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CAPTULO 20

ENSAIOS IMUNOLGICOS

INTRODUO Os ensaios imunolgicos foram e tm sido os principais responsveis pelo conhecimento que se tem do sistema imune. Alm deste aspecto relacionado ao conhecimento cientfico bsico, estes ensaios so importantes, na clnica, para a deteco de infeces, de doenas auto-imunes e de estados de imunodeficincia. Os ensaios imunolgicos podem ser utilizados no s para detectar a produo de anticorpos bem como para detectar a presena de antgenos, diferenciar o estgio de uma doena de acordo com a classe de Ig produzida, selecionar doadores e receptores de rgos para transplantes, avaliar o prognstico da doena, da eficcia de um tipo de terapia, dentre outros. Nos ltimos anos, houve uma grande evoluo no sentido de que com a tcnica de anticorpos monoclonais (produzidos por um nico clone celular) podem ser obtidos anticorpos altamente purificados e especficos, tais como os anticorpos anti-CD4 e anti-CD8, que identificam respectivamente linfcitos T auxiliares e citotxicos. Alm dos anticorpos, os antgenos tambm so produzidos por meio de tcnicas de sntese proteca e de recombinao, propiciando que antgenos purificados possam ser utilizados nas tcnicas de ELISA, por exemplo. Os ensaios imunolgicos podem ser realizados por meio de tcnicas no quantitativas, visualizadas por meio de reaes de precipitao e aglutinao ou podem ser quantitativas, com utilizao de marcadores enzimticos (ELISA, imunoperoxidase, citometria de fluxo) ou radioistopos (Radioimunoensaio). Os testes de precipitao e aglutinao tm menor sensibilidade que os imunoenzimticos, porque os complexos Antgeno-Anticorpo para serem visualizados devem apresentar um tamanho

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adequado (ver abaixo). Os testes de precipitao so utilizados para a deteco de antgenos solveis (protenas, glicoprotenas) enquanto que os de aglutinao para a deteco de antgenos particulados (hemcias, bactrias, clulas diversas). ENSAIOS DE PRECIPITAO O ensaio de precipitao utilizado para detectar os anticorpos produzidos contra antgenos solveis em concentraes entre 20 e 2 mg/ml. Para que a reao de precipitao seja visvel deve haver uma relao de equivalncia entre as concentraes do antgeno e do anticorpo. Em caso de excesso de antgeno ou de anticorpo ocorre uma reduo na formao do precipitado. Quando as concentraes de antgeno e anticorpo so equivalentes, formam-se complexos de tamanho que permite a sua visualizao; nestas concentraes encontra-se a zona de equivalncia (Figura 1A). Quando o plasma ou soro a ser analisado apresenta uma alta concentrao de anticorpos, estes se associam aos antgenos, formando pequenos complexos, no visualizados por precipitao; nesta concentrao de anticorpos ocorre o efeito de pr-zona (Figura 1B). Quando o anticorpo est pouco concentrado em relao ao antgeno, tambm so formados pequenos complexos e ocorre o efeito denominado de ps-zona (Figura 1C). Ttulo do anticorpo Quando os ensaios no so quantitativos, a produo de anticorpos contra um determinado antgeno pode ser correlacionada s diluies dos soros utilizadas para a realizao do teste. Nestes ensaios, as partculas antignicas so misturadas com diferentes diluies do soro do paciente e considera-se como resultado de produo de anticorpos a maior diluio em que ocorre a visualizao (precipitao ou aglutinao) da reao antgeno-anticorpo. A esta diluio d-se o nome de ttulo do anticorpo. Por exemplo, suponhamos que vamos estudar a produo de anticorpos contra espcies de Leishmania, que causam calazar, em uma populao de rea endmica, no Brasil. comum ser observada aglutinao de formas promastigotas de Leishmania at a diluio de 1:600 (ttulo) na maioria das pessoas porque a infeco com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium, Leishmania que causa a forma mucocutnea) induz a produo de anticorpos que apresentam reao cruzada com Leishmania donovani. Por outro lado, o soro de pacientes infectados, que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas at a diluio de 1:6.400 (ttulo). Como pode ser observado, neste exemplo, o ttulo de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da regio endmica de 1:600 enquanto que nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes.

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Figura 1 Reao de Precipitao: A. Ponto de Equivalncia, B. Efeito de Pr-zona e C. Efeito de Ps-zona

A. Ac1 Ag

Ac2

B.

Ac1

Ac2

C. Ac1

Ac2

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1. Teste do anel ou ring test Um dos testes mais rpidos e simples, utilizado em laboratrios de pesquisa, o teste do anel ou ring test. Utiliza-se este teste quando o objetivo saber se um animal est produzindo anticorpos contra um determinado antgeno solvel, durante o processo de imunizao. Suponhamos que estamos imunizando um coelho com Igs isoladas do soro de camundongos. Depois de algumas semanas, podemos colher o soro do coelho e coloc-lo cuidadosamente num tubo de vidro e sobre este uma soluo do antgeno, no caso as Igs de camundongo (Figura 2B). Quando o animal produziu anticorpos especficos contra o antgeno, aps alguns minutos, surge na interface entre as duas solues, quando atingida a equivalncia, um precipitado, visvel a olho nu,. Pode-se utilizar como controle negativo, o soro do animal colhido antes da imunizao; neste caso, no haver a formao da linha de precipitao na interface entre o soro e o antgeno (Figura 2A).
Figura 2 Ensaio do Anel A. Reao Negativa: soro antes da imunizao, B. Reao Positiva: soro ps-imunizao

A. Ag1

B. Ag1

Linha de precipitao

Soro

Soro

2. Imunodifuso A tcnica de imunodifuso realizada em meio semi-slido, geralmente o gar ou agarose, que permite uma difuso mais homognea que em meio lquido, mas que tem o inconveniente de demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitao. A difuso dos imunoprecipitados no gel depende do tamanho destes; quando so grandes ficam maior que o dimetro dos poros, o que impede a sua difuso. A imunodifuso pode ser simples ou dupla; simples, quando ou o antgeno ou o anticorpo fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, at ocorrer precipitao; dupla, quando os dois componentes migram um em direo ao outro.

