Manual Testes Antimicrobianos

Tecnologia em servios de sade
Controle Interno da Qualidade para Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos
MARO - 2006 OPAS/ANVISA/SVS
Projeto de Monitoramento e Preveno da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Coordenao do Projeto Flvia Freitas de Paula Lopes GGTES/ANVISA/MS Adlia Aparecida Maral dos Santos GIPEA/GGTES/ANVISA/MS Maria Cndida de Souza Dantas CGLAB/SVS/MS Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS Elaborao Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS Colaboradores Adlia Aparecida Maral dos Santos GIPEA/GGTES/ANVISA/MS Antonia Maria Machado - Laboratrio Central do Hospital So Paulo - UNIFESP Eliete Frigatto - Laboratrio Central do Hospital So Paulo - UNIFESP Heiko Thereza Santana - GIPEA/GGTES/ANVISA/MS Janana Sallas Coordenao Geral Laboratrios de Sade Pblica DEVEP/CGLAB/SVS/MS Mrcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz / So Paulo SP Maria Rita Elmor Laboratrio de Microbiologia do Hospital Srio Libans / So Paulo SP Marins Dalla Valle Martino Hospital Israelita Albert Einstein / So Paulo SP Sociedade Brasileira de Anlises Clnicas Reviso tcnica Heiko Thereza Santana GIPEA/GGTES/ANVISA/MS Janana Sallas DEVEP/CGLAB/SVS/MS Slvia Figueiredo Costa Hospital das Clnicas FM/USP Suzie Marie Gomes GIPEA/GGTES/ANVISA/MS Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS Reviso de texto Ana Beatriz de Noronha
Esta publicao est sendo realizada no marco do Termo de Cooperao 37 (TC 37) entre a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria / Ministrio de Sade e a Organizao Pan-Americana da Sade/Organizao Mundial da Sade - Representao do Brasil. Organizao Pan-Americana da Sade/Organizao Mundial da Sade Setor de Embaixadas Norte, Lote 19, 70800-400 Braslia-DF Postmaster@bra.ops-oms.org www.opas.org.br Impresso no Brasil
Lista de Figuras
Figura 1
Propagao da cultura de Bactrias

Figura 2
M2 - I - 4
Fluxograma para manuseio e estocagem da Cepa de Referncia

Figura 3
M2 - C1 - 2
Fluxograma para manuseio da Cepa de Referncia no controle da qualidade
M2 - C1 - 3
Tecnologia em Servios de Sade
M2 - 5
Lista de Siglas e Abreviaturas
Anvisa ATCC BaSO4 CCIH CGLAB CIM CIQ CLSI CO2 CQ CQIL DEVEP EPC EPI ESBL FM/USP GGTES GIPEA IEC ISO MH MS OMS OPAS PCIQ pH POP SNVS SPVA SVS TSB UNIFESP
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria American Type Culture Collection Sulfato de Brio Comisso de Controle de Infeco Hospitalar Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica Concentrao Inibitria Mnima Controle Interno da Qualidade Clinical Laboratory Standard Institute Dixido de Carbono Controle da Qualidade Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais Departamento de Vigilncia Epidemiolgica Equipamentos de Proteo Coletiva Equipamentos de Proteo Individual Beta-lactamase de Espectro Estendido Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo Gerncia-Geral de Tecnologia em Servios de Sade Gerncia de Investigao e Preveno das Infeces e dos Eventos Adversos International Electrotechnical Commission Internacional Standards Organization Mueller-Hinton Ministrio da Sade Organizao Mundial da Sade Organizao Pan-Americana da Sade Programa de Controle Interno da Qualidade Potencial Hidrogeninico Procedimento Operacional Padro Sistema Nacional de Vigilncia Sanitria Sucrose Fosfato Glutamato Secretria de Vigilncia em Sade Caldo de Soja Trptica Universidade Federal Escola Paulista
M2 - 6
Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
Sumrio
Introduo 1. Parmetros para um Programa de Controle da Qualidade I - Fase pr-analtica II - Fase analtica III - Fase ps-analtica 2. Cepas de referncia 2.1. Definies 2.2. Tabela 1. Indicao de uso das cepas de referncia
Captulo 1
M2 - I - 1 M2 M2 M2 M2 I I I I 1 1 2 4
M2 - I - 4 M2 - I - 4 M2 - I - 5
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia 1. Cepas de referncia 1.1. Manuseio e estocagem 2. Controle de Turbidez para a Preparo do Inculo 3. Mtodo de Disco-Difuso 3.1. Freqncia dos testes de controle da qualidade 3.2. Teste de controle da qualidade dos meios de cultura 3.3. Testes de controle da qualidade da prova e do perfil de sensibilidade 4. Mtodo de Diluio em Caldo ou gar (CIM) 4.1. Freqncia dos testes de controle da qualidade 4.2. Freqncia dos testes de controle da qualidade para testes de triagem 4.3. Testes de controle da qualidade do meio de cultura 4.4. Mtodo de diluio em gar 4.5. Mtodo de diluio em caldo (microdiluio e macrodiluio) 4.6. Testes de controle da qualidade da prova e do perfil de sensibilidade
Captulo 2
M2 - C1 - 1 M2 - C1 - 1 M2 - C1 - 1 M2 - C1 - 4 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 C1 C1 C1 C1 4 4 5 6
- C1 - 8 - C1 - 9 - C1 - 9 - C1 - 9 - C1 - 9 - C1 - 10 - C1 - 10
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras 1. Cepas de Referncia 1.1. Cepas recomendadas para testes de CIM de 48 horas por diluio em caldo 1.2. Cepas recomendadas para testes de CIM de 24 e 48 horas por microdiluio em caldo 1.3. Cepas recomendadas para disco-difuso 2. Manuseio e estocagem das cepas de referncia 2.1. Preparo das cepas de referncia para armazenamento 2.2. Armazenamento das cepas de referncia 2.3. Manuseio das cepas de referncia nos testes de rotina
M2 - C2 - 1 M2 - C2 - 1 M2 - C2 - 1 M2 - C2 - 1 M2 - C2 - 1 M2 M2 M2 M2 C2 C2 C2 C2 1 1 2 2
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3. Freqncia dos Testes de Controle da Qualidade 3.1. Intervalos de CIM 3.2. Testes de sensibilidade a antifngicos 4. Testes de controle da qualidade do Meio de Cultura e Artigos de Plstico 5. Outros Testes de Controle utilizados na macrodiluio e microdiluio 5.1. Controle do crescimento 5.2. Controle de pureza 5.3. Controle da leitura dos pontos finais da reao
M2 - C2 - 3 M2 - C2 - 3 M2 - C2 - 3 M2 - C2 - 4 M2 M2 M2 M2 C2 C2 C2 C2 5 5 5 5
6. Teste de qualidade da prova e do perfil de sensibilidade

Captulo 3
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Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizado por Mtodos Automatizados 1. Elementos essenciais do sistema de gesto da qualidade 1.1 Fase pr-analtica 1.2. Controle interno do laboratrio 1.3. Controle da qualidade dos processos automatizados 1.4. Validao Referncias Bibliogrficas Anexos Anexo I: Procedimentos utilizados para manuteno e estocagem de microrganismos
M2 - C3 - 1 M2 M2 M2 M2 M2 C3 C3 C3 C3 C3 1 1 1 1 2
M2 - RB - 1 M2 - A - 1
M2 - A - 1 M2 - A - 3
Anexo II: Planilhas para controle interno da qualidade Anexo III: Relatrios de Registro da Realizao do Controle Interno da Qualidade - Hospital Anexo IV: Relatrios de Registro da Realizao do Controle Interno da Qualidade - LACEN
M2 - A - 15
M2 - A - 19
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Introduo
O programa de controle interno da qualidade um conjunto de aes que visam garantir a qualidade e reprodutibilidade dos processos e dos resultados produzidos por meio da verificao continua dos fatores que interferem nessa. Deve ser visto como uma oportunidade de aprimoramento das atividades desenvolvidas no laboratrio. Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS)1 a implantao de um programa da qualidade necessria para: melhorar a qualidade dos servios de sade; gerar resultados confiveis e reproduzveis; propiciar que resultados interlaboratoriais sejam comparveis; aumentar a credibilidade do laboratrio entre os mdicos e seus clientes; motivar os funcionrios a melhorar o desempenho; e prevenir de complicaes legais que podem seguir a liberao de exames de baixa qualidade. Muitos fatores interferem na qualidade dos resultados liberados pelo laboratrio de microbiologia, como por exemplo: (a) a seleo, coleta, transporte e acondicionamento apropriados do espcime biolgico; (b) o treinamento, comprometimento e motivao do pessoal de laboratrio; (c) fatores ambientais, como luminosidade deficiente ou excessiva, ventilao e condies do local de trabalho; (d) fatores analticos, como baixa qualidade dos reagentes, vidraria, corantes, meios de cultura e falta de equipamentos precisos; e (e) erros de transcrio de resultados, resultados liberados incompletos e interpretao errada das provas bioqumicas ou antibiograma1. Este guia um instrumento que tem como objetivo oferecer subsdios aos laboratrios de microbiologia na elaborao do manual de procedimentos operacionais padro (POP) que deve ser construdo pelo laboratrio. Ele faz parte do Manual de Microbiologia Clnica para o controle de infeco em servios de sade elaborado e disponvel na pgina eletrnica da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Anvisa)2. Este deve ser utilizado em consonncia com a Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), Boas Prticas de Laboratrios, Norma Brasileira Reguladora - NBR ISO/ IEC 17025 por microbiolgicos e biolgicos e Resoluo Diretoria Colegiada - RDC 302, de 13 de outubro de 2005. Os documentos aqui apresentados contm informaes bsicas acerca da realizao, da freqncia e das indicaes dos testes de controle interno da qualidade (CIQ) dos laboratrios de microbiologia clnica, na fase analtica.
1.
PARmEtROs pARA Um PROGRAmA DE COntROlE DA QUAliDADE2,3

