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Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Alberto Mayo Mosqueda Jaime G. Czares Camero Efran de la Cruz Lzaro Alejandro Flores Hernndez

Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Candita Victoria Gil Jimnez


Rectora Alma Catalina Berumen Alatorre

Directora de la Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias

Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco

Alberto Mayo Mosqueda Jaime G. Czares Camero Efran de la Cruz Lzaro Alejandro Flores Hernndez

Universidad Jurez Autnoma de Tabasco Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias

Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco / Alberto Mayo Mosqueda[et al.] Villahermosa, Tabasco: Universidad Jurez Autnoma de Tabasco, 2010. 32 p.: IL. -- (Coleccin Jos N. Rovirosa, Biodiversidad, Desarrollo Sustentable y Trpico Hmedo) Incluye Referencias Bibliogrficas e ndice. ISBN: 978-607-7557-30-2 1. Semillas Desarrollo \ 2. Germinacin. I. Mayo Mosqueda, Alberto, Ed. II. Ttulo. III. Serie. L.C. QK740 G47 2010

Primera edicin, 2010 Universidad Jurez Autnoma de Tabasco Av. Universidad s/n Zona de la Cultura, Col. Magisterial Villahermosa, Centro. Tab. C.P. 86040 Queda prohibida la reproduccin parcial o total del contenido de la presente obra, sin contar previamente con la autorizacin expresa y por escrito del titular, en trminos de la Ley Federal de Derechos de Autor. ISBN: 978-607-7557-30-2 Impreso y hecho en Villahermosa, Tabasco. Mxico

ndice
Agradecimientos Introduccin I.Cultivo in vitro de orqudeas Biologa de la germinacin de semillas de orqudeas Propagacin de orqudeas a partir de semillas II. Medios de cultivo III. Siembra de semillas Colecta y almacenamiento de las semillas Consideraciones sobre la siembra de cpsulas verdes y cpsulas abiertas Mtodo de siembra de cpsulas verdes Mtodo de siembra a partir de cpsulas abiertas IV. Induccin de germinacin in vitro Crecimiento y emisin de races V. Transplante a condiciones ex vitro Bibliografa ndice de Cuadros y Figuras 7 9 11 11 12 13 15 15 17 17 19 21 21 21 27 31

Agradecimientos
Agradecemos a las personas que amable y desinteresadamente permitieron el acceso a sus terrenos para realizar las colectas de semillas y plantas de orqudeas. De igual forma a todos los estudiantes que participaron en los recorridos de campo, como en la realizacin de experimentos en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT. Al fondo sectorial SAGARPA-CONACYT por su financiamiento para el desarrollo del proyecto Conservacin y propagacin de orqudeas de Tabasco (clave C01 propuesta 12133), as como tambin del financiamiento para la impresin del presente documento.

Introduccin

Las orqudeas son plantas que pertenecen a la familia Orchidaceae, con aproximadamente 700 a 800 gneros y 25,000 a 35,000 especies (Arditti, 1979). Taxonmicamente representan una de las familias ms evolucionadas entre las monocotiledoneas, en su mayora presentan flores atractivas y en algunos casos aunque no presenten flores cautivadoras ni de gran tamao, tienen importancia desde el punto de vista ecolgico. En general son consideradas como flores exticas. Es por ello que la industria de flores de corte y macetas se ha convertido en un mercado creciente, tanto para mercados locales como de exportacin. Adicionalmente, el desarrollo de nuevos hbridos y el cultivo comercial de orqudeas se ha convertido en una industria lucrativa en Europa, Hawaii, Australia, Tailandia, Japn, Singapur, Sri Lanka y Kenia (Luan, et al., 2006). Esta familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuentran amenazadas o en peligro de erradicacin, debido al saqueo indiscriminado, destruccin de espacios, contaminacin ambiental y deforestacin, aunado a los problemas de lento crecimiento y baja tasa de germinacin en condiciones naturales. En Tabasco, existen algunas especies con potencial ornamental; sin embargo, hay que disear estrategias de reproduccin debido a que por mtodos convencionales es un proceso lento. La propagacin vegetativa a partir de rizomas, separacin de brotes generados del tallo o seudobulbos, es muy lenta, adems de obtenerse pocos brotes despus de dos a tres aos de iniciado el proceso. Las orqudeas nativas merecen atencin para su conservacin, dado que se encuentran en peligro debido a la accin extractiva de pobladores locales. La conservacin ex situ de los recursos genticos vegetales se puede lograr mediante el almacenamiento in 9

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vitro. Esta tcnica ofrece la oportunidad de conservar germoplasma selecto a corto y mediano plazo. El germoplasma conservado debe ser regenerado a plantas y para ello se necesitan establecer protocolos de micropropagacin antes de la conservacin.

