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Técnicas Básicas de Biologia

Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ
Visão da Apresentação
„ PCR
„ Bibliotecas genômica e de expressão
„ Fragmentação - digestão
„ Separação - eletroforese
„ Clonagem molecular
„ Sequênciamento
„ Southern, Northern e Western blotting

By Diamar
Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas,
pois a maioria dos cromossomo já estão
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratório clínico.

Mapas Genéticos, Citológicos e
Físicos

EST – Sequências expressas marcadas.
cDNA curtos que ligam mapas físicos a
genéticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrição

By Diamar
Procurar um gene dentro de um genoma
humano é comparável a procurar uma pessoa
sem sobrenome em uma casa sem endereço
em uma rua desconhecida em uma cidade não
identificada de um país estrangeiro.

Solange Farah

By Diamar
Enzimas de Restrição

„ 1953 – a eficiência de replicação de um
bacteriófago dependia da célula hospedeira
„ Verificou-se, então, a presença de nucleases
„ Bactéria restringe o crescimento do fago e
protege o seu DNA metilando-o (modificando)
„ Fenômeno chamado restrição/modificação
„ Advento das endonucleases de restrição
„ Sítio é normalmente uma palíndrome

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Enzimas de Restrição
(continuação)

Palíndrome:
ARARA
ARARA

OMO
OMO

ANA
ANA
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Enzimas de Restrição
(continuação)

„ Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de
bases
„ Cortes com extremidades abruptas ou coesivas
„ Primeira letra maiúscula é gênero e as duas
outras minúsculas são espécies
„ 1073 – foram usadas para clonagem molecular
„ Pode-se recombinar DNA humano com qualquer
outra espécie
„ Fragmentos separados por eletroforese

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Enzimas de Restrição
(continuação)

By Diamar
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Vídeo de Enzima de
Restrição

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Eletroforese

„ Já conhecida desde 1930
„ Difundida em 1950-1960
„ Movimentação de moléculas submetidas a
campo elétrico
„ Usa um substrato: papel, agarose,
poliacrilamida
„ Separa proteínas por cargas e peso molecular
„ Separa ácido nucléicos por peso molecular

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Eletroforese

Fonte de eletroforese
Vertical
- +
Visualização do gel de agarose

-
Horizontal

+ By Diamar
Eletroforese

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Vídeo de Eletroforese

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Clonagem Molecular

„ Consiste no isolamento e propagação de
moléculas de DNA idênticas

„ Primeiro: inserto + vetor = rDNA

„ Segundo: rDNA + célula hospedeira =
transformação

By Diamar
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Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um
gene específico, com uma característica desejada, e transfere este
gene para outro organismo vivo

Célula humana Bactéria

DNA

Plasmídeo

Transformação

DNA da bactéria
Digestão Enzima de restrição
Tesoura genética
rDNA
Clonagem

DNA da célula humana

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O DNA recombinante

8 Não se limita a organismos de uma mesma espécie

8 A compatibilidade sexual torna-se irrelevante

8 Permite modificações em uma única geração, o que
antes levaria dezenas ou centenas de gerações

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Vídeo de Clonagem
Molecular

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Vetor

„ São moléculas de transporte
„ Moléculas de DNA
„ Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos,
vírus, YACs, etc.
„ Diferenças de tamanho de inserto
„ Podem ter comportar linear e/ou circular

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Vetor
(continuação)

Vetores de expressão procarióticos
„ Promotores fortes
„ Sítios de ligação a ribossomos
„ Sítios de clonagem

Vetores de expressão eucarióticos
„ Origem de replicação eucariótica
„ Região de controle de transcrição e tradução,
poliadenilação de mRNA, capping
„ Sinais especiais para processamento e secreção
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Vetor
(continuação)

Características gerais

„ Região promotora
„ Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker
„ Gene de resistência a antibióticos
„ Origem de replicação
„ Gene repórter

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Vetor
(continuação)

PLASMÍDEOS:

„ Penetra naturalmente nas bactérias
„ Fita dupla
„ Circular
„ Extracromossômico
„ Resistência a antibióticos
„ Vetores shuttle
„ Insertos até 4000 pb
„ pUC 18, pUC 19

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Vetor
(continuação)

FAGOS
„ Vírus de bactérias
„ Fago λ é o mais utilizado
„ Fita dupla linear
„ Recirculariza durante a infecção na bactéria
„ Aceita até 20 mil pb

