SOLUES dos EXERCCIOS de ENZIMAS

1. Um inibidor no-competitivo puro causa 65% de inibio quando presente

numa concentrao igual a 3,35 mM. Qual o valor da constante de inibio
(K
I
)? Grau de inibio = 1 v
i
/v

Como se trata de um inibidor no competitivo puro, K
I
= K
I
, isto , a afinidade da enzima
livre pelo inibidor igual afinidade da enzima complexada pelo inibidor. O grau de
inibio, , independente da concentrao do substrato, dado por:

I
K ] I [
] I [
+



Isolando K
I
, que o que devemos calcular:

+
] I [
K ] I [
I ,
] I [
] I [
K
I

; substituindo os valores:
mM 80 , 1 mM 35 , 3
65 , 0
mM 35 , 3
K
I




2. Durante danos considerveis no fgado,
uma enzima (E1A) liberada na corrente
sangunea. Aps exerccios intensos, uma
enzima do msculo (E
1B
), que catalisa a
mesma reao, liberada na corrente san-
gunea. E
1A
e E
1B
podem ser diferenciadas
porque possuem K
M
's diferentes. O valor de
K
m
da enzima do msculo igual a 2 10
-5

M. Uma determinao numa amostra de
sangue de um paciente apresentou os resul-
tados da tabela ao lado. O paciente sofre de
uma doena do fgado, ou simplesmente
tem se exercitado violentamente?












[S]
(M)
v
mmol ml de
soro
-1
min
-1

5 10
-5
43
7 10
-5
57
1 10
-4
75
1,5 10
-4
100
2 10
-4
120
3 10
-4
150
6 10
-4
200

preciso avaliar o valor de K
M
; de quebra podemos tambm avaliar V
max
. Isto pode ser feito
graficamente. Primeiro ser necessrio calcular os inversos de [S] e v:




















Agora, devemos plotar (representar) graficamente 1/v versus 1/[S] e avaliar K
M
e V
max
de
acordo com a equao de Lineweaver-Burk:

max max
M
V
1
] S [
1
V
K
v
1
+





M 000299 , 0
5 , 3344
1
K
M


1 1 -
min ml mmol 65 , 299
0033372 , 0
1
V
max




[S]
(M)
1/[S]
(M
1
)
v
mmol ml de soro
-1

min
-1

1/v
(min ml de soro
nmol
1
)
5 10
-5
20000 43 0,0232
7 10
-5
14285,71 57 0,0175
1 10
-4
10000 75 0,0133
1,5 10
-4
6666,67 100 0,01
2 10
-4
5000 120 0,00833
3 10
-4
3333,33 150 0,00666
6 10
-4
1666,66 200 0,005





O K
M
no coincide com o da enzima do msculo; mais provvel que o indivduo esteja
sofrendo de uma doena do fgado



3. Que concentrao de um inibidor competitivo necessria para produzir
75% de inibio a uma concentrao de substrato de 1,5 10
-3
M, se K
m
=
2,9 10
-4
M e K
I
= 2 10
-5
M? A que valor devemos elevar a concentrao do
substrato para restabelecer o valor original (no inibido) da velocidade de
reao?


Para a inibio competitiva, o grau de inibio dado por:

M I
I
K / ] S [ K / ] I [ 1
K / ] I [
+ +



A primeira pergunta sobre o valor de [I] para que seja igual a 0,75. Para obter isto,
peciso isolar [I] na equao acima:

I M I
K / ] I [ ) K / ] S [ K / ] I [ 1 ( + + , depois
I M I
K / ] I [ K / ] S [ K / ] I [ + +

Isolando os termos que contm [I]:

+
M I I
K / ] S [ K / ] I [ K / ] I [ , depois +
M I
K / ] S [ K / ) 1 ]( I [

e, finalmente

+

1
) 1 K / ] S ([ K
1
K K / ] S [ K
] I [
M I I M I
; substituindo valores:

M 10 70 , 3
25 , 0
10 258 , 9
75 , 0 1
) 1 10 9 , 2 / 10 5 , 1 ( 10 2 75 , 0
] I [
4
5 4 3 5

Este valor est certo? s tirar a prova:

max
4 3
3
max
m
max
V 837 , 0
10 9 , 2 10 5 , 1
) 10 5 , 1 ( V
K ] S [
] S [ V
v
+

max
4
5
4
3
3
max
m
I
max
i
V 209 , 0
10 9 , 2
10 2
10 7 , 3
1 10 5 , 1
) 10 5 , 1 ( V
K
K
] I [
1 ] S [
] S [ V
v

,
_

+ +

,
_

+ +

Calculando o grau de inibio:

75 , 0 V 837 , 0 / V 209 , 0 1 v / v 1
max max i










E a segunda pergunta: a que valor devemos elevar [S] para fazer com que v
i
passe a ter o
valor de v?

Ns queremos um valor de [S] tal que:

m
I
max
i
K
K
] I [
1 ] S [
] S [ V
v v

,
_

+ +



mas com [I] = 3,7 10
4
M. Na verdade, basta isolar [S] na expresso acima e calcular:
SIC DEMONSTRANDUM
ERAT!

] S [ V K
K
] I [
1 ] S [ v
max m
I

1
]
1

,
_

+ +
; e ainda:
] S [ V K
K
] I [
1 v ] S [ v
max m
I

,
_

+ +


continuando: m
I
max
K
K
] I [
1 v ] S [ v ] S [ V

,
_

+
; ou seja: m
I
max
K
K
] I [
1 v ) v V ]( S [

,
_

+


e, finalmente: m
I max
K
K
] I [
1
v V
v
] S [

,
_

substituindo valores:
4
5
4
max max
max
10 9 , 2
10 2
10 7 , 3
1
V 837 , 0 V
V 837 , 0
] S [

,
_

( ) M 029 , 0 10 9 , 2 5 , 19 134 , 5 10 9 , 2 5 , 19
837 , 0 1
837 , 0
] S [
4 4

4. Uma enzima pura tem uma atividade especfica de 120 unidades/mg de
protena. (a) Calcule o nmero de turnover, se o peso molecular 360000.
(b) Calcule o tempo necessrio para um ciclo cataltico.

Uma atividade especfica de 120 unidades/mg corresponde a uma atividade de 120 mol
minuto
1
mg
1


a) O peso molecular de 360 000; logo 1000 g (ou 1 mg) correspondem a:

1000/360000 = 0,002778 mol

b) Portanto, uma atividade especfica de 120 mol minuto
1
mg
1
corresponde a

43196,54
mol 002778 , 0 min
mol 120
kcat

minuto
1

Isto significa que cada molcula de enzima capaz de transformar 43196,54 molculas de
substrato por minuto (ou cada mol de enzima capaz de transformar 43196,54 mol de
substrato por minuto).

Durante 1 segundo, que um intervalo de tempo 60 vezes menor, a quantidade a ser
transformada dever ser 60 vezes menor. Portanto, o valor de k
cat
igual a 43196,54/60 =
719,94 segundo
1
.

Quando ao ciclo cataltico, em segundos,

durao do ciclo cataltico = 1/k
cat
= 1/719,94 = 0,001389 segundos
A enzima leva 0,001389 segundo (ou 1,38 msegundo) para fazer uma transformao; ou seja,
0,00002315 minuto (ou 23,15 minutos).


5. Um extrato livre de clulas de Escherichia coli contm 24 mg de protena
por ml. Vinte microlitros (20 l) deste extrato num volume padro de
incubao de 0,1 ml catalisaram a incorporao de [
14
C]glicose a partir de
[
14
C]glicose 1-fosfato no glicognio, com uma velocidade de 1,6
nmol/minuto. Calcule a velocidade da reao em termos de: (a)
mol/minuto; (b) mol litro
-1
min
-1
; (c) mol mg de protena
-1
minuto
-1
.
Calcule tambm a atividade da enzima do extrato em termos de (d)
unidades/ml e (e) unidades/mg de protena.

a) mol/minuto? A velocidade de reao de 1,6 nmol/minuto; 1 mol = 1000 nmol;
portanto, 1,6 nmol/minuto correspondem a 1,6 10
3
mol/minuto.

