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Tecnicas Basicas de Biologia Molecular

Tecnicas Basicas de Biologia Molecular

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teorias basicas de biologia celular e molecular.
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Técnicas Básicas de Biologia Molecular

Diamar Costa-Pinto FIOCRUZ

Visão da Apresentação
PCR Bibliotecas genômica e de expressão Fragmentação - digestão Separação - eletroforese Clonagem molecular Sequênciamento

Southern, Northern e Western blotting

By Diamar

Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas, pois a maioria dos cromossomo já estão mapeados. - O projeto genoma tem sido uma grande ferramenta para unir genomas e laboratório clínico.

Mapas Genéticos, Citológicos e Físicos EST – Sequências expressas marcadas. cDNA curtos que ligam mapas físicos a genéticos RFLP- Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição
By Diamar

Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro. Solange Farah

By Diamar

Enzimas de Restrição
1953 – a eficiência de replicação de um bacteriófago dependia da célula hospedeira Verificou-se, então, a presença de nucleases Bactéria restringe o crescimento do fago e protege o seu DNA metilando-o (modificando) Fenômeno chamado restrição/modificação Advento das endonucleases de restrição Sítio é normalmente uma palíndrome

By Diamar

Enzimas de Restrição
(continuação)

Palíndrome: ARARA ARARA OMO OMO ANA ANA
By Diamar

Enzimas de Restrição
(continuação)

Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de bases Cortes com extremidades abruptas ou coesivas Primeira letra maiúscula é gênero e as duas outras minúsculas são espécies 1073 – foram usadas para clonagem molecular Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outra espécie Fragmentos separados por eletroforese

By Diamar

Enzimas de Restrição
(continuação)

By Diamar

By Diamar

Vídeo de Enzima de Restrição

By Diamar

Eletroforese
Já conhecida desde 1930 Difundida em 1950-1960 Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida Separa proteínas por cargas e peso molecular Separa ácido nucléicos por peso molecular

By Diamar

Eletroforese

-

Fonte de eletroforese

+

Vertical Visualização do gel de agarose

Horizontal

+

By Diamar

Eletroforese

By Diamar

Vídeo de Eletroforese

By Diamar

Clonagem Molecular
Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas Primeiro: inserto + vetor = rDNA Segundo: rDNA + célula hospedeira = transformação

By Diamar

By Diamar

Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um gene específico, com uma característica desejada, e transfere este gene para outro organismo vivo
Célula humana DNA Plasmídeo Transformação Digestão Enzima de restrição Tesoura genética Clonagem
DNA da bactéria

Bactéria

rDNA

DNA da célula humana

By Diamar

O DNA recombinante
Não se limita a organismos de uma mesma espécie

A compatibilidade sexual torna-se irrelevante Permite modificações em uma única geração, o que antes levaria dezenas ou centenas de gerações

By Diamar

Vídeo de Clonagem Molecular

By Diamar

Vetor
São moléculas de transporte Moléculas de DNA Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, YACs, etc. Diferenças de tamanho de inserto Podem ter comportar linear e/ou circular

By Diamar

Vetor
(continuação)

Vetores de expressão procarióticos Promotores fortes Sítios de ligação a ribossomos Sítios de clonagem Vetores de expressão eucarióticos Origem de replicação eucariótica Região de controle de transcrição e tradução, poliadenilação de mRNA, capping Sinais especiais para processamento e secreção
By Diamar

Vetor
(continuação)

Características gerais Região promotora Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker Gene de resistência a antibióticos Origem de replicação Gene repórter

By Diamar

Vetor
(continuação)

PLASMÍDEOS: Penetra naturalmente nas bactérias Fita dupla Circular Extracromossômico Resistência a antibióticos Vetores shuttle Insertos até 4000 pb pUC 18, pUC 19
By Diamar

Vetor
(continuação)

FAGOS Vírus de bactérias Fago λ é o mais utilizado Fita dupla linear Recirculariza durante a infecção na bactéria Aceita até 20 mil pb

