Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2007/2008 Disciplina de BIOQUMICA I Curso de MEDICINA 1 Ano

ENSINO PRTICO E TEORICO-PRTICO

9 AULA PRTICA

EXTRACO E QUANTIFICAO DE CIDOS NUCLEICOS

Consideraes gerais

No ncleo das clulas humanas, a cromatina est organizada em 23 pares de cromossomas. heterocromatina - condensada, genes inactivos; eucromatina - descondensada, genes activos.

A informao contida nos genes est armazenada nos cidos nucleicos, que so polmeros de nucletidos.

NUCLETIDOS

Os nucletidos so steres fosfricos dos nuclesidos. Da sua hidrlise completa, liberta-se uma pentose (ribose ou desoxirribose), uma base azotada (prica ou pirimdica) e uma molcula de cido fosfrico (carcter acdico).

Os nucletidos tm uma grande importncia biolgica, essencialmente por duas razes:

1. So constituintes fundamentais dos cidos nucleicos; 2. Fazem parte da estrutura de coenzimas muito importantes; alguns participam no
metabolismo intermedirio e nas reaces do metabolismo energtico celular.

No entanto, como constituintes dos cidos nucleicos que eles desempenham a sua funo biolgica essencial, participando nos mecanismos moleculares de conservao, replicao e transcrio da informao gentica.

Devido a terem na sua constituio bases azotadas, os nucletidos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm.

Podem ser separados por electroforese em papel ou em gel de agarose e por cromatografia de troca inica, em papel ou em coluna, porque, pelo facto de na sua constituio existir cido fosfrico, so molculas com carga negativa a pH 7.

CIDOS NUCLEICOS

So macromolculas resultantes da polimerizao de um nmero elevado de nucletidos. H dois tipos fundamentais de cidos nucleicos: - DNA ou cido desoxirribonucleico (Watson & Crick, 1953) - RNA ou cido ribonucleico - RNAm (RNA mensageiro) - RNAt (RNA de transferncia) - RNAr (RNA ribossmico)

O DNA e o RNA so cidos nucleicos, que armazenam e transmitem a informao nas clulas cdigo gentico.

DNA

O DNA existe na forma de uma hlice, composta por duas cadeias complementares unidas por ligaes de hidrognio, com as seguintes caractersticas: Bases nitrogenadas no interior da hlice (perpendicular ao eixo da hlice) Fosfato e pentose no exterior da hlice, papel estrutural (ngulo recto em relao s bases) A pH neutro, o grupo fosfato confere carga negativa ao DNA; uma vez que existe um grupo fosfato por cada base, a razo carga/massa permanece constante Dimetro ~20 Cadeias unidas por ligaes de hidrognio: A=T; GC Bases adjacentes interagem por foras de van der Waals O aparecimento das cadeias unidireccional: 5' Formas do DNA: hlice linear simples (vrus) circular (mitocondrial) dupla hlice (trs formas: A, B (+) e Z) 3'

PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DO DNA:

*Peso molecular elevado

*Viscosidade (ndice de enrolamento)

*A dupla hlice pode ser desnaturada por efeito de: temperatura, pH's extremos, ureia e formamida, enzimas (helicases).

*A desnaturao depende do contedo em bases (Tm). A renaturao espontnea, sob condies normais.

*Susceptvel de hidrlise cida suave; no hidrolisado por bases diludas

*No forma intermedirios cclicos *Liga Mg2+ e Ca2+

*Pode sofrer hidrlise enzimtica (desoxiribonucleases ou endonucleases).

RNA

O RNA existe normalmente na forma de cadeia simples, com as seguintes caractersticas:

*Material gentico de vrus, bactrias, animais e Homem

*Existe sob trs formas fundamentais: RNAm (RNA, surge por aco da RNA polimerase II), RNAt (surge por aco da RNA polimerase III), RNAr (surge por aco da RNA polimerase I): o primeiro codifica a informao gentica do DNA; o segundo, descodifica - traduz - a sequncia de bases do RNAm em aminocidos; o ltimo, combinado com protenas, forma os ribossomas, onde se ligam todas os componentes necessrios para a sntese proteica.

*A RNA polimerase II a enzima responsvel pela transcrio (sntese de RNA a partir de DNA).

*O conjunto de genes que so transcritos para a mesma molcula de RNAm, em conjunto com os locais de controle, chama-se opero. A RNA polimerase liga-se a um local especfico do opero, o promotor.

*Existem sequncias de DNA que interagem com protenas especficas e influenciam a taxa de transcrio - enhancers.

*A transcrio iniciada no local cap, +1, com o 1 nt, m7Gppp, terminando quando a RNA polimerase transcreve a sequncia AAUAAA; a seguir (15 a 30 nt depois), adicionada uma cauda poly A.

*O RNA, copiado directamente do DNA, o transcrito primrio, sofre modificaes, antes de ser traduzido (splicing).

PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DO RNA:

*Solveis em solues salinas diludas

*Desnaturao qumica, (alcalina), fsica (aquecimento) e enzimtica (ribonucleases)

*Separveis por ultracentrifugao e cromatografia.

Diferenas fundamentais entre DNA e RNA:

HLICE DNA DUPLA

BASES AZOTADAS Adenina = Timina Guanina = Citosina

PENTOSE Desoxirribose

RNA

SIMPLES

Adenina = Uracilo Guanina Citosina

Ribose

PROPRIEDADES DOS CIDOS NUCLEICOS

- Os cidos nucleicos so pouco solveis em cidos diludos; - Podem ser extrados das clulas, usando o fenol ou solues salinas neutras concentradas, e precipitados por etanol; - Os cidos nucleicos podem ser degradados por hidrlise qumica (alcalina), ou enzimtica (endonucleases); - So insolveis em solventes orgnicos, muito solveis em solues salinas diludas e moderadamente solveis na gua. Podem ser separados por cromatografia em coluna, por ultracentrifugao em gradiente de densidade de sacarose, ou por electroforese em gel; - Absorvem radiao UV a 260 nm, o que permite a sua identificao e caracterizao.

CONSIDERAES SOBRE A DETECO DOS CIDOS NUCLEICOS

ESPECTRO DE ABSORO DOS CIDOS NUCLEICOS DEFINE-SE NA REGIO DO ULTRAVIOLETA - ( de absoro mxima a 260 nm, dependendo das bases que entram na sua constituio). EFEITO HIPERCROMTICO consiste no aumento de absoro, a um dado , com a desnaturao das cadeias.

Reagem com a DIFENILAMINA formando um complexo corado azul por ligao desoxiribose e aquecimento (Reaco de DISHE - tpica das desoxirriboses). assim, possvel a sua deteco por espectrofotometria a = 600 nm. Reagem com a soluo de ORCINOL (10 %) na presena de FeCl3 e aquecimento formando um complexo amarelo por ligao ribose (Reaco de BIAL tpica das riboses), o que permite a suadeteco por espectrofotometria a = 670 nm.

DETERMINAO DE CIDOS NUCLEICOS TOTAIS

A manipulao de cidos nucleicos, tanto para extraco como para manipulao e anlise gentica, assenta em determinados princpios bsicos a ter em conta, nomeadamente, as pipetagens de preciso, realizadas com micropipeta (tipo EPPENDORF ou GILSON); a esterilidade de todos os materiais e solues usadas; a pureza dos reagentes, que deve ser, sempre que possvel, de grau de pureza molecular ou adequados a estudos de biologia molecular; a gua usada para a preparao das solues deve ser H2O milli-Q autoclavada; devem ser usadas bata e luvas de ltex, para prevenir contaminaes; devem observar-se as precaues adequadas ao manuseamento de produtos qumicos txicos, como o brometo de etdeo, radiao ultra-violeta (UV) e ao uso de electricidade de alta voltagem.

EXTRACO DE DNA GENMICO A PARTIR DE SANGUE TOTAL:

Existem inmeros mtodos para extrair DNA. O protocolo apresentado (descrito por Laura-Lee Boodram, 2004 - Department of Life Sciences, The University of the West Indies) apresenta uma alternativa rpida e eficaz na obteno de DNA sem o uso de solventes orgnicos. usada uma extraco com soluo salina (NaCl 5,3 M) para remover as protenas da amostra. Este passo fundamental na obteno de DNA com qualidade para ser analisado, nomeadamente por PCR. possvel obter 100-200 g de DNA a partir de 4-8 ml de sangue.

QUANTIFICAO DE DNA

No sentido de estimar a concentrao de DNA (Moore et al., 1997), cada amostra extrada (5 l) diluda (1:100) em H2O milli-Q estril, num tubo cnico de 1,5 ml (tipo EPPENDORF), submetida a agitao (RETSCH MIXER) para homogeneizao da soluo, sendo depois colocada em cuvette de quartzo e submetida a leitura da densidade ptica a 260 nm (DO260), para avaliar a quantidade de DNA, e a 280 nm (DO280) para estimar a contaminao com protenas, num quantificador automtico GeneQuant II (RNA/DNA CALCULATOR, AMERSHAM BIOSCIENCES). O quociente entre DO260 e DO280 deve situarse entre 1,5 e 2, para se considerar que estamos perante uma amostra de DNA com pureza adequada para anlise posterior. Um valor inferior indica contaminao com protenas e um

valor superior indica contaminao com RNA. A concentrao de DNA total foi estimada, de acordo com a Equao 1, tendo em conta que uma unidade de DO corresponde concentrao de 0,050 ug/ul de DNA de dupla cadeia (dsDNA) (Moore et al., 1997). [DNA] (g/l) = DO260 x 0,05 x factor diluio