b) mol litro
1
minuto
1
? O volume de incubao de 0,1 ml, ou 0,1 10
3
litro, ou ainda
1 10
4
litro. Portanto,

mol litro
1
minuto
1
(mol/minuto por 0,1 ml)/10
4
= 1,6 10
3
/10
4
= 16 mol
litro
1
minuto
1


c) mol mg protena
1
minuto
1
?

mol mg protena
1
minuto
1
mol minuto
1
/mg protena no ensaio

1 ml (1000 l) do extrato contm 24 mg de protena; por isto, os 20 l usados para medir a
atividade contm:

mg protena no ensaio = (20/1000) 24 = 0,48 mg

Portanto:

mol mg protena
1
minuto
1
1,6 10
3
/0,48 = 0,00333 mol min
1
mg
1

d) unidades/ml? Uma unidade corresponde quantidade que transforma 1 mol por minuto.
20 l do extrato tem uma atividade de 1,6 10
3
mol/minuto. Logo, tem tambm, 1,6 10
3

unidades. Por ml: 1,6 10
3
unidades/0,1 ml = 1,6 10
2
unidades/ml.
e) unidades/mg protena? s dividir 1,6 10
3
unidades por 0,48 mg de protena: 0,00333
unidades/mg protena.


6. Cinquenta mililitros (50 ml) do extrato livre de clulas descrito no
problema anterior foram fracionados por precipitao com sulfato de amnio.
A frao que precipita entre 30 e 50% de saturao foi redissolvida num
volume total de 10 ml e dialisada. A soluo aps a dilise forneceu um
volume de 12 ml e continha 30 mg de protena/ml. Vinte microlitros (20 l)
da frao purificada catalisaram a reao da fosforilase com uma velocidade
de 5,9 nmol/minuto sob condies padro de ensaio. Calcule (a) a
recuperao da enzima; (b) o grau de purificao obtido na etapa de
precipitao com sulfato de amnio.



6)










a) Recuperao da enzima? Quanto havia no incio? Em 20 l da soluo original havia
atividade de 1,6 nmol/minuto. O volume era de 50 ml (50000 l), portanto

atividade total original = (50000/20) 1,6 nmol/minuto = 4000 nmol/minuto

Quanto sobrou depois do tratamento com sulfato de amnio? Em 20 l h atividade de 5,9
nmol/minuto. O volume final obtido era de 12 ml (12000 l), portanto

atividade total depois da purificao = (12000/20) 5,9 nmol/minuto = 3540 nmol/minuto

A recuperao, portanto, foi de

Recuperao(%) = (3540/4000) 100 = 88,5%

b) Purificao da enzima? preciso comparar as atividades especficas.

50 ml, contendo
24 mg
protena/ml
20 l catalisam
1,6 nmol/minuto
Sulfato de
amnio
Precipitado com 30-50% de
sulfato de amnio: redissolvido
em 10 ml e dialisado; volume
final: 12 ml e 30 mg protena/ml
20 l tem uma atividade de 5,9
nmol/minuto
atividade especfica original = atividade/mg protena = 4000/(50 24) = 4000/1200= 3,33
nmol min
1
mg
1


atividade especfica depois da purificao = 3540/(12 ml 30 mg) = 3540/360 = 9,83 nmol
min
1
mg
-1

Grau de purificao = 9,83/3,33 = 2,95 vezes


7. O etanol no corpo humano oxidado a acetaldedo pela lcool
desidrogenase do fgado. Outros lcoois tambm so oxidados pela enzima.
Por exemplo, o metanol, que mode-radamente txico, oxidado a
formaldedo, que muito mais txico. Os efeitos txicos do metanol podem
ser diminudos pela administrao de etanol. O etanol age competindo com o
metanol e deslocando-o do stio ativo na lcool desidrogenase. Se um
indivduo ingeriu 100 ml de metanol (cachaa baiana; dose que pode ser
letal), que quantidade de usque escocs de fabricao paraguaia (50% em
etanol) ele deve beber para reduzir a atividade da lcool desidrogenase com
o metanol a 5% de sua atividade original? Um adulto humano contm, em
mdia, 40 litros de fludos aquosos nos quais os lcoois se distribuem
rapidamente e de modo uniforme. As densidades do etanol e metanol so
ambas iguais a 0,79 g/cm
3
. Os KM's da lcool desidrogenase para o etanol e
do metanol so, respectivamente, 1 10
-3
M e 1 10
-2
M. Considere o K
I
do
etanol como sendo igual ao K
M
.