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A imunodifuso dupla pode ser realizada numa lmina de microscpio revestida de gar, contendo orifcios onde so colocadas concentraes de Ag e Ac (Figura 3). Quando o Ag e os anticorpos especficos encontram-se, em concentraes correspondentes zona de equivalncia, so formados complexos precipitantes.
Figura 3 Imunodifuso dupla

Lmina revestida de agar

Ag X

Antisoro

Ags Y e Z

Migrao no agar

Na figura 3, observa-se que o antgeno X precipitou prximo ao orifcio, onde ele foi depositado, enquanto que os antgenos Y e Z, precipitaram na regio mdia entre os orifcios onde foram depositados o antgeno e o anticorpo. O fenmeno observado com o antgeno X, pode ter vrias explicaes: o antgeno pode estar em baixas concentraes e a zona de equivalncia, ocorreu prximo ao orifcio onde foi depositado ou o PM ou a carga do antgeno interferiu na sua capacidade de migrao. 3. Imunodifuso dupla, segundo Ouchterlony O mtodo de imunodifuso, segundo Ouchterlony, utilizado quando se deseja identificar um antgeno comparando-o a outros j conhecidos. Nas lminas ou placas de Petri, revestidas de gar, so feitos orifcios adjacentes: em um destes orifcios colocado o soro e nos outros, o antgeno de origem conhecida e aquele a ser identificado (Figura 4). Nesta figura, observa-se que existem trs padres de resultado conforme a relao estrutural entre o antgeno conhecido (padro) e o que se quer analisar. Quando o antgeno conhecido (HSA Albumina Srica Humana) similar ao analisado (Antgeno A), os anticorpos e os antgenos migram, formando uma linha de precipitao contnua, na concentrao correspondente zona de equivalncia (Figura 4A). Quando os antgenos so semelhantes mas no idnticos, formado um esporo; na figura 4B, por exemplo, os anticorpos reconhecem o antgeno padro (HSA) e o A2 (BSA Albumina Srica Bovina), que so similares; no entanto, o esporo

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corresponde aos determinantes antignicos, reconhecidos pelos anticorpos anti-HSA, presentes apenas no HSA. Quando os anticorpos reconhecem os dois antgenos mas estes so distintos (HSA e HGG Gamaglobulina Humana), so observadas duas linhas que se cruzam, formando dois espores, o que demonstra que determinantes antignicos diferentes presentes nestes antgenos so reconhecidos pelos anticorpos (Figura 4C). A presena de mais de uma linha de precipitao significa que os anticorpos esto reconhecendo outros componentes e que a soluo antignica no est purificada. Este um mtodo semi-quantitativo, de baixa sensibilidade, ainda utilizado para caracterizar antgenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenas auto-imune. Uma das limitaes deste teste o tempo (18-24 horas) requerido para a obteno dos resultados, alm de detectar apenas reaes Ag-Ac nas quais h formao de precipitados. Atualmente, este teste tem sido substitudo por ensaios imunoenzimticos.
Figura 4 Imunodifuso de Ouchterlony A. B. C.

HSA

Ag A

HSA

Ag A2
esporo

HSA

Ag B

Soro anti-HSA Resultado: Ag A = HSA Identidade Total

Soro anti-HSA Ag A2 = BSA Identidade parcial

Soro anti-HSA e anti-HGG Ag B = HGG No identidade

4. Imunodifuso radial simples A imunodifuso radial simples, introduzida por Mancini, em 1965, alm de ser uma tcnica de fcil realizao e de baixo custo, quantitativa. realizada em placas ou lminas revestidas de gar, no qual incorporado um antisoro especfico para a molcula a ser quantificada (Figura 5B). No gel de gar so feitos orifcios onde so depositadas pelo menos trs concentraes conhecidas da molcula estudada (soluo padro) e as amostras de concentrao desconhecida. Estas molculas difundem-se no gar e quando reagem com o anticorpo, na concentrao correspondente zona de equivalncia, forma-

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se a linha de precipitao, o que ocorre entre 48-72 horas. O dimetro do halo que se forma ao redor do orifcio onde foram depositadas as amostras corresponde concentrao da molcula, de acordo com a curva padro obtida (Figura 5A). Para a obteno da curva padro so utilizadas concentraes conhecidas da soluo padro e aps reao com os anticorpos presentes no gar, os halos so medidos. Por exemplo, se quisermos dosar as concentraes de IgM do soro de pacientes; para a obteno da curva padro deve-se ter uma soluo contendo IgM purificada de concentrao conhecida. Esta tcnica utilizada para quantificar IgG, IgM e IgA e molculas do sistema Complemento.
Figura 5 Imunodifuso radial simples A. Curva padro, B. Placa com concentraes do Ag e da soluo padro
A. 60 B.

Gel contendo anticorpo Concentraes do padro

50 dimetro do anel (mm) 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 concentrao do Ag (mg/ml)

Diluies do Ag

5. Imunoeletroforese A imunoeletroforese um mtodo qualitativo que combina as tcnicas de eletroforese e imunodifuso. A associao das duas tcnicas permite que um maior nmero de componentes antignicos de um lquido biolgico (soro, urina) sejam identificados; no caso do soro, mais de 30 componentes so identificados pela imunoeletroferese enquanto que na eletroforese entre 5 e 6 o so. realizada tambm em lminas ou placas de vidro recobertas de gar, onde so feitos orifcios e canaletas para a colocao dos reagentes. Na primeira etapa, que geralmente dura entre 60-90 minutos, a soluo antignica colocada num orifcio do gar e a lmina submetida eletroforese. Nesta fase, os componentes antignicos so separados de acordo com as suas cargas eltricas. Vrios fatores dos componentes antignicos (alm da carga eltrica, o tamanho, a forma e a concentrao), do

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solvente (a fora inica e o pH), do meio (temperatura e viscosidade do gar) e do campo eltrico podem interferir na migrao. Na Figura 6A, est representada a separao de protenas sricas de uma pessoa normal e de uma que apresenta mieloma de IgG. Na segunda etapa, cortada uma canaleta no gar submetido a eletroferese, onde depositado o antisoro (Figura 6B). Quando os anticorpos associam-se aos componentes antignicos separados pela eletroforese, formam-se linhas de precipitao (Figura 6C). A difuso e a formao das linhas de precipitao ocorre num perodo entre 18-24 horas. Na Figura 6C, o soro de coelho anti-protenas sricas humana reconhece as molculas de albumina, do sistema complemento, as classes de imunoglobulinas, dentre outras no mostradas. Quando a produo de algumas destas molculas est alterada, sendo produzidas em concentraes abaixo (imunodeficincias, doenas auto-imunes) ou acima (tumores de plasmcitos, tal como os mielomas) do normal, esta alterao pode ser detectada qualitativamente, como observado na Figura 6C. Este mtodo eficiente para detectar qualquer substncia solvel imunognica, sendo adequado para a caracterizao de protenas e deteco de alteraes estruturais e nas concentraes. Nos laboratrios de anlises clnicas, utilizado para o diagnstico de gamopatias monoclonais tais como o mieloma mltiplo e a macroglobulinemia. ENSAIOS DE AGLUTINAO A reao de aglutinao ocorre quando um antgeno particulado associa-se com o anticorpo especfico. uma reao de rpida visualizao e que ocorre em duas etapas: !"a primeira etapa consiste na associao dos anticorpos aos determinantes antignicos. !"a segunda etapa, ocorre em decorrncia das colises entre as partculas, o que resulta na dissociao dos anticorpos e a associao a partculas vizinhas. Desta forma forma-se a malha de interaes visveis a olho nu (Figura 7).

O ensaio de aglutinao pode ser realizado com partculas que apresentam determinantes antignicos naturais, tais como as hemcias, bactrias (aglutinao direta) ou pode ser realizado com partculas inertes (ltex, poliestireno, bentonita) adsorvidas com antgenos na sua superfcie (aglutinao passiva ou indireta).