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Vetor
(continuação)

COSMÍDEOS
„ Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
„ Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do
fago para infectar bactéria
„ Possuem seqüências cos
„ Aceitam insertos de até 50 mil pb

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COSMÍDEOS

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Vetor
(continuação)

YACs (Yeast Artificial Chromosome)
„ Células hospedeiras as leveduras
„ Comportam-se como cromossomos
„ Aceitam 400 mil pb
„ Possuem seqüências de DNA específicas de
levedura: telômero, centrômero e origem de
replicação

ARS: Seqüência de replicação autônoma
CEN: Seqüências centroméricas

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Engenharia Genética – Produção em série

- Hormônio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormônio sexuais
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Sequenciamento

„ Frederick Sanger (1977), Inglaterra
„ Segundo Prêmio Nobel
„ Síntese de DNA in vitro por término
didesoxi
„ Mapa físico dos genes e dos
cromossomos

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Sequenciamento
(continuação)

„ Hood: Semi-automatizado (1986)
„ Venter: Genoma de bactéria usando
ddNTPs fluorescentes automatizados,
robóticas e PCR (1995)
„ Perkins-Elmer Corp: Comercializado o
Sequenciamento totalmente automatizado
(1999)
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Considerações
P P

P A P A
C
P P C
C5 BN G C5 BN G
C4 C1 T C4 C1 T
U
Ribose Pentose
C3 C2 C3 C2

OH OH OH OH

NTP dNTP (Didesoxinucleotídeo)
ddNTP
O - Necessário
para ligação
Ácido ribonucleico fosfodiéster
Ácido desoxirribonucleico
5’ 3’
Polimerização

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Estuda a integridade da sequência de um DNA
molde. Analisa diferentes tamanhos de
fragmentos formados a partir de um primer e da
inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e

Sequenciamento ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.

A C G T
DNA molde

Primer
DNA polimerase

T G C A
Fragmento 1
ddNTP dNTP dNTP dNTP

C A
Fragmento 2
ddNTP dNTP

G C A
Fragmento 3
ddNTP dNTP dNTP

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Sequenciamento automatizado
Vídeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)

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Southern Blotting
„ E. M. Southern (1975)
„ Fragmentos de DNA são separados em gel de
agarose
„ Transferidos para membranas por ação capilar
„ DNA é desnaturado antes ou durante a
transferência
„ Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
membrana
„ Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
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Southern blot
Descrição:
- Digestão do DNA em teste com enzimas
de restrição;
- Resolução dos fragmentos com
eletroforese em gel de agarose;
- Transferência do DNA para membrana de
nylon;
- Hibridação com uma sonda de DNA ou
RNA marcada com radioatividade ou
quimioluminescentes

Aplicação: Alterações em um único
nucleotídeos; detecção de inserções, deleções
e rearranjos; ordenamento de fragmentos do
DNA em um mapa físico; fragmentos de
cromossomo.

Com o advento da PCR seu uso tornou-se
limitado.

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Southern blot

46, XY.Síndrome da insensibilidade
androgênica. Vagina em fundo de
saco, sem útero ou tubas uterinas.
1:20.000. Testículos no abdome ou Exemplo da especificidade das
canal inguinal (confundidos com sondas.
Sonda de cDNA para o
hérnias, na infância). Defeito
gene humano ligado ao X
molecular: varia de deleção
de receptor de andrógeno
completa do gene a mutações de
hibridando no genoma
ponto nos domínios de ligação de
digerido do paciente.
andrógenos ou ligação ao DNA da
proteína receptora de andrógeno.
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Vídeo de Southern blot
(DNA _DetectivePC)
Northern blotting
„ Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de
agarose
„ RNAs devem ser desnaturados (formaldeído)
„ Sensibilidade a RNAses
„ Transferência para membrana por ação capilar
„ Sondas de RNA ou DNA para hibridar

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Northern blotting
(Continuação)

„ Úteis em estudo de expressão gênica
„ Estudo de diferentes tecidos
„ Estuda o padrão temporal de expressão
de genes durante o crescimento do
indivíduo

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Northern blotting

Marcadores
rRNA

RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).
A – sonda de α-tubulina – hibrida todos
B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores
C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos
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Western blotting
„ Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida
„ Separação e caracterização de proteínas
„ Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para
desnaturação
„ Transferência para membrana por força elétrica

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Western blotting
(continuação)

„ Proteína alvo é identificada por anticorpo mono
ou policlonal
„ Revelação do sistema com anticorpo secundário
fluorescente ou radioativo
„ Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

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Western blotting

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Western blotting
Análise de proteínas por anticorpos específicos após
eletroforese e transferência para membrana.

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Vídeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição

„ Uso de enzimas de restrição
„ Produção de fragmentos de DNA de tamanho
adequados para serem utilizados
„ As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco
frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de
DNA
„ Aplicação: compara alelos normais e afetados para
cada mutação estudada.
Mapa de Restrição

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PCR - RFLP

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RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição

Um caso de erro inato do metabolismo:
G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
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RFLP de Planta

DNAs genômico de
Arabidopis é digerido
com EcoRI.
Southern blotting
com sonda azul e
verde.
F1 é heterogênio
possui fragmentos de
ambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipo
diferentes: C-
Colombia, N-
Niederzenzes e H –
Heterozigoto.
Oligonucleotídeo alelo-
específico (ASO)

Descrição:
- Hibridação preferencial de sonda
marcada para testar DNA com composição
de bases complenmentar única.

Aplicação:
- Alelos de composição conhecida.

Mutação é conhecida. Revela uma única
alteração de base. Distingue hetero ou
homozigotos para a sequência. A análise é
restrita a mutação familiar conhecida ou para
distúrbios genéticos com nº finito de
mutações diferentes. Ex: beta-talassemia.
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FISH
Hibridação in situ com fluorescência

„ Detecta DNA localizados dentro de cromossomos
„ Usa lâminas de microscopia
„ Cromossomos estão em metáfase, anáfase e
interfase
„ Usa sondas de DNA específicas

By Diamar
FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)

Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no
cromossomo 15 paterno.

By Diamar
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FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)

Relação evolutiva
entre cromossomos.
DNA de gibão
Hylobates lar
sondado com DNA
Humano.
Setas indicam
cromossomo 8 do
gibão.

Cromossomo
humano 4 hibrida
com cromossomo
(laranja) do macaco
verde africano.

Evolução cromossômica em mamíferos
SSCP
Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

) Método baseado na Protocolo Básico
mobilidade eletroforética.

) Gel não desnaturante. ) PCR do gene alvo.
) Sensível para ) DNA desnaturado.
tamanho e forma da fita
(eletroforese)
simples.
) Mobilidade diferente
) Detecta a mudança da normal indica
de uma base. mutação.

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SSCP
Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

Heterozigoto
) Fragmentos até
200 pb – 90% de
sensibilidade.
) Fragmentos
maiores que 400 pb
- 80% de
sensibilidade.
(digestão )
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
„ Southern blotting em lâmina
„ Chips de genes
„ Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas

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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
„ Microdisposição de oligo ou de sondas
- Microssíntese de oligos in situ (no chip)
- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré
fabricadas
- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA
„ Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes
„ Leitura por scanners
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Microarray
Microarranjos de DNA – Chips de DNA 

É uma técnica que emprega arranjos (arrays),
que contêm um grande número de genes
roboticamente distribuídos de forma ordenada em
uma placa de vidro. 
Pode comparar a expressão de um grande
número de gene, simultaneamente. 
Existem lâminas de 400.000 pontos.
São feitas com ponteiras de titâneo.

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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA

„ Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos
„ Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos
sob condições normais e anormais
„ Sequenciamento do DNA e genotipagem
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Contras Utilização

Técnica cara - Mapear mutações

Sensibilidade é reduzida - Oncogenes

Lâminas não são reutilizadas - Expressão das vias
metabólicas

Repetir várias vezes - Regiões regulatórias
de genes de levedura

Grande quantidade de - Expressão de genes
mRNA (2 a 5 µg) anônimos

- Analisar 10.000 amostras
em 12 horas
Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA

Descrição:
- Hibridação do DNA em
teste com disposições
ordenadas de nucleotídeos
em chip de silicone.

Aplicação:
- Detecção de DNA em
teste com composição
conhecida.

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Referências Bibliográficas:
„ MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array
of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.
„ MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65.
„ SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
„ SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences
among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.
Mol. Biol. 98:503-517.

By Diamar
Obrigada!

By Diamar