A pergunta , que quantidade de usque (50% em etanol) que o sujeito deve ingerir para
reduzir a atividade da lcool desidrogenase com o metanol a apenas 5% da atividade
original. Espera-se que o etanol atue como inibidor competitivo do metanol:


Original (sem beber usque):
m
max
K ] Met [
] Met [ V
v
+

Depois de beber usque:
m
I
max
i
K
K
] Et [
1 ] Met [
] Met [ V
v

,
_

+ +

Ns queremos que v
i
= 0,05v (isto , v
i
deve reduzir-se a 5% de v). Ns temos K
M
e K
I
. Se
soubermos [Met], poderemos calcular [Et] necessrio para que v
i
= 0,05v. V
max
, v e v
i
podem
ser eliminados dividindo uma das equaes pela outra. Por exemplo, dividindo v
i
por v:

M
M
K
K
] Et [
1 ] Met [
K ] Met [
K ] Met [
] Met [ V
K
K
] Et [
1 ] Met [
] Met [ V
05 , 0
v
v
I
M
M
max
I
max
i

,
_

+ +
+

,
_

,
_

+ +



Podemos isolar [Et]:

M
K
K
] Et [
1 ] Met [
05 , 0
) K ] Met ([
I
M

,
_

+ +
+


ou ainda
I
M
M
M
K
] Et [ K
K ] Met [
05 , 0
K ] Met [
+ +
+


e mais ainda M
M
I
M
K ] Met [
05 , 0
K ] Met [
K
] Et [ K

+

e finalmente

,
_

M
M
M
I
K ] Met [
05 , 0
K ] Met [
K
K
] Et [


[Et] a concentrao de etanol que precisamos atingir para que a velocidade de
transformao de metanol diminua em 95% (para 5%).

Mas, para poder calcular usando a frmula acima, precisamos saber a concentrao de
metanol. O sujeito ingeriu 100 ml. A densidade do metanol de 0,79 g/ml, logo, o sujeito
ingeriu 79 g. O peso molecular do metanol (CH
3
OH) igual a 32. Logo, 79 g correspondem
a

79/32 = 2,468 mol de metanol

A concentrao de metanol [Met] nos 40 litros de gua do sujeito igual a:

[Met] = 2,468/40 = 0,0617 M.

Agora podemos aplicar a frmula:

,
_

M
M
M
I
K ] Met [
05 , 0
K ] Met [
K
K
] Et [

,
_

01 , 0 0617 , 0
05 , 0
01 , 0 0617 , 0
01 , 0
10 1
] Et [
3

( ) M 135 , 0 01 , 0 0617 , 0 43 , 1 1 , 0 ] Et [


Vamos tirar a prova? v
i
/v tem que dar 0,05, no mesmo?

0504 , 0
01 , 0
001 , 0
135 , 0
1 0617 , 0
01 , 0 0617 , 0
K
K
] Et [
1 ] Met [
K ] Met [
v
v
M
I
M i

,
_

+ +
+

,
_

+ +
+

Mas, e a dose de usque? Para atingir uma concentrao de 0,135 M em 40 litros, precisamos
de 40 0,135 = 5,4 mol.

O peso molecular do etanol (CH
3
CH
2
OH) igual a 46. Portanto, sero necessrias 5,4 46 =
248,4 gramas.

Com uma densidade de 0,79 g/ml, isto corresponde a 248,4/0,79 = 314,4 ml; como o usque
50%, precisamos (oh! felicidade) de 314,4 2 = 628,8 ml


8. Uma enzima que segue o modelo simtrico para os efeitos do pH sobre a
sua atividade tem pKES1 = 4 e pKES2 = 8. Qual o pH no qual a V'max tima
para esta enzima? Que frao da V
max
o V'
max
atinge neste pH?