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I. Cultivo in vitro de orqudeas


La propagacin y cultivo de las orqudeas fue revolucionado despus del descubrimiento de Knudson (1922) en donde las semillas pudieron ser germinadas en un medio simple con azcar. Este trabajo demostr que la germinacin de semillas de orqudeas en condiciones in vitro fue posible sin la asociacin con hongos. Posteriormente, el mismo autor propuso una nueva solucin con la adicin de nutrientes para la germinacin de semillas de orqudeas en 1946. A partir de este momento muchas orqudeas se han regenerado y propagado a partir de segmentos de hoja (Murthy Pyati, 2001), segmentos nodales de plntulas provenientes de semillas germinadas in vitro (Chen et al., 2002) nudos florales (Chen et al., 2002), pices (Saiprasad y Polisetty, 2003), rizomas (Martin, 2003) y microsecciones apicales (Lakshmanan et al., 1995).

Biologa de la germinacin de semillas de orqudeas

Para que las semillas de orqudeas germinen en un medio natural, se hace necesaria la simbiosis con hongos micorrzicos (Hadley, 1997). Las semillas de orqudeas son pequeas y contienen pocas o ninguna reserva para llevar a cabo su germinacin (Singh, 1981), adicionalmente presentan pequeas cantidades de lpidos y protenas como material de reserva y no presentan endospermo (Savina, 1974) y cotiledones (Arditti y Ernst, 1984). Es por ello, que estratgicamente establecen una relacin simbitica con micorrizas, en la que, despus de la infeccin se establece un flujo de carbohidratos, minerales, vitaminas, hormonas y aminocidos que contribuyen a la germinacin de semillas y desarrollo de las plantas (Weber y Webster, 2001). Las plntulas de orqudeas epfitas tambin pueden utilizar la simbiosis con hongos como una fuente de resistencia a la desecacin, resultado de su pequeo tamao y hbito arbreo (Yoder et al., 2000).

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Aunque las semillas contenidas en una cpsula de orqudea pueden ser numerosas (2-3 millones), se considera que solo un 2-3% de semillas pueden germinar en condiciones naturales (Luan et al., 2006). Debido a las limitaciones anteriores, la germinacin y el desarrollo en condiciones in vitro, se plantea como una alternativa que puede ser ms eficiente en la regeneracin de plantas, ya que se realiza en condiciones controladas y aspticas.

Propagacin de orqudeas a partir de semillas

Desde el punto de conservacin ex situ de los recursos genticos vegetales, las semillas de orqudeas representan variabilidad gentica, lo que las convierte en un material apropiado para ser incluido en programas de conservacin. La primera propagacin exitosa de orqudeas en condiciones in vitro a partir de la germinacin de semillas fue lograda por Knudson (1922) con especies de Cattleya y ms recientemente Lo et al. (2004) con Dendrobium tosaense y Damon et al. (2004) con Cattleya aurantiaca, Encyclia chacoensis y Brassavola nodosa. La germinacin in vitro de semillas de orqudeas puede ser efectuada por dos vas: a) Co-cultivo de las semillas con diversos hongos micorrzicos para establecer una relacin simbitica. Para ello es necesario el aislamiento y cultivo del hongo en un medio de cultivo especfico. b) Inoculacin de las semillas en un medio de cultivo, que en ausencia de hongos simbiticos, proporciona los nutrientes requeridos para el desarrollo de la semilla.