(Equao 1)

NOTA: Tambm possvel usar espectrofotometria de visvel para estimar os cidos nucleicos DNA e RNA, corando-os, embora seja uma forma menos rigorosa de os determinar. O reagente de Difenilamina (Reaco de Dishe ou da Difenilamina) forma um complexo corado com o DNA, que detectado por espectrofotometria de absoro a 600 nm. Essa reaco caracterstica das desoxirriboses. Se fizermos reagir um extracto de cidos nucleicos com uma soluo de orcinol a 10 %, na presena da FeCl3 (Reaco de Bial ou do orcinol), com aquecimento, forma-se um complexo corado, detectando o RNA por espectrofotometria de absoro visvel, a 670 nm. A reaco caracterstica das riboses. Atravs deste mtodo, utilizam-se solues padro de DNA e RNA 0,01 % estabelecendo uma relao entre a D.O. e a concentrao (aplicando a Lei de BeerLambert), em que a D.O. = x l x c.

Referncias:

Helms, C. Salting out Procedure for Human DNA extraction. In The Donis-Keller Lab - Lab Manual Homepage [online]. 24 April 1990. [cited 19 November 2002; 11:09 EST]. Available from: http://hdklab.wustl.edu/lab_manual/dna/dna2.html.

Epplen, J.E., and T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and DNA fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin. p.55.

Ano Lectivo 2007/2008 BIOQUMICA I 1 Ano PROTOCOLO DE BANCADA - 9 AULA PRTICA

EXTRACO E QUANTIFICAO DE DNA Reagentes

Tampo A (Tampo de lise dos glbulos vermelhos): 0,32 M sacarose; 10 mM Tris HCl ; 5 mM MgCl2; 0,75% Triton-X-100 ; (pH a 7,6). Tampo B (desproteinizao): 20 mM Tris-HCl; 4 mM Na2EDTA; 100 mM NaCl; (pH a 7,4). H2O milliQ SDS 10% Soluo de Proteinase K (20 mg/ ml) NaCl 5,3 M Isopropanol frio Etanol 70% frio TrisHCl 10 mM

Nota: Todas as solues devem ser estreis. A esterilizao pode ser efectuada por autoclavagem (antes da adio de Triton-X-100) ou por filtrao, 0,22 m (melhor opo).

Procedimento para extraco (amostra: 5 ml de sangue, 1 volume): - Adicionar 1 volume de tampo A e 2 volumes de H2O MilliQ estril a 4C. - Submeter a vortex moderado ou inverter o tubo 6-8 vezes. - Incubar em gelo durante 2-3 minutos. - Centrifugar a 3500 rpm, durante 15 minutos a 4C. - Remover o sobrenadante para uma soluo de lixvia a 2,5%. - Ressuspender o sedimento em 2 ml de Tampo A e 6 ml de H2O (vortex 30 segundos em velocidade mdia). - Centrifugar a 3500 rpm, durante 15 minutos a 4C. - Retirar o sobrenadante. O sedimento deve ser de cor clara. Se estiver vermelho, repetir o passo anterior (lavagem). - Adicionar 5 ml de Tampo B e 500 l de SDS a 10% ao sedimento e ressuspender (vortex forte 30-60 segundos. Adicionar 50 l de Soluo de Proteinase K (20 mg/ml). Esta soluo deve ser preparada antes de usar e mantida a 4C ou pode ser conservada a -20 C por tempo mais prolongado. - Incubar a 55C durante 1-2 horas. - Colocar em gelo durante 2-3 minutos. - Adicionar 4 ml de NaCl a 5,3 M. Vortex suave durante 15 segundos. - Centrifugar a 4500 rpm durante 15-20 minutos a 4C. - Transferir o sobrenadante cuidadosamente para um tubo limpo. - Adicionar 1 volume de isopropanol frio (guardado a -20C). - Inverter o tubo 5-6 vezes para precipitar o DNA. - Remover a medusa com uma pipeta de Pasteur para um tubo eppendorf 1,5 ml e lavar (17949 g ~13000rpm-EPP, 10 minutos) com 1 ml de etanol frio a 70%. - Deixar secar 15-20 minutos a 37C ou 5-10 minutos a 55C. - Ressuspender em 300-400 l de TrisHCl a 10 mM pH 8,5. - Deixar solubilizar durante a noite. - Guardar a 4C.

Procedimento para a quantificao: 1. 2. 3. Diluir 10 l da soluo de DNA em 1000 l de H2O, num eppendorf 1,5 ml. Vortex suave da amostra. Leitura da DO (densidade ptica) a 260 nm (DNA) e a 280 nm (PROTENAS). O quociente entre DO260 e DO280 deve situar-se entre 1,5 e 2. 4. Clculo: [DNA] = DO260 x 0,05 g/l x factor de diluio (100) = (DO260 x 5) g/l