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Técnicas Básicas de Biologia

Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ

Visão da Apresentação
„ PCR
„ Bibliotecas genômica e de expressão
„ Fragmentação - digestão
„ Separação - eletroforese
„ Clonagem molecular
„ Sequênciamento
„ Southern, Northern e Western blotting

By Diamar

Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas,
pois a maioria dos cromossomo já estão
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratório clínico.

Mapas Genéticos, Citológicos e
Físicos

EST – Sequências expressas marcadas.
cDNA curtos que ligam mapas físicos a
genéticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrição

By Diamar

Solange Farah By Diamar . Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro.

Enzimas de Restrição „ 1953 – a eficiência de replicação de um bacteriófago dependia da célula hospedeira „ Verificou-se. então. a presença de nucleases „ Bactéria restringe o crescimento do fago e protege o seu DNA metilando-o (modificando) „ Fenômeno chamado restrição/modificação „ Advento das endonucleases de restrição „ Sítio é normalmente uma palíndrome By Diamar .

Enzimas de Restrição (continuação) Palíndrome: ARARA ARARA OMO OMO ANA ANA By Diamar .

Enzimas de Restrição (continuação) „ Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de bases „ Cortes com extremidades abruptas ou coesivas „ Primeira letra maiúscula é gênero e as duas outras minúsculas são espécies „ 1073 – foram usadas para clonagem molecular „ Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outra espécie „ Fragmentos separados por eletroforese By Diamar .

Enzimas de Restrição (continuação) By Diamar .

By Diamar .

Vídeo de Enzima de Restrição By Diamar .

poliacrilamida „ Separa proteínas por cargas e peso molecular „ Separa ácido nucléicos por peso molecular By Diamar . Eletroforese „ Já conhecida desde 1930 „ Difundida em 1950-1960 „ Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico „ Usa um substrato: papel. agarose.

Eletroforese Fonte de eletroforese Vertical . + Visualização do gel de agarose - Horizontal + By Diamar .

Eletroforese By Diamar .

Vídeo de Eletroforese By Diamar .

Clonagem Molecular „ Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas „ Primeiro: inserto + vetor = rDNA „ Segundo: rDNA + célula hospedeira = transformação By Diamar .

By Diamar .

Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um gene específico. com uma característica desejada. e transfere este gene para outro organismo vivo Célula humana Bactéria DNA Plasmídeo Transformação DNA da bactéria Digestão Enzima de restrição Tesoura genética rDNA Clonagem DNA da célula humana By Diamar .

o que antes levaria dezenas ou centenas de gerações By Diamar . O DNA recombinante 8 Não se limita a organismos de uma mesma espécie 8 A compatibilidade sexual torna-se irrelevante 8 Permite modificações em uma única geração.

Vídeo de Clonagem Molecular By Diamar .

YACs. Vetor „ São moléculas de transporte „ Moléculas de DNA „ Diversos tipos: plasmídeos. vírus. „ Diferenças de tamanho de inserto „ Podem ter comportar linear e/ou circular By Diamar . cosmídeos. fagos. etc.

Vetor (continuação) Vetores de expressão procarióticos „ Promotores fortes „ Sítios de ligação a ribossomos „ Sítios de clonagem Vetores de expressão eucarióticos „ Origem de replicação eucariótica „ Região de controle de transcrição e tradução. poliadenilação de mRNA. capping „ Sinais especiais para processamento e secreção By Diamar .

Polylinker „ Gene de resistência a antibióticos „ Origem de replicação „ Gene repórter By Diamar . Vetor (continuação) Características gerais „ Região promotora „ Sítio Múltiplo de Clonagem .

Vetor (continuação) PLASMÍDEOS: „ Penetra naturalmente nas bactérias „ Fita dupla „ Circular „ Extracromossômico „ Resistência a antibióticos „ Vetores shuttle „ Insertos até 4000 pb „ pUC 18. pUC 19 By Diamar .

Vetor
(continuação)

FAGOS
„ Vírus de bactérias
„ Fago λ é o mais utilizado
„ Fita dupla linear
„ Recirculariza durante a infecção na bactéria
„ Aceita até 20 mil pb

By Diamar

Vetor
(continuação)

COSMÍDEOS
„ Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
„ Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do
fago para infectar bactéria
„ Possuem seqüências cos
„ Aceitam insertos de até 50 mil pb

By Diamar

COSMÍDEOS

By Diamar

centrômero e origem de replicação ARS: Seqüência de replicação autônoma CEN: Seqüências centroméricas By Diamar . Vetor (continuação) YACs (Yeast Artificial Chromosome) „ Células hospedeiras as leveduras „ Comportam-se como cromossomos „ Aceitam 400 mil pb „ Possuem seqüências de DNA específicas de levedura: telômero.