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II. Medios de cultivo


Para la germinacin de semillas de orqudeas se reportan en la literatura algunos medios de uso generalizado como Knudson C (Knudson, 1946), MS (Murashigue y Skoog, 1962), Hutner (1953), Dalla Rosa y Laneri (Dalla Rosa y Laneri, 1977), VW (Vacin y Went, 1949) y Lindemann (1970). Sin embargo, los requerimientos pueden ser muy diversos, incluso en especies del mismo gnero. En el Cuadro 1 se muestra el contenido de elementos de cada medio de cultivo. En resultados obtenidos con especies del estado de Tabasco (Catasetum integerrimun Hook, Encyclia alata, Encyclia cordigera, Epidendrum flexuosum, Epidendrum chlocorymbos, Epidendrum stamfordianum, Myrmecophila sp., Trichocentrum ascendens, Trichocentrum carthagenense, Oncidium sphacelatum, Prosthechea cochleata, Nidema boothii, Trichocentrum lindenii), se han obtenido resultados aceptables con promedios de germinacin de semillas de un 70 a 90% empleando los medios VW, MS, y MS a la mitad de su concentracin, todos ellos adicionados con 0.1% de carbn activado. Para la etapa de desarrollo de las plntulas, se ha utilizado el medio Knudson C (Mayo et al., 2008).

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Cuadro 1. Formulacin de medios de cultivo, empleados en el cultivo in vitro de orqudeas

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III. Siembra de semillas


Colecta y almacenamiento de las semillas

Las semillas pueden ser colectadas a partir de cpsulas verdes o cpsulas maduras. En una cpsula verde que est en proceso de maduracin, debe estimarse la edad promedio para cosecharla (el tiempo requerido para madurar es diferente para cada especie), de lo contrario pudiera ser que se encuentre en un estadio inicial de maduracin, lo que afectara negativamente el proceso de germinacin. Algunos de los indicadores para determinar si una cpsula presenta semillas maduras, son el cambio de coloracin (generalmente inicia la presencia de tonalidades amarillas), la base de la cpsula en el lugar del relicto floral se encuentra seco y cuando se presiona no se deforma debido a que se encuentra llena de semillas (Seaton y Ramsay, 2005). En la Figura 1, se muestran cpsulas maduras de diferentes especies, listas para germinar in vitro. Note la tonalidad parda en los bordes de la cpsula y la cicatriz de la flor completamente seca en la parte distal.

Figura 1. Cpsulas maduras. 1) Oncidium Sphacelatum, 2) O. luridum, 3) C. integerrimum.

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Una vez abierta la cpsula, se desprenden con facilidad las semillas de las paredes con solo agitar al momento de la inoculacin en el medio de cultivo. Las cpsulas pueden ser almacenadas por algunas semanas si se envuelven en papel peridico y se colocan en refrigeracin a 4C. Es importante no utilizar bolsas plsticas para almacenar cpsulas o semillas ya que se presentar condensacin y consecuentemente pudriciones. En la medida de lo posible, es mejor colectar cpsulas que han estado expuestas a un da seco. Cuando se dispone de suficiente material y no es posible sembrar la totalidad, se sugiere extraer las semillas en un rea estril y deshidratarlas con slica gel en un desecador por dos das. Posteriormente, se colectan las semillas en tubos de vidrio con tapa hermtica (Figura 2) y se pueden almacenar en un refrigerador a 4C por varios meses, siempre y cuando no se abra el contenedor.

Figura 2. Extraccin de semillas y deshidratacin con slica gel. a) Deshidratacin por dos das; b) Almacenamiento en contenedor de vidrio con tapa hermtica a 4 C.

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Consideraciones sobre la siembra de cpsulas verdes y cpsulas abiertas

Siembra a partir de cpsulas verdes. De forma general se considera que el interior de una cpsula de orqudea conserva las condiciones de asepsia si est intacta. Sin embargo, en la prctica se sugiere que al momento de realizar la diseccin, se ponga atencin en el color y textura del interior, en algunas ocasiones al abrir la cpsula, las semillas pueden estar necrticas o contaminadas debido a daos mecnicos que no son visibles a simple vista. Se considera que al esterilizar la parte externa y abrirla en condiciones aspticas, las semillas estn estriles listas para inocularse en el medio de cultivo, por lo que ya no se requiere esterilizar las semillas. Una consideracin a esta opcin es que las semillas sembradas a partir de cpsulas que no han madurado lo suficiente podran germinar lentamente o simplemente no germinar. Siembra a partir de cpsulas abiertas. Las cpsulas abiertas, contienen en su interior semillas secas, pero como han estado expuestas al ambiente, este material presenta contaminacin por hongos y bacterias. Para este material es necesario realizar esterilizacin, por lo que con frecuencia se tienen problemas con los protocolos, dado que no existe alguno de forma general, sino que hay que establecer para cada especie las condiciones especficas. La eleccin de alguna de las opciones anteriores, estar en funcin de la disponibilidad de material vegetal.

