. Agradecemos a Universidade de Coimbra e a professora Maria Joo pelo auxlio na pesquisa.

VII. BIBLIOGRAFIA
1. Hydrolysis of a Carboxylic Acid Ester: Neutral and Base Enhanced Reaction of p-Nitrophenyl Acetate. Acedido em 02 de Outubro de 2013 em http://web.viu.ca/krogh/chem331/Hydrolysis%20Lab%202006.pdf 2. Meloun B., Kluh I., Kostka V., Morvek L., Prusk Z., Vancek J., Keil B, Sorm F. (1996). Covalent structure of bovine chymotrypsinogen A.. Acedido em 01 de Novembro de 2013 em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5972866 3. Anderson J., Byrne T., Woelfel K. J., Meany J. E., Spyridis G. T., Pocker Y. (1994). The Hydrolysis of pNitrophenyl Acetate: A Versatile Reaction To Study Enzyme Kinetics. Acedido em 03 de Outubro de 2013 em http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed071p715?journalCode=jceda8 4. 5. Voet, D., Voet, J. (2011). Biochemistry. Hoboken: John Wiley & Sons. Apura J., Mendes M., Uva M., (2012). Estudo da estabilidade da -quimotripsina numa gama alcalina de pH por absoro UV. Acedido em 26 de Outubro de 2013 em http://goo.gl/nikGcS

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