A velocidade mxima funo do pH (V
max
) igual a:

] H [
K
K
] H [
1
V
' V
2 E
1 E
max
max
+
+
+ +

SIC DEMONSTRANDUM ERAT!
Ad nauseam!


onde V
max
uma hipottica velocidade mxima independente do pH. A dependncia entre log
V
max
e o pH simtrica. Portanto, o pH timo deve situar-se no ponto mdio entre pK
E1
e
pK
E2
; portanto,

pH
timo
= (pK
E1
+ pK
E2
)/2 = (4 + 8)/2 = 6

Neste pH, o valor da V
max
ser:

max
max max
6
8
4
6
max
max
V 98 , 0
02 , 1
V
01 , 0 01 , 0 1
V
10
10
10
10
1
V
' V
+ +

+ +

9. A tcnica de marcao por afinidade utilizada para identificar resduos de
aminocidos no stio ativo ou prximos a ele. Este procedimento baseia-se
no tratamento da enzima com um anlogo do substrato na forma substrato-X,
no qual X um grupo reativo que pode ligar-se covalentemente cadeia
lateral de um ou poucos aminocidos especficos. Como o anlogo ao
substrato liga somente ao stio ativo, X ir reagir apenas com aminocidos
prximos, que podem ser identificados por hidrlise seletiva. Explique os
seguintes resultados encontrados em trs experimentos de marcao por
afinidade realizados com trs amostras diferentes:

(a) No houve marcao
(b) Foram obtidas duas sequncias marcadas:

Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro
Arg-Lys-Val-*Ser-Glu-Asp-Gly

(c) Duas sequncias marcadas foram obtidas:
Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro
Val-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro

a) Se no houve marcao, provvel que no haja tal aminocido no stio ativo desta enzima

b) As sequncias so completamente diferentes, mas Ser apareceu marcada. A hiptese mais
provvel que haja duas serinas no stio ativo, mas pertencentes a segmentos diferentes da
cadeia polipeptdica, postas em proximidade por causa do enovelamento da proteina (estutura
terciria).

c) As duas sequncias marcadas diferem em apenas um aminocido. Pode ser que haja
isoenzimas na amostra, que dizer, formas diferentes da mesma enzima. Pode ser tambm que
a enzima tenha vrios stios ativos em diversas subunidades, cuja sequncia de aminocidos
seja um pouco diferente.
10. Qual o fator de acelerao de uma reao a 25
o
C, se a enzima reduz a
energia livre de ativao ( G

) em (a) 1 kJ mol
-1
e (b) 10 kJ mol
-1
?

A energia livre de ativao dada pela equao de Arrhenius:

Reao no catalisada:
RT / G
NC
*
NC
Ae V

Reao catalisada:
RT / G
C
*
C
Ae V

Para calcular fatores de acelerao, deve-se dividir V
C
/V
NC
:

RT / ) G G (
RT / G
RT / G
NC C
*
C
*
NC
*
NC
*
C
e
e
e
V / V






A diferena,
*
C
*
NC
G G
precisamente a reduo na energia livre de ativao causada
pelo catalisador. R = 8,134 J mol
1
grau
1
e T = 298 K.

49 , 1 e e V / V
404 , 0 ) 298 314 , 8 /( ) 1000 (
NC C




7 , 56 e e V / V
04 , 4 ) 298 314 , 8 /( ) 10000 (
NC C





11. Para uma reao de Michaelis-Menten, k
1
= 5 10
7
M
-1
s
-1
, k
-1
= 2 10
4

s
1
, e k
2
= 4 10
2
s
-1
. Calcule a constante de dissociao do complexo enzima-
substrato (K
s
) e a constante de Michaelis (K
m
). A ligao do substrato atinge
o equilbrio ou apenas o estado estacionrio?

A constante de dissociao do complexo enzima-substrato:

M 10 4
10 5
10 2
k
k
] ES [
] S ][ E [
K
4
7
4
1
2
S

A constante de Michaelis-Menten:

M 10 08 , 4
10 5
10 4 10 2
k
k k
K
4
7
2 4
1
3 2
M

K
S
e K
M
so muito prximas; o sistema est praticamente em equilbrio.