Mtodo de siembra para cpsulas verdes

El mtodo general para sembrar semillas a partir de cpsulas verdes es el siguiente: 1. Con un bistur o tijera, cortar cuidadosamente los restos de la flor muerta de la cpsula. 2.Lavar la cpsula con una solucin de etanol al 70% por un minuto. 17

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3.Esterilizar la cpsula por 5 minutos en una solucin de hipoclorito de sodio al 2.5 %, adicionando una gota de detergente Tween 20 por 100 ml. 4. Retirar de la solucin de cloro. En condiciones aspticas, sumergir en alcohol al 70 % por 30 segundos, y a continuacin flamear hasta que el alcohol se queme. Esta operacin se puede realizar de una a tres veces dependiendo del tamao de la cpsula. En caso de realizar un mayor nmero se corre el riesgo de daar las semillas. 5. Realizar uno o dos cortes en forma longitudinal y abrir la cpsula con un bistur, cuidando de no introducirlo demasiado para no tocar el interior. 6. Tomar la mitad de la cpsula y con una esptula o bistur golpearla para esparcir las semillas sobre el medio de cultivo. Normalmente, cuando las semillas se encuentran maduras se desprenden con facilidad (Figura 3). De no ser as, con un bistur se deben raspar, cuidando de no incluir tejido de las paredes de la cpsula.

Figura 3. Siembra a partir de cpsulas verdes. a) Lavado en solucin con jabn b) Inmersin en hipoclorito de sodio, c) Diseccin de la cpsula y d) Esparcimiento de semillas sobre el medio de cultivo.

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Mtodo de siembra a partir de cpsulas abiertas

Se dispone de diferentes mtodos para la siembra a partir de semillas secas. Por destacar, existe el mtodo de la jeringuilla (ms empleado), de la funda de papel, dentro de una pipeta o filtracin a travs de un embudo. Cada tcnica vara de acuerdo a la especie, tiempo de esterilizacin y la concentracin de los esterilizantes. En el laboratorio de cultivo de tejidos de la Divisin Acadmica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT, se ha utilizado con buenos resultados la tcnica de Dixon (1987). Consiste en la utilizacin de una solucin de 5 ml de hipoclorito de sodio al 6%, 5 ml de etanol al 95% y 90 ml de agua destilada. Las semillas se colocan en esta solucin por un minuto (agitando vigorosamente) y posteriormente se enjuagan 2 veces en agua destilada estril, dando un minuto por cada enjuague. Despus del segundo lavado, se dejan sedimentar ligeramente las semillas y con una pipeta estril se toman de 0.1 a 0.2 cc, depositando sobre el medio de cultivo con esta tcnica una cantidad de 50 a 300 semillas por cada contenedor de cultivo (Figura 4).

Figura 4. Esterilizacin de semillas secas.

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IV. Induccin de germinacin in vitro


Al disponer de semillas (independientemente del origen) se deben cultivar a una temperatura de 27 C 2, con iluminacin difusa, y se debe eliminar aquellos cultivos contaminados o que presenten problemas de fenolizacin. En las especies de Tabasco que se hace referencia anteriormente se observan las semillas germinando despus de 2 a 3 meses de iniciado el cultivo.

Crecimiento y emisin de races

Una vez que se ha presentado la germinacin, se sugiere realizar una transferencia de las plntulas a un medio de cultivo renovado. En caso de no presentar problemas, puede ser en el mismo medio que el primero; o bien, realizar un cambio a un medio Knudson C. En esta etapa algunos autores recomiendan la utilizacin de sustancias indefinidas como pulpa de banano (Lo et al., 2004) o agua de coco (Arias et al., 2006). Dependiendo del desarrollo del cultivo, se deben utilizar contenedores de cultivo de acuerdo al tamao de las plntulas, para permitir un adecuado desarrollo. De igual forma debe considerarse la utilizacin de una mayor intensidad lumnica o luz natural, para permitir que se adapten con mayor facilidad a condiciones naturales.