I - FAsE PR-AnAlticA A) Garantia da qualidade das amostras clnicas O laboratrio de Microbiologia deve elaborar um manual de instrues, contemplando os
seguintes itens: coleta, identificao e conservao da amostra; transporte da amostra, estabelecendo meio recomendado, prazo, condies de temperatura e padro tcnico para garantir a sua integridade e estabilidade;
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critrios para o preparo do cliente com instrues claras e escritas em linguagem acessvel, sendo que somente as instrues simples e de fcil compreenso podem ser dadas verbalmente; critrios para a aceitao ou rejeio das amostras; e documentao das informaes relacionadas s amostras coletadas, como data, horrio e responsvel pela coleta e eventuais intercorrncias, garantindo sua rastreabilidade durante todo o processo. II - FAsE AnAlticA A) Manual de Procedimentos Operacionais Padro (POP) O laboratrio de Microbiologia deve elaborar os documentos internos de procedimentos, seguindo as indicaes de GP2-A4 do CLSI (Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals; Approved Guideline - Fourth Edition (2002) e deste documento. Os POPs devero conter, no mnimo: tcnica, limites de tolerncia, aceitao e rejeio da amostra, preparo de reagentes, controle de qualidade (CQ), clculos, critrios de liberao de resultados. Revisar os documentos, anualmente, ou sempre que ocorrer mudanas nos processos descritos. Disponibilizar as informaes escritas no ambiente de trabalho. B) Garantia da qualidade tcnica dos colaboradores Oferecer e documentar capacitao tcnica para as atividades desempenhadas na rotina do laboratrio de microbiologia. Manter programa de capacitao para o uso apropriado de equipamentos. Utilizar equipamentos de proteo individual (EPI) e equipamentos de proteo coletiva (EPC) e cumprir as normas de biossegurana. Participar ativamente junto Comisso de Controle de Infeco Hospitalar (CCIH), fornecendo dados epidemiolgicos de diferentes agentes etiolgicos de infeco hospitalar e seus perfis de sensibilidade. Armazenar cepas de interesse para estudos. Os resultados dos procedimentos e testes devem ser conferidos quanto exatido, reprodutibilidade e concordncia com os padres de CQ pelo responsvel designado. C) Desempenho dos equipamentos e instrumentos Elaborar e manter um programa de manuteno preventiva e corretiva dos equipamentos. Manter registro dirio de temperaturas dos equipamentos de banho-maria, estufa, freezer, geladeira e meio ambiente. Fazer controle da eficcia do processo de esterilizao das autoclaves (Bacillus stearothermophilus). Dispor de manual de funcionamento do equipamento em portugus. Estabelecer cronograma de manuteno preventiva. Registrar a manuteno preventiva e corretiva dos equipamentos em uso. Documentar o estado de calibrao dos equipamentos e instrumentos usados nos processos analticos, como pipetas automticas e pipetadores, termmetros, centrfugas, microscpios, espectrofotmetros, turbidmetro, balanas analticas, pHmetro, equipamentos analticos, etc. Documentar a verificao do funcionamento do equipamento. Documentar a realizao da limpeza dos equipamentos. Manter e documentar a higienizao peridica de fluxos, cabines de segurana, capelas, geladeiras, freezer, banho-maria, centrfugas, estufas, etc.
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Documentar a utilizao de cepas de referncia para o CIQ de acordo com as especificaes do equipamento. Documentar alertas emitidos pelo equipamento. Atualizar software a cada mudana, documentando as modificaes. Definir os limites de aceitabilidade para as inexatides encontradas nas calibraes, verificaes e comparaes entre equipamentos, e garantir a implementao de aes corretivas para os eventuais desvios. D) Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais (CQIL) D1. Corantes e reagentes Respeitar as orientaes escritas dos fabricantes para o uso dos reagentes. Solicitar cpia dos laudos qualitativos junto ao fabricante para cada lote recebido. Rotular cada produto com: nome, nmero do lote, concentrao, condies de estocagem, data do preparo, recebimento, quando foi colocado em uso e prazo de validade. Testar com controles positivos e negativos antes do uso, conforme o tipo de teste. Se os resultados no forem satisfatrios notificar o fornecedor e o SNVS. Descartar o produto se o controle no estiver apropriado. Definir e documentar o grau de pureza da gua reagente utilizada nas anlises, assim como a forma de obteno e controle dessa gua. D2. Meios de cultura Documentar a quantidade de meio preparado no laboratrio, nmero do lote, mtodo de esterilizao, data do preparo, pH, validade e tcnico responsvel pela preparao. Realizar e documentar teste de esterilidade e desempenho dos meios preparados no laboratrio, utilizando cepas de referncia, tipo ATCC. Observar o meio quanto a cor, consistncia, profundidade e/ou superfcie, hemlise, presena de bolhas e contaminao. Documentar o nmero do lote e a data de recebimento dos meios comerciais. Solicitar ao fornecedor o certificado de controle de qualidade, conforme recomendaes do CLSI. Documentar os meios que no estejam de acordo com os padres, as aes corretivas tomadas e informar ao fornecedor e ao SNVS. D3. Discos e fitas E-test Testar os discos ou fitas E-test de antimicrobianos, cartes ou painis com antibiticos, diariamente, por 20 dias consecutivos, a fim de validar a metodologia. Utilizar cepas de referncia, tipo ATCC. Seguir, rigorosamente, as recomendaes do fabricante quanto ao armazenamento dos discos antimicrobianos. Documentar os discos de antimicrobianos que no estejam de acordo com os padres CLSI, as aes corretivas tomadas e informar ao fornecedor e SNVS. D4. Kits comerciais e anti-soros Verificar se h registro do kit junto ao ministrio da sade www.anvisa.gov.br Testar os kits e anti-soros de um novo lote em paralelo com o lote anterior ou com cepas de referncia, antes de coloc-los em uso. Utilizar controles positivos e negativos, juntamente com cepas de referncia recomendadas. Documentar os resultados desses testes.
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Seguir as recomendaes do fabricante para o teste do controle da qualidade. Registrar as informaes contidas no rtulo do Kit para rastreabilidade do processo. Notificar ao fornecedor e SNVS os desvios de qualidade encontrados. III - FAsE Ps-AnAlticA Documentar a liberao de resultados, emisso e entrega de laudos. Garantir a confidencialidade dos resultados dos laudos. Fornecer aos colaboradores uma avaliao peridica de desempenho do laboratrio no controle interno, verificando a abrangncia e adequao desses controles.
2.
CEpAs DE REfERnciA6,7
2.1. DEfiniEs6 As cepas de referncia destinam-se verificao dos resultados obtidos, pois suas caractersticas
fenotpicas j so conhecidas, ou seja, sua identificao e seu perfil de sensibilidade j foram determinados. As cepas de referncia devem possuir uma origem confivel, vindo de um laboratrio de referncia que realiza testes fenotpicos e moleculares para confirmar sua identificao e perfil de sensibilidade. Define-se como cultura de estoque o subcultivo das cepas de referncia. Essa cultura armazenada no laboratrio de microbiologia (a -20oC ou menos) e descongelada anualmente. A cultura de trabalho o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque e ser mantida no laboratrio (4oC a 8oC) para realizao dos testes dirios ou semanais de CIQ. Uma passagem a transferncia do organismo de uma cultura vivel para um novo meio de cultura com crescimento de microrganismos. A hidratao (ou decongelamento) de uma cepa de referncia no considerada uma passagem ou repique. A primeira passagem ser o subcultivo da cepa de referncia para a cultura de estoque. A transferncia do microrganismo da cultura de estoque para a cultura de trabalho ser a segunda passagem (Figura 1).
FIGURA 1. PROpAGAO DA cUltURA DE BActRiAs4
Cepa de referncia
Cultura de estoque 1 passagem
Cultura de trabalho 2 passagem
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2.2. TABELA 1: InDicAO DE UsO DAs CEpAs DE REfERnciA4,5 Microrganismos Gram-negativos E. coli ATCC 25922 - Cepa no produtora de -lactamase. Qualidade da prova de DD e CIM de enterobactrias Qualidade da prova de DD e CIM de Pseudomonas, Acinetobacter, S. maltophilia e Burkholderia Qualidade da prova de DD e CIM de Vibrio colerae Testes de triagem e confirmatrio de ESBL Qualidade da prova em testes automatizados de susceptibilidade em painis de gram negativos E. coli ATCC 35218 - Cepa produtora de -lactamase Qualidade da prova de DD e CIM para de -lactmicos e inibidores de -lactamase Qualidade da prova de DD e CIM para Amoxacilina - Ac. clavulnico de Haemophilus spp VITEK GNS MIC painel QC set
Deve ser mantida a -60 C para prevenir perda do plasmdeo
o
Teste indicado
Testes automatizados para inibidores de -lactamase em painis de gram-negativos Testes automatizados de para ESBL Qualidade da prova em testes automatizados de identificao de bacilos gram-negativos Testes de triagem e teste confirmatrio de ESBL
E. coli ATCC 51446
K. pneumoniae ATCC 13883
K. pneumoniae ATCC 700603 - Cepa produtora de -lactamase de espectro ampliado

Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda do plasmdeo
P. aeruginosa ATCC 27853 Sensvel aos agentes anti-pseudomas
Qualidade da prova em testes de diluio em caldo e diluio em gar de P. aeruginosa e outros no-enterobacteriaceas Testes automatizados para verificao da concentrao de ction e pH com aminoglicosdeos em painis de gram-negativos
P. mirabilis ATCC 7002
Qualidade da prova em testes automatizados de identificao de bacilos gram-negativos
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2.2. TABELA 1: InDicAO DE UsO DAs CEpAs DE REfERnciA4,5 Microrganismos Gram-positivos E. faecalis ATCC 29212 - Sensvel a vancomicina, ampicilina e altos nveis de aminoglicosdeos Adequao do meio para testes de sulfonamidas e trimetropim, DD e CIM Qualidade da prova de CIM para Enterococcus spp Teste de triagem de alto nvel de resistncia aos aminoglicosdeos e vancomicina Qualidade da prova em testes automatizados de identificao e susceptibilidade de gram-positivos E. faecalis ATCC 51299 - Resistente a vancomicina e altos nveis de aminoglicosdeos Teste de triagem de alto nvel de resistncia aos aminoglicosdeos e vancomicina Testes automatizados de susceptibilidade a vancomicina para gram-positivos Qualidade da prova em testes de DD para Staphylococcus spp, Enterococcus spp Qualidade da prova em testes de CIM para Staphylococcus spp Teste confirmatrio de susceptibilidade a Oxacilina Qualidade da prova em testes automatizados de identificao e susceptibilidade de gram-positivos S. aureus ATCC 43300 - Resistente a oxacilina S. pneumoniae ATCC 49619 - Intermedirio para penicilina Leveduras C. albicans ATCC 14053 Qualidade da prova em testes automatizados de identificao de leveduras Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por CIM e DD de fluconazol Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por CIM de leveduras Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por DD de fluconazol Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por DD de fluconazol Teste confirmatrio de susceptibilidade a Oxacilina Qualidade da prova de DD da susceptibilidade de S. pneumoniae ou Streptococcus spp Teste indicado
S. aureus ATCC 25923 - Cepa no produtora de -lactamase S. aureus ATCC 29213 - Cepa produtora de -lactamase
C. parapsilosis ATCC 22019
C. kruzei ATCC 6258
C. albicans ATCC 90028
C. tropicalis ATCC 750
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Captulo 1
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia

1. CEpAs DE REfERnciA
1.1. MAnUsEiO E EstOcAGEm As cepas de referncia tm um nmero mximo de geraes a qual podem ser submetida, so cinco passagens a partir da cepa de referncia original6. O nmero indefinido de passagens pode comprometer principalmente a pureza da cultura e as caractersticas fenotpicas de algumas bactrias. Seguindo os procedimentos descritos neste documento e em condies ideais de armazenagem, a passagem para a produo das culturas de estoque pode ser anual e a passagem das culturas de trabalho pode ser realizada a cada trs semanas. Algumas cepas devem ser mantidas em condies especiais devido a suas caractersticas intrnsecas (ex. cepas exigentes). As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e mtodos empregados para testes de isolados clnicos. No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referncia devem ser mantidas a temperatura de -20oC, ou menos, (de preferncia a -60oC ou menos, ou em nitrognio lquido) em meio estabilizador recomendado. Meios utilizados para a manuteno das cepas de referncia (Figura 2): Skin milk a 20% (p/v) de leite desnatado em p dissolvido em gua destilada, autoclavar a 121oC por 20 minutos. Caldo de soja trptica a 10 - 20% de glicerol (v/v), autoclavar 121oC por 20 minutos. Sangue de coelho desfibrinado.
OBS: Os criotubos com selo de proteo interna so os mais utilizados para o processo de armazenamento dessas amostras. Os criotubos so preparados com antecedncia, em volumes que em geral esto em torno de 0,5mL por tubo, e previamente testados quanto esterilidade. A) Partindo da cepa original liofilizada: Ressuspender a cepa liofilizada, conforme as recomendaes do fabricante. Homogenizar o frasco. Semear em meio de cultura especfico (gar Sangue, MacConkey ou gar Chocolate). Fazer dois repiques. Identificar atravs de provas bioqumicas manuais ou automatizadas e colorao de Gram. Realizar testes de sensibilidade antimicrobianos. Depois de certificar a identificao e os testes de sensibilidade, armazenar a cepa.
Transferir as colnias recentes de 18 a 24 horas, em 15 frascos estreis (criotubos), para cada cepa de referncia a ser utilizada no controle. Etiquetar os frascos com o nome do microrganismo, nmero da cepa de referncia, a data do armazenamento e o ms a ser utilizado (janeiro a dezembro). Nos outros trs frascos, colocar a data dos trs anos seguintes para realizar o mesmo procedimento. Armazenar em freezer 20oC ou 60oC (Figura 2).
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FIGURA 2. FlUXOGRAmA pARA mAnUsEiO E EstOcAGEm DA cEpA DE REfERnciA
ATCC liofilozada
Hidratar
1 Repique
gar de acordo com o microrganismo especfico
Verificar a viabilidade, pureza das colnias
2 placas de gar especfico + 1 gar Seletivo
2 Repique
Validao
Identificao e confirmao Provas Bioqumicas e Colorao de Gram
Teste de perfil de sensibilidade (Antibiograma)
Fazer o banco 2006 2007 2008
Jan.
Fev.
Mar. Abr.
Mai. Jun. Jul. Armazenar todas
Ago. Set.
Out. Nov. Dez.
Freezer - 20C ou - 60C
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B) Partindo da cepa congelada: Retirar o criotubo com a cepa (ex.: janeiro) do freezer e com o auxlio de uma ala bacteriolgica, semear a amostra ainda congelada em meio especfico. Incubar a placa por 18 a 24 horas em temperatura e atmosfera recomendadas. Fazer um segundo repique utilizando duas placas. Numa das placas, fazer os testes de sensibilidade a antimicrobianos (para a 1 semana). Na outra placa, semear a cepa em trs tubos de gar Meller Hinton inclinado. Incubar por 18 a 20 horas em temperatura e atmosfera recomendadas. Colocar esses tubos na geladeira ( 2 a 8oC) para serem utilizados nos testes de sensibilidade aos antimicrobianos para a 2a, 3a e 4a semanas do ms, repicar apenas uma vez. Esse procedimento deve ser realizado para todas as cepas envolvidas no CIQ (Figura 3). OBS: As culturas congeladas ou liofilizadas devem ser cultivadas duas vezes antes de se realizar os testes de sensibilidade. Ateno especial manuteno do organismo (subcultivo mnimo) e seu armazenamento (ex.- 60oC ou menos) so particularmente importantes para as cepas CIQ E. coli ATCC 35218 e K. pneumoniae ATCC 700603, visto que tem sido documentada a perda espontnea do plasmdeo que codifica a -lactamase. Deve-se preparar um novo lote de cultivos se forem obtidos resultados aberrantes.
FIGURA 3. FlUXOGRAmA pARA mAnUsEiO DA cEpA DE REfERnciA nO cOntROlE DA qUAliDADE
Janeiro
1 Repique
2 Repique
gar MH inclinado
O 2 repique para o uso na 1 semana
2 semana
3 semana
4 semana
Geladeira
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2.
COntROlE DE TURbiDEZ pARA A PREpARO DO IncUlO 7