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Figura 6 Imunoeletroforese A. Separao do antgeno por eletroforese: Lmina vista de cima na cuba de eletroforese. B. Adio do Anticorpo na canaleta C. Difuso e precipitao

A.
Ag-soro humano

Eletrodo

Papel de filtro

Ag-soro de paciente com mieloma de IgG

Tampo

B. IgG IgA IgM C3 Albumina

Antisoro - soro de coelho antiprotenas sricas humana

C. IgA IgM C3 Albumina

IgG

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Figura 7 Aglutinao. A. Ausncia de anticorpos, B. Presena de anticorpos

A.

B.

Vrios fatores podem interferir neste tipo de ensaio: o tipo de Ig (a IgM 750 vezes mais eficiente que a IgG), o pH do meio (entre 6 e 8, o ideal), enzimas, tempo e temperatura. Estes testes podem ser realizados em lminas, placas ou tubos. Quando o soro tem altas concentraes de anticorpos pode ser observado o efeito de pr-zona, com resultados falso-negativos; para eliminar este efeito necessita-se diluir o soro. Na figura 8, por exemplo, nos poos C1 a C3 e C10 a C12 no houve aglutinao enquanto que nos poos de C4 a C9 houve. Pode-se considerar que os anticorpos presentes nos poos de C1-C3, esto muito concentrados causando um efeito de pr-zona, entre C4 e C9, est ocorrendo a zona de equivalncia e entre C10 e C12, os anticorpos esto muito diludos, causando um efeito de ps-zona.

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Figura 8 Hemaglutinao em placa

Diluio do Soro:

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096

10

11

12

Ttulo do Anticorpo

A B C D E F G H
aglutinao

1: 512 1: 64 1: 256 1: 128 1: 16 1: 128 ausncia 1: 4096

Ausncia de aglutinao

1. Aglutinao direta Na reao de aglutinao direta as partculas antignicas (bactrias, hemcias, fungos, protozorios) podem estar na forma ntegra ou fragmentada. As reaes de aglutinao direta que utilizam as hemcias podem identificar os tipos sanguneos humano ABO e Rh (Figura 9). No caso da identificao do sistema ABO, as hemcias da pessoa so colocadas para incubar com anticorpos anti-A ou anti-B, em lminas. Se a aglutinao ocorrer quando a incubao feita com anti-A ou anti-B, as clulas sero respectivamente, A ou B; se a aglutinao ocorrer com os dois anticorpos em questo as hemcias sero do tipo AB e caso no ocorra aglutinao, o tipo sanguneo ser O. Alm das hemcias, bactrias podem ser aglutinadas por anticorpos especficos, como no caso do teste para deteco de Salmonella (teste de Widal) e para o dianstico da brucelose (teste de Wright). Testes de aglutinao para identificar infeco com Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma e Leptospira tambm so realizados.

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Figura 9 Aglutinao direta na identificao dos antgenos do sistema ABO

Anti-A

Anti-B B

Anti-A

Anti-B AB

+
A

+
O

2. Aglutinao direta por anticorpos anti-Rh - Teste de Coombs direto e Teste de Coombs indireto A doena hemoltica do recm-nascido uma patologia que se enquadra no grupo das hipersensibilidades do tipo II (Captulo 12), na qual uma mulher Rh negativa sensibilizada por hemcias Rh positivas do filho, durante o parto, e a partir deste contato, IgG anti-Rh passada pela placenta, durante a gravidez, causando anemia hemoltica nos filhos Rh positivos. A presena de anticorpos anti-Rh na membrana das hemcias fetais pode ser detectada pelo Teste de Coombs direto (Figura 10A) enquanto que a de anticorpos anti-Rh no soro materno pode ser detectada pelo Teste de Coombs indireto (Figura 10B). No teste de Coombs direto, as hemcias fetais esto revestidas in vivo pelos anticorpos anti-Rh, no entanto, no aglutinam. A adio in vitro de soro anti-Ig humana proporciona a aglutinao (Figura 10A). No teste de Coombs indireto, hemcias Rh positivas so incubadas com o soro da paciente (me Rh negativa sensibilizada), no entanto, a aglutinao tambm visualizada pela incubao de anti-Ig humana (Figura 10B).

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Figura 10 Teste de Coombs. A. Teste direto, B. Teste indireto

A. + anti-Ig humana

Hemcias fetais Rh+ sensibilizadas in vivo com anti-Rh

Aglutinao

B.
+ anti-Ig humana

Hemcias Rh+

Soro de mulher Rhsensibilizada com hemcias Rh+

Hemcias Rh+ e anti-Rh materno

Aglutinao

3. Hemaglutinao e aglutinao passiva Os testes de aglutinao passiva podem ser realizados com hemcias (hemaglutinao) ou com partculas inertes (ltex, poliestireno, bentonita). As hemcias so utilizadas, nos ensaios de aglutinao, por apresentarem uma superfcie rica em molculas, o que propicia a adsoro de vrios tipos de antgenos. As hemcias mais utilizadas para esta finalidade, pela facilidade de obteno, so as de carneiro e as humanas, que podem ser fixadas em formaldedo, permitindo que sejam estocadas por um tempo maior. Antgenos polissacardicos geralmente conseguem adsorver de forma passiva na superfcie das hemcias enquanto que os antgenos protecos associam-se a hemcias taninizadas (pr-tratadas com cido tnico). O teste de hemaglutinao para antgenos protecos mais sensvel que os ensaios de precipitao, podendo detectar anticorpos em concentraes de at 0,01 g/ml. Anticorpos contra

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antgenos de Trypanosoma, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii entre outros podem ser detectados por meio desta tcnica (Figura 11). A aglutinao passiva com partculas de ltex mais aplicada na deteco do Fator Reumatide (FR), que uma Ig (geralmente IgM), que reconhece a poro Fc da IgG, presente em algumas doenas auto-imunes reumticas (Captulo 15). Alm da IgM, o FR pode ser uma IgG ou IgA que reconhece no s a poro Fc da IgG como tambm da IgA, da IgM ou da IgE. Neste teste a IgG passivamente adsorvida s partculas de ltex e quando o plasma contendo FR incubado com estas, ocorre aglutinao.
Figura 11 Aglutinao passiva

+ soro do paciente

Hemcea ou ltex

Ags:Toxoplasma gondii Plasmodium falciparum

Hemaglutinao

4. Teste de inibio da aglutinao passiva O teste de inibio da Aglutinao ou Hemaglutinao Passiva um ensaio competitivo sensvel para a deteco de concentraes entre 0,1-10 g/ml de antgenos solveis, haptenos ou anticorpos. Este teste consiste na incubao do lquido corporal do paciente (plasma, urina) com anticorpos especficos para o antgeno que se quer detectar e posterior incubao com hemcias adsorvidas com o mesmo antgeno. Na figura 12, queremos detectar a presena do hormnio Gonadotrofina Corinica Humana (HCG), presente na urina de mulheres grvidas. Quando a mulher est gravida e a urina incubada com anticorpos anti-HCG, formam-se complexos HCG-anti-HCG que impedem a aglutinao de partculas de ltex adsorvidas com HCG (Figura 12A). A urina da mulher normal como no contm HCG, propicia que os anticorpos anti-HCG associem-se ao ltex adsorvido com o HCG, tornando a aglutinao possvel (Figura 12B).