V. Transplante a condiciones ex vitro


Para esta etapa, deben separarse aquellas plantas con presencia de crecimiento radicular, hojas y rizoma (Figura 5). Las condiciones especiales durante el cultivo in vitro trae como resultado modificaciones en la morfologa y fisiologa de las plantas micropropagadas. Es por ello que deben seguirse algunos 21

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cuidados durante la transferencia a condiciones ex vitro, para asegurar el mximo porcentaje de sobrevivencia. Al extraer las plantas del contenedor de cultivo, debern lavarse con agua corriente en forma abundante hasta eliminar los restos del medio de cultivo, de igual forma deben eliminarse hojas y races daadas o necrosadas. Tratar las plantas con una solucin de fungicida con Mancozeb (Manzate) a una concentracin de 1gl l-1 durante 10 minutos, para tratar de evitar problemas causados por hongos durante el proceso.

Figura 5. Plntulas con presencia de hojas y races suficientes para iniciar el proceso de aclimatizacin.

Respecto al sustrato a utilizar existe a nivel comercial una amplia gama a utilizar, entre los que incluyen corteza de pino, musgo, perlita, tezontle, poliestireno, carbn vegetal, arcilla, etc. El sistema utilizado incluye la utilizacin de charolas plsticas con perforaciones en el fondo (Figura 6). Como primer paso se coloca en el fondo una capa de tepetzil grueso, material de origen volcnico, utilizado para construccin de casas, pero que por su peso liviano y poca retencin de agua, se utiliza para permitir un mayor drenaje (Figura 7). Se requiere lavar abundantemente, para no llevar partculas de polvo, que ms tarde pueden retener agua.

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Figura 6. Charola plstica con perforaciones.

Figura 7. Tepetzil. Despus de cribarlo se separa por tamaos. 1) menor de 0.5 cm; 2) de 0.5 a 1 y 3) mayor de 1 cm. Despus de la primer capa, se coloca la mezcla de sustrato, que puede ser alguna de las siguientes: corteza de macuilis (Tabebuia rosea) con peat moss 2:1 (v/v), tepetzil grado 1 o fibra de coco. 23

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Posteriormente de sembrar las plntulas deben cubrirse con un domo plstico (Figura 8) para evitar la desecacin y colocarlas bajo sombra al 50 % con un nivel de luz promedio de 100 a 200 mol m-2 s-1. Cuando estas condiciones no sean posibles, se debe escoger una temporada donde la temperatura no sea muy elevada (no ms de 30 C) y con media sombra.

Figura 8. Cobertura de charolas con domos plsticos para evitar la desecacin.

Despus de dos semanas de iniciar el proceso, se remueve el domo parcialmente y a la siguiente se retira completamente (Figura 9). El riego debe realizarse en forma de spray con intervalos de 2 a tres das, dependiendo de las condiciones. Despus de un mes las plntulas pueden ser fertilizadas semanalmente con 150 ppm de fertilizante NPK (Peters 20- 20- 20, Scotts Company, Marysville, OH) . De esta forma pueden crecer las plantas hasta obtener la talla adecuada para ser transferidas a maceta, lo cual est en funcin de la velocidad de crecimiento de la especie.

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Figura 9. Plntulas establecidas sobre diferentes sustratos. (a) Tepetzil; (b) Fibra de coco.

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ndice de Cuadros y Figuras

Cuadro 1. Formulacin de medios de cultivo, empleados en el cultivo in vitro de orqudeas Figura 1. Cpsulas maduras Figura 2. Extraccin de semillas y deshidratacin en slica gel Figura 3. Siembra a partir de cpsulas verdes Figura 4. Esterilizacin de semillas secas

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Figura 5. Plntulas con presencia de hojas y races suficien- 22 tes para iniciar el proceso de aclimatizacin Figura 6. Charola plstica con perforaciones Figura 7. Tepetzil despus de cribarlo se separa por tamaos Figura 8. Cobertura de charolas con domos plsticos para evitar la desecacin Figura 9. Plntulas establecidas sobre diferentes sustratos 23 23 24 25

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Germinacin in vitro de Semillas y Desarrollo de Plntulas de Orqudeas Silvestres de Tabasco se termin de imprimir en Grficos Cnovas, Juan lvarez, 505, Centro, el 25 de febrero de 2010, con un tiraje de 400 ejemplares. En la ciudad de Villahermosa, Tabasco, Mxico. El cuidado de la edicin estuvo a cargo de los autores y el Fondo Editorial Universitario.

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978- 607- 7557- 30- 2