By Diamar

Vetor
(continuação)

COSMÍDEOS Pequeno tamanho 4 a 6 Kb Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do fago para infectar bactéria Possuem seqüências cos Aceitam insertos de até 50 mil pb

By Diamar

COSMÍDEOS

By Diamar

Vetor
(continuação)

YACs (Yeast Artificial Chromosome) Células hospedeiras as leveduras Comportam-se como cromossomos Aceitam 400 mil pb Possuem seqüências de DNA específicas de levedura: telômero, centrômero e origem de replicação
ARS: Seqüência de replicação autônoma CEN: Seqüências centroméricas

By Diamar

Engenharia Genética – Produção em série

- Hormônio de crescimento - Insulina humana - Vacina da Hepatite B - Hormônio sexuais
By Diamar

Sequenciamento
Frederick Sanger (1977), Inglaterra Segundo Prêmio Nobel Síntese de DNA in vitro por término didesoxi Mapa físico dos genes e dos cromossomos
By Diamar

Sequenciamento
(continuação)

Hood: Semi-automatizado (1986) Venter: Genoma de bactéria usando ddNTPs fluorescentes automatizados, robóticas e PCR (1995) Perkins-Elmer Corp: Comercializado o Sequenciamento totalmente automatizado (1999)
By Diamar

Considerações
P P P C5 C4 C1 A C G T U P P P C5 C4 C1 A C

BN

BN

G T

Ribose C3 C2 OH OH

Pentose C3 C2 OH OH

NTP Ácido ribonucleico
5’

O - Necessário para ligação fosfodiéster

ddNTP (Didesoxinucleotídeo) dNTP Ácido desoxirribonucleico
3’

Polimerização

By Diamar

Sequenciamento
A C G T

Estuda a integridade da sequência de um DNA molde. Analisa diferentes tamanhos de fragmentos formados a partir de um primer e da inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.

DNA molde Primer
DNA polimerase

T

G
dNTP

C
dNTP

A
dNTP

ddNTP

Fragmento 1

C

A
dNTP

ddNTP
G C
dNTP

Fragmento 2

A
dNTP

ddNTP

Fragmento 3

By Diamar

Sequenciamento automatizado

Vídeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)

By Diamar

Southern Blotting
E. M. Southern (1975) Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose Transferidos para membranas por ação capilar DNA é desnaturado antes ou durante a transferência Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
By Diamar

Southern blot
Descrição: - Digestão do DNA em teste com enzimas de restrição; - Resolução dos fragmentos com eletroforese em gel de agarose; - Transferência do DNA para membrana de nylon; - Hibridação com uma sonda de DNA ou RNA marcada com radioatividade ou quimioluminescentes Aplicação: Alterações em um único nucleotídeos; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico; fragmentos de cromossomo. Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado.

By Diamar

Southern blot

Sonda de cDNA para o gene humano ligado ao X de receptor de andrógeno hibridando no genoma digerido do paciente.

46, XY.Síndrome da insensibilidade androgênica. Vagina em fundo de saco, sem útero ou tubas uterinas. 1:20.000. Testículos no abdome ou canal inguinal (confundidos com hérnias, na infância). Defeito molecular: varia de deleção completa do gene a mutações de ponto nos domínios de ligação de andrógenos ou ligação ao DNA da proteína receptora de andrógeno.

Exemplo da especificidade das sondas.

By Diamar

Vídeo de Southern blot
(DNA _DetectivePC)

Northern blotting
Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) Sensibilidade a RNAses Transferência para membrana por ação capilar Sondas de RNA ou DNA para hibridar

By Diamar

Northern blotting
(Continuação)

Úteis em estudo de expressão gênica Estudo de diferentes tecidos Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo

By Diamar

Northern blotting

Marcadores rRNA

RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F). A – sonda de α-tubulina – hibrida todos B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos
By Diamar

Western blotting
Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação Transferência para membrana por força elétrica

By Diamar

Western blotting
(continuação)

Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

By Diamar

Western blotting

By Diamar

Western blotting
Análise de proteínas por anticorpos específicos após eletroforese e transferência para membrana.