12. Para a enzima aspartato transcarbamoilase o succinato age como um
inibidor competitivo de um dos substratos, aspartato. A dependncia da
velocidade de reao (v) da concentrao de aspartato, sob condies
saturantes do outro substrato, mostrada no grfico (a). No experimento do
grfico (b) a concentrao de aspartato foi mantida constante no valor
indicado pela flecha no grfico (a), enquanto que a concentrao de
succinato foi aumentada. O succinato no pode participar como substrato na
reao. Explique os resultados.




O grfico (a), em que [aspartato] foi variada, mostra uma enzima como efeitos homotrpicos
positivos. Esta enzima, conforme vimos, tem vrios stios ativos/alostricos

No grfico (b) escolheu-se uma concentrao pequena de aspartato e variou-se succinato
desde zero at determinado valor. O succinato deve ligar aos mesmos stios do aspartato, sem
que haja reao, no entanto. Ao fazer isto deve deslocar o equilbrio da enzima do estado T
para o estado R, colocando mais stios ativos disposio do aspartato, o que justifica o
aumento inicial da atividade. Devemos lembrar que a enzima mantm sua simetria: se um
stio passa ao estado R, todos os outros passam tambm.. Mas, medida que a concentrao
de succinato aumenta mais, os stios extra colocados disposio pela converso T R
passam a ligar o prprio succinato que ganha a competio com o aspartato. Por isto, acaba
havendo inibio uma vez atingido o ponto de mxima atividade.


13. O K
M
de certa enzima de comportamento michaeliano igual a 1 10
5

M.
Numa concentrao de substrato igual a 0.1 M, a velocidade inicial
experimental foi igual a 37 mol/min para uma certa concentrao da
enzima. No entanto, diminuindo a concentrao do substrato para 0.01 M,
observou-se que a velocidade de reao permaneceu sendo igual a 37
mol/min. Por que uma reduo de dez vezes na concentrao do substrato
no produziu nenhuma variao perceptvel na velocidade da reao?

Evidentemente a enzima est saturada com [S] = 0,1 M e continua saturada com [S] = 0,01
M. O seu K
M
dve ser muito menor do que 0,01 M.



14. Velocidades iniciais da reao da glutamato desidrogenase
Glutamato + H
2
O + NAD
+

-cetoglutarato + NH
3
+ NADH + H
+

foram medidas espectrofotometricamente a 340 nm (o NADH absorve a 340
nm e o NAD
+
no). Foram feitas medidas variando a concentrao de
glutamato na presena e ausncia de salicilato de sdio 40 mM, conforme a
tabela abaixo:


v, na ausncia de
salicilato
( A/min)
v
i
, na presena de
salicilato 40 mM
( A/min)
[Glutamato]
(mM)
0.21 0.08
1.5
0.25 0.10 2.0
0.28 0.12 3.0
0.33 0.13 4.0
0.44 0.16 8.0
0.40 0.18 16.0

Determine o tipo de inibio, o valor do K
M
e o valor da constante de inibio
(K
I
).







A representao de v e v
i
contra [S] fornece:





v
0 3 6 10 13 16
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50










Os valores foram obtidos fazendos ajustes de mnimos quadrados, mas poderiam ter sido
obtidos por manipulao grfica. Trata-se de inibio no-competitiva. Lembrem-se que:

I
K
] I [
1+
e '
I
K
] I [
1 ' +


Portanto, conhecendo , , K
M
, V
max
e [I], vocs podem determinar K
I
e K
I
.

[S] mM
v

] S [ 879 , 1
] S [ 482 , 0
] S [ K
] S [ V
v
M
max
+ +
= =
+ +
= =
; V
max
= 0,482 A/min

K
M
= 1,879 mM

] S [ 20 , 2
] S [ 204 , 0
] S [ K ) ' / (
] S [
'
V
v
M
max
i
+ +
= =
+ +







= =
; V
max
/' = 0,204; (/)K
M
= 2,20