ESCOLA MUNICIPAL GOVERNADOR ISRAEL PINHEIRO Avenida Luzia Brandão Fraga de Souza, nº 201, Loanda - João Monlevade Minas

Gerais - CEP: 35.931-023

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CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA

Química Clínica

Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Escola Municipal Governador Israel Pinheiro para obtenção do título de Técnico em Química. Supervisor: Fernanda G. Ribeiro Orientador: Prof. Me. Huita do Couto Matozo

João Monlevade/MG 2013

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CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA Laboratório de Análises Clínicas

Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Química Clínica

Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira Av. Gustave Peffer – n° 751 – Bairro: Louis Ensch Tel.: (31) 9522-8095 E-mail: leandro.yukiroyt@hotmail.com

João Monlevade/MG 2013

ESCOLA MUNICIPAL GOVERNADOR ISRAEL PINHEIRO Avenida Luzia Brandão Fraga de Souza, nº 201, Loanda - João Monlevade Minas Gerais - CEP: 35.931-023

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Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Química Clínica
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) – Área de Concentração: Química

________________________________________ Farmacêutica/Bioquímica Fernanda G. Ribeiro Supervisora de Estágio - RT

_______________________________________ Professor Me. Huita do Couto Matozo Orientador de Estágio _______________________________________ Mônica Faria da Silva Parente Diretora da Instituição de Ensino – EMIP

_______________________________________ Leandro José Dias G. de Oliveira Estagiário de Química

João Monlevade - Fevereiro de 2013

4 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Oliveira, Leandro José Dias Gonçalves de. Química Clínica / Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira; Orientador Huita do Couto Matozo; Secretaria Municipal de Saúde e Meio Ambiente: Fernanda G. Ribeiro – Rio Piracicaba, 2013. 123 p. Relatório de Estágio (Técnico – Disciplina de Estágio Supervisionado – Área de Concentração: Química) – Escola EMIP – QUÍMICA. 1. Análises Clínicas. 2. Química. 3. Bioquímica. 4. Exames.

5 “Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, já que têm a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, às margens de nós mesmos.” Fernando Pessoa

AGRADECIMENTOS

“Agradeço a Deus, sempre presente em minha vida.” “Aos meus familiares e amigos, que juntos torceram pela minha vitória.” “À minha avó materna Efigênia (in memorian), cuja presença espiritual sempre me ajudou a progredir com afinco nos estudos.” “Aos meus professores, que me guiaram durante toda minha jornada.” “Aos colegas de trabalho do laboratório da secretaria de saúde, pela oportunidade que me deram de mostrar meu conhecimento, possibilitando meu desenvolvimento profissional.”

6 OLIVEIRA, L. J. D. G. Química Clínica, 2013 – 123 p. Relatório Técnico Supervisionado de Conclusão do Curso Técnico de Química – EMIP – Escola Municipal Governador Israel Pinheiro; João Monlevade – MG, 2013.

O laboratório do Centro de Saúde Dr. Gentil Alves Costa tem como objetivo a análise de materiais biológicos (sangue, fezes e urina) cujo estudo visa apresentar laudos sobre a saúde do paciente. As áreas nas quais os técnicos atuam são: coleta, hematologia, bioquímica, imunologia, urinálise e parasitologia. As atividades realizadas estão em conformidades com as recomendações e exigências pelo Conselho Regional de Farmácia e da Vigilância Sanitária Estadual de Minas Gerais. No laboratório não se pensa apenas nos procedimentos e nos resultados obtidos, mas também na ética profissional. Há, também, zelo pelos materiais de trabalho e mais, pelo meio ambiente. No presente relatório constam as atividades desenvolvidas durante o estágio supervisionado na área de análises clínicas. Apresenta aplicações vistas durante o curso técnico de química e, também, a programação de estágio. As atividades estão interligadas, e funcionam harmonicamente desde a entrada do paciente (cadastro) até a entrega do resultado.

Palavras-Chave: Análises Clínicas; Bioquímica; Química; Exames.

7 Sumário Pág.

1. Introdução ............................................................................................................................. 2. Objetivos ............................................................................................................................... 2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................... 2.2. Objetivo Específico ....................................................................................................... 3. Recursos para o Trabalho Laboratorial ................................................................................. 3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ........................................................................... 3.1.1. Materiais .............................................................................................................. 3.1.2. Reagentes Analíticos ........................................................................................... 3.1.3. Equipamentos e Acessórios ................................................................................. 4. Metodologia Científica ......................................................................................................... 5. Assepsia e Coleta de Material Biológico .............................................................................. 5.1. Assepsia ......................................................................................................................... 5.2. Coleta ............................................................................................................................. 5.2.1. Sangue ..................................................................................................................... 5.2.2. Urina (de rotina) ..................................................................................................... 5.2.3. Fezes ....................................................................................................................... 5.2.3.1. Fezes sem MIF............................................................................................ 5.2.3.2. Fezes com MIF .......................................................................................... 6. Hematologia .......................................................................................................................... 6.1. Hemograma (Hc) ........................................................................................................... 6.1.1. Eritrograma ........................................................................................................... 6.1.2. Leucograma .......................................................................................................... 6.1.3. Plaquetograma ...................................................................................................... 6.2. Elementos do Sangue .................................................................................................... 6.2.1. Eritrócitos (Hemácias/RBC) ................................................................................. 6.2.2. Hemoglobina (HGB) ............................................................................................ 6.2.3. Hematócrito (HCT) ............................................................................................... 6.2.4. Leucócitos (WBC) ................................................................................................ 6.2.5. Linfócitos (LYN) .................................................................................................. 6.2.6. Monócitos .............................................................................................................

10 11 11 11 12 12 12 13 15 16 16 16 17 17 21 21 21 21 23 24 24 25 25 29 29 31 32 32 32 33

8 6.2.7. Neutrófilos ............................................................................................................ 6.2.8. Neutrófilos ............................................................................................................ 6.2.9. Mielócitos ............................................................................................................. 6.2.10. Metamielócitos ................................................................................................... 6.2.11. Basófilos ............................................................................................................ 6.2.12. Bastonetes ........................................................................................................... 6.2.13. Segmentados ....................................................................................................... 6.2.14. Trombócitos ........................................................................................................ 6.3. Preparo de Lâminas ...................................................................................................... 6.4. Contagem Diferencial de Células Leucocitárias ........................................................... 6.5. Grupos Sanguíneos + Fator Rh (GS + Rh) ................................................................... 6.6. Velocidade de Hemossedimentação (VHS) ................................................................. 6.7. Coagulograma (COAG) ................................................................................................ 6.7.1. Tempo de Protombina (TP) .................................................................................. 6.7.2. Atividade de Protombina (AP) ............................................................................. 6.7.3. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA) ............................................ 6.7.4. Relação Normalizada Internacional (RNI) ........................................................... 7. Bioquímica ............................................................................................................................ 7.1. Glicose (GLIC) .............................................................................................................. 7.1.1. Glicose (GLIC-J) ................................................................................................. 7.1.2. Glicose (GLIC-PP) .............................................................................................. 7.2. Colesterol Total (COL) .................................................................................................. 7.2.1. Frações do Colesterol .......................................................................................... 7.2.1.1. HDL ......................................................................................................... 7.2.1.2. LDL ......................................................................................................... 7.2.1.3. VLDL ...................................................................................................... 7.2.1.4. Triglicérides (TRIG) ................................................................................ 7.3. Uréia (UR) .................................................................................................................... 7.4. Ácido Úrico (AUR) ...................................................................................................... 7.5. Fosfatase Alcalina (FAL/ALP) ..................................................................................... 7.6 Proteínas Totais (PROT) ................................................................................................ 7.7. Albumina (ALB) ........................................................................................................... 7.8. Creatinina (CR) ............................................................................................................. 33 34 34 34 35 35 36 36 37 40 43 45 46 47 47 48 48 49 52 52 54 54 56 56 58 59 59 61 64 67 69 69 71

9 7.9. Mucoproteínas (MUC) .................................................................................................. 7.9.1. Desproteinização .................................................................................................. 7.9.2. Precipitação .......................................................................................................... 7.10.3. Colorimetria ....................................................................................................... 7.10. Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO) ............................................................. 7.11. Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGP) ............................................................. 8. Imunologia (Sorologia) ......................................................................................................... 8.1. HIV-1/2 .......................................................................................................................... 8.2. VDRL ............................................................................................................................ 8.3. Antiestreptolisina O (ASO/ASLO/AEO) ...................................................................... 8.4. Proteína C Reativa (PCR) .............................................................................................. 8.5. Fator Reumatoide (FR) ................................................................................................. 9. Parasitologia ......................................................................................................................... 9.1. Exame Parasitológico de Fezes (EPF) ........................................................................... 9.1.1. Método de Hoffman-Pons-Janes (HPJ) ................................................................ 9.1.2. Pesquisa de Controle de Esquistossomose (PCE) – Método Kato-Katz (KK) ..... 10. Urinálise .............................................................................................................................. 10.1. Análise Físico-Química .............................................................................................. 10.2. Análise Bioquímica .................................................................................................... 10.3. Sedimenstoscopia (EAS – Elementos Anormais do Sedimento) ............................... 11. Biossegurança ..................................................................................................................... 11.1. Procedimentos Operacionais Padrão (POP) ............................................................... 11.2. EPI’s e EPC’s ............................................................................................................. 11.3. Boas Práticas Laboratoriais ........................................................................................ 12. Lavagem de Material, Descarte de Resíduos e Esterilização ............................................. 13. Considerações Finais .......................................................................................................... 14. Conclusão ........................................................................................................................... 15. Referências ......................................................................................................................... 16. Anexos ................................................................................................................................ 73 74 75 76 77 78 81 82 83 87 88 89 91 92 92 94 96 96 98 99 102 102 102 103 103 104 105 106 116

10 1. Introdução

Em cumprimento ao que regulamenta a Lei n° 11.788, de 25/09/2008, o aluno Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira, do Curso Técnico de Química, da Escola Municipal Governador Israel Pinheiro – EMIP, localizada em João Monlevade, elaborou o seu Trabalho de Conclusão de Curso, referente ao estágio curricular no laboratório do Centro de Saúde Dr. Gentil Alves Costa, Química Clínica, em Rio Piracicaba, MG. Teve-se por base as atividades exercidas rotineiramente em laboratório de análises clínicas, realizado no período de 01/06/12 a 30/11/12, sob orientação da farmacêutica/bioquímica RT, Fernanda Ribeiro.