Insulina humana .Hormônio sexuais By Diamar .Vacina da Hepatite B .Engenharia Genética – Produção em série .Hormônio de crescimento .

Sequenciamento „ Frederick Sanger (1977). Inglaterra „ Segundo Prêmio Nobel „ Síntese de DNA in vitro por término didesoxi „ Mapa físico dos genes e dos cromossomos By Diamar .

Sequenciamento (continuação) „ Hood: Semi-automatizado (1986) „ Venter: Genoma de bactéria usando ddNTPs fluorescentes automatizados. robóticas e PCR (1995) „ Perkins-Elmer Corp: Comercializado o Sequenciamento totalmente automatizado (1999) By Diamar .

Necessário para ligação Ácido ribonucleico fosfodiéster Ácido desoxirribonucleico 5’ 3’ Polimerização By Diamar . Considerações P P P A P A C P P C C5 BN G C5 BN G C4 C1 T C4 C1 T U Ribose Pentose C3 C2 C3 C2 OH OH OH OH NTP dNTP (Didesoxinucleotídeo) ddNTP O .

A C G T DNA molde Primer DNA polimerase T G C A Fragmento 1 ddNTP dNTP dNTP dNTP C A Fragmento 2 ddNTP dNTP G C A Fragmento 3 ddNTP dNTP dNTP By Diamar . Estuda a integridade da sequência de um DNA molde. Analisa diferentes tamanhos de fragmentos formados a partir de um primer e da inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e Sequenciamento ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.

Sequenciamento automatizado .

Vídeo do Sequenciamento (Cycseqpc) By Diamar .

Southern Blotting „ E. M. Southern (1975) „ Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose „ Transferidos para membranas por ação capilar „ DNA é desnaturado antes ou durante a transferência „ Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana „ Detecta polimorfismo de DNA ou mutação By Diamar .

. detecção de inserções.Resolução dos fragmentos com eletroforese em gel de agarose. Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado.Hibridação com uma sonda de DNA ou RNA marcada com radioatividade ou quimioluminescentes Aplicação: Alterações em um único nucleotídeos. . deleções e rearranjos. ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico.Transferência do DNA para membrana de nylon.Southern blot Descrição: .Digestão do DNA em teste com enzimas de restrição. . fragmentos de cromossomo. By Diamar .

Defeito gene humano ligado ao X molecular: varia de deleção de receptor de andrógeno completa do gene a mutações de hibridando no genoma ponto nos domínios de ligação de digerido do paciente. sem útero ou tubas uterinas. na infância). andrógenos ou ligação ao DNA da proteína receptora de andrógeno. Sonda de cDNA para o hérnias. Testículos no abdome ou Exemplo da especificidade das canal inguinal (confundidos com sondas. By Diamar .Síndrome da insensibilidade androgênica. XY. 1:20. Vagina em fundo de saco.000. Southern blot 46.

Vídeo de Southern blot (DNA _DetectivePC) .

Northern blotting „ Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose „ RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) „ Sensibilidade a RNAses „ Transferência para membrana por ação capilar „ Sondas de RNA ou DNA para hibridar By Diamar .

Northern blotting (Continuação) „ Úteis em estudo de expressão gênica „ Estudo de diferentes tecidos „ Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo By Diamar .

sonda de α1. Northern blotting Marcadores rRNA RNAs totais de raízes (R).tubulina – hibrida todos By Diamar .tubulina – hibrida só flores C .sonda de α3. folhas (L) e flores (F). A – sonda de α-tubulina – hibrida todos B .

Western blotting „ Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida „ Separação e caracterização de proteínas „ Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação „ Transferência para membrana por força elétrica By Diamar .

Western blotting (continuação) „ Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal „ Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo „ Informa o tamanho e a quantidade das proteínas By Diamar .

Western blotting By Diamar .

Western blotting Análise de proteínas por anticorpos específicos após eletroforese e transferência para membrana. By Diamar .

Vídeo Immunoblotting (3EIMMBLOT) .

pouco frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de DNA „ Aplicação: compara alelos normais e afetados para cada mutação estudada. RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição „ Uso de enzimas de restrição „ Produção de fragmentos de DNA de tamanho adequados para serem utilizados „ As Enzimas de restrição são: previsíveis. .

