Celulas Q3 lavadas em PBS Fixar em parafrmaldeido (4%) -20 min Permeabilizadas com Triton X-100(0.

2%) em PBS (5 min) Lavagem das celulas Incubao com nucleotidos biotinilads e o TdT (60 min a 37C) Lavagem com PBS Contraste com DAPI Preparaes montadas com Glycergel

Todos os componentes foram preparados de acord com os relatorios obtidos anteriormente (Santiago et al.,2006b,2007)

RESULTADOS TUDCA evita a morte celular neuronal da retina devido a elevada concentrao de glucose. Concentraco elevada de Glucose Sabendo que a TUDCA tem capacidades neuroprotectoras. Morte das Celulas da Retina

Quantificar a apoptose das celulas em fase precoce

Tinhamos celulas da retina numa cultura com elevada concentrao de glicose, com anexina V-com FITC para quantificarmos a morte celular. Pela analise do grafico concluimos que... Existe uma diminuio do numero de apoptose das celulas quando juntamos TUDCA a glucose.

Com a marcao por TUNEL

A tcnica de TUNEL, avalia a estrutura da cromatina e integridade do DNA das clulas, detectando com confiabilidade fragmentaes de DNA em amostras

Celulas com elevada concentrao de Glicose aumentou o numero de celuas positivas TUNEL (Celulas com DNA fragmentado) O tratamento com TUCA impediu que houvesse um aumento de celulas positivas TUNEL. No grupo tratado com manitol no houve grandes variaes em relaco ao controlo.

Prepara do Total, mitocondrial e fraces nucleares

Total de extractos lavado com PBS gelado lisadas e homogeneizadas (150 mM de NaCl,50Mm Tris,5 mM de EGTA,Triton X-100 (1%), desoxicolato (0.5%) SDS (0,1%) suplementad com inibidor de protease

Extractos Mitocondriais lavadas em tampo de sacarose gelado(250mM de sacarose,20mM HEPES/KOH (ph 7,4), EGTA 1 mM,EDTA 1mM
Extractos celulares (tampo de sacarose)

Extractos Nucleares celulas lavadas em PBS gelado

Extractos (tampo A,HEPES,KCL (10mM),EDTA(0.1 mM) + 1mM de DTT e 0.4% de Nonidet P-40

arrefecido com gelo 1mM de DTT,100 IM de PMSF, 1lg/ml quimostatina,1lg/ml de pepstanina A,1lg/ml leupeptina, 1lg/ml antiparin

Lisados colocar em gelo (30 min.) centriugar-se 15.800g (5min. 4C)

Nao lisados

lisados h Sonicados centrifugado s durante (10 min a 4C)

No lisados lLisados Nao lisados

Homogeneizados Centrifugar a 4C, a 500g (12min)

Sobrenadante

Sedimentos

O sobrenadante e recolhido e armazenado a 80C

Sobrenadante

Sedimentos

Centrifugado a 12.000g (20 min. )

Ressuspenso em tampo B + 1Mm DDT e glicerol (60 min gelo) snicadas e centrifugadas a 15.800g (5min. 4C)

O resultante foi ressuspendido em sacarose,suplementado com tampo e guardado a 80C

O sobrenadante doi recolhido e armazenado a 80C