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Figura 12 Inibio da aglutinao passiva. A. Mulher grvida, B. mulher no grvida

A.

Urina - HCG solvel

Anti-HCG

Partculas de ltex+HCG

Inibio da aglutinao

B.

Anti-HCG

Partculas de ltex+HCG

Aglutinao

5. Aglutinao passiva reversa Enquanto que na Aglutinao Passiva, as partculas so revestidas de antgenos, na Aglutinao Passiva Reversa, as partculas so revestidas de anticorpos. Para a realizao do teste, as partculas revestidas com anticorpos adsorvidos so incubadas com o plasma, a urina ou o lquido encelaforraquidiano do paciente. Quando existem antgenos nestes lquidos que so reconhecidos pelos anticorpos adsorvidos nas partculas, estas aglutinam. um teste geralmente utilizado em fases da infeco em que a concentrao dos anticorpos baixa e pode-se detectar a presena do agente infeccioso. Na Figura 13, as partculas esto revestidas de anticorpos contra o vrus da Hepatite; quando estas partculas so colocadas em contato com plasma contendo os vrus, estas aglutinam. Este ensaio utilizado para detectar tambm alfa-fetoprotena e hemoglobina, alm de diversos microorganismos (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophyllus influenzae, Mycobacterium tuberculosis). A sensibilidade deste ensaio alta, detectando, por exemplo, entre 0,30,6 ng/ml de polissacardeo grupo-especfico solvel de H. influenzae.

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Figura 13 Inibio da aglutinao passiva reversa

Ltex + Anti - vrus da hepatite

Partculas virais presentes no soro

Aglutinao

ENSAIOS DE IMUNO - MARCAO 1. Imunofluorescncia e imunoperoxidase A imunofluorescncia, assim como a imunoperoxidase, so tcnicas, realizadas em lminas de microscpio, que permitem a deteco e localizao de antgenos ou anticorpos em clulas ou tecidos. O que diferencia a imunofluorescncia da imunoperoxidase, que na primeira os anticorpos para a deteco do antgeno so marcados com molculas que emitem luz fluorescente (fluorescena, rodamina) enquanto que na segunda, os anticorpos so marcados com uma enzima (peroxidase, fosfatase alcalina). A tcnica de imunofluorescncia de uso mais limitado que a imunoperoxidase, porque necessita de uma infraestrutura mais complexa: microscpio de fluorescncia e uma sala escura para visualizao da emisso da luz fluorescente. Alm disso, os resultados precisam ser rapidamente analisados, porque a fluorescncia vai sendo reduzida gradativamente, e uma tcnica que no pode ser adaptada microscopia eletrnica. As vantagens da imunoperoxidase que as lminas submetidas anlise podem ser guardadas por vrios anos, os resultados podem ser observados em qualquer microscpio ptico e a marcao enzimtica pode ser adaptada s tcnicas de microscopia eletrnica. Estas tcnicas podem ser utilizadas para detectar microorganismos presentes em clulas e tecidos, auto-anticorpos ou molculas do sistema Complemento, depositadas nos tecidos,

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imunoglobulinas presentes nas clulas, antgenos tumorais, identificao de clulas por meio da deteco de molculas especficas de cada populao, dentre outras. A imunofluorescncia e a imunoperoxidase podem ser de dois tipos: !"Direta ou !"Indireta. 1.1 Imunofluorescncia e imunoperoxidase direta Nas tcnicas diretas, o antgeno tecidual reconhecido por um anticorpo marcado com uma molcula fluorescente (imunofluorescncia) ou uma enzima (imunoperoxidase). Por exemplo, se quisermos identificar simultaneamente por imunofluorescncia, clulas CD4+ e CD8+ presentes no sangue ou no linfonodo de um paciente (Figura 14); neste caso, as clulas sero colhidas, aderidas em lmina de microscpio, adequadamente fixadas e incubadas com anticorpos monoclonais (ver abaixo) anti-CD4 marcados com fluorescena (emite luz verde) e anti-CD8 marcados com rodamina (emite luz vermelha). Aps um tempo de incubao pr-estabelecido, as lminas so lavadas para retirar os anticorpos que no se associaram e observadas ao microscpio de fluorescncia. As clulas CD4+ apresentaro marcao de membrana em verde enquanto que as CD8+, marcao em vermelho. Se contarmos o nmero de clulas marcadas em verde e em vermelho, teremos, neste caso, a proporo de linfcitos Tauxiliares e Tcitotoxicos, respectivamente. No caso de utilizarmos a imunoperoxidase direta para identificar os linfcitos T e B, teremos que fazer duas lminas, uma incubada com anti-CD4 e outra com anti-CD8, ambos marcados com Peroxidase; isto porque no possvel identificar pelas cores os padres de marcao. Nesta tcnica, depois da adio do anticorpo e posterior lavagem, deve-se incubar a lmina com o substrato da enzima, no caso o Perxido de Hidrognio, e um doador de eltrons, tal como a diaminobenzidina (DAB). Durante a reao enzimtica, esta substncia sofre oxidao e polimeriza numa substncia insolvel, de cor castanha visvel ao microscpio ptico.

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Figura 14 Imunofluorescncia direta para identificao das molculas CD4 e CD8

Lmina apresentando clulas isoladas de linfonodo ou do sangue, em duplicata


Anti-CD8 marcado com rodamina Anti-CD4 marcado com fluorescena

CD4

CD8

Visualizao ao microscpio de fluorescncia

1.2 Imunofluorescncia e imunoperoxidase indireta Na imunofluorescncia ou na imunoperoxidase indireta, os antgenos teciduais ou celulares so detectados pela incubao com dois tipos de anticorpos: !"O primeiro que reage diretamente com o antgeno, como o anticorpo monoclonal anti-CD4, que reconhece molculas CD4 presentes na membrana de Linfcitos T auxiliares (Figura 15). !"E o segundo, que reage com o primeiro anticorpo, sendo este marcado com o fluorocromo ou com a enzima. Suponhamos que o primeiro anticorpo (anti-CD4) tenha sido produzido em rato, ou seja, temos um anticorpo monoclonal de rato anti-CD4 humano. Neste caso, o segundo anticorpo deve ser um anticorpo produzido em outra espcie (carneiro, coelho, cavalo) que reaja com a Ig de rato. Caso o anticorpo monoclonal de rato anti-CD4, seja uma IgG, temos que ter um soro de carneiro (ou de cavalo, de coelho) anti-IgG de rato marcado com o fluorocromo ou a enzima.