By Diamar

Vídeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)

RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição
Uso de enzimas de restrição Produção de fragmentos de DNA de tamanho adequados para serem utilizados As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de DNA Aplicação: compara alelos normais e afetados para cada mutação estudada.

Mapa de Restrição

By Diamar

PCR - RFLP

By Diamar

RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição

Um caso de erro inato do metabolismo: G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
By Diamar

RFLP de Planta
DNAs genômico de Arabidopis é digerido com EcoRI. Southern blotting com sonda azul e verde. F1 é heterogênio possui fragmentos de ambos os genitores. F1 autopoliniza: 1:2:1 Ecotipo diferentes: CColombia, NNiederzenzes e H – Heterozigoto.

Oligonucleotídeo aleloespecífico (ASO)

Descrição: - Hibridação preferencial de sonda marcada para testar DNA com composição de bases complenmentar única. Aplicação:
- Alelos de composição conhecida.

Mutação é conhecida. Revela uma única alteração de base. Distingue hetero ou homozigotos para a sequência. A análise é restrita a mutação familiar conhecida ou para distúrbios genéticos com nº finito de mutações diferentes. Ex: beta-talassemia. By Diamar

FISH Hibridação in situ com fluorescência
Detecta DNA localizados dentro de cromossomos Usa lâminas de microscopia Cromossomos estão em metáfase, anáfase e interfase Usa sondas de DNA específicas

By Diamar

FISH (Hibridação in situ com fluorescência)

Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no cromossomo 15 paterno.

By Diamar

By Diamar

FISH (Hibridação in situ com fluorescência)
Relação evolutiva entre cromossomos. DNA de gibão Hylobates lar sondado com DNA Humano. Setas indicam cromossomo 8 do gibão.

Cromossomo humano 4 hibrida com cromossomo (laranja) do macaco verde africano. Evolução cromossômica em mamíferos

SSCP
Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
Método baseado na mobilidade eletroforética. Gel não desnaturante. Sensível para tamanho e forma da fita simples. Detecta a mudança de uma base.

Protocolo Básico
PCR do gene alvo. DNA desnaturado. (eletroforese) Mobilidade diferente da normal indica mutação.

By Diamar

SSCP
Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples Heterozigoto
Fragmentos até 200 pb – 90% de sensibilidade. Fragmentos maiores que 400 pb - 80% de sensibilidade. (digestão )

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
Southern blotting em lâmina Chips de genes
Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas

By Diamar

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
Microdisposição de oligo ou de sondas - Microssíntese de oligos in situ (no chip) - Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré fabricadas - Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes Leitura por scanners
By Diamar

Microarray
Microarranjos de DNA – Chips de DNA
É uma técnica que emprega arranjos (arrays), que contêm um grande número de genes roboticamente distribuídos de forma ordenada em uma placa de vidro. Pode comparar a expressão de um grande número de gene, simultaneamente. Existem lâminas de 400.000 pontos. São feitas com ponteiras de titâneo.

By Diamar

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais Sequenciamento do DNA e genotipagem

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
Contras Técnica cara Sensibilidade é reduzida Lâminas não são reutilizadas Repetir várias vezes Grande quantidade de mRNA (2 a 5 µg) Utilização - Mapear mutações - Oncogenes - Expressão das vias metabólicas - Regiões regulatórias de genes de levedura - Expressão de genes anônimos - Analisar 10.000 amostras em 12 horas

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA

Descrição: - Hibridação do DNA em teste com disposições ordenadas de nucleotídeos em chip de silicone.

Aplicação: - Detecção de DNA em teste com composição conhecida.

By Diamar

Referências Bibliográficas:
MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31. MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467. SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

By Diamar

Obrigada!

By Diamar

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