A análise clínica é o ramo de conhecimento que trabalha com o estudo de alguma substância de forma a coletar dados e apontar diagnósticos a respeito da saúde do paciente. Essas análises ocorrem a partir de um exame feito a pedido de um médico e são entregues em laboratórios próprios para realização desses exames. A hematologia é a subárea especializada em observar os elementos do sangue: hemácias, leucócitos, plaquetas e outras células. A bioquímica é a parte que se encarrega das dosagens de elementos diversos (glicose, colesterol, proteínas etc) utilizando o soro ou o plasma como material. A imunologia é o estudo das características do sistema imunológico, também utilizando o soro. A urinálise é a parte responsável pela observação dos elementos que compõe o sedimento urinário, avaliando possíveis anormalidades. A parasitologia é a parte que trata da observação dos sedimentos fecais visando à detecção de verminoses e outras anormalidades.

Nos procedimentos laboratoriais é fundamental o conhecimento teórico e saber interpretar os resultados encontrados nas dosagens realizadas. Atualmente os processos são semiautomatizados, mas mesmo assim o analista deve ter um conhecimento prévio, para que os serviços sejam executados de maneira correta e eficiente, pois erros de qualquer natureza devem ser evitados.

11 2. Objetivos 2.1. Objetivo Geral Concluir o estágio supervisionado de química demonstrando os conhecimentos obtidos durante o mesmo.

2.2. Objetivo Específico Detalhar minuciosamente todos os procedimentos realizados no laboratório de análises clínicas, de maneira a obter o título de técnico em química pela apresentação deste TCC ao corpo docente da EMIP.

12 3. Recursos para o Trabalho Laboratorial Os procedimentos realizados no laboratório são voltados para a análise de material biológico humano: sangue, fezes e urina. Todo procedimento tem métodos diferenciados, bem como a maneira de execução e interpretação dos mesmos. Os recursos de trabalho são os materiais, reagentes e equipamentos.

3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos 3.1.1. Materiais Agulha 0,70 x 25 mm Agulha 0,80 x 25 mm Balão Volumétrico Bandagem Anticéptica Bandeja Inox Bastão de Vidro Béquer de Vidro Braçadeira de Coleta Canudo de Plástico Coletor de Urina/Fezes Coletor para Perfurocortantes Compressa de Gaze Hidrofílica 7,5x7x7,5 cm Cronômetro Manual Cuba Rim Inox Cubeta para Coagulômetro Detergente Escova para Tubos de Ensaio Esponja Dupla-Face Antibactérias Estande para tubos de Ensaio Frasco conta gotas Funil de Polipropileno Garrote Impressora Matricial Jaleco Branco Lâminas sem Borda Fosca

13 Lápis Dermatográfico Luvas de Procedimento Descartáveis Macropipetadores Micropipetadores de Volume Fixo Micropipetadores de Volumes Variados Papel Filtro Qualitaivo Papel Matricial Branco de 1 via Pêra de Borracha Pincel Retroprojetor Pipeta Graduada Pipeta de Westergreen Placa de Kline Placa para reação imuno-látex Ponteiras para Micropipetadores Proveta de 50,0 mL Seringa de 3,0 mL Seringa de 5,0 mL Seringa de 10,0 mL Seringa de 20,0 mL Suporte para Micropipetadores Suporte de Westergreen Suporte para Micropipetas Monocanais Automáticas e Semiautomáticas Tampa para Tubos de Ensaio Tiras Reagentes de Urinálise Tiras Reagentes de β-hcg Tubo de Cônico Graduado Tubo de Ensaio de Plástico Tubo de Ensaio de Vidro Tubo para Bomba Peristáltica do Analisador Bioquímico BIOPLUS 2000 3.1.2. Reagentes Analíticos Ácido Úrico Água Deionizada Albumina

14 Álcool Ácido de Ziehl Neelsen 3% Anticoagulante Citrato Anticoagulante EDTA Anticoagulante Flureto Anticorpos Monoclonais Murinos para Classificação ABO – Soroclone Anti-A Anticorpos Monoclonais Murinos para Classificação ABO – Soroclone Anti-B Anticorpos Monoclonais Murinos para Classificação ABO – Soroclone Anti-D Antiestreptolisina O Látex Azul de Metileno Colesterol HDL Colesterol Total Controle de Plasma Abnormal Controle de Plasma Normal Corantes Rápidos de Hematologia Creatinina Etanol a 70% Etanol a 99,8% Fator Reumatóide Látex Fosfatase Alcalina Fucsina Fenicada Glicose Hipoclorito de Sódio a 1% HIV - 1/2 Mucoproteínas Óleo de Imersão Proteína C Reativa Látex Proteínas Totais Solução de Calibração HC-Diluent (Contador Hematológico Human Count Plus) Solução de Calibração HC-Lyse (Contador Hematológico Human Count Plus) Solução de Limpeza HC-Cleaner (Contador Hematológico Human Count Plus) Solução de Limpeza para Analisador Bioquímico BioPlus 2000 Soro de Coombs BSA Tempo de Protombina

15 Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada Transaminase Glutâmico Pirúvica Transaminase Glutâmico Oxalacética Triglicerídeos Ureia 3.1.3. Equipamentos Analisador Bioquímico BioPlus 2000 Analisador Hematológico Human Count Plus Banho-Maria Quimis Centríguga Celm Combate Coagulômetro Óptico Monocanal Human Clot Jr. Computador e Impressora Matricial Contador Diferencial de Células Benfer CC 900 Deionizador de Coluna Quimis Estufa de Esterilização e Secagem Odontobrás Geladeira Electrolux Homogeneizador de Sangue Quimis Microscópio Binocular Nikkon Eclipse

16 4. Metodologia Científica A metodologia (no presente relatório) é a parte da produção do TCC que trata dos procedimentos e métodos realizados dentro do local de estágio. É de suma importância o detalhamento das atividades, pois facilita o entendimento técnico e prático dos mesmos. De acordo com EITERER (2006), o método científico compreende basicamente um conjunto de dados iniciais e um sistema de operações ordenadas adequado para a formulação de conclusões, de acordo com certos objetivos predeterminados. A rotina laboratorial não é leve e, por isso, demanda uma rigorosa atenção na realização dos procedimentos. A metodologia é aplicada como a maneira de se reproduzir todos os ensaios laboratoriais de maneira correta, eficaz e segura. A elaboração e execução das análises necessitam, para que seus resultados sejam satisfatórios, estarem baseadas em planejamento cuidadoso, reflexões conceituais sólidas e alicerçados em conhecimentos já existentes. Na elaboração do TCC de Química é de grande importância, também, além de demonstrar métodos e etapas de procedimentos, apresentar fórmulas químicas, reações e interações moleculares, bem como os nomes dos reagentes, produtos, e outros agentes participantes, para que haja um enriquecimento do mesmo.

5. Assepsia e Coleta de Material Biológico 5.1. Assepsia Assepsia ou desinfecção é o conjunto de medidas que permitem manter um ser vivo ou meio inerte de microrganismos. Os antissépticos utilizados no laboratório são o etanol a 70% (que coagulam proteínas e lipídios das membranas dos microrganismos) e o Hipoclorito de Sódio a 1% (que inibem a atividade das proteínas e a síntese de DNA dos microrganismos). Chegandose ao laboratório, pega-se uma compressa de gaze, limpa, e umedecida com etanol 70%, e limpa-se as bancadas, mas sempre em um único sentido (ou vertical ou horizontal), para evitar a recontaminação. A assepsia é feita como demonstrado no grupo de figuras 01 abaixo:

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Fig.01 – Quatro maneiras de executar assepsia em bancada.

A realização desse procedimento é indispensável num laboratório de análises clinicas. Segundo SENA, et.al (2011) a principal causa das infecções na área da saúde é a deficiência no processo de assepsia. A assepsia também deve ser feita nas mãos. Deve-se lavá-las bem com sabonete líquido neutro e depois passar álcool 70%.

5.2. Coleta 5.2.1. Sangue A coleta de sangue para análise é realizada por uma auxiliar de enfermagem ou por uma técnica em patologia clínica. Para realizar a coleta, o paciente chega com a solicitação médica dos exames. O pedido médico é mandado ao laboratório, onde o paciente é cadastrado no sistema, e recebe um número de entrada em sua ficha. Feito isso, o sangue é coletado. Os demais materiais (urina e fezes são entregues no próprio laboratório). O paciente se senta, coloca o braço sobre uma braçadeira de coleta revestida por compressa cirúrgica de gaze 45x50 cm; o local da punção no braço é

limpo com álcool a 70% INPM e, em seguida, garroteado. A pessoa que fará a coleta procura sentir onde a veia do paciente está mais superficial, para que evite ter de aprofundar demais a agulha, machucando-o. O bisel (agulha) deve ser injetado com o orifício para cima, para que facilite a entrada do sangue. Deve-se colocar o sangue colhido nos respectivos tubos com atenção. Feita a coleta, é colocada uma bandagem antisséptica no local da punção. (Informar ao paciente para não dobrar o braço evitando, assim, hematomas.) Após ser coletado, o sangue do paciente é colocado em tubos que contenham ou não anticoagulante; e que anteriormente foram identificados com as iniciais do nome do paciente e o número de cadastro. Quando o tubo possui anticoagulante, deve-se observar a cor da tampa do tubo. A quantidade de sangue colhida depende dos exames solicitados. Quando o sangue é coletado e é colocado nos tubos deve-se adicionar, quando necessário, substâncias denominadas anticoagulantes. Essas substâncias químicas são inibidoras da

18 coagulação do sangue. Elas iram impedir, obviamente, que o sangue permaneça maior tempo sem coagular em temperatura ambiente. O sangue deve ser colhido em jejum, e quando houver preparos, deverão ser seguidos. O anticoagulante deve ser específico para os exames que se deseja realizar. No laboratório há três anticoagulantes utilizados. O EDTA é o anticoagulante utilizado em sangue que serão utilizados nos exames da área da hematologia (exceto coagulograma). Sua nomenclatura, segundo IUPAC (2001), é ácido etilenodiaminotetracético.

Fig. 02 – Fórmula estrutural do EDTA. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/EDTA

Ele forma complexos muito estáveis com diversos íons metálicos. O tubo, de vidro, que receber o anticoagulante EDTA deve ser de tampa roxa. Ele reage através de seus dois radicais ácidos com o cálcio plasmático, formando um quelato, tornado-se insolúvel. O quelato é um composto químico formado por um íon metálico ligado por várias ligações covalentes a uma estrutura heterocíclica de compostos orgânicos. Como no caso da molécula abaixo, pela química de coordenação, irão se juntar aos átomos de oxigênio, os metais que reagirem com o anticoagulante. O EDTA é um líquido de cor alaranjada.