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Figura 15 - Imunofluorescncia indireta para identificao da molcula CD4 Primeiro Anticorpo Segundo Anticorpo marcado

IgG de camundongo Anti-CD4

Soro de carneiro anti IgG de rato marcado com fluorescena

CD4

Visualizao ao microscpio de fluorescncia

A imunofluorescncia e a imunoperoxidase indireta apresentam mais vantagens que a direta em vrios aspectos. A primeira vantagem que, nos laboratrios clnicos, se utilizssemos a tcnica direta para identificar anticorpos anti-HIV ou outro microorganismo em pacientes, por exemplo, teramos que marcar os anticorpos, de todos, com fluorocromo ou enzima e isto impraticvel. Outra vantagem que o fato de utilizarmos dois anticorpos aumenta a sensibilidade da tcnica e podemos utilizar menores concentraes do primeiro anticorpo, o que reduz os custos, principalmente quando estes so anticorpos monoclonais. A tcnica de imunofluorescncia muito utilizada na pesquisa de Imunoglobulinas e molculas do sistema Complemento, presentes nos rins e na pele em doenas auto-imunes. utilizado tambm em casos de pesquisa de agentes infecciosos tais como: vrus respiratrios (influenza, para-influenza, adenovrus, vrus respiratrio sincicial), vrus da famlia herpes (herpes simples, citomegalovrus), Treponema pallidum, Chlamydia, Legionella, Escherichia coli, estreptococcus beta hemoltico, dentre outros. Estes antgenos podem ser detectados em diferentes tipos de amostras: bipsias, urina, lavado broncoalveolar ou preparado de leuccitos. Os resultados podem ser analisados por meio da titulao do

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soro; por exemplo, a deteco de IgM e IgG anti-Chlamydia pneumoniae em ttulos maiores, respectivamente, que 1:32 e 1:2000 indica infeco ativa. 2. Citometria de fluxo A citometria de fluxo permite, pelo uso de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos, quantificar clulas, expressando molculas de diferenciao (CDs) ou outros antgenos, em amostras de clulas colhidas do sangue, de rgos linfides, dentre outros tecidos. Apesar da semelhana com a imunofluorescncia, a citometria de fluxo uma tcnica automatizada na qual se utiliza um aparelho denominado fluormetro (Figura 16). As clulas so previamente incubadas com diferentes anticorpos monoclonais marcados com dois ou mais fluorocromos e a quantidade de fluorocromo associada a cada clula medida passando as clulas isoladamente num fluormetro. Neste aparelho, medida que as clulas passam por uma cnula, um feixe de raio laser incidido sobre elas, refletindo a luz emitida, o que permite que esta luz seja identificada num sistema computadorizado, e seja feita a quantificao da molcula expressa por cada clula. Por exemplo, se quisermos avaliar a produo de clulas CD4+ (LTa) e CD8+ (LTc) presentes no sangue perifrico de pessoas normais e infectadas pelo HIV. As clulas brancas do sangue de cada paciente so isoladas, incubadas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 marcados, respectivamente, com fluorescena (fluorocromo verde) e rodamina (fluorocromo vermelho), e colocadas num fluormetro. Estas clulas, medida que passam pela cnula do aparelho, vo sofrer a ao de um feixe de raio laser e a luz emitida (verde ou vermelha) ser identificada e a informao enviada para um computador. Os resultados obtidos so expressos, em grficos, pelo computador. Num dos possveis tipos de grfico, cada clula visualizada num quadrante, no qual observa-se a distribuio das clulas que expressam um dos fluorocromos (fluorescena LT CD4+ ou rodamina LT CD8+), as que so negativas (DNduplo negativas) ou positivas para os dois fluorocromos (Figura 16). 3. Separador de clulas ativadas por fluorescncia (FACS Fluorescent Activated Cell Sorter) Este aparelho, FACS - mais sofisticado que o fluormetro, permite que alm de quantificadas, as clulas sejam separadas de acordo com a sua ligao com o anticorpo monoclonal marcado com o fluorocromo. A separao ocorre porque as clulas so carregadas eletricamente e passam por campos magnticos, cuja fora e direo variam de acordo com a intensidade do sinal fluorescente emitido (Figura 16).

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FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BSICA E APLICADA

Figura 16 Citometria de fluxo e FACS

Meio de cultura
Clulas marcadas com anticorpos monoclonais fluorescena anti-CD4 rodamina anti-CD8

Fluorescncia

Raio Laser Detector de comprimento de onda e analisador Campos eletromagnticos


%F1+ F L U O R O C R O M O 1 (F1) FLUOROCROMO 2 (F2) %F1/F2+

%DN

%F2+

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLGICOS

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Estas clulas podem ser reutilizadas para outros ensaios porque so mantidas a integridade e a esterilidade da amostra. 4. Ensaios imunoenzimticos (ELISA - Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay) e radioimunoensaios (RIA-Radio-Immuno Assay) Os ensaios imunoenzimticos e os radioimunoensaios apresentam os mesmos princpios tcnicos com a diferena que no primeiro, a revelao da reao realizada com anticorpos marcados com enzima, como na imunoperoxidase, e no segundo, a revelao realizada com anticorpos marcados com istopos radioativos (geralmente
125 131

I ou

I). Pelos efeitos deletrios da radiao, os

radioimunoensaios esto sendo substitudos pelos ensaios imunoenzimticos. Estes mtodos podem ser utilizados para a deteco de antgenos (hormnios, drogas, marcadores tumorais, alrgenos) e de anticorpos (contra bactrias, vrus, fungos e protozorios). A sensibilidade de deteco destes ensaios na ordem de nanogramas (ng) ou picogramas (pg). Ser dada nfase aos ensaios de ELISA, e dentre as variaes empregadas na realizao deste, sero focalizados os do tipo indireto e de captura. O mtodo indireto propicia a deteco de anticorpos na amostra enquanto que no de captura so detectados antgenos, que podem ser inclusive Imunoglobulinas. Estas tcnicas so geralmente realizadas em placas de poliestireno de 96 poos, o que propicia a utilizao de um maior nmero de amostras num nico ensaio (Figura 17). No mtodo indireto, as placas so pr-incubadas com os antgenos contra os quais se quer detectar a produo de anticorpos; atualmente compram-se placas contendo alguns tipos de antgenos j padronizados (Figura 17A). Depois da pr-incubao, as placas devem ser lavadas para retirar os antgenos no aderidos e incubadas com solues protecas (leite desnatado, gelatina, albumina srica bovina, casena) para bloquear os locais no ocupados pelos antgenos. Esta etapa importante porque como estas placas apresentam capacidade de adsorver protenas, os anticorpos ou outras molculas presentes nos lquidos analisados podem se associar placa e alterar os resultados. Aps o bloqueio, as amostras de soro/plasma so incubadas, por perodos de tempo e temperatura padronizados (Figura 17B); em seguida, as placas so lavadas para retirar os anticorpos no especficos e incubadas com anticorpos especficos para o primeiro anticorpo, marcados com uma enzima (fosfatase alcalina, por exemplo) (Figura 17C).