Para padronizar a densidade do inculo para um teste de sensibilidade, deve-se usar um con-
trole de turbidez de BaSO4, equivalente a uma soluo padro 0,5 de McFarland ou seu equivalente ptico (ex., suspenso de partculas de ltex). A soluo padro 0,5 de McFarland de BaSO4 pode ser preparada da seguinte maneira. Acrescenta-se uma alquota de 0,5mL de BaCl2 0.048 mol/L (1,175% v/v BaCl2 2H2O) a 99,5mL de H2SO4 0,18mol/L (1% v/v), homogeneizando constantemente para manter a suspenso. A densidade correta do controle de turbidez deve ser verificada usando um espectrofotmetro com fonte de luz de 1-cm e cubeta apropriada para determinar a absorbncia. A absorbncia da soluo padro 0,5 de McFarland dever variar de 0,08 a 0,10 utilizando um comprimento de onda de 625 nm. A suspenso de sulfato de brio deve ser transferida, em alquotas de 4 a 6 mL, para tubos com tampas de rosca do mesmo tamanho usados para cultivar e diluir o inculo bacteriano. Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, temperatura ambiente. O controle de turbidez de sulfato de brio deve ser agitado vigorosamente num misturador mecnico tipo vrtex antes de cada uso, verificando se est uniformemente trbido. No caso de precipitao visvel, o controle deve ser substitudo. As suspenses de partculas de ltex devem ser misturadas invertendo-as suavemente, e no num misturador tipo vrtex. Os controles de sulfato de brio devem ser substitudos, ou suas densidades verificadas, todo ms.
3.
MtODO DE DiscO-DifUsO
O mtodo de Kirby-Bauer ou disco-difuso recomendado para algumas combinaes micror-
ganismo/ antimicrobiano e muito utilizado em nosso meio. Sua praticidade, baixo custo e facilidade operacional facilitam a implantao deste mtodo nos laboratrios de microbiologia clnica. Alguns fatores relacionados ao preparo do meio de cultura e sua composio podem interferir no resultado final liberado pelo laboratrio. A confirmao da qualidade, esterilidade e composio do meio de cultura devem ser avaliadas atravs dos testes de CIQ. 3.1. FREqnciA DOs tEstEs DE cOntROlE DA qUAliDADE A freqncia dos testes de CIQ deve ser no mnimo mensal. Entretanto, as recomendaes nacionais e internacionais2,6 preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas se a estrutura ou a capacidade do laboratrio permitir. A introduo do programa de CIQ inicia-se com a realizao de testes dirios, passando, em fase posterior, para a realizao mensal dos testes. Teste dirio - Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos e documentar os resultados. Para passar a realizao dos testes de diria para mensal nenhuma das cinco leituras de halos, para cada combinao de agente/antimicrobiano, pode estar fora dos limites aceitveis.
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Teste mensal - Testar todas as cepas de CIQ no mnimo mensalmente e sempre que qualquer novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo lote de gar ou meio, um novo lote de discos ou outro fabricante de insumos). Documentar a realizao dos testes de controle da qualidade, anotando os nmeros dos lotes, meios de cultura, reagentes, discos de antibiticos testados nas respectivas datas e ms. Sempre que algum resultado dos testes mensal de controle da qualidade estiver fora da faixa aceitvel, faz-se necessrio implantar ao corretiva6. Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanas importantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes, estes devem ser realizados por cinco dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqncia mensal. 3.2. TEstE DE cOntROlE DA qUAliDADE DOs mEiOs DE cUltURA6 A) Meio de cultura O meio indicado para os testes de disco-difuso em organismos no fastidiosos o gar MellerHinton (MH). B) Espessura A espessura do meio deve ser de 4 mm uniformemente distribuda. Volumes mdios utilizados: 60 a 70 mL / placa de 150 mm e 25 mL / placa de 90 mm. C) Esterilidade Aps preparo das placas, examinar uma amostra significativa (10%) e aleatria de cada lote das placas para confirmar sua esterilidade, mediante sua incubao a 30C - 35C por, pelo menos, 24 horas. As placas devem ser usadas at sete dias aps o preparo, a no ser que sejam tomadas precaues adequadas, como embrulh-las em saco plstico, para minimizar o ressecamento do gar. D) pH O pH de cada lote de gar Meller-Hinton deve ser verificado quando o gar preparado. O meio gar dever ter pH entre 7,2 e 7,4 a temperatura ambiente aps solidificao. A medida do pH deve ser feita preferencialmente atravs de pHmetro apropriado, submerso em poro de meio solidificado temperatura ambiente. Caso esteja fora das especificaes, deve-se checar a procedncia do meio, a qualidade da gua e, eventualmente, preparar novo lote seguindo estritamente as recomendaes do fabricante6. Mtodos de verificao de pH (ver CLSI Norma M2-A96 ou norma substituta): Macerar uma quantidade suficiente de gar para submergir a ponta de um eletrodo do pHmetro calibrado. Ou permitir que uma pequena quantidade de gar solidifique-se em torno da ponta de um eletrodo do pHmetro calibrado. Ou em um bquer contendo o gar usar um eletrodo de superfcie devidamente calibrado.
E) Efeitos da timidina ou timina Excesso dessas substncias pode levar a falsas resistncias para sulfa-trimetoprim. Portanto, deve-se usar meio gar Meller-Hinton com o menor teor possvel de timina ou timidina
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O teor de timidina ou timina deve ser testado com Enterococcus faecalis ATCC 29212 com discos de sulfametaxol/trimetoprim. Um meio satisfatrio produzir halos de inibio ntidos com dimetro 20 mm. F) Efeitos de Variao nos Ctions Divalentes As variaes nos ctions divalentes, principalmente magnsio e clcio, afetaro os resultados dos testes dos aminoglicosdeos e da tetraciclina e variao nos nveis de clcio tambm afeta os resultados dos testes de daptomicina. Realizar teste de qualidade da prova para estes agentes antimicrobianos. G) Armazenamento de Discos Antimicrobianos Os discos devem ser armazenados conforme indicado a seguir. Refrigerar os recipientes a temperatura de 8C ou menos, ou congelar a -15C ou mais frio, num congelador comum (no do tipo frost-free) at o momento de usar. Os pacotes fechados de discos contendo drogas da classe de -lactmicos devem ser armazenados congelados, com exceo de um pequeno nmero de discos reservados para o trabalho cotidiano, que pode ser refrigerado (entre +4oC e +8oC) durante, no mximo, uma semana. Alguns agentes lbeis (ex., combinaes de cido clavulnico, carbapenmicos e cefaclor) devem ser armazenados congelados at o uso. Os recipientes fechados de discos devem ser retirados da geladeira ou congelador uma ou duas horas antes de serem usados, para que se equilibrem em temperatura ambiente antes de serem abertos. Aps retirar o cartucho de discos do pacote selado, coloc-lo num dissecador. Quando se usa um dissecador, este deve ser tampado hermeticamente, acrescentando-se um dissecante recomendado. Deve-se deixar que a temperatura do dispensador chegue temperatura ambiente antes de abri-lo. Evitar umidade excessiva, substituindo o dissecante sempre que o indicador mudar de cor. Quando no estiver em uso, o dispensador de discos deve ser mantido refrigerado. Apenas os discos dentro do prazo de validade do fabricante podem ser usados. Os discos devem ser descartados no vencimento. 3.3. TEstEs DE cOntROlE DA qUAliDADE DA pROvA E DO pERfil DE sEnsibiliDADE Falhas na deteco do padro de resistncia podem estar relacionadas a diversos fatores como: m qualidade do meio de cultura, disco com baixa concentrao de antimicrobiano, falhas no procedimento, inculo com concentrao de microrganismos fora do preconizado, tempo e temperatura de incubao inapropriados. O controle da acurcia dos testes realizados deve ser feito utilizando-se as cepas referncia para o gnero ou espcie do microrganismo ou classe de antimicrobiano que est sendo testado. Sero testados os antimicrobianos que fazem parte do antibiograma utilizado na rotina do laboratrio. Ex. Se o laboratrio testa para Enterococcus spp ampicilina, ciprofloxacina, clorafenicol, teicoplanina, vancomicina, quinupristin/dalfopristin, estes mesmos antimicrobianos sero testados com a cepa referncia S. aureus ATCC 25923 (ver abaixo) para avaliar a qualidade da prova realizada, e os halos encontrados sero comparados com os valores de referncia7.
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Os limites aceitveis para os halos encontrados para as cepas de referncias e os diversos antimicrobianos so descritos em CLSI norma M100-S167 ou norma substituta. A) Condies dos testes de controle da qualidade e cepas de referncia usadas para monitorar a acurcia dos testes de disco difuso Enterobactrias Meio: gar Meller-Hinton Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0,5 de McFarland Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas Cepas referncia: E. coli ATCC 25922 e E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase) Deteco de ESBL em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis Testes de triagem e confirmatrio de ESBL Meio: gar Meller-Hinton Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603 P. aeruginosa Meio: gar Meller-Hinton Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas Cepas de referncia: P. aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922 e/ou E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase) Acinetobacter spp, S. maltophilia e B. cepacia Meio: gar Meller-Hinton Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 20 a 24 horas Cepas de referncia: P.aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922 e/ou E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase) Staphylococcus spp Meio: gar Meller-Hinton Inculo: Suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro de 0,5 de McFarland. Incubao: 33 a 35oC, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para oxacilina, cefoxitina, meticilina, nafcilina e vancomicina.
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Cepas de referncia: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase), S. aureus ATCC BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de induo clindamicina) Enterococcus spp Meio: gar Meller-Hinton Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para vancomicina. Cepas de referncia: S. aureus ATCC 25923; E. faecalis ATCC 29212 para os testes de deteco de resistncia a altos nveis de aminoglicosdeos. S. pneumoniae ou Streptococcus spp Meio: gar Meller-Hinton com 5% de sangue de carneiro Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0,5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, CO2 a 5%, de 20 a 24 horas. Cepas de referncia: S. pneumoniae ATCC 49619 Haemophilus influenzae e H. parainfluenzae Meio: Haemophilus Test Medium ( HTM ) ver CLSI Norma M2-A9 Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0,5 de McFarland Incubao: 35oC 2 graus, CO2 a 5%, de 16 a 18 horas. Cepa de Referncia: H. influenzae ATCC 49247, H. influenzae ATCC 49766, E. coli ATCC 35218 (quando testar amoxacilina - cido clavulnico).
4.
MtODO DE DilUiO Em CAlDO OU GAR (CIM)

Os testes de diluio em caldo ou em gar so utilizados para a determinao da sensibilidade in
vitro de um microrganismo a um agente antimicrobiano. Por este mtodo se determina a concentrao inibitria mnima (CIM) de um antimicrobiano, ou seja, a menor concentrao de antimicrobiano que inibe o crescimento de um microrganismo. Esse mtodo tambm utilizado na confirmao de alguns perfis de resistncia detectados inicialmente por disco-difuso. Falhas na deteco do padro de resistncia pelos mtodos dilucionais podem estar relacionadas a diversos fatores, como: m qualidade do meio de cultura, concentrao de ctions ou pH fora da faixa recomendada, baixa concentrao de antimicrobiano, soluo estoque de antibitico com concentrao fora do preconizado, falhas no procedimento tcnico, inculo com concentrao de microrganismos fora do preconizado, tempo e temperatura de incubao no recomendadas. Os testes de CIQ avaliam os parmetros crticos para a deteco da resistncia. E devem ser realizados nas mesmas condies e pelo mesmo pessoal tcnico que realiza os testes de rotina.
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4.1. FREqnciA DOs tEstEs DE cOntROlE DA qUAliDADE 3,6 A freqncia dos testes de CIQ deve ser no mnimo mensal. Entretanto, as recomendaes nacionais e internacionais2,6 preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas se a estrutura ou a capacidade do laboratrio permitirem. A introduo do programa de CIQ inicia-se com a realizao de testes dirios, passando, em fase posterior, para a realizao mensal dos testes. Teste dirio Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos e documentar os resultados. Para passar os testes de dirios para mensais nenhuma das cinco leituras de CIM para cada combinao de microrganismo/antimicrobiano pode estar fora dos limites aceitveis. Teste mensal Testar todas as cepas de controle no mnimo mensalmente e sempre que qualquer reagente do teste for utilizado (ex. um novo lote de gar ou meio, um novo lote de antimicrobianos ou outro fabricante de insumos). Sempre que algum resultado dos testes mensais de controle de qualidade estiver fora da faixa aceitvel, faz-se necessrio implantar ao corretiva3 Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanas importantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes (ex.converso de leitura visual da CIM para leitura instrumental ou mudana no tipo de painel usado), estes devem ser realizados por cinco dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqncia mensal. 4.2. FREqnciA DOs tEstEs DE cOntROlE DE qUAliDADE pARA tEstEs DE tRiAGEm Testes em placas para triagem de resistncia a vancomicina e de resistncia de alto-nvel de aminoglicosdeos podem ser realizados no mnimo mensalmente, desde que o laboratrio realize os testes rotineiramente e os critrios de mudana do sistema de teste de dirio para mensal tenham sido atingidos. Se o teste de triagem no for realizado rotineiramente (< que uma vez/semana) ou se o agente antimicrobiano for lbil (ex. ampicilinas, meticilinas, imipenem, cido clavulnico, ceflacor e cefamandole), ser necessria a realizao de testes de controle de qualidade sempre que o teste de triagem for realizado em amostras clnicas. 4.3. TEstEs DE cOntROlE DA qUAliDADE DO mEiO DE cUltURA 4.4. MtODO DE DilUiO Em GAR8 Os meios indicados para os testes de diluio em gar so: gar Meller-Hinton ou gar Meller-Hinton com sangue lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de carneiro a 5%. A) Esterilidade Aps preparo das placas, examinar uma amostra significativa de cada lote (10%) para confirmar sua esterilidade, mediante sua incubao a 30C-35C, por pelo menos 24 horas. As placas devem ser usadas at sete dias aps o preparo, a no ser que sejam tomadas precaues adequadas, como embrulh-las em saco plstico e proteg-las da luz quando o antimicrobiano fotossensvel.
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B) pH O pH de cada lote de placas de gar Meller-Hinton ou gar Meller-Hinton com sangue lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de carneiro a 5% deve ser verificado quando o gar for preparado. O meio gar dever ter pH entre 7,2 e 7,4 temperatura ambiente aps solidificao. A medida do pH deve ser feita preferencialmente atravs de pHmetro apropriado, submerso em poro de meio solidificado temperatura ambiente. Caso esteja fora das especificaes, deve-se checar a procedncia do meio, a qualidade da gua e, eventualmente, preparar novo lote, seguindo-se estritamente as recomendaes do fabricante. Mtodos de verificao de pH ver CLSI Norma M7-A7 ou norma substituta. 4.5. MtODO DE DilUiO Em cAlDO (MicRODilUiO E MAcRODilUiO) 8 O meio indicado para os testes de diluio em caldo Meller-Hinton. A) Esterilidade Aps preparo do meio, examinar uma amostra significativa e aleatria (10%) de cada lote para confirmar sua esterilidade, mediante sua incubao a 30C-35C por, pelo menos, 24 horas. B) pH O pH de cada lote de caldo Meller-Hinton deve ser verificado quando o meio for preparado. O meio dever ter pH entre 7,2 e 7,4 temperatura ambiente. C) Efeitos da timidina ou timina Para determinar a adequao do meio para testes de sulfonamida e trimetropim, os testes de CIM podem ser realizados com E. faecalis ATCC 29212. Os pontos finais devem ser de fcil leitura (com uma reduo de 80% ou mais no crescimento, quando comparado com o controle). Se a CIM para trimetoprim-sulfametoxadol for 0,5/0,95g/mL, o meio poder ser considerado apropriado para uso. Os testes dilucionais para monitorar a acurcia dos resultados devem ser realizados com os antimicrobianos que fazem parte do antibiograma liberado pelo laboratrio. Para cada gnero ou espcie de bactrias ou classe de antimicrobiano so recomendadas cepas de referncia especficas. Os limites aceitveis para as concentraes CIM (g/mL) definidos para as cepas de referncias e os diversos antimicrobianos so descritos em CLSI norma M100-S16 ou norma substituta. 4.6. TEstEs DE qUAliDADE DA pROvA E DO pERfil DE sEnsibiliDADE A) Condies dos testes e cepas de controle de qualidade usadas para monitorar a acurcia dos testes de CIM (g/mL). Enterobactrias Meio Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions Diluio em gar: gar Meller-Hinton
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Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase) Deteco de ESBL em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis Testes de triagem de ESBL K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli Meio: Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions Concentrao de Antimicrobianos: Cefpodoxima 4g/mL ou Ceftazidima 1g/mL ou Aztreonam 1g/mL ou Cefotaxima 1g/mL ou Ceftriazona 1g/mL
Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 Testes de triagem de ESBL P. mirabilis Meio: Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions Concentrao de Antimicrobianos: Cefpodoxima 1g/mL ou Ceftazidima 1g/mL ou Cefotaxima 1g/mL ou
Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 Teste confirmatrio de ESBL Meio: Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions Concentrao de Antimicrobianos: E Cefotaxima 0,25 - 64g/mL Cefotaxima/cido clavulanico 0,25/4 - 64/4g/mL Ceftazidima 0,25 - 128g/mL Ceftazidima/cido clavulanico 0,25/4 - 128/4g/mL
Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
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P. aeruginosa e outros no-enterobacteriaceas (inclue Pseudomonas spp., e outros bacilos grannegativos no fastidiosos e no fermentadores exceto B. cepacia, B. mallei, B. pseudomallei, S. maltophilia e Acinetobacter spp.) Meio Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions Diluio em gar: gar Meller-Hinton
Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas Cepas de referncia: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase) Acinetobacter spp., Burkodelia cepacia, S. maltophilia Meio Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions Diluio em gar: gar Meller-Hinton
Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 20 a 24 horas Cepas de referncia: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase) Staphylococcus spp. Meio Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions + NaCl a 2% para oxacilina, meticilina e nafcilina; Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions suplementado com 50g/mL de clcio para daptomicina. Diluio em gar: gar Meller-Hinton, gar Meller-Hinton +NaCl a 2% para oxacilina, meticilina e nafcilina. Diluio em gar no recomendada atualmente para daptomicina. Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 33 - 35oC, ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para oxacilina, meticilina, nafcilina e vancomicina Cepas de referncia: S. aureus ATCC 29213; E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase); S. aureus ATCC BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de induo clindamicina) Teste de triagem com gar Oxacilina NaCl para S. aureus Meio: Diluio em gar: gar Meller-Hinton + NaCl a 4% m/v e 6g/mL de oxacilina. Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC, ar ambiente, 24 horas. Cepas de referncia: E. faecalis ATCC 29212 sensvel, E. faecalis ATCC 51299 - resistente.
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Teste de triagem com gar Vancomicina para S. aureus Meio: Diluio em gar: gar BHI e 6g/mL de vancomicina. Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC, ar ambiente, 24 horas. Cepas de referncia: S. aureus ATCC 29213 sensvel, S. aureus ATCC 43300 - resistente Enterococcus spp. Meio Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions ou Caldo MellerHinton ajustado com ctions suplementado com 50g/mL de clcio para daptomicina. Diluio em gar: gar Meller-Hinton. Diluio em gar no recomendada atualmente para daptomicina. Inculo: Mtodo de crescimento e suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. Incubao: 35oC 2 graus ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para vancomicina. Cepas de referncia: E. faecalis ATCC 29212 Teste de triagem para alto nvel de resistncia a aminoglicosdeos e resistncia a vancomicina para Enterococcus spp. Tabela 2D M100-S16 Meio Diluio em gar: gar BHI Antimicrobianos: 6g/mL de vancomicina ou 2000g/mL de estreptomicina ou 500g/mL de gentamicina.
Diluio em caldo: meio BHI Antimicrobianos: 1000g/mL de estreptomicina ou 500g/mL de gentamicina.
Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5 de McFarland. gar: colocar 10 L da suspenso 0,5 de McFarland na superfcie da placa Incubao: 35oC, ar ambiente, 24 horas. Cepas de referncia: E. faecalis ATCC 29212 - sensvel, E. faecalis ATCC 51299 - resistente.
M2 - C1 - 13
Captulo 2
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras

O CIQ tem como objetivo monitorar os seguintes aspectos: preciso (repetitividade) e acurcia (exatido) dos resultados obtidos nos testes de sensibilidade; desempenho dos reagentes utilizados nos testes; e desempenho dos tcnicos que executam os testes e realizam a leitura dos resultados. Esse objetivo mais facilmente atingido, com uso de cepas de referncia que tm sua sensibilidade aos antifngicos pr-determinada. No entanto, isso no dispensa a adoo de outras medidas que melhoram a qualidade dos resultados.
1.
CEpAs DE REfERnciA9,10
1.1. CEpAs REcOmEnDADAs pARA tEstEs DE CIM DE 48 hORAs pOR DilUiO Em cAlDO Faixa de leitura CIM: Ver tabela 4- M27-A2 ou norma substituta. Candida parapsilosis ATCC 22019. Candida krusei ATCC 6258. 1.2. CEpAs REcOmEnDADAs pARA tEstEs DE CIM DE 24 E 48 hORAs pOR micRODilUiO Em cAlDO Faixa de leitura CIM: Ver tabela 5- M27-A2 ou norma substituta. Candida parapsilosis ATCC 22019. Candida krusei ATCC 6258. 1.3. CEpAs REcOmEnDADAs pARA DiscO-DifUsO Candida parapsilosis ATCC 22019 Intervalo de valores do halo de inibio (dimetro em
mm), esperado em testes com discos de fluconazol (25 mg) - 22-33mm. Candida albicans ATCC 90028 Intervalo de valores do halo de inibio (dimetro em mm), esperado em testes com discos de fluconazol (25 mg) - 28-39 mm. Candida tropicalis ATCC 750 Intervalo de valores do halo de inibio (dimetro em mm), esperado em testes com discos de fluconazol (25 mg)- 26-37mm.
2.
MAnUsEiO E EstOcAGEm DAs cEpAs DE REfERnciA

2.1. PREpARO DAs cEpAs DE REfERnciA pARA ARmAZEnAmEntO As suspenses-padro, preparadas de acordo com o procedimento delineado a seguir, podem ser mantidas indefinidamente, sem risco significativo de alterao nos perfis de sensibilidade ao agente antifngico. Para preparar as cepas para armazenamento, deve-se obedecer ao procedimento abaixo:
M2 - C2 - 1
Cultivar os organismos em placas de Petri, durante uma noite, em gar Sabouraud-dextrose, ou em gar batata-dextrose, ou gar enriquecido com digerido de soja-casena.
Selecionar vrias colnias e realizar testes de sensibilidade apropriados, para demonstrar resultados esperados de sensibilidade, halo de inibio no mtodo de disco-difuso ou CIM na macrodiluio ou microdiluio (ver item anterior para halos de referncia ou Tabelas 4 e 5 do doc. M27A2 ou norma substituta para valores esperados de CIM).
Realizar uma subcultura das cepas, que produziram os resultados esperados, no mesmo meio usado para a cultura primria e incubar para que ocorra crescimento suficiente (em geral, de um a trs dias).
Examinar, com cuidado, a morfologia e cor das colnias para se certificar da pureza da cultura. Suspender as colnias na soluo estabilizante de glicerol a 50%, at fazer suspenso densa ou, se estiver liofilizado, suspender no meio apropriado. Distribuir pequenos volumes (uma ou duas gotas) da suspenso turva em recipientes estreis recomendados para congelamento. Colocar esses recipientes em freezer (preferencialmente 60oC ou -20oC ) ou em nitrognio lquido. Quando o estoque de recipientes estiver praticamente exaurido, repete-se o processo para produzir um novo estoque.
2.2. ARmAZEnAmEntO DAs cEpAs DE REfERnciA Para o armazenamento prolongado das cepas de referncia. As leveduras devem ser cultivadas em gar batata-dextrose e depois congeladas a -70oC. Alternativamente, as cepas de referncia (no Criptococcus) podem ser cultivadas suspendendo as clulas fngicas em soluo de glicerol a 50% em pequenos frascos e armazenados a -70oC. Para armazenamento de curto prazo, as culturas-padro de trabalho, ou seja, de uso rotineiro nos testes, devem ser cultivadas a 35C (+ 2C) em tubos de gar-Sabouraud ou gar sangue, em tubos inclinados, at se observar crescimento suficiente, sendo depois armazenadas temperatura de 2 a 8oC, enquanto no so utilizadas nos testes.
2.3. MAnUsEiO DAs cEpAs DE REfERnciA nOs TEstEs DE ROtinA Todas as culturas usadas em testes de sensibilidade a antifngicos devem ser semeadas em meio isentos de antibiticos, antes de serem submetidas s anlises. As cepas de controle de qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e mtodos empregados para testes de isolados clnicos. Para o uso das cepas de referncia nos testes de rotina, necessrio realizar os seguintes procedimentos: Retirar o recipiente da cultura do freezer ou frasco liofilizado. Deixar descongelar a suspenso congelada ou reidratar a cultura liofilizada.
M2 - C2 -
Realizar uma subcultura, bem distribuda, em placa de Petri, contendo gar batata-dextrose e incub-la a 35 C (+ 2C) durante 24 horas. Retirar quatro ou cinco colnias, realizar subcultura em gar Sabouraud-dextrose ou gar batata-dextrose e, aps 24h, realizar testes de sensibilidade. As cepas-padro, aps seu crescimento a 35C (+ 2C) por 24 horas em gar-batata-dextrose, devem ser mantidas em geladeira, sob temperatura entre 2 a 8C, como cultura-padro de trabalho para uso na rotina. Essas culturas devem ser substitudas de duas em duas semanas, pelo menos, por outras do estoque congelado. Realizar sempre os testes de sensibilidade das colnias cultivadas durante uma noite. Os repiques das culturas de trabalho so preparados a cada duas semanas pelo mtodo de transferncia seriada. A cada trs repiques da cultura de trabalho, deve-se descongelar uma nova amostra para uso em testes de rotina, para diminuir o risco de contaminao. Deve-se obter uma cultura de trabalho nova sempre que ocorrerem resultados aberrantes.
3.
FREqnciA DOs TEstEs DE COntROlE DA QUAliDADE

3.1. IntERvAlOs DE CIM As Tabelas 4 e 5 (CLSI M27-A2 ou norma substituta) apresentam os intervalos de preciso dos
valores de CIM para um nico teste de controle. Em geral, um dentre 20 valores de CIM, em srie de 20 testes consecutivos, pode estar fora do controle (i.e., fora da faixa definida), devido s variaes aleatrias do teste. Dois resultados consecutivos, com valores fora do esperado ou mais de dois resultados fora do esperado em 20 testes de controle consecutivos, exigem medidas corretivas. Toda vez que se tomar medidas corretivas, a contagem de 20 testes consecutivos recomea. OBS.: No confundir esse procedimento com o procedimento para estabelecer o desempenho satisfatrio dos testes de CIM visando realizao de testes de controle da qualidade mensais, ao invs de dirios. 3.2. TEstEs DE sEnsibiliDADE A AntifnGicOs Para monitorar o desempenho geral dos procedimentos para testes, recomenda-se incluir cepas de referncia apropriadas, todo dia que o teste for realizado. Esse procedimento apenas para estabelecer o desempenho satisfatrio dos testes de CIM e disco-difuso, com a finalidade de realizar testes de controle da qualidade mensais, ao invs de dirios. Esse procedimento no deve ser confundido com os passos que devem ser seguidos para tomar as medidas de correo. A freqncia do monitoramento dos testes pode ser diminuda se o laboratrio puder documentar desempenho satisfatrio com testes de controle dirios. Para esse fim, define-se desempenho satisfatrio da seguinte maneira: documentao que comprove que todas as cepas de referncia foram testadas durante cinco dias consecutivos de testes; e
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para cada combinao droga-microrganismo, nenhum dos cinco valores de CIM (i.e., valores de CIM obtidos para uma combinao droga-microrganismo durante cinco dias consecutivos de testes) ou dimetros dos halos de inibio podem estar fora do intervalo de acurcia definidos nas Tabelas 4 e 5 em CLSI M27-A2 ou norma substituta e item cepas de referncia para leveduras. Quando essas condies forem cumpridas, ser preciso testar cada cepa de referncia pelo menos uma vez por ms2,6 e sempre que qualquer reagente ou artigo plstico for mudado. Sempre que for constatado um valor de CIM ou dimetro de halo fora do intervalo de acurcia, usando o sistema de monitoramento mensal, ser necessrio recomear e manter os testes de controle dirios enquanto no se definir qual a fonte de erro para o resultado aberrante e a resoluo do problema no tiver sido documentada da seguinte maneira: realizar os testes com cepas de referncia apropriadas durante cinco dias consecutivos; para cada combinao droga-microrganismo, os cinco valores de CIM (ex., valores de CIM obtidos para uma combinao droga-microrganismo durante cinco dias consecutivos de testes) devem se manter dentro do intervalo de acurcia definidos nas Tabelas 4 e 5 (CLSI M27-A2); se a soluo do problema no puder ser documentada (ex., pelo menos um dos cinco valores de CIM ou dimetro do halo de inibio estiver fora do intervalo de acurcia) ser necessrio continuar os testes dirios de controle da qualidade; o retorno adoo de testes mensais exige documentao do desempenho satisfatrio durante cinco dias consecutivos, conforme j descrito; no caso de algumas drogas, os testes de controle de qualidade devem ser efetuados com freqncia maior do que uma vez por ms, devido degradao relativamente rpida da droga.
4. TEstEs DE cOntROlE DA qUAliDADE DO mEiO DE cUltURA E ARtiGOs DE PlsticO9

Para controle de lotes de meio de cultura e de artigos plsticos, o procedimento pode ser dividido nos passos abaixo. Testar cada novo lote de meio usado em tubos de macrodiluio, ou lote de placas de microdiluio, usando uma das cepas-controle da qualidade relacionadas na Tabela 4 CLSI M27-A2 ou norma substituta para determinar se os valores de CIM esto dentro do intervalo esperado; caso contrrio, rejeitar o lote. Pelo menos um tubo de cada lote deve ser incubado, sem inocular, durante o mesmo perodo necessrio para realizar o teste, de maneira a se verificar a esterilidade do meio. Os lotes novos do meio RPMI-1640 devem ser testados para verificar se seu desempenho ser aceitvel, antes de us-los em testes de isolados clnicos, visto que estudos recentes demonstram que alguns lotes no tm desempenho apropriado. O pH do meio RPMI-1640 pode variar de 6,9 a 7,1 e o pH do meio Meller-Hinton deve ficar entre 7,2 e 7,4. Registrar os nmeros de lote de todos os materiais e reagentes usados nesses testes.
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5. OUtROs TEstEs DE COntROlE UtiliZADOs nA mAcRODilUiO E micRODilUiO

5.1. COntROlE DO CREscimEntO Cada srie de tubos na macrodiluio deve incluir um controle de crescimento do meio RPMI 1640, sem agente antifngico, para avaliar a viabilidade das leveduras em teste. Na microdiluio uma coluna da placa de micro titulao destinada a esse controle. Em testes de caldo, o controle do crescimento tambm serve como controle da turbidez para a leitura dos pontos finais de reao. 5.2. COntROlE DE PUREZA Uma alquota de cada inculo deve ser colocada numa placa de gar Sabouraud-dextrose e incubada temperatura de 35C + 2C at haver crescimento suficiente para detectar possveis culturas mistas e prover novas colnias isoladas para o caso de se tornar necessrio repetio do teste. 5.3. COntROlE DA LEitURA DOs POntOs FinAis DA REAO A leitura dos pontos finais da reao deve ser monitorada, periodicamente, para minimizar possveis variaes nos resultados de testes de CIM, realizados por diferentes observadores. Todo pessoal de laboratrio que realiza esses testes dever ler, separadamente, um conjunto selecionado de testes de diluio. Os resultados devem ser registrados e comparados com os resultados obtidos por um tcnico experiente. As cepas de referncia, com valores de CIM pr-determinados, so particularmente teis para essa finalidade, especialmente, em testes com fluconazol, em que pode ocorrer o fenmeno de trailing.
6.
TEstE DA qUAliDADE DA pROvA E DO pERfil DE sEnsibiliDADE

A) Condies dos testes e cepas de controle da qualidade usadas para monitorar a acurcia dos testes de CIM (g/mL) Meio: Diluio em caldo: Meio RPMI -1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho fenol) pH 7,0 0,1. Inculo: As diferentes operaes de preparo do inculo so as abaixo. Deve-se realizar a subcultura (repique) dos organismos, em tubos estreis com gar Sabouraud dextrose ou gar batata-dextrose, executando passagens para assegurar sua pureza e viabilidade. O inculo deve ser preparado escolhendo-se cinco colnias com dimetro de ~1mm de cultura de 24 horas para espcies de As colnias devem ser suspensas em 5mL de soluo salina estril 0,145 mol/L (8,5g/L NaCl; salina a 0,85%). A suspenso resultante deve ser colocada em agitador de vrtex durante 15 segundos e a densidade celular, ajustada com espectrofotmetro, acrescentando-se soluo salina suficiente para obter a transmitncia equivalente de uma soluo-padro da escala 0,5 de McFarland em comprimento de onda de 530nm. Esse procedimento fornece uma suspenso-padro de levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 clulas por mL A suspenso de trabalho produzida fazendo-se uma diluio 1:100 seguida de uma diluio de 1:20 da suspenso-padro com meio lquido RPMI 1640, resultando em concentrao de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 clulas por mL. Incubao: A temperatura de incubao deve permanecer em 35 C.
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Captulo 3
Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizado por Mtodos Automatizados8

1. ElEmEntOs EssEnciAis DO sistEmA DE GEstO DA qUAliDADE
1.1. FAsE pR-AnAlticA A) Representante/empresa responsvel pelo equipamento Manual de funcionamento do equipamento no idioma do pas. Registro nacional e certificado de funcionamento in situ do equipamento e de qualidade dos lotes dos reagentes. Plano de manuteno preventiva e corretiva do equipamento. Programa de capacitao para o uso apropriado do equipamento. Fornecimento de cepas ATCC para o controle interno de qualidade de acordo com as especificaes do equipamento. Atualizao do software a cada mudana. Comunicao escrita dos problemas registrados que impliquem em mudana da qualidade dos resultados. B) Usurio Manual de procedimento do laboratrio para o uso do sistema automatizado. Capacitao de pessoal no uso do equipamento. Programa de manuteno preventiva e corretiva do equipamento. Notificao, autoridade competente, de forma escrita, dos problemas registrados que impliquem em mudanas na qualidade dos resultados obtidos.
1.2. COntROlE IntERnO DO lAbORAtRiO A) Controle de temperatura Registro dirio da temperatura ambiental. Registro dirio da temperatura interna do equipamento. Registro de alertas do equipamento. Registro das medidas corretivas tomadas. B) Preparo e padronizao do inculo Se for utilizado turbidimetro, deve-se calibrar e registrar diariamente transmitncia. Definir e registrar a forma e a freqncia do controle de esterilidade da soluo de trabalho. 1.3. COntROlE DA qUAliDADE DOs pROcEssOs AUtOmAtiZADOs A) Lista de cepas de referncia recomendadas para testes de identificao Recomenda-se testar no mnimo uma cepa de referncia por painel.
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Para painis de Gram negativos: E. coli 25922 (qualidade da prova). P. mirabilis 7002 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-). K. pneumoniae 13883 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-). Para painis de Gram positivos: S. aureus 29213 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram+). E. faecalis 29212 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram+). Para painis de Levaduras: C. albicans 14053 (qualidade da prova de identificao de levaduras). B) Lista de cepas de referncia recomendadas para testes de sensibilidade Para painis de Gram negativos: E. coli 25922 (qualidade da prova). E. coli 35218 (para inibidores de lactamase). E. coli 51446 (ESBL). P. aeruginosa 27853 (concentrao de ctions e pH com aminoglicosdeos). E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT). Para painis de Gram positivos: S. aureus 29213 (qualidade da prova). E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT). E. faecalis 51299 (resistncia a vancomicina). E. coli 35218 (para inibidores de lactamase). 1.4. VAliDAO A) Protocolo de controle da qualidade dirio Prova diria por 5 dias Sem erro, seguir com o controle peridico. 1 de cada 5 ensaios apresentarem erro, tomar aes corretivas: erro bvio6: testar novamente no mesmo dia e, se o resultado for o esperado, continuar com as provas diria. erro no bvio6: testar novamente no mesmo dia e controlar por cinco dias consecutivos. Se todos os resultados estiverem dentro do esperado, passar ao controle mensal. B) Protocolo de controle da qualidade peridico Recomenda-se realizar os controles a cada ms, utilizando as listas de cepas de referncia acima mencionadas. Tambm deve ser realizado um controle a cada troca de lote do painel. Se os testes mensais apresentarem erros, tomar aes corretivas e retornar aos testes de CIQ dirios.
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Referncias Bibliogrficas
1.
WHO. Blood Safety and Clinical Technology Guidelines on Standard Operating Procedures for MICROBIOLOGY. http://w3.whosea.org/EN/Section10/Section17/Section53/Section482_ 1790.htm
2.
Manual de Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco em Servios de Sade. http://www. anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/index.htm
3. 4.
Oplustil, CP et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. So Paulo: SARVIER, 2004. Reference Strains: How many passages are too many? Technical bulletin ATCC n 6. ATCC Connection 23(2):6-7,2003
5.
Ivonne D. Rankin. Aseguramiento de Calidad/Control de Calidad (AC/CC) 65. In: Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana. Editora Coordinadora Marie B. Coyle American Society for Microbiology - Organizacion Panamericana de la Salude. 2005
6.
NCCLS/CLSI - Padronizao dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Discodifuso: Norma Aprovada Nona Edio. Documento M2-A9 Vol.26 N 1. Substitui a Norma M2-A8. Vol. 23 N 1
7.
NCCLS/CLSI - Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 16o Suplemento Informativo. Documento M100S16. Vol. 26 N 3 - Substitui a Norma M100-S15 Vol. 25 N 1.
8.
NCCLS/CLSI - Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio para Bactria de Crescimento Aerbico: Norma Aprovada Sexta Edio. Documento M7A7. Vol. 26 N 2. Substitui a Norma M7-A6 Vol. 23 N 2.
9.
NCCLS/CLSI - Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para Determinao da Sensibilidade de Leveduras Terapia Antifngica: Norma Aprovada Segunda Edio. Documento M27-A2 Vol. 22 N 15 Substitui a Norma M27-A. Vol. 17 N 9
10.
NCCLS/CLSI - Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Guideline. NCCLS document M44-A Volume 24 Number 15.
11.
Programa de Acreditao de Laboratrios Clnicos PALC. Lista de requisitos PALC. Sociedade Brasileira de Patologia Clnica/ Medicina Laboratorial (SBPC/ML), 2004. http://www.sbpc. org.br/files/pdf/Requisitos_PALC_versao2004.pdf
12.
Relatrio final de Comit de Expertos en la evaluacin del desempeo para la identificacin bacteriana y antibiograma con mtodos automatizados Brasilia, Brasil. 26 -28 octubre 2004. Vol. 23 N 1
13.
Reimer, LG and Carrol, K.C. Procedures for Storage of Microorganisms. In: Manual of Clinical Microbiology, cap.7, 67-73, 8 edio, 2003.
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ANEXOS
AnEXo I: PROcEDimEntOs UtiliZADOs pARA mAnUtEnO E EstOcAGEm DE micRORGAnismOs
Microrganismos Fungo filamentoso Mtodos de estocagem Subcultivo leo mineral Seco Freezer gua destilada Liofilizado gua destilada Seco Agar batata dextrose Protozorios Freezer Crio conservante ----------Terra ou silica gel Glicerol e DMSO1 -----Skim milk, glicerol, sacarose e DMSO1 ----Meio nutriente -----Glicerol ou DMSO1 ou sangue + nutriente Sangue, caldo nutriente + DMSO1 nutriente SPGA2 SPGA2 -------------Sucrose, TSB3 + glicerol Skim milk, sucrose,TSB3 + glicerol Skim milk, sucrose Temperatura de Estocagem 4 a 25C ambiente ambiente - 70C -196C ambiente Viabilidade 2 a 10 anos 1 a 40 anos 1 a 4 anos 2 a 30 anos 1 a 10 anos
4C
2 a 30 anos
Leveduras
ambiente ambiente - 70C
1 a 2 anos 1 a 2 anos
- 70C -196C
Congelador Vrus Subcultivo Freezer Liofilizado Bactrias Gram Positivas Subcultivo leo mineral Congelador
- 20C 40C 4C - 70C -196C 4C ambiente 4C - 20C 6 meses 1 a 30 anos 6 a 10 anos 2 a 3 meses 6 meses a 2 anos 1 a 3 anos
Freezer
- 70C a -196C
1 a 30 anos
Liofilizado
4C
30 anos
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Microrganismos Estreptococos
Mtodos de estocagem Congelador Freezer Liofilizado
Crio conservante Skim milk, sangue de coelho Skim milk, sangue de coelho Skim milk, sangue de coelho ------------Sucrose,lactose Lactose, sucrose, TSB3 + glicerol ou Skim milk Skim milk + sucrose + lactose -----------------glicose Skim milk, glicose Skim milk + lactose Skim milk Skim milk Skim milk
Temperatura de Estocagem - 20C - 70C a -196C 4C ambiente 4C - 20C - 70C a -196C
Viabilidade 90 dias 90 dias a 1 ano 6meses a 30 anos 1 a 3 meses 1 a 2 anos 1a 2 anos 2 a 30 anos
Bactrias Gram Negativas
Subcultivo leo mineral Congelador Freezer
Liofilizado Bactrias formadoras de esporos
4C
30 anos 2 meses a 1 ano 1 ano 1 a 2 anos 1 a 2 anos 2 a 30 anos 30 anos 3 a 5 anos 3 a 5 anos 16 a 30 anos
Subcultivo leo mineral Seco Congelador Freezer Liofilizado
ambiente 4C ambiente - 20C - 70C a -196C 4C - 20C - 70C a -196C 4C
Micobactrias
Congelador Freezer Liofilizado
Adaptada de: Reimer, LG and Carrol, K.C. Procedures for Storage of Microorganisms. In: Manual of Clinical Microbiology, cap.7, 67-73, 8edio.,2003
1 2
MSDS - dimetil-sulfxido SPGA - sucrose fosfato glutamato contendo 1% de albumina bovina. TSB - caldo de soja trptica
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AnEXo II: PlAnilhAs pARA cOntROlE intERnO DA qUAliDADE
(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DA CALIBRAO DE PIPETAS E MICROPIPETAS Marca:....................................................................... Agente calibrador: Metodologia: Prprio Laboratrio Espectrofotometria Volume:...................................................... Fabricante Verificao por comparao
Terceirizado Gravimetria
REGISTRO DADOS VALOR OBTIDO CONFORMIDADE SIM NO
DATA
CERTIFICADO N.
Informao: Especificao da exatido, de acordo com a ASTM. Capacidade nominal (L) 0,5 a 2,0 3,0 a 5,0 10 20 50 100 Variabilidade (+/- L) 0,006 0,01 0,02 0,03 0,05 0,08
Obs.: Para verificao de pipetas no prprio Laboratrio, h necessidade de equipamento prprio ou outra calibrada, para comparao espectrofotomtrica.
Data:........./........../............ ________________________________________ Assinatura/ Visto do Diretor do Laboratrio
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DA CALIBRAO DE REFRATMETRO OU DENSMETRO Refratmetro: Densmetro: Marca:........................................................................................
Freqncia da verificao: Semanal Fase preliminar: Acertar a D=1,000 com gua reagente tipo I ou II. Amostra-controle: Soluo de NaCl a 3 % = 1,015 Amostra-controle: Soluo de NaCl a 5 % = 1,022 Amostra-controle: Soluo de Sacarose a 9 % = 1,034
Critrio de aceitabilidade: +/- 0,010
REGISTRO Parmetros DATA VALOR OBTIDO ASSINATURA Conformidade SIM NO
M2 - A - 4
(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DA ESTERILIDADE DOS MEIOS DE CULTURA Meio de cultura: ......................................... Critrio de Aceitabilidade: Estril Fabricante: ...................................... Lote:..................
REGISTRO DATA DA PREPARAO Crescimento bacteriano SIM NO DATA DA LIBERAO
ASSINATURA
M2 - A - 5
(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DO CONTROLE INTERNO DA GUA REAGENTE gua obtida por: Periodicidade: Destilao Diria Deionizao Semanal Mensal Osmose reversa
Outro processo (citar): .........................................................................................
Marca do condutivmetro: ....................................................................................................................... Critrio de aceitabilidade: Dentro das especificaes da gua reagente Temperatura da medio: ............ C
REGISTRO Data Valor obtido* Conformidade Sim No Tipo de gua Reagente I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; I; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; II; III III III III III III III III III III III III III III III III Assinatura
Obs: 1. Quando o Condutivmetro permitir, assinalar o valor obtido em mmho, na coluna*. 2. Quando o Condutivmetro possuir apenas indicador luminoso, indicar nas colunas de conformidade, se a gua Reagente est conforme ou no-conforme.
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DO CONTROLE DA QUALIDADE DOS CORANTES Corante: GRAM ZIEHL OU SIMILAR OUTRO (Citar): ...............................................
Lote: .............................................. Critrio de aceitabilidade: Colorao das bactrias de acordo com sua classificao
REGISTRO Data Conforme No-conforme Assinatura
M2 - A - 7
(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DO CONTROLE DA TEMPERATURA Banho Maria a .........C Estufa a .........C Equipamento automatizado a ...........C Ms: ........................................................... Ano: ...........................................................
Nmero: .................................................................... Localizao: ...............................................................
REGISTRO (descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: 33 35C) Data Hora Tcnico 35C 36C 37C 38C 39C Outra
Manuteno especial: 1. 2. 3. Limpeza/Troca de gua Comprovao da temperatura com termmetro externo Outros procedimentos compatveis:..............................................
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DO CONTROLE DA TEMPERATURA Refrigerador (Geladeira) Nmero:......................................... Localizao:................................... Cmara Fria Ms:................................................. Ano:................................................. REGISTRO (descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: 2 8C) Temperatura em C Dia Hora Tcnico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Manuteno especial: 1. 2. 3. Descongelamento/Limpeza Comprovao da temperatura com termmetro externo de mxima e mnima Outros procedimentos compatveis:............................................................... 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C Outra
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DA MANUTENO DA AUTOCLAVE E DO CONTROLE DA ESTERILIZAO Nmero do aparelho:............................................. Fabricante:................... Modelo:....................... Localizao:............................................................ Ms:.............................. Ano:.............................
REGISTRO Temperatura Verificao do Controle da Limpeza usada emC nvel da gua esterilidade mensal
Data Hora Tcnico
Obs.:
Manuteno especial: 1. 2. 3. Limpeza Comprovao da esterilizao, por processos qumicos, fsicos ou biolgicos. Outros procedimentos compatveis:...........................................................................
M2 - A - 10
(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DO CONTROLE DA TEMPERATURA Banho Maria a 56C Nmero: ......................................... Ms:................... Ano ................. Localizao:.....................................
REGISTRO (descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: 54-56C) Data Hora Tcnico 54C 55C 56C 57C 58C Outra
Manuteno especial: 1. 2. 3. Limpeza/Troca de gua Comprovao da temperatura com termmetro externo Outros procedimentos compatveis:..............................................
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DA CALIBRAO E MANUTENO DE CENTRFUGAS Centrfuga: Centrfuga Clnica Marca:...................... Micro-centrfuga Modelo:.................. Nmero: .........................................
Freqncia da verificao e aceitabilidade: De acordo com o POP especfico.
REGISTRO Parmetros DATA R.P.M. ASSINATURA Conformidade SIM NO
Obs.: 1. Para a centrfuga clnica, de dessorao, anotar somente a conformidade com o uso dirio. 2. Para outras centrfugas, anotar na coluna R.P.M. o valor das rotaes encontradas com o Tacmetro. 3. Checar ainda, limpeza, vibraes, calibrao do relgio (se houver), vedao da tampa, carves, etc. 4. Copiar este formulrio e preencher um para cada aparelho existente.
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DO CONTROLE DA TEMPERATURA Congelador (Freezer) Nmero: .......................................... Ms: ................................................. REGISTRO (descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: -18 - -22C) Temperatura em C Dia Hora Tcnico -15C -16C -17C -18C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Manuteno especial: 1. 2. 3. Descongelamento/Limpeza Comprovao da temperatura com termmetro externo de mxima e mnima Outros procedimentos compatveis: ................................................................... -19C -20C -21C -22C -23C Outra Localizao: ..................................... Ano: ................................................
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(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DAS AES CORRETIVAS (COLOCAR O NOME DO APARELHO) Nmero:.......................................... Localizao:.................................... Ms:...................................... Ano:......................................
REGISTRO Se for encontrada alguma no conformidade, anotar a causa do problema e as aes corretivas executadas. Causa da no conformidade
Data
Aes corretivas
Assinatura
Obs.: ........................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................... Data: ...... / ...... / ......... ________________ Supervisor do Setor Data: ...... / ...... / ......... ________________ Gestor de qualidade
________________________________________ Assinatura/ Visto do Diretor do Laboratrio
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AnEXo III: RElAtRiOs DE REGistRO DA REAliZAO DO COntROlE IntERnO DA QUAliDADE - HOspitAl

(Nome do Laboratrio e Logomarca) REGISTRO DA REALIZAO DO CIQ Ms:............................ Ano:............................
Gram-positivos Halo (cm)/ CIM (g/mL)
Data
Microrganismos E. faecalis ATCC 29212 E. faecalis ATCC 51299 S. aureus ATCC 25923 S. aureus ATCC 29213 S. aureus ATCC 43300 S. pneumoniae ATCC 49619
Teste realizado
Obs:
Aes corretivas: 1. 2. Realizao de novo teste Outros procedimentos compatveis:...............................................................
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Gram-negativos Halo (cm)/ CIM (g/mL)
Data
Microrganismos E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 E. coli ATCC 51446 K. pneumoniae ATCC 13883 K. pneumoniae ATCC 700603 P. aeruginosa ATCC 27853 P. mirabilis ATCC 7002
Teste realizado
Obs:
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Leveduras Halo (cm)/ CIM (g/mL)
Data
Leveduras C. albicans ATCC 14053 C. parapsilosis ATCC 22019 C. kruzei ATCC 6258 C. albicans ATCC 90028 C. tropicalis ATCC 750
Teste realizado
Obs:
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Mtodos automatizados
Data
Microrganismos E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 E. coli ATCC 51446 K. pneumoniae ATCC 13883 P. aeruginosa ATCC 27853 P. mirabilis ATCC 7002 E. faecalis ATCC 29212 E. faecalis ATCC 51299 S. aureus ATCC 29213 C. albicans ATCC 14053
Teste realizado
Leitura
Obs:
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AnEXo IV: RElAtRiOs DE REGistRO DA REAliZAO DO COntROlE IntERnO DA QUAliDADE - LACEN

REGISTRO DA REALIZAO/AVALIAO DO CIQ Ms:............................ Ano:............................
Cepa de referncia ........................................... Colocar o Nome da Cepa (ex. E. coli ATCC 25922) Data realizao do teste Adequao dos Resultados
Hospital
Teste realizado
Halo (cm)/ CIM (g/mL)
Ao Hospital
Ao LACEN
M2 - A - 19

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6. Teste de qualidade da prova e do perfil de sensibilidade

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PARmEtROs pARA Um PROGRAmA DE COntROlE DA QUAliDADE2,3

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Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

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FIGURA 1. PROpAGAO DA cUltURA DE BActRiAs4

Cultura de estoque 1 passagem

Cultura de trabalho 2 passagem

Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

E. coli ATCC 51446

K. pneumoniae ATCC 13883

K. pneumoniae ATCC 700603 - Cepa produtora de -lactamase de espectro ampliado

P. aeruginosa ATCC 27853 Sensvel aos agentes anti-pseudomas

P. mirabilis ATCC 7002

Qualidade da prova em testes automatizados de identificao de bacilos gram-negativos

Tecnologia em Servios de Sade

C. parapsilosis ATCC 22019

C. kruzei ATCC 6258

C. albicans ATCC 90028

C. tropicalis ATCC 750

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Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia

FIGURA 2. FlUXOGRAmA pARA mAnUsEiO E EstOcAGEm DA cEpA DE REfERnciA

gar de acordo com o microrganismo especfico

Verificar a viabilidade, pureza das colnias

2 placas de gar especfico + 1 gar Seletivo

Identificao e confirmao Provas Bioqumicas e Colorao de Gram

Teste de perfil de sensibilidade (Antibiograma)

Fazer o banco 2006 2007 2008

Mai. Jun. Jul. Armazenar todas

Out. Nov. Dez.

Freezer - 20C ou - 60C

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FIGURA 3. FlUXOGRAmA pARA mAnUsEiO DA cEpA DE REfERnciA nO cOntROlE DA qUAliDADE

O 2 repique para o uso na 1 semana

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COntROlE DE TURbiDEZ pARA A PREpARO DO IncUlO 7

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MtODO DE DilUiO Em CAlDO OU GAR (CIM)

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Diluio em caldo: meio BHI Antimicrobianos: 1000g/mL de estreptomicina ou 500g/mL de gentamicina.

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Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras

MAnUsEiO E EstOcAGEm DAs cEpAs DE REfERnciA

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