Fig. 03 – Complexo formado pela ação do EDTA.
Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Titula%C3%A7%C3%A3o_de_complexa%C3%A7%C3%A3o

19 O Fluoreto de Sódio, cuja fórmula química é NaF, é o anticoagulante utilizado apenas para alguns exames bioquímicos. É interessante citar que este anticoagulante também contém uma fração mínima de EDTA. O tubo, de plástico, deve conter uma gota do anticoagulante, e a tampa deve ser de cinza. O fluoreto de sódio possui uma cor azulada.

O Citrato trissódico é o anticoagulante utilizado quando são realizados os exames de coagulograma, pois envolvem laudos que servem de base para que o médico analise as condições do paciente de ser submetido a cirurgias. O sangue deve ser colhido sem que o garrote esteja muito apertado, e uma gota do anticoagulante deve ser colocada no tubo, de vidro, somente na hora que o sangue tiver sido colhido, ao contrário dos outros dois, que podem ser colocados no tubo horas antes e até mesmo permanecer neles de um dia para outro. As tampas dos tubos que contém o sangue para realizar COAG (coagulograma) são de cor azul. O citrato possui uma coloração azul cintilante. O nome IUPAC dessa substância é trissódio-2hidroxipropan-1,2,3-tricarboxilato.

Fig. 04 – Fórmula estrutural do citrato trissódico. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Citrato_de_s%C3%B3dio

Os exames que necessitam utilizar o soro sanguíneo não utilizam anticoagulantes. Depois de colhido o sangue, o mesmo é incubado em banho-maria a 37°C por alguns minutos. Após isso, é centrifugado até que haja separação entre a ‘parte líquida’ e a ‘parte sólida’ do sangue. Várias dosagens bioquímicas e imunológicas são realizadas no soro (obtido a partir do sangue sem anticoagulante) ou no plasma (obtido no sangue com anticoagulantes). A diferença entre soro e plasma é que o soro não contém fibrinogênio, o qual participou da formação do coágulo (fibrina).

Para um maior entendimento e organização das informações sobre os exames, montou-se a seguinte tabela:

20 Tabela 01: Diferenciação dos tubos de coleta de sangue Exame Ácido Úrico Albumina Antiestreptolisina O Atividade de Protombina Colesterol HDL Colesterol Total Creatinina Fator Reumatóide Fosfatase Alcalina Glicose Glicose Pós-Prandial Grupos Sanguíneos (ABO + Rh) Material Soro Soro Soro Plasma Soro Soro Soro/Plasma* Soro Soro Soro/Plasma* Soro/Plasma* Sangue não centrifugado com anticoag. Sangue não centrifugado com anticoag. Soro Soro Soro Soro Plasma Plasma Plasma Soro Soro Anticoag. Citrato Fluoreto* Fluoreto* Fluoreto* EDTA Tampa Azul Cinza* Cinza* Cinza* Roxa Área Bioquímica Bioquímica Hematologia Hematologia Bioquímica Bioquímica Bioquímica Hematologia Bioquímica Bioquímica Bioquímica Hematologia

Hemograma

EDTA

Roxa

Hematologia

HIV 1/2 Mucoproteínas Proteína C Reativa Proteínas Totais RNI Tempo de Protombina Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada TGO TGP

Citrato Citrato Citrato -

Azul Azul Azul -

Imunologia Bioquímica Hematologia Bioquímica Hematologia Hematologia Hematologia Bioquímica Bioquímica

21 Triglicerídeos Uréia VDRL Velocidade Hemossedimentação de Soro Soro/Plasma* Soro Sangue não centrifugado Fluoreto* EDTA Cinza* Roxa Bioquímica Bioquímica Imunologia Hematologia

* as informações utilizadas ficam a critério do laboratório, podendo variar de um para outro.

5.2.2. Urina (de rotina) O paciente deve higienizar os órgãos genitais, utilizando água e sabão. Depois, secá-los com gaze estéril ou uma toalha seca e bem limpa. A urina deve ser colhida no frasco coletor, logo pela manhã, pelo menos 12 mL. Porém, o primeiro jato deve ser desprezado, sendo colhido, para o exame, o jato médio. O frasco deve ser levado em no máximo 30 minutos ao laboratório. Caso não seja cumprido o prazo, a urina deve estar acondicionada em uma geladeira ou caixa de isopor com gelo reutilizável, desde que se tome cuidado para que a água do gelo não entre em contato com a amostra.

5.2.3. Fezes 5.2.3.1. Fezes sem MIF Deve-se utilizar um frasco coletor seco e limpo. Coletar mais ou menos cinco pazinhas, sendo que sempre deve-se retirar um pouco de cada extremidade e um pouco do meio da amostra. Deve ser levada ao laboratório no mesmo dia, identificado com nome, estando previamente acondicionada em uma geladeira. Não há necessidade de levar grandes quantidades de amostra.

5.2.3.2. Fezes com MIF O MIF (merthiolate-iodo-formol) é o líquido avermelhado utilizado na conservação das amostras pedidas para a realização dos exames parasitológicos de fezes. O paciente deve coletar a amostra em um fraco coletor contendo o MIF, comprado na farmácia, onde recolherá 9 pazinhas de fezes (3 por dia). Deve-se retirar um pedaço de cada extremidade e do meio da amostra, e ir acondicionando em geladeira, até o dia de entregar ao laboratório, identificado com nome. (Não precisa haver excesso de amostra)

22 6. Hematologia A hematologia é a parte dos ensaios laboratoriais voltados para a observação das células sanguíneas, sua contagem, características e anormalidades. O aparelho que realizam este exame traz gráficos, curvas de concentração e valores de concentração relacionados a cada célula do sangue. Antes de começar o hemograma, colocam-se os sangues de controle para homogeneizar, já que ficam na geladeira e precisam de algum tempo pra se estabilizar. Quando se passa o sangue de controle (L-baixo, N-normal e/ou H-alto) e os resultados conferem com o padrão, podem-se iniciar os exames.

Fig. 05 – Sangues de controle hematológico.

O contador hematológico HUMAN COUNT PLUS é o equipamento utilizado para essa finalidade. O mesmo é mostrado na figura abaixo.

Fig. 06 – Contador hematológico HUMAN COUNT PLUS. Fonte: http://www.medville.com.br/infiniti/files/produto-arquivo/HumacountPlus.pdf

23 O contador hematológico é semi-automatizado para diagnóstico in vitro. A sua interface permite o envio de resultados para uma impressora matricial acoplada. Ele é capaz de acessar até 60 amostras por hora com exatidão e reprodutibilidade. É capaz de gerar histogramas de hemácias e leucócitos e, ainda, determinar 18 parâmetros utilizando 25µL de sangue, apenas. Esses parâmetros são: WBC, LYM, MID, GRA, LYM%, MID%, GRA%, HGB, RCB, HCT, MCV, RDW, MCH, MCHC, PLT, MPV, PCT e PDW. Após a coleta de sangue, deve-se deixar os tubos com sangue no homogeneizador por alguns minutos. No aparelho, deve ajustar o sexo e o número de cadastro do paciente. Após isso, deve-se mergulhar a agulha de sucção no tubo, para que aspire o sangue e faça a leitura dos parâmetros indicados. Após a sucção do sangue os resultados são visualizados. O analisador de sangue utiliza três reagentes de funcionamento. São eles:  HC-CLEANER – solução de limpeza utilizada no contínuo processo de limpeza do sistema fluídico do equipamento. Ele é composto por sulfato de sódio a 0,8% (Na2SO4), fosfato de sódio a 0,5% (Na3PO4), cloreto de sódio a 0,3% (NaCl), enzimas proteolíticas a 0,8%, corante Sky blue a 0,002% e conservantes a 0,1%.  HC-DILUENT – reagente utilizado na calibração e manuseio do equipamento. É uma solução isotônica usada para diluir amostras de sangue total. É composto por sulfato de sódio a 1% (Na2SO4), fosfato inorgânico tamponado <0,6%, cloreto de sódio a 0,3% (NaCl) e estabilizantes.  HC-LYSE – reagente utilizado na calibração e manuseio do equipamento. É livre de cianeto, usado para preparar sangue lisado para as medidas de leucócitos e hemoglobina. É composto por sais de amônio quartenários a 3,5% e surfactantes <0,05%.

Como se sabe, a hematologia é a parte das análises clínicas destinada à observação e quantificação dos elementos sanguíneos. No laboratório os exames que se realizam nessa área são: hemograma, grupo sanguíneo, coagulograma e velocidade de hemossedimentação.

24 6.1. Hemograma (HC) O hemograma é o exame clínico que quantifica as mais variadas células sanguíneas. Quando o equipamento apresenta flags (erros) ou mostra valores alterados para mais ou para menos, fazse a lâmina do paciente. O sangue deve ser homogeneizado bem antes de ser passado no aparelho.

O

homogeneizador

tem

um

movimento

contínuo, do tipo thundeler-burgger, para frente e para trás, sendo capaz de

homogeneizar o sangue de maneira uniforme pelo tempo que for necessário.

Fig. 07 – Homogeneizador de sangue.

O hemograma é dividido basicamente em três partes: eritrograma, leucograma e plaquetograma.

6.1.1. Eritrograma É a parte do hemograma que visa à observação e quantificação das células vermelhas do sangue (hemácias). De acordo com VIVAS (2010), constitui o estudo das células da série vermelha, revelando tipos essenciais de alterações patológicas. Os parâmetros observados no eritrograma são:  o número de eritrócitos (hemácias) em cada 1,0 µL de sangue;  quantidade de hemoglobina em cada 1,0 dL de sangue;  porcentagem de hematócrito;  tamanho médio dos hematócritos em fL (fenolitros);  quantidade média de hemoglobina em cada hematócrito em pc (picogramas);  concentração média de hemoglobina em 100 mL de eritrócitos em g/dL;  índice de variação do tamanho dos eritrócitos, que é quantificado, quanto à ocorrência, em (+), (++) ou (+++).

25 6.1.2. Leucograma Sendo o estudo das células da série branca, compreende a contagem global e específica dos leucócitos, além do estudo qualitativo. Os parâmetros observados no leucograma são:  o número de leucócitos em cada 1,0 µL de sangue;  quantificação de várias células brancas: linfócito, monócito, neutrófilo (segmentado), eosinófilo, metamielócitos, basófilos e bastonetes (segmentados jovens) etc.

6.1.3. Plaquetograma Determina-se o número de plaquetas em cada 1,0 µL de sangue. Há índices como plaquetócritos, por exemplo, que são apenas diagnosticados por equipamentos muito sofisticados. Depois de homogeneizado, o analista programa o sexo e o número do paciente. Feito isso, coloca o sangue para ser aspirado por uma haste metálica que sai do interior do aparelho. Começa a análise, que dura em torno de 2 minutos para cada amostra. Quando a análise da amostra termina o aparelho mostra uma interface semelhante à mostrada abaixo.

Fig. 08 – Resultado de hemograma no contador hematológico.

26 É baseado nos dados mostrados na tela do aparelho e em alguns cálculos que os técnicos podem lançar os resultados e tirar conclusões sobre os valores reais e suas alterações (quando houver). De acordo o que mostra a figura, há gráficos com o pico de concentração plasmática de leucócitos (WBC) e de hemácias (RBC), ao lado esquerdo. Do lado direito há o código do paciente (3584), o sexo (fem (adulto)), a data do exame (04/10/2012) e a hora em que o hemograma foi feito (10:17). Ainda do lado direito, na parte inferior, há as quantificações, as quais estão transcritas na tabela abaixo, para melhor visualização dos valores. À essas quantificações dá-se o nome de parâmetros. Os mesmos foram transcritos para a tabela abaixo para melhor visualização.

Tabela 02: Parâmetros e índices hematimétricos (baseados na figura 08) WBC RBC HGB HCT MCV RDWc 6,94 5,13+ 14,5 37.9 7412,0 MCH MCHC PLT LY% MI% GR% 28,3 38,2+ 11431,0 6,1 62,9

É sabido que, quando há sinais (+) e/ou (-) no hemograma há alguma anormalidade no parâmetro. Deve-e repetir o hemograma, adicionando um ‘ponto’ ao fim do número do paciente para identificar a repetição. (Ex.: 3584.). Alguns parâmetros podem ser calculados pelo analista; isso possibilita que ele tenha previamente um valor que permite dizer se os resultados mostrados no aparelho estão realmente corretos. Isso é muito útil quando não se tem uma tabela de referências no local no momento. Os valores encontrados para MCV, MCH e MCHC podem ser determinados por cálculos. Deve-se observar que sempre haverá uma margem de erro entre o aparelho e o cálculo do técnico. Esses parâmetros são chamados de índices hematimétricos.

Cálculo do VCM VCM = (HCT : HEM) x 10

Pela fórmula, o volume corpuscular médio da hemácia é dado pela razão entre o valor de hematócrito e o das hemácias multiplicado por 10. Voltando à tabela, viu-se que o VCM da paciente deu 74-. Pelo cálculo têm-se:

27 VCM = (37,9 : 5,13) x 10 VCM = 73 fL

O valor do cálculo foi bem próximo do valor do equipamento. Como o parâmetro está diminuído, o equipamento mostra o sinal negativo.

Cálculo do HCM HCM = (HGB : HEM) x 10

Pela fórmula, o volume corpuscular médio de hemoglobina é dado pela razão entre o valor de hemoglobina e o das hemácias multiplicado por 10). O valor de HCM da paciente foi 28,2+ pg. Pelo cálculo têm-se: HCM = (14,5 : HEM) x 10 HCM = 28 pg

O valor foi bem próximo do valor do aparelho, que gera o sinal (+) pelo parâmetro estar aumentado. Cálculo do MCHC MCHC = (HGB : HCT) x 100

A concentração de hemoglobina corpuscular média da paciente foi 38,2+ g / dL. O valor é dado pela razão entre a quantidade de hemoglobina e a quantidade de hematócrito multiplicada por 100. Pela fórmula, têm-se:

MCHC = (14,5 : 37,9) x 100 MCHC = 38,2 g / dL

O valor encontrado foi igual ao mostrado pelo aparelho. O sinal positivo indica que o valor está aumentado.

Para que se possam comparar valores quando não se dispõe de fórmulas, deve-se ter em mãos uma tabela de referências.

28 Tabela 03: Valores de referência de hemograma para crianças Até 1 mês Leucócitos Eritrócitos Hemoglobina Hematócrito MCV MCH MCHC PLT Metamielócitos Bastonetes Segmentados Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Linfócitos Monócitos
4300 – 19300/µL 2,7 – 5,8 milhões/µL 10 – 18 g/dL 27,7 – 58,4% 86 – 120 fL 31 – 37 pg 30,8 – 36 g/dL 250 000 – 500 000 mm³ 0 – 193/µL 129 – 1158/µL 1032 – 13703/µL 1161 – 15054/µL 0 – 772/µL 0 – 193/µL 645 – 12545/µL 86 – 1544/µL

1 mês a 1 ano
6000 – 17500/µL 3,1 – 5,6 milhões/ µL 10 – 14 g/dL 27,8 – 41,4% 74 – 89 fL 25 – 32 pg 33,8 – 36 g/dL 200 000 – 500 000 mm³ 0 – 175/µL 180 – 1050/µL 1140 – 5075/µL 1320 – 6300/µL 60 – 700/µL 0 – 175/µL 3420 – 11725/µL 240 – 1400/µL

2 a 4 anos
5500 – 16000/µL 3,3 – 5,6 milhões/µL 10,5 – 14,5 g/dL 29,5 – 41,3% 74 – 90 fL 26 – 32 pg 33,8 – 36 g/dL 200 000 – 500 000 mm³ 0 – 160/µL 165 – 960/µL 1430 – 5760/µL 1595 – 6680/µL 55 – 650/µL 0 160/µL 2695 – 9760/µL 220 – 1280/µL

5 a 10 anos
4500 – 13500/µL 3,8 – 5,8 milhões/µL 12 – 15 g/dL 34,1 – 43,8% 6 – 91 fL 26 – 32 pg 33,8 – 36 g/dL 140 000 – 400 000 mm³ 0 – 135/µL 135 – 810/µL 1935 – 7155/µL 2070 – 8100/µL 45 – 450/µL 0 – 135/µL 1440 – 5940/µL 180 – 1080/µL

*fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p.27 – portal da educação. Tabela 04: Valores de referência de hemograma para adolescentes e adultos 11 a 15 anos Leucócitos Eritrócitos Hemoglobina Hematócrito MCV MCH MCHC PLT
4500 – 13500/µL 3,9 – 5,9 milhões/µL 12 – 16 g/dL 35,6 – 48,6% 82 – 92 fL 27 – 31 pc 32,9 – 36 g/dL 150 000 – 400 000 mm³

Homens
5000 - 10000/µL 4,5 – 6,7 milhões/µL 13 – 18 g/dL 41,5 – 54,7% 82 – 92 fL 27 – 31 pc 32,9 – 36 g/dL 150 000 – 400 000 mm³

Mulheres
5000 - 10000/µL 3,9 – 5,9 milhões/µL 12 – 16 g/dL 35,6 – 48,6% 82 – 92 fL 27 – 31 pc 32,9 – 36 g/dL 150 000 – 400 000 mm³

29 Metamielócitos Bastonetes Segmentados Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Linfócitos Monócitos
0 – 135/µL 135 - 810/µL 1935 -7155 2070 – 8100/µL 45 - 540/µL 0 - 135/µL 1440 - 1080/µL 180 - 1080/µL 0 - 100/µL 150 - 600/µL 2750 - 6500/µL 2900 - 7200/µL 55 - 220/µL 0 - 100/µL 1000 - 3200/µL 200 - 800/µL 0 - 100/µL 150 - 600/µL 2750 - 6500/µL 2900 - 7200/µL 55 - 220/µL 0 - 100/µL 1000 - 3200/µL 200 - 800/µL

*fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p.27 – portal da educação.

6.2. Elementos do Sangue Como já foi mencionado, o sangue é basicamente formado por células vermelhas, células brancas e plaquetas. As hemácias são responsáveis pelo transporte de oxigênio para os órgãos e tecidos. Os leucócitos são responsáveis pela defesa imunológica do organismo. As plaquetas são responsáveis pela coagulação do sangue (em outras palavras, pelas cicatrizações e regenerações).

6.2.1. Eritrócitos (Hemácias / RBC) Hemácias são células anucleadas e com formato de disco bicôncavo, com cor variando entre rosada e vermelha, dependendo da concentração de hemoglobina. As células vermelhas, quando não apresentam alterações nem quanto à forma nem quanto à pigmentação recebem o nome de hemácias normocíticas e normocrômicas. Quando estão em quantidade além do normal indica ocorrência de eritrocitose (ou policitemia). Quando estão abaixo do normal caracteriza uma eritroblastemia. As hemácias variam quanto ao tamanho, o que é medido pelo valor de VCM (Volume Corpuscular Médio). Quando a hemácia está muito grande é chamada macrocítica. E, quando está muito pequena, microcítica. As hemácias variam quanto à pigmentação característica. A concentração de hemoglobina é que determina a coloração da hemácia. Essa característica depende do valor de CHCM (Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média). Quando a hemácia está com coloração muito intensa é chamada hipercrômica. Quando sua coloração está muito clara, é chamada hipocrômica. Pode até

30 mesmo serem indícios de uma anemia aguda. Deve-se lembrar de que os valores de VCM e HCM irão variar com a idade do paciente. Abaixo, encontram-se imagens ilustrativas dos eritrócitos em algumas das condições mencionadas acima.

Fig. 09 – Hemácias normocíticas e normocrômicas. Fonte: http://heloisagallo.site.med.br/index.asp?PageName=Sangue

Fig. 10 – Hemácias macrocíticas e hipocrômicas. Fonte: http://www.icb.usp.br/mol/10-2-sangue2.html

Fig. 11 – Hemácias macrocíticas e hipercômicas. Fonte: http://www.ciencianews.com.br/doencaeritro/Principais%20Alt.%20Morf%20eritr.%20%206/althemog.htm

31 6.2.2. Hemoglobina (HGB) A hemoglobina é uma proteína presente no interior dos eritrócitos e eventualmente ligada a outras proteínas plasmáticas (quando há destruição dos eritrócitos). É responsável por 97% da composição da hemácia (desconsiderando a água) e 35% (considerando a água). É o pigmento responsável pela coloração das mesmas, e forma um complexo químico conjugado cuja substância central é a Heme. A Heme tem o ferro (II), Fe2+, como átomo principal, em seu centro (cuja carência acarreta à anemia). Está ligado a cadeias peptídicas chamas globinas. Essa substância é mostrada abaixo, na figura 12.

Fig. 12 – Grupo Heme. Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Heme_b.png

Quando há a união de quatro grupos Heme e quatro cadeias de globina resulta na formação de uma molécula de hemoglobina. Quando o paciente possui a taxa de hemoglobina baixa há grandes de chances de ter adquirido uma anemia, que se torna tanto mais agudo quanto mais baixo for o nível da proteína, acarretando até mesmo uma leucemia. Conforme citado, quando há carência de hemoglobina as hemácias se tornam cada vez mais hipocômicas.

É interessante ressaltar que a bilirrubina é o principal produto do metabolismo da Heme na hemoglobina. Cerca de 80% da bilirrubina são provenientes da destruição de eritrócitos velhos ou defeituosos.

32

Fig. 13 – Estrutura química da bilirrubina. Fonte: http://www.infoescola.com/bioquimica/bilirrubina/

6.2.3. Hematócrito (HCT) Conforme já mencionado, o hematócrito corresponde à porção sólida do sangue, ou seja, eritrócitos, leucócitos e trombócitos. Sua quantificação é expressa em porcentagem.

6.2.4*. Leucócitos (WBC) Chamamos de leucócitos todas as células da série branca, aquela responsável pela defesa imunológica do organismo. Quando têm-se valores aumentados de leucócitos há uma leucocitose. Alguns casos do aumento dos leucócitos são: recém-nascidos, puberdade, gravidez, infecções, partos etc. Quando o nível de leucócitos está muito baixo há uma leucopenia. Algumas das causas da leucopenia são: depressão, moléstias parasitárias, alteração na distribuição dos leucócitos etc. Vários são os leucócitos:

6.2.5. Linfócitos (LYN) São leucócitos que podem ser classificados como grandes ou pequenos. Seu citoplasma não apresenta granulações e, por isso, são chamados de agranulócitos. Seu núcleo ocupa quase toda a porção do citoplasma, e representam cerca de 20 a 30% das células brancas do sangue.

Fig. 14 – Linfócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 162 – portal da educação.

33 6.2.6. Monócitos São os maiores leucócitos do sangue. Assim como os linfócitos, são agranulócitos. Possuem citoplasma azul-acinzentado. Seu núcleo é grande e sem segmentação.

Fig. 15 – Monócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 162 – portal da educação.

6.2.7. Neutrófilos São os leucócitos mais numerosos na circulação sanguínea, sendo que correspondem a mais de 60%. Possuem núcleo segmentado e, em seu citoplasma, são observadas pequenas granulações de coloração avermelhada. Ele e os demais leucócitos (salvo linfócitos e monócitos) são granulócitos.

Fig. 14 – Neutrófilo. Fonte: http://www.infoescola.com/citologia/neutrofilos/

34 6.2.8. Eosinófilos São um pouco maiores que os neutrófilos. Seu núcleo é segmentado e possui granulações no citoplasma, esféricas e de contorno nítido. As granulações são alaranjadas ou avermelhadas.

Fig. 16 – Eosinófilo. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 – portal da educação.

6.2.9. Mielócitos Possui um núcleo frequentemente excêntrico, onde a cromatina se evidencia; há uma aglomeração de nucléolos.

Fig. 17 – Mielócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 160 – portal da educação.

35 6.2.10. Metamielócitos O núcleo possui cromatina disposta em grossos aglomerados. As granulações são maiores e mais visíveis.

Fig. 18 – Metamielócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 160 – portal da educação.

6.2.11. Basófilos São os leucócitos mais raros. Apresentam núcleo segmentado e citoplasma com granulações específicas, que se tornam violetas quando coradas.

Fig. 19 – Basófilo. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 – portal da educação.

6.2.12. Bastonetes Possui núcleo alongado como uma salsicha ou recurvado. A cromatina é intensamente aglomerada. O citoplasma é roxo e possui finas granulações.

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Fig. 20 – Bastonete. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 – portal da educação.

6.2.13. Segmentados Parecem ter o núcleo totalmente granulado. Possuem aglomerações grossas e específicas.

Fig. 21 – Segmentado. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 – portal da educação.

6.2.14. Trombócitos São as plaquetas, responsáveis pela coagulação sanguínea. Está presente no sangue que é formado na medula óssea. A sua principal função é a formação de coágulos. Uma pessoa normal tem entre 150.000 e 400.000 plaquetas por milímetro cúbico de sangue. Sua diminuição ou disfunção pode levar a sangramentos, assim como seu aumento pode aumentar o risco de trombose. Trombocitopenia (ou plaquetopenia) é a diminuição do

37 número de plaquetas no sangue. Trombocitose (ou plaquetose) é o aumento do número de plaquetas no sangue.

Fig. 22 – Plaquetas normais (pontos pequenos). Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 172 – portal da educação.

Fig. 23 – Plaquetas gigantes (VPM alto) (pontos pequenos). Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 172 – portal da educação.

6.3. Preparo de Lâminas Quando o aparelho mostra alterações ou quando a clínica do paciente não condiz com o resultado apresentado, faz-se a lâmina, para observações e verificações. A contagem passa, então, a ser manual. Inicialmente homogeneíza-se novamente o sangue do paciente. Em seguida, coloca-se uma gota do sangue sobre uma lâmina previamente limpa com gaze hidrofílica (quanto menor a quantidade de sangue melhor será a visualização). Deve-se iniciar o procedimento para espalhar o sangue sobre a lâmina: o esfregaço. O sangue é “empurrado” sobre a lâmina com o auxílio de uma lâmina mais grossa de bordas chanfradas, a extensora.

38 Deve-se manter a extensora a 45° e realizar o esfregaço rapidamente, conforme ilustrado na figura abaixo:

Fig. 24/25 – Exemplificação da execução do esfregaço. Fonte: http://biomedicoscopia.blogspot.com.br/2012/06/um-bom-estiraco-sanguineo.html

Após a confecção do esfregaço escreve-se o código do paciente na parte superior da lâmina utilizando um lápis dermatográfico azul. A lâmina fica secando por alguns minutos, até o momento de ser corada. Os corantes hematológicos, na verdade, recebem o nome de quem os desenvolveu através de pesquisas. Eles são preparados utilizando o metanol como solvente. O procedimento de preparo da lâmina é divido em três partes: fixação, coloração e lavagem. Atualmente mesclou-se a metodologia dos corantes em apenas uma. Esse método é o Leishman (ou May-Grunwald-Giemsa), que é o mesmo utilizado no laboratório onde se procedeu ao estágio. Quando o esfregaço seca as lâminas são colocadas dentro de um frasco com ranhuras internas, contendo soluções denominadas corantes rápidos de hematologia. A lâmina deve ficar no mínimo 40 segundos dentro do corante, para que o mesmo se fixe às células de maneira eficiente. As lâminas são colocadas no corante intitulado rápido 1 (azul), depois são retiradas e colocadas no corante rápido 2 (alaranjado) e, por último, no corante rápido 3 (roxo). Somente após serem retiradas do corante 3 as lâminas são lavadas sob água corrente. Depois são postas para secar em um local apropriado até a hora da observação.

Fig. 26 – Corantes hematológicos.

39 Conforme foi dito, as lâminas coradas são postas para secar antes da observação. Elas são colocadas com inclinação de 45° num suporte apropriado de madeira, conforme ilustra a figura 27, abaixo. Se acontecer de o esfregaço sair errado, a lâmina deve ser desprezada em um recipiente com água e hipoclorito, que fica na bancada.

Fig. 27 – Lâminas coradas.

Os corantes de hematologia são soluções químicas alcoólicas que permitem uma coloração rápida sendo, portanto, chamados de panóticos. Sua composição é dada abaixo.  Rápido 1: é uma solução azulada de trifenilmetano. Também é chamada tritano. Sua nomenclatura oficial é 1,1’,1” – trifenilmetano.

Fig. 28 – Estrutura química do corante rápido 1. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Trifenilmetano

40  Rápido 2: é uma solução alaranjada de xanteno. Seu nome IUPAC é 9-H-xanteno, 10H-9-oxaantraceno.

Fig. 29 – Estrutura química do corante rápido 2. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Xanteno  Rápido 3: é uma solução roxo-azulada de fenotiazina. É oficialmente conhecida como tiodifenilamina ou dibenzoparatiazina.

Fig. 30 – Estrutura química do corante rápido 3. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Fenotiazina

Os corantes não podem ficar abertos tempo demais, apenas o necessário, pois são voláteis, mesmo que lentamente. Terminado o procedimento de corar lâmina, e passado pelo menos 01 hora de secagem, pode-se iniciar a fase de contagem das células.

6.4. Contagem Diferencial de Células Leucocitárias Várias das células citadas anteriormente (antigamente contada sobre câmara de Newbauer) atualmente são contadas ao microscópio, e usa-se um contador diferencial de células. No laboratório a contagem diferencial é feita de maneira semiautomática. A contagem global e diferencial, segundo alguns autores, é a principal informação fornecida na análise da série branca e, a mesma deve ser feita com o auxílio de um bom microscópio.

É de grande importância o conhecimento das partes do microscópio e suas funções, pois ele é largamente utilizado durante a rotina de análises em um laboratório.

41

O microscópio binocular é utilizado tanto na hematologia quanto na urinálise, mas deve haver um para cada área. Na hematologia ele é utilizado em conjunto com o contador diferencial de células, que lê oito parâmetros de células brancas. A visualização é feita na última objetiva (‘branca’), utilizando óleo de imersão. O óleo facilita a visualização e condensação das células

previamente coradas em lâminas. Para chegar à objetiva ‘branca’ deve-se começar na menor (‘vermelha’) e ir localizando o foco em cada uma. Fig. 31 – Microscópio binocular.

É muito importante saber utilizar o microscópio, pois é uma ferramenta de potencial e indispensável à contagem celular na hematologia. Deve-se conhecer seus elementos e como ajustar o foco de suas lentes para o trabalho. Abaixo, as partes do microscópio binocular óptico.

A – Oculares: são os canais por onde observamos as lâminas. São formados por 6 a 8 lentes

sobrepostas. B – Revólver: peça giratória que sustenta objetivas. C – Braço: serve de suporte ao canhão (ou tubo), que sustenta o revólver. Fig. 32 – Partes do microscópio. Fonte:
http://dc261.4shared.com/doc/9UBT_sUS/pr eview.html

as

lentes

chamadas

42 D – Charriot: movimenta a lâmina de um lado para o outro, tanto em sentido longitudinal quanto transversal. E – Parafuso Macrométrico: responsável pelos movimentos verticais da platina, rápidos e com grande amplitude. F – Parafuso Micrométrico: responsável pelos movimentos verticais da platina, pequenos e de pequena amplitude, permitindo aperfeiçoar o foco. G – Liga/ Desliga: permite ligar e desligar a luz. H – Base: dá apoio a todos as partes do microscópio. I – Espelho ou lâmpada: Permite a passagem de luz. J – Condensador: promove uma iluminação uniforme. K – Regulador do Charriot: fuso que permite o deslocamento da lâmina para frente e para trás, para a direita e para a esquerda. L – Platina: é onde se apoia a lâmina quer será observada. M – Objetivas: são as lentes que se prendem ao revólver. São compostas por 4 a 6 lente sobrepostas. O maior desafio antes da observação ao microscópio é a focalização das objetivas. Deve-se iniciar pela objetiva menor e ir para a de maior aumento, sempre após encontrar o foco da anterior. As objetivas, em ordem crescente de aumento, são: ‘vermelha’ – 4x/0.10 ‘amarela’ – 10x/0.25 ‘azul’ – 40x/0.65 ‘branca’ – 100x/1.25 Quando se atinge a objetiva que aumenta 100 vezes mais, usa-se o óleo de imersão, que facilita e torna mais translúcida a visualização das células. Não é necessário o uso de lamínulas. Ajustado o foco, deve-se ligar o contador diferencial de células. À medida que as células forem sendo vistas nos campos da lãmina, o analista deve ir apertando o botão do aparelho que

43 corresponde àquela célula. Quando houver sido atingido o total de 100 células contadas o aparelho irá emitir um sinal sonoro, finalizando a contagem.

Fig. 33 – Contador diferencial de células BENFER CC900.

O contador diferencial é capaz de realizar a contagem de 8 tipos diferentes de células: basófilos, eosinófilos, metamielócitos, bastonetes, granulócitos, linfócitos, monócitos e mielócitos. Cada vez que é visualizada uma célula de série branca ao microscópio, deve-se apertar a tecla correspondente à célula o número de vezes que ela aparecer no mesmo campo.

6.5. Grupos Sanguíneos e Fator Rh (GS + Rh) Quando o clínico solicita esse exame, tem o objetivo de identificar qual é o tipo sanguíneo do paciente. O exame de grupo sanguíneo é feito com o sangue não centrifugado, contendo EDTA. Devem-se separar duas lâminas. Primeiramente elas devem ser limpas com gaze hidrofílica. Em seguida deve-se utilizar uma micropipeta com volume 50 µL da amostra de sangue, e dispô-las nas placas conforme a ilustração abaixo.

Fig. 34 – Preparo de lâmina para teste de Gs + Rh.

44 Na figura acima, o poço A representa o grupo sanguíneo A; o poço B representa o grupo sanguíneo B. Já o poço D é o que indicará o fator Rh, ou seja, se o grupo A, B ou AB será (+) ou (–). Para realizar o exame basta adicionar uma gota do reagente específico em cada poço. (*os reagentes devem ser acondicionados na geladeira).

Fig. 35 – Reagentes para determinação de grupo sanguíneo + fator Rh.

Os reagentes para a determinação são antígenos, ou seja, irão aglutinar a amostra de sangue que contiver os mesmos antígenos, revelando assim o grupo sanguíneo. Essas substâncias de determinação são chamadas anticorpos monoclonais murinos. O sistema ABO, segundo os fabricantes dos soroclones murinos, é o mais importante sistema de classificação sanguínea existente. A determinação é feita através da identificação de antígenos na membrana eritrocitária. Quando há aglutinação do poço de sangue pelo reagente usado significa que o paciente tem aquele grupo sanguíneo. Caso não haja aglutinação significa que ele não tem aqueles antígenos. Deve-se pingar 1 gota do reagente A sobre o poço A, 1 gota de B sobre o poço B e 1 gota de D sobre o poço D. Homogeneizar. Se aglutinar em A o paciente é tipo A; se aglutinar em B o paciente é tipo B; se aglutinar em A e B o paciente é tipo AB; caso não haja aglutinação em nenhum dos dois, o pacientes é tipo O. Se houver aglutinação em D o paciente tem fator Rh (+); se não houver aglutinação em D o paciente tem fator Rh (–). Quando acontece de o paciente ter fator Rh negativo deve-se realizar a pesquisa do fator Du. O fator Du serve para a confirmação do fator Rh negativo (uma vez que sangues do tipo negativo (-) são raros).

45 Pesquisa de Du Primeiramente, deve-se preparar uma ‘suspensão de hemácias’ a 5%. Para isso, devem-se seguir os seguintes passos:  centrifugar o sangue;  desprezar o plasma;  lavar hemácias com solução salina (cloreto de sódio – NaCl – 0,9%) 3 vezes;  centrifugar por 5 minutos;  desprezar o sobrenadante;  colocar em um tubo com 1000 µL (1 mL) de salina;  pipetar 50 µL da suspensão de hemácias; Depois de feita a suspensão:  num tubo, colocar 200 µL da suspensão e adicionar 2 gotas do reagente Anti-D;  incubar em banho-maria a 37°C por 30 minutos;  retirar do banho-maria e adicionar 2 gotas de Soro Coombs;  centrifugar por 5 minutos. Após essa série de procedimentos deve-se observar o tubo. Se houver aglutinação têm-se Du + e se não houver aglutinação, Du –. Se o fator der negativo comprova o teste de Rh realizado anteriormente.

6.6. Velocidade de Hemossedimentação (VHS) A hemossedimentação, segundo um dos manuais de hematologia do laboratório, consiste na medida da velocidade com que as hemácias se sedimentam dentro da pipeta de Westergreen. De acordo com alguns guias de interpretação de exames, a VHS reflete os resultados entre as forças envolvidas no movimento de sedimentação das hemácias e os mecanismos oponentes exercidos por substâncias plasmáticas, principalmente o fibrinogênio. A presença de processos inflamatórios favorece a hemossedimentação. A técnica consiste em pipetar o sangue do tubo de ensaio com sangue não centrifugado e previamente homogeneizado. Após a pipetagem (com pêra de borracha), devem-se limpar as bordas da pipeta e encaixá-la no suporte de Westergreen. A pipeta é graduada em milímetros, e a leitura é feita após 1 hora. Abaixo, um exemplo da realização da VHS (método Westergreen)

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O suporte ao lado, que está com duas pipetas, ainda comporta mais oito amostras para a realização do exame. Segundo alguns autores a referência da VHS para homens entre 17 e 50 anos é de 1 a 7 mm. Para homens acima de 50 anos é de 2 a 10 mm. No caso das mulheres, de 13 a 50 anos é 3 a 9 mm e para mulheres acima de 50 anos é 5 a 15 mm. A VHS aumenta com o aumento da idade.

Fig. 36 – Exame de VHS.

Valores elevados da VHS podem significar infecções bacterianas, hepatites agudas, processos inflamatórios agudos, artrite reumatoide, anemias graves, leucemias, disfunção da tireoide etc. Já valores muito baixos da VHS podem significar lesões hepáticas graves, insuficiência cardíaca, microcitose, hemoglobinopatia, policetemia etc.

6.7. Coagulograma (COAG) O aparelho utilizado no coagulograma é um coagulômetro óptico monocanal para a determinação dos parâmetros da hemostasia (cascata de coagulação) em plasma citratado.

Fig. 37 – Coagulômetro HUMAN CLOT Jr.

47 O método utilizado é o coagulométrico (Quick Automatizado). O coagulograma é o conjunto de exames que requer a maior precisão e atenção dentro do laboratório, na área de hematologia, pois seus resultados servirão de parâmetros para avaliação médica em procedimentos préoperatórios. Os exames de coagulograma irão fornecer dados sobre a hemostasia, ou seja, a capacidade de ‘parar’ o sangramento e iniciar o reparo tecidual, logo, estão relacionados às características fisiológicas de coagulação do sangue. O material utilizado é o plasma citratado, previamente centrifugado. Há quatro exames principais que são solicitados: TP, AP, TTPA e RNI (juntos ou individualmente). Mas há métodos que foram se tornando obsoletos, porém, ainda são utilizados em alguns laboratórios rudimentares, como a Contagem de Plaquetas (Método de Brecher-Cronkite), pois já é fornecida a quantidade no hemograma, Prova do Laço (Método de Rumpel-Leed), o Tempo de Sangria (Método de Duke) e o Tempo de Coagulação (Método de Lee-White).

6.7.1. Tempo de Protombina (TP) / Tempo de Atividade Protombina (TAP) O tempo de protombina consiste na determinação do tempo (em segundos) de coagulação de um plasma citratado. Ao plasma descalcificado (retirada de cálcio) é adicionado um excesso de tromboplastina. Considerando que a protombina se converte em trombina em um tempo uniforme, a recalcificação (promovida pelo reagente de CaCl2) produz a coagulação do plasma. O valor dado corresponde ao TP. O Tempo de Protombina considerado normal está entre 10 e 14 segundos.

* Importante: a coleta do sangue para exames de COAG deve ser feita no braço levemente garroteado. Quando se aproximar o fim da coleta deve-se retirar o garrote. O anticoagulante citrato deve ser pingado no tubo (usar tubo de vidro) no momento da coleta e, o sangue da seringa deve ter o final desprezado em local adequado. O material deve ser centrifugado até que o plasma esteja visivelmente separado da parte celular.

6.7.2. Atividade de Protombina (AP) A atividade de protombina irá medir o percentual de ação da coagulação baseando-se na concentração de protombina. Valores considerados bons para AP estão entre 70 e 120%.

48 6.7.3. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA) O teste de TTPA consiste na determinação do tempo (em segundos) de coagulação do plasma citratado após a adição dos reagentes que contém um ativador plasmático (ácido elágico) e fosfolipídeos, que irão atuar como substituintes das plaquetas. Valores considerados bons estão entre 20 e 30 segundos (pessoas sadias) e 24 e 45 segundos (pessoas que utilizam medicação anticoagulante)*. *Há anticoagulantes que são medicamentos, com finalidade de impedir a trombose. Ex.: Enoxaparina (Clexane), Varfarina (Marevan), Heparina, entre outros.

6.7.4. Relação Normalizada Internacional (RNI) A RNI é uma derivada do TP. É solicitado, portanto, junto ao TP quando pacientes utilizam anticoagulantes orais. A RNI é um exame que visa padronizar os resultados do TP, pois pode haver variações inerentes ao método e ao reagente utilizado neste último exame. Pacientes que fazem uso de anticoagulantes orais devem fazer o exame de TP juntamente com a RNI de forma periódica (o ideal é que seja pelo menos mensal). Os valores podem se elevar nas seguintes situações (além do uso dos anticoagulantes): deficiência da vitamina K (em casos de anorexia, má absorção intestinal, destruição da flora bacteriana intestinal por antibióticos), insuficiência hepática, elevações graves do colesterol etc. Os valores podem estar reduzidos com o uso de drogas de inibem os anticoagulantes (antiácidos, corticoides e diuréticos) ou em pacientes com uma dieta rica em vitamina K. Os valores de RNI ideais variam de acordo com a situação: entre 1,0 e 1,3 (pacientes sadios) e entre 2,0 e 3,0 (pacientes em uso de medicação anticoagulante). Para a realização dos exames TP (TAP), AP, e RNI, colocam-se as cuvetas nas câmaras do fotômetro. Cada uma das cuvetas menores (existem 08) deve conter 25 µL de soro do paciente. Nas cuvetas maiores (existem 02) devem haver 50 µL de reagente. Ajusta-se o aparelho para análise de TP e programam-se 180 segundos. Coloca-se a cuveta com amostra no canal de leitura (situado entre as câmaras de reagentes) e, quando o aparelho emitir um sinal sonoro, deve-se despejar o reagente. Deve-se aguardar a leitura dos três exames, que é fornecida simultaneamente.

Tabela 05: Exames TP (TAP), AP e RNI Amostra 25 µL

Reagente (Formador de Coágulo, CaCl2) 50 µL

49 Para a realização do exame TTPA o procedimento é o mesmo, diferindo apenas nos reagentes e suas dosagens.

Tabela 06: Exame TTPA Amostra Reagente n° 1 (Ativador) 25 µL 25 µL

Reagente n° 2 (Formador de Coágulo, CaCl2) 25 µL

Abaixo, uma síntese dos valores de referência para o coagulograma completo:  TP: 10 – 14 s  AP: 70 – 120%  RNI: 1,0 – 3,0 s (pessoas sadias) / 2,0 – 3,0 s (uso de anticoagulantes orais)  TTPA: 20 – 30 s (pessoas sadias) / 24 – 45 s (uso de anticoagulantes orais)

7. Bioquímica A bioquímica é parte mais extensa e trabalhosa (e mais interessante) das análises clínicas, pois compreende a maior parte dos exames que são realizados em qualquer laboratório. As práticas de bioquímica requerem muita atenção, pois há detalhes que podem por os resultados a desejar caso as etapas não sejam rigorosamente obedecidas. Esta área estuda mais intimamente a química do metabolismo humano através de métodos específicos (os quais estão descritos nas bulas dos reagentes). O foco da bioquímica, então, são as biomoléculas: carboidratos (açúcares), lipídios (óleos e gorduras), ácidos nucleicos (DNA e RNA) e aminoácidos (proteínas).

No laboratório onde se realizou o estágio os exames realizados são: glicose (jejum e pósprandial), colesterol total e suas frações (HDL e Triglicérides – sendo que VLDL e LDL são determinados por cálculos), ureia, ácido úrico, fosfatase alcalina, proteínas totais, albumina, TGO, TGP, creatinina e mucoproteínas. Na análise bioquímica uma coisa é igual para todos os procedimentos: o paciente, em jejum, irá colher o sangue conforme os procedimentos citados anteriormente. Os tubos da bancada são identificados com o número do paciente, mas o tubo que contiver o soro ou plasma deve ser identificado com iniciais do nome e o número. O sangue é pré-aquecido em banho-maria (36-37°C) antes de ser centrifugado.

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Fig. 38 – Sangue sendo colocado em banho.

A parte líquida é sempre pipetada e separada da parte celular que sedimentou durante a centrifugação, e é colocada em tubos de plástico, identificados, numa estante diferente. Costuma-se dizer que o sangue foi “sorado”.

Fig. 39 – Material “sorado” (soro/plasma)

Todos os exames bioquímicos são dosados no analisador bioquímico BIOPLUS 2000. Ele é um fotômetro com leitura monocromática e bicromática com banda de 6 a 10 nm (nanômetros) e

51 luz espúria de 0,01% T (transmitância), equipado com leitura de cuveta quadrada e capaz de trabalhar com apenas 32 µL de amostra.

Fig. 40 – Analisador bioquímico BIOPLUS 2000. Quase todas as dosagens possuem uma amostra chamada ‘branco’, a qual deve ser sempre lida antes da amostra. O branco (B) corresponde a um tubo de ensaio apenas com o reagente. O padrão é usado para o controle de linearidade dos resultados, e tem valores específicos para cada dosagem. O tubo do padrão (P) deve conter apenas padrão + reagente. Já os tubos onde foram utilizados soro ou plasma deverá conter reagente de trabalho + amostra do material. Antes de utilizar o aparelho ele deve aquecer, e inicialmente ser lavado 10 vezes com água deionizada pelo seu sistema de aspiração. Feito isso, ele deve ser reprogramado a cada mudança do tipo de dosagem. É importante dizer que as dosagens bioquímicas, em sua maioria, dependem de aquecimento em banho-maria para serem realizadas.

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Fig. 41 – Banho-maria sendo aquecido.

Aquecido o analisador bioquímico e preparadas as amostras, deve-se iniciar a formação das matrizes bioquímicas, que serão dosadas quantitativamente.

7.1. Glicose (GLIC) A Glicose (C6H12O6) é um importante carboidrato no metabolismo dos seres vivos. Os kits de glicose contém um frasco com o reagente de trabalho e outro com o padrão de calibração, e devem ser acondicionados em geladeiras entre 2°C e 8°C. O reagente n° 1 é aquele que contém as enzimas: é formado por um tampão (pH=7,0) a 36 mmol L-1, fenol a 10 mmol L-1, 4aminoantipirina a 0,03 mmol L-1, azida sódica a 7,7 mmol L-1, glicose oxidase > 100,0 mg dL-1 e peroxidase > 700 U L-1. O reagente n° 2 é o padrão, e é formado por glicose a 100,0 mg dL-1 (5,56 mmol L-1) e conservantes.

7.1.1. Glicose em Jejum (GLIC-J) Quando houver pós-prandial deve-se colocar “J” no tubo de glicose em jejum e “PP” ou “POS” no outro tubo. O sangue será colocado em tubos de plástico (com tampa cinza) contendo o anticoagulante fluoreto. A amostra, depois de homogeneizada será centrifugada até que a

53 máxima quantidade de plasma seja separada. Realiza-se a glicemia sempre em duplicata, para uma maior confiabilidade dos resultados. Tabela 07: Exame Glicose Método: Enzimático-Colorimétrico GOD-PAP Reagente n° 1 (enzimas) Reagente n° 2 (padrão) Amostra Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL 10 µL Tubo Teste 1,0 mL 10 µL

Os tubos devem ser homogeneizados e incubados em banho-maria a 37ºC durante 10 min. Aparecerá uma coloração estável por 30 minutos.

Fig. 42 – Exames de glicose sendo realizado.

Nesse teste a glicose é oxidada enzimaticamente pela glicose-oxidase (GOD) de acordo com a reação: glicose + O2 + H2O  ácido glucônico + H2O2 Na segunda etapa da reação, o peróxido de hidrogênio, em presença da enzima peroxidase (PAP), reage com a 4-aminoantipirina e fenol, formando um cromógeno vermelho cereja, cuja intensidade da cor é proporcional à concentração de glicose. Essa coloração é a mesma

54 mostrada na figura acima. Após retirar a glicose do banho, deve-se programar o aparelho para sua dosagem. A cada intervalo entre as leituras das amostras deve-se ‘lavar’ o equipamento, para evitar contaminação da próxima amostra e/ou entupimento da via de sucção. Após a dosagem, o fotômetro imprime os resultados mostrados em seu visor. O limite de referência para a glicose dosada no sangue é 70 – 110 mg dL-1. A sua dosagem é um dos exames mais solicitados pelos médicos, e serve para diagnosticar distúrbios nesse açúcar, que leva à hipoglicemia (glicose diminuída) ou hiperglicemia (glicose elevada). Um dos problemas mais frequentes envolvendo os carboidratos é o diabetes mellitus, que pode ser descrito como um grupo de doenças metabólicas capazes de comprometer o sistema vascular e neural, levando órgãos importantes a graves lesões.

7.1.2. Glicose Pós-Prandial (GLIC-PP) A glicose pós-prandial é aquela colhida após a glicose jejum, porém, após a primeira coleta, o paciente deve fazer um lanche reforçado, e ficar em repouso (sentado ou deitado) por 02 horas. Após esse tempo ele retorna para colher o sangue novamente. O sangue é centrifugado e o procedimento é repetido da mesma maneira que no exame de glicemia em jejum.

7.2. Colesterol Total (COL) O colesterol é um dos lipídios encontrados nos tecidos animais, e desempenha funções fisiológicas importantes, como a síntese de ácidos biliares, vitamina D e hormônios. Os kits de colesterol devem ser armazenados em geladeiras, entre 2°C e 8°C. Eles contém o reagente n° 1, que é composto por um tampão (pH=7) a 75 mmol L-1, fenol a 4,5 mmol L-1, 4aminoantipirina a 0,3 mmol L-1, colesterol oxidase > 200 U L-1, lipoproteína lípase > 700 U L-1, peroxidase > 300 U L-1, azida sódica 14,6 mmol L-1, estabilizantes e surfactantes. O reagente n° 2 é o padrão, que é formado por colesterol a 200,0 mg dL-1, estabilizantes e solubilizantes. O paciente tem o sangue coletado (sem anticoagulante), o qual é incubado em banho-maria a 37°C por alguns minutos. Em seguida é levado à centrífuga até que a maior porção do soro se separe do sangue.

55 Tabela 08: Exame Colesterol Total Método: Enzimático-Colorimétrico COD-PAP Reagente n° 1 (enzimas) Reagente n° 2 (padrão) Amostra Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL 10 µL Tubo Teste 1,0 mL 10 µL

Os tubos devem ser homogeneizados e incubados em banho-maria a 37°C durante 10 min. Aparecerá uma coloração estável por 60 minutos, conforme mostrado na figura abaixo.

Fig. 43 – Exame colesterol total sendo realizado.

Na primeira fase reacional os ésteres de colesterol são catalisados pela enzima lípase, conforme a reação: ésteres de colesterol  colesterol + ácidos graxos

Na segunda etapa o catalisador é a enzima colesterol oxidase: colesterol + O2  colesterol-3-ona + H2O2 Na última etapa, a enzima peroxidase é a catalisadora, conforme mostrado abaixo: 2 H2O2 + fenol + 4-aminoantipirina  cromógeno vermelho cereja + 4 H2O

56 A intensidade da coloração é proporcional à concentração de colesterol na amostra. Quando o colesterol total encontra-se < 200 mg dL-1 está ótimo; quando está entre 200 e 239 está no limite tolerável; se for > 240 mg dL-1 está alto. A concentração de colesterol plasmático é influenciada por caracteres hereditários, função endócrina, nutrição e integridade dos órgãos vitais como fígado e rins. O colesterol muito elevado pode levar à obstrução das vias coronárias e outros vasos sanguíneos (aterosclerose), dificultando a circulação do sangue. O colesterol encontra-se aumentado em pacientes com diabetes, cirrose biliar, hipotiroidismo e hiperlipoproteinemias. Encontra-se diminuído em pacientes com hepatites virais, pneumonia, hipertiroidismo, anemia e desnutrição.

*Obs.: O cromógeno avermelhado formado nas reações é devido à presença de uma substância chamada quinoneimina, cuja nomenclatura sistemática IUPAC-2001 é 2,6dicloroquinona-4-cloroimida.

Fig. 44 – Estrutura química da quinoneimina. Fonte: http://chemeo.com/cid/33-757-5

7.2.1. Frações do Colesterol 7.2.1.1. HDL O HDL (High Density Lipoprotein), lipoproteínas de alta densidade, é o chamado bom colesterol. As HDL são pequenas partículas constituídas de cerca de 50% de proteínas, 30% de triglicerídeos e 20% de colesterol. Sua função é a de levar colesterol até o fígado, contribuindo para a diminuição do mesmo na corrente sanguínea ou nas células. Para o ensaio bioquímico das HDL realizam-se duas etapas: a primeira é a precipitação e a segunda é dosagem da lipoproteína. O reagente n° 1 é o padrão, soro liofilizado de HDL. O reagente n° 2 é o precipitante enzimático, composto de tampão a 100 mmol L-1 (pH = 7,0), DSBT a 24 mmol L1

, colesterol oxidase < 300 U L-1, peroxidase < 1000 U L-1 e detergente.

57 Para um tubo de plástico, previamente numerado com o código do paciente, pipetar volumes conforme a tabela abaixo: Tabela 09: Exame Colesterol HDL – precipitação Método: Enzimático Reagente n° 2 (enzima) Amostra Tubo Branco Tubo Padrão Tubo Teste 250 µL 250 µL

A seguir, agitar manualmente ou em vórtex por 3 minutos até que se forme uma densa espuma por cima da fase líquida. Levar para centrifugar por 15 minutos. Após isso, pipetar o sobrenadante, tomando cuidado para não dispersar o corpo de fundo. Deve-se utilizar tubos de vidro para a segunda etapa. Tabela 10: Exame Colesterol HDL – dosagem Método: Enzimático Sobrenadante Reagente n° 1 (padrão) Reagente* (enzima COL) Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 50 µL 1,0 mL Tubo Teste 50 µL 1,0 mL

* usar o mesmo reagente de determinação do Colesterol Total.

A primeira etapa da reação ocorre em presença da enzima colesterol estrease: colesterol esterificado + H2O  Colesterol + ácido graxo A segunda etapa ocorre em presença da enzima colesterol oxidase: colesterol esterificado + H2O + ½ O2  colestenona + H2O2 A última etapa ocorre em presença da enzima peroxidase: 2 H2O2 + 4-aminoantipirina + DSBmT*  quinoneimina + 4 H2O
* DSBmT = N,N’-bis (4-sulfobutil)-m-toluidina

58 Deve-se homogeneizar e levar em banho-maria por 5 minutos, a 37°C. A coloração será estável por 30 minutos.

Fig. 45 – Exame HDL.

Na interpretação das HDL para: Mulheres  > 65 mg/dL é desejável;  45 – 65 mg/dL representa médio risco;  < 45 mg/dL representa alto risco;

Homens  > 55 mg/dL é desejável;  35 – 55 mg/dL representa médio risco;  < 35 mg/dL representa alto risco;

7.2.1.2. LDL É uma fração do colesterol que pode ser determinada via cálculos. As LDL (Low Density Lipoprotein), lipoproteínas de baixa densidade. Representa aproximadamente 50% em massa das lipoproteínas que circulam pelo corpo. O colesterol representa cerca de metade da massa de LDL, sendo a lipoproteína que mais carrega moléculas de colesterol. Também é chamado de mal colesterol. Uma vez que LDL transporta colesterol para as artérias, níveis maiores estão

59 associados com aterosclerose, infarto do miocárdio, ataque cardíaco e doença vascular. O cálculo do LDL é feito através da Fórmula de Friedwald:

Pela fórmula, as LDL podem ser calculadas pela união dos valores de colesterol total, H DL

e

da quinta parte do valor dos triglicérides. Segundo a “American Heart Association”, os valores de
referência para LDL são:

< 100 mg/dL está ótimo, sendo que o risco de doença cardíaca é menor. 100 – 129 está toleravelmente próximo do nível ótimo. 130 – 189 está limítrofe alto, ou seja, já não é mais tão aceitável. 160 – 189 está alto. > 190 está muito alto, sendo que o risco de doença cardíaca é alto.

A atualização de 2004 das recomendações da "American Heart Association", para pessoas com doenças de ateroscleroses é para um nível de LDL menor que 70 md/dL. 7.2.1.3. VLDL As VLDL são as lipoproteínas de muito baixa densidade (Very Low Density Lipoprotein). VLDL também é uma fração do colesterol total, sendo também uma transportadora de lipoproteínas. Os níveis de VLDL têm sido relacionados com taxa aceleradas de aterosclerose e elevação na quantidade de doenças e estados metabólicos. Não é interessante que as taxas de LDL e VLDL sejam elevadas. Segundo o laboratório HERMES PARDINI, a taxa de VLDL não deve exceder a 40 mg/dL. É avaliado a partir da concentração de triglicérides. Ainda pela relação de Friedwald, o cálculo é feito TRIG / 5, ou seja, é a quinta parte do valor das triglicérides.

7.2.1.4. Triglicérides (TRIG) As triglicérides são também uma fração do colesterol total. São provenientes da alimentação e do fígado. Esses lipídios são ésteres de ácidos graxos de glicerol, e representam a maior porção da gordura de nossos corpos. As dosagens desses lipídeos servem para diagnosticar hiperlipidemias, ou seja, presença de níveis elevados ou anormais de lipídeos no sangue. O kit de triglicérides é composto por um reagente e um padrão, que devem ser conservados entre 2 e

60 8°C. O reagente é enzimático, e contém tampão (pH 7,0) a 100 mmol L-1, 4-clorofenol a 5 mmol L-1, lípase lipoproteica 2500 U L-1, glicerol quinase > 1500 U L-1, peroxidase > 1000 U L-1, 4-aminoantipirina a 0,9 mmol L-1, ATP a 1,5 mmol L-1, glicerol-3-fosfato oxidase > 4000 U L-1, conservante, ativante e estabilizante. O padrão contém triglicérides a 100 mg dL-1 (1,13 mmol L-1) e conservante.

A técnica para dosagem das triglicérides é dada na tabela abaixo:

Tabela 11: Exame Triglicérides Método: Enzimático-Colorimétrico Reagente n° 1 (enzimas) Reagente n° 2 (padrão) Amostra Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL 10 µL Tubo Teste 1,0 mL 10 µL

Após a mistura do reagente de trabalho e o soro, deve-se homogeneizar bem e incubar em banho-maria, 37°C, por 10 minutos. A coloração será estável por cerca de 60 minutos.

Fig. 46 – Exame triglicérides sendo realizado.

61 A primeira reação do processo ocorre em presença da enzima lípase: Triglicérides + H2O  Glicerol + Ácidos Graxos A segunda etapa é dada em presença do catalisador glicerol quinase e íons Mg2+ do soro. Glicerol + ATP  Glicerol-3-fosfato + ADP

O produto da segunda etapa irá interagir com O2, em presença de oxidase dihidroxiacetanona, conforme a reação abaixo: Glicerol-3-fosfato + O2 

+ H2O2

O fosfato formado na terceira etapa reage da seguinte maneira: 2 H2O2 + 4-aminoantipirina + p-clorofenol  quinoneimina (cromógeno cereja) + 4 H2O A coloração cereja aparece em presença da enzima peroxidase, cuja intensidade da cor é proporcional à concentração de triglicérides. Quanto à interpretação dos valores de referência, tem-se que: < 150 mg/dL é desejável 150 – 199 mg/dL é limítrofe 200 – 499 é elevado > 500 mg/dL é muito elevado

7.3. Ureia (UR) A ureia é um produto do metabolismo de aminoácidos e proteínas. Gerada no fígado, é a principal fonte de excreção de nitrogênio do organismo, em sua maior parte na urina.

Fig. 47 – Estrutura química da ureia. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Ureia

62 No organismo, o metabolismo das proteínas libera amônia, que é convertida em ureia pelo fígado. Segundo USBERCO et. al (2001), a ureia antes só era obtida a partir da urina, sendo um composto orgânico, mas hoje sabe-se que pode ser encontrada também no sangue. Um

aumento da taxa de ureia pode ser observado em dietas ricas em proteínas, insuficiência cardíaca, deficiência renal aguda e hemorragias internas. A diminuição da produção da ureia está relacionada com doenças hepáticas graves, redução do metabolismo de proteínas e dietas com poucas proteínas. Conforme diz SILVA et. al. (2008), a ureia é excretada na urina, embora 40 a 70% seja reabsorvida por difusão nos túbulos renais. O nível de ureia no soro é afetado pela função renal, conteúdo proteico da dieta e teor de catabolismo proteico, estado de hidratação do paciente e presença de sangramento intestinal.

Os reagentes de ureia são um pouco mais complexos, pois há momentos em que se deve prepará-los. O reagente n° 1 é um tampão tris (pH = 7,6) a 100 mmol L-1, ADP a 0,7 mmol L-1, α-cetoglutarato 9 mmol L-1, azida sódica 15,38 mmol L-1, uréase > 6500 U L-1 e glutamato desidrogenase > 1100 U L-1. Tris é a abreviação de tris-hidroximetilaminometano, cujo nome IUPAC é 2-amino-2-hidroximetilpropan-1,3-diol.

Fig. 48 – Fórmula estrutural Tris. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Tris

O reagente n° 2 é uma coenzima, também chamada de tampão estoque, de NADH a 0,32 mmol L-1. O reagente n° 3 é o padrão, a ureia a 70 mg/dL. Há um dado reagente n° 4, que é o oxidante de trabalho. O tampão, que é o reagente n°1, é feito misturando-se 100 mL do reagente n° 2 com 400 mL de H2O deionizada. Deve-se homogeneizar e estocar em frasco âmbar; ele será estável por 12 meses se mantido entre 2 e 8°C. O reagente de trabalho, que é o que contém a ureia na concentração adequada para dosagem, é feito misturando-se 1,0 mL do reagente n° 2 com 20 mL do tampão. Deve-se homogeneizar e acondicionar em frasco âmbar;

63 ele será estável por 20 dias (entre 2 e 8°C). O oxidante de trabalho deve ser preparado adicionando-se o reagente n° 4 em 450 mL de água deionizada. Deve-se homogeneizar e acondicionar em frasco de plástico escuro; o mesmo será estável por 12 meses (2 a 8°C). Tabela 12: Exame Ureia – parte 1 Método: Colorimétrico Reagente de Trabalho (Reagentes n° 1 + Reagente n° 2) Reagente n° 3 (padrão) Amostra Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL 10 µL Tubo Teste 1,0 mL 10 µL

Após as misturas das matrizes conforme a tabela 10 deve-se homogeneizar-se o material dos tubos levemente e incubar em banho-maria, a 37°C, por 5 minutos. Quando o cronômetro apontar o vencimento dos 5 minutos, deve-se proceder à segunda parte do procedimento: Tabela 13: Exame Ureia – parte 2 Método: Colorimétrico Reagente n° 4 (oxidante) Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL Tubo Teste 1