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Figura 17 - ELISA

Placa de 96 cavidades A. Sensibilizao da placa com o Ag


1 2 A B C D E F G H 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Lavagem

B. Adio do primeiro anticorpo

C. Adio do anticorpo marcado com enzima (ELISA) ou radioistopo (RIA)

Lavagem

Lavagem

D. ELISA - adio do substrato e cromgeno

E. Reao enzimtica - reao colorida leitura da Densidade ptica (DO) no espectrofotmetro

1 A B C D E F G H

9 10 11 12

Curva padro

Amostras

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLGICOS

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A revelao da reao antgeno-anticorpo feita pela incubao com o substrato da enzima e com os doadores de hidrognio, sendo os mais comumente utilizados o cido 5-aminosaliclico (castanho), o 2,2-diazino (3-etilbenzotiazolino6cido sulfnico-ABTS) (verde) e a

tetrametilbenzidina-TMB (azul) (Figura 17D). A intensidade da cor no final da reao proporcional a concentrao dos anticorpos presentes na amostra (Figura 17E); e por isso este ensaio colorimtrico. A leitura da intensidade da cor obtida em espectrofotmetros, adaptados leitura de placas, e estes resultados so dados em Densidade ptica (DO), a qual proporcional concentrao de anticorpos na amostra. Alm das amostras dos pacientes, estes ensaios devem utilizar como controle anticorpos especficos, de concentrao conhecida, de forma que se possa quantificar a concentrao de anticorpos presentes nas amostras (curva - padro). Tendo-se a curva - padro onde se tem a correlao entre concentraes conhecidas do anticorpo com a DO, pode-se calcular a partir das DOs de soros dos pacientes, a concentrao de anticorpos especficos. Como exemplo, examinemos a Figura 18.
Figura 18 Curva padro

Curva Padro
Concentrao (mg/ml) DO 1.5

2 1 0,5 0,25 X Y

1 0,694
DO (x n m) 1.0

0,347 0,168 0,894 0,325

0.5

0.0 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Concentrao do Anticorpo (mg/ml)

Na Figura 18, temos na tabela as concentraes de um anticorpo padro (entre 2 e 0,25mg/ml) e as correspondentes DOs; estes resultados propiciam que se tenha uma curva - padro, a partir da qual, atravs da anlise de regresso linear (por exemplo, Programa GraphPad Prism), pode-se calcular as concentraes x e y, cujas DOs so conhecidas. Na curva - padro, a linha azul foi obtida a partir dos dados de DOs e a concentrao de anticorpos e a linha vermelha corresponde ao resultado da anlise de regresso linear, que nos d a segurana de que existe realmente uma correlao linear entre os dois dados. A anlise de regresso linear proporciona um ndice de correlao entre os dados, o qual deve ser

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o mais prximo possvel de 1,0, o que indica uma boa correlao entre os dados analisados. No caso da Figura 18, o ndice de correlao da curva foi de 0,99071, o que nos indica que existe uma correlao linear entre a DO e as concentraes de anticorpos. A partir da equao obtida, tem-se que os valores desconhecidos X e Y correspondem s concentraes de anticorpos de 1,73 e 0,503 mg/ml, respectivamente. No mtodo de captura (ou ELISA sanduche), anticorpos especficos so aderidos placa e a amostra contendo a molcula a ser reconhecida (hormnio, citocina, droga, Imunoglobulina, antgenos tumorais ou alrgenos) colocada. Aps os procedimentos normais de incubao e de lavagem, a placa incubada com um soro policlonal marcado com enzima, que reconhece o antgeno associado ao anticorpo aderido placa. Esta tcnica chamada de sanduche porque o antgeno fica entre dois anticorpos, o aderido placa e o anticorpo marcado com a enzima. Neste tipo de tcnica quando o anticorpo aderido placa monoclonal deve-se ter o cuidado do segundo anticorpo marcado ser policlonal ou um monoclonal que reconhea um eptopo diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo. 5. Western Blotting O termo blotting significa, em biologia molecular, transferir macromolculas de um meio semi-slido como o gel de poliacrilamida para um papel de filtro. A primeira tcnica deste tipo descrita foi o Southern Blotting, na qual so transferidas molculas de DNA; este nome foi dado tcnica por causa do sobrenome do cientista que a descreveu E.M.Southern. Como uma brincadeira, a tcnica descrita para a transferncia de RNA foi denominada Northern Blotting e para protenas, Western Blotting. A tcnica de Western Blotting permite que peptdeos antignicos sejam separados, por Peso Molecular (entre 5.000 e 250.000 daltons), e reconhecidos por anticorpos especficos. Vrios antgenos, principalmente os patgenos, j so conhecidos em termos moleculares e apresentam um padro caracterstico de peptdeos e portanto, pode-se identificar, com alto grau de preciso, se um indivduo apresenta uma infeco com um determinado tipo de patgeno. Na tcnica de Western Blotting, peptdeos oriundos de um antgeno, por exemplo, dos HIV so separados por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo um detergente aninico - o SDS (dodecil sulfato de sdio) (Figura 19). O SDS associa-se s regies hidrofbicas das protenas conferindo-lhes cargas negativas, o que propicia a migrao na eletroforese de acordo com o PM. Aps a eletroforese, os peptdeos separados so transferidos por capilaridade (blotting) ou por corrente eltrica (eletroforese) para um papel de nitrocelulose. O papel de nitrocelulose apresenta a partir deste procedimento uma

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLGICOS

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cpia dos antgenos que foram separados no gel e durante esta passagem do gel para o papel, o SDS deslocado das protenas e os determinantes antignicos nativos so re-expostos. Na etapa seguinte, o papel contendo os peptdeos isolados incubado com o soro dos pacientes em anlise. Aps lavagem, para a retirada dos anticorpos no associados, as fitas so incubadas com um soro anti-Ig humana marcado com uma enzima, com o substrato e o cromgeno. Quando o paciente apresenta anticorpos contra os peptdeos isolados, aps a revelao pelo cromgeno, aparecem bandas (manchas) nos locais onde os anticorpos especficos se associaram. Alm da revelao enzimtica, podem ser utilizados anticorpos marcados com radioistopos e assim o papel submetido a autoradiografia (revelao com emulso fotogrfica), para que sejam visualizadas as bandas. Na figura 19, temos trs padres de resultado: !"No papel de nitrocelulose referente ao paciente 1 esto presentes bandas nos locais correspondentes s protenas de PM 120, 64, 55, 41, 33, 24 e 18 kD, demonstrando que apresenta anticorpos que reconhecem todos os componentes do HIV (Captulo 19). !"O papel de nitrocelulose referente ao paciente 2 no apresenta bandas o que significa que este no apresenta anticorpos especficos contra os peptdeos presentes na fita. !"O papel de nitrocelulose referente ao paciente 3 apresenta banda apenas no local correspondente p24, o que pode sugerir, que ele tenha uma infeco por um outro retrovrus, com peptdeos similares ao do HIV ou outro tipo de microorganismo que apresenta uma protena de 24 kD. TCNICAS DE CULTURA CELULAR 1. Cultura de clulas e ensaios de proliferao A grande maioria dos conhecimentos relativos ativao celular, induo de citocinas, molculas co-estimulatrias e outras tem sido obtidos com clulas cultivadas in vitro. Vrios destes mecanismos tm sido, nos ltimos anos, comprovados em sofisticados modelos in vivo utilizando animais nocauteados (nos quais genes foram inativados) e transgnicos (nos quais genes foram implantados).

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Figura 19 Western Blotting A. Gel de separao, B. Tanque de Blotting (transferncia para papel de nitrocelulose), C. Incubao com soro de paciente, Ig marcada e substrato, D. Visualizao dos resultados

A. Polo +

B.
Papel de filtro Membrana de nitrocelulose
A A A

Amostras Ags do HIV

Gel com peptdeos separados

Peptdeos separados

Polo Papel de filtro

Soluo tampo

C.
Soro dos pacientes
A1 A2 A3 A1 A2 A3

Lavagem

+anti-Ig humana marcada com enzima + substrato + cromgeno

D.
Padro de PM (kDa)

A1

A2

A3

120 64 55 41 33 24 18

Interpretao dos resultados: A1- Paciente 1 HIV+ A2- Paciente 2 negativo A3 Paciente 3 p24+ (outro Ag que expressa p24, alm do HIV).

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLGICOS

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As clulas cultivadas in vitro podem ser obtidas do sangue perifrico ou de rgos linfides primrios (medula ssea e timo) e secundrios (linfonodos e bao). As culturas tambm podem ser feitas com linhagens obtidas de clulas tumorais que foram isoladas de seres humanos ou animais; estas linhagens podem ser de macrfagos, mastcitos, linfcitos ou outros tipos celulares; no entanto, estas clulas apesar de serem homogneas apresentam alteraes patolgicas que podem interferir nos mecanismos em estudo. Desta forma, resultados obtidos com clulas de linhagens tumorais devem ser corroborados por resultados obtidos com clulas de padro normal. As clulas isoladas do sangue (geralmente as principais clulas obtidas em seres humanos pela facilidade de coleta) ou de rgos linfides (geralmente, de animais de experimentao, na maioria dos casos, de camundongos) so colocadas em placas estreis de plstico, em meios de cultura com suplementos importantes para a sua sobrevivncia (Figura 20). Nestas placas, as clulas so submetidas a estmulos inespecficos ou especficos. Os estmulos inespecficos que ativam os linfcitos de forma policlonal, ou seja, independentemente de sua especificidade, so denominados mitgenos. Alguns mitgenos induzem a proliferao de linfcitos T enquanto que outros, a de linfcitos B. A concanavalina A (ConA), lectina isolada do feijo da espcie Canavalia ensiformis, induz a proliferao de linfcitos T de camundongos, enquanto que a Fitohemaglutinina (PMA), isolada do feijo da espcie Phaseolus vulgaris, induz a de linfcitos T humanos (Figura 20). O Lipopolissacardeo bacteriano (LPS) obtido de Salmonella ou de Escherichia coli ativa de forma policlonal os linfcitos B de camundongos, alm de ativar os macrfagos, induzindo a produo de citocinas pr-inflamatrias e os produtos txicos de oxignio e nitrognio. Estes mitgenos geralmente so utilizados para avaliar o estado funcional celular porque pela sua capacidade de associao a acares da membrana celular, ativam entre 30 e 60% das clulas. Por outro lado, a ativao especfica dos linfcitos nem sempre induz proliferao mensurvel porque o percentual de clulas especficas para um determinado antgeno muito pequeno (entre 0,2 e 0,01%). A utilizao de antgenos na ativao celular in vitro mais eficiente quando as clulas so oriunda+++++++s de animais ativados in vivo com altas doses do antgeno, o que propicia um aumento do nmero de clulas especficas. Em seres humanos, com exceo de alguns casos patolgicos, mais difcil ativar as clulas com antgenos isolados. No entanto, quando pessoas so vacinadas, suas clulas podem ser cultivadas na presena de antgenos da vacina para serem estudados os tipos de resposta induzidos: proliferao dos linfcitos, produo de citocinas, expresso de molculas co-estimulatrias. Como por exemplo: se quisermos estudar o tipo de resposta que uma vacina contra a leishmaniose est

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induzindo, teremos que isolar os leuccitos do sangue perifrico das pessoas vacinadas e no vacinadas residentes no local regio e cultiv-las com antgenos de Leishmania presentes na vacina e avaliarmos a resposta proliferativa e a secreo de citocinas, dentre outras possibilidades.
Figura 20 Cultura de clulas e ensaio de proliferao

Coleta de sangue perifrico

Separao dos linfcitos do sangue

Plasma
Hemcias, plaquetas, granulcitos

Linfcitos/moncitos

Sem estmulo

A B
+ PMA

C D Placa estril de 24 poos Proliferao celular Citocinas (ELISA)

2. Produo de hibridoma e anticorpos monoclonais Quando inoculamos um antgeno em um animal e coletamos o seu sangue, no plasma so encontrados os anticorpos especficos contra os determinantes antignicos deste antgeno. Este plasma um antisoro policlonal porque os anticorpos ali presentes so oriundos de vrios clones de linfcitos B especficos para cada um dos determinantes antignicos. Por exemplo, se inocularmos linfcitos T

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humanos num camundongo, ocorrer ativao de linfcitos T e B especficos contra as principais molculas presentes na superfcie da clula humana inoculada (Figura 21) e teremos, ao coletar o plasma dos camundongos, um conjunto de anticorpos que reconhecem estes determinantes antignicos. No entanto, para se obter estes anticorpos especficos contra os determinantes antignicos de forma isolada podemos utilizar a tcnica de anticorpos monoclonais, desenvolvida em 1975, por Khler e Milstein. Nesta tcnica, o animal inoculado com o antgeno, no nosso caso os linfcitos T humanos, ter o seu bao ou linfonodo coletado e os linfcitos B isolados so fundidos com clulas de mieloma (um tumor de linfcitos B, no produtor de anticorpos), pelo uso de uma substncia denominada Polietilenoglicol (PEG). Estas clulas so cultivadas em meios seletivos, que propiciam que apenas as clulas fundidas (hibridomas) sobrevivam. Os hibridomas obtidos da fuso de linfcitos B e das clulas do mieloma so clulas que apresentam a capacidade de secretar anticorpos e sobreviver indefinidamente em cultura, o que no ocorre com os plasmcitos. As clulas do hibridoma so diludas em placas de plstico estril de forma que em cada poo seja inserida uma nica clula (ensaio de diluio limitante). Quando a clula prolifera, ela secreta anticorpos mono-especficos, ou seja, os anticorpos monoclonais, oriundos de um nico clone. Foi exatamente desta forma que foram descobertas as molculas (CDs) presentes na membrana dos linfcitos T, B, macrfagos, NK e outras. TCNICAS DE MODIFICAO GENTICA DE ANIMAIS 1. Camundongos transgnicos Os camundongos transgnicos so aqueles nos quais foram introduzidos no genoma, durante a fase embrionria, novos genes pr-existentes ou no (seqncias clonadas e denominadas transgenes). A primeira etapa na criao de um camundongo transgnico a induo de superovulao em um camundongo fmea, pelo inculo de Hormnio Folculo Estimulante e Gonadotrofina Corinica. Aps a induo da ovulao, o camundongo fmea acasalado e o ocito fertilizado removido e a seqncia do gene injetado no pr-ncleo masculino. Estes ocitos fertilizados so inoculados no tero de fmeas pseudo-grvidas. Das centenas de cpias de genes injetadas no pr-ncleo, cerca de 25% so integradas no genoma e originam os camundongos transgnicos. Estes camundongos transgnicos geralmente so heterozigotos e devem ser endocruzados para originar a linhagem homozigota.