Mapa de Restrição By Diamar .

RFLP By Diamar .PCR .

RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição Um caso de erro inato do metabolismo: G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase) By Diamar .

. F1 autopoliniza: 1:2:1 Ecotipo diferentes: C- Colombia. Southern blotting com sonda azul e verde. N- Niederzenzes e H – Heterozigoto. F1 é heterogênio possui fragmentos de ambos os genitores.RFLP de Planta DNAs genômico de Arabidopis é digerido com EcoRI.

Ex: beta-talassemia. Aplicação: . Revela uma única alteração de base. Oligonucleotídeo alelo- específico (ASO) Descrição: .Alelos de composição conhecida. A análise é restrita a mutação familiar conhecida ou para distúrbios genéticos com nº finito de mutações diferentes. Distingue hetero ou homozigotos para a sequência. Mutação é conhecida. By Diamar .Hibridação preferencial de sonda marcada para testar DNA com composição de bases complenmentar única.

FISH Hibridação in situ com fluorescência „ Detecta DNA localizados dentro de cromossomos „ Usa lâminas de microscopia „ Cromossomos estão em metáfase. anáfase e interfase „ Usa sondas de DNA específicas By Diamar .

FISH (Hibridação in situ com fluorescência) Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no cromossomo 15 paterno. By Diamar .

Cromossomo humano 4 hibrida com cromossomo (laranja) do macaco verde africano. Setas indicam cromossomo 8 do gibão. Evolução cromossômica em mamíferos . DNA de gibão Hylobates lar sondado com DNA Humano.By Diamar FISH (Hibridação in situ com fluorescência) Relação evolutiva entre cromossomos.

SSCP Single-strand conformational polymorphism Polimorfismo Conformacional da Fita Simples ) Método baseado na Protocolo Básico mobilidade eletroforética. tamanho e forma da fita (eletroforese) simples. By Diamar . ) PCR do gene alvo. mutação. ) Sensível para ) DNA desnaturado. ) Gel não desnaturante. ) Mobilidade diferente ) Detecta a mudança da normal indica de uma base.

SSCP Single-strand conformational polymorphism Polimorfismo Conformacional da Fita Simples Heterozigoto ) Fragmentos até 200 pb – 90% de sensibilidade.80% de sensibilidade. (digestão ) . ) Fragmentos maiores que 400 pb .

000 sondas oligonucleotídicas By Diamar . Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA „ Southern blotting em lâmina „ Chips de genes „ Pode conter mais de 10.

Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA „ Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes „ Leitura por scanners By Diamar . Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA „ Microdisposição de oligo ou de sondas .Microssíntese de oligos in situ (no chip) .Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré fabricadas .

Pode comparar a expressão de um grande número de gene. que contêm um grande número de genes roboticamente distribuídos de forma ordenada em uma placa de vidro.000 pontos. By Diamar . Microarray Microarranjos de DNA – Chips de DNA  É uma técnica que emprega arranjos (arrays).  Existem lâminas de 400. São feitas com ponteiras de titâneo. simultaneamente.

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA „ Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos „ Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais „ Sequenciamento do DNA e genotipagem .

Expressão das vias metabólicas Repetir várias vezes .Oncogenes Lâminas não são reutilizadas .Analisar 10.Mapear mutações Sensibilidade é reduzida .Expressão de genes mRNA (2 a 5 µg) anônimos . Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Contras Utilização Técnica cara .000 amostras em 12 horas .Regiões regulatórias de genes de levedura Grande quantidade de .

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Detecção de DNA em teste com composição conhecida.Hibridação do DNA em teste com disposições ordenadas de nucleotídeos em chip de silicone. Aplicação: . By Diamar .Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Descrição: .

E. Acad.. Proc. „ SANGER. And Coulson.M. By Diamar . A. 1990. Amer. Natl. „ MULLINS. A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Sci. B. 262(4): 56-65. Nickelen. 74:5463-5467. Biol. 98:503-517. DNA chips: array of possibilities. J. Detection os specific sequences among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. The unusual origin of polymerase chain reaction. R. Mol.. 1977. 1998. U. F. Sci. 16:27-31. J. Nature Biotechnology. S. „ SOUTHERN. 1975. K.S. and HODGSON. Referências Bibliográficas: „ MARSHALL.

Obrigada! By Diamar .