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FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BSICA E APLICADA

Figura 21 Produo de hibridoma e anticorpos monoclonais

Ag - Linfcitos T humano

Inculo em camundongos

Da1

Da2

Da4

Coleta do bao
Da3

Coleta de sangue
Clulas do bao Clulas de mieloma

Antisoro policlonal Fuso

Anticorpos monoclonais

1 A B C D

Hibridomas

Coleta do sobrenadante das culturas

Separao dos clones de linfcitos B

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLGICOS

303

Estes camundongos so importantes nos estudos das atividades da grande variedade de molculas que o organismo produz. Por exemplo: se o gene da IL-4 foi clonado e queremos observar o efeito desta citocina na infeco contra a Leishmania, podemos criar um camundongo que expresse em excesso a IL-4 (transgnico para IL-4) e aps a infeco, acompanhar comparativamente em relao ao camundongo normal da mesma linhagem, o desenvolvimento da leso, o nmero de parasitas na leso e nos rgos linfides, a induo de outras citocinas e a resposta imune nestas condies. 2. Camundongos nocauteados (knock out) A tcnica de nocaute gnico permite que genes mutados in vitro e inseridos, durante o desenvolvimento embrionrio no blastocisto, originem camundongos deficientes na produo da molcula induzida pelo gene. Assim como foram utilizadas, nos primrdios da Imunologia, as tcnicas de timectomia, bursectomia, esplenectomia para serem estudadas as funes destes rgos, hoje se pode mutar qualquer gene, impedindo que ele seja expresso de forma adequada. Vrias funes das citocinas, de molculas co-estimultorias tm sido estudadas, em diferentes modelos experimentais, por meio desta tcnica. Para que seja produzido um camundongo nocauteado, a primeira etapa consiste na clonagem do gene e da sua modificao in vitro. Estas modificaes so obtidas pela insero de dois genes (Figura 22): !"O da resistncia a neomicina. Este gene insere-se em regies intragnicas, modificando a sua expresso, ou seja mutando o gene (Figura 22A); alm disso, atua como marcador da clula mutante, porque esta se torna resistente a neomicina, quando cultivada em meio contendo este antibitico (Figura 22C3). !"O da timidina quinase (tk), do vrus herpes. Este gene no expresso quando a clula sofre recombinao homloga, ou seja, quando ocorre a troca do gene normal pelo mutado. Como a clula mutante no expressa o gene tk, esta no sensvel ao ganciclovir, agente anti-viral (Figura 22C3). Por outro lado, as clulas que apresentam insero aleatria do gene, continuam expressando o gene tk e so sensveis ao ganciclovir (Figura 22C2). Aps a mutao, estes genes so inseridos num vetor e introduzidos em clulas embrionrias primordiais (ES Embryonic Stem Cells) de camundongo (linhagem 1). Estas clulas so capazes de originar qualquer tipo de tecido (Figura 22B).

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FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BSICA E APLICADA

Figura 22 Clonagem do gene e insero em clulas in vitro. A. Clonagem do gene (IL-4, por exemplo) e mutao do gene in vitro (insero do gene da resistncia neomicina (neo) e o gene timidina quinase tk- do vrus herpes), B Insero in vitro do gene mutado em clulas tronco embrionrias (transfeco), C.Tipos de insero:1. ausncia de insero, 2. Insero ao acaso e 3. Insero por recombinao homloga

A. Gene da IL-4 neo Tk

B.

Cromossomos (linhagem 1)

Cls.Tronco

C.

1.

2.

3.

Morte Morte Sobrevivncia


Cultivo em Neomicina e ganciclovir
Gene excisado

Proliferao

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLGICOS

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Estes genes introduzidos podem apresentar trs destinos diferentes na clula: ausncia de insero, insero aleatria e insero por recombinao homloga. Desta forma, apenas uma pequena populao das clulas apresenta o gene inserido de forma correta, ou seja, os que apresentaram recombinao homloga; para que ocorra seleo destas clulas, elas so cultivadas em meio contendo neomicina e ganciclovir, como acima referido. O resultado desta cultura em meio contendo neomicina e ganciclovir o seguinte: !"As clulas que no tiveram o gene inserido, so sensveis a neomicina e morrem (Figura 22C1). !"As clulas que apresentam insero aleatria, no perdem o gene da tk e so sensveis ao ganciclovir e morrem (Figura 22C2). !"As clulas que sofreram recombinao homloga do gene mutado apresentam resistncia a neomicina e por no expressarem a tk so resistentes ao ganciclovir e sobrevivem (Figura 22C3). Na prxima etapa, estas clulas sobreviventes so inseridas in vitro em blastocisto de camundongo fmea de cor de pelagem diferente (linhagem 2) daquela da qual foram coletadas as clulas embrionrias (linhagem 1) (Figura 23A). Aps a introduo das clulas no blastocisto, este inserido em camundongos fmea na qual foi induzida a gravidez hormonal. O blastocisto desenvolve-se e origina uma prole formada por camundongos quimricos, ou seja, apresentando caractersticas das duas linhagens. A utilizao de camundongos de pelagens diferentes importante para a identificao dos camundongos quimricos que herdaram os genes mutantes: estes apresentam um padro mesclado de cor de pelagem. Por exemplo, as clulas embrionrias (linhagem 1) podem ser oriundas de camundongos de pelagem marrom enquanto que o blastocisto de fmeas de pelagem negra (linhagem 2). Os camundongos quimricos apresentam a cor negra mesclada com faixas marrons e so heterozigotos para o gene mutado. Estes camundongos quimricos so cruzados com camundongos normais, para que seja obtida uma linhagem homozigota para o gene mutante (Figura 23B).

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FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BSICA E APLICADA

Figura 23 Obteno de camundongos nocauteados A. Inculo das Clulas Tronco Embrionrias de camundongo marrom em blastocisto de fmeas pretas B. cruzamento dos camundongos quimricos

A.
Cromossomos (linhagem 2)

Cromossomo com gene mutado

Filhote quimrico

Clulas tronco

Blastocisto

Reimplante do blastocisto em fmea pseudo-grvida

B.
Cromossomo mutado

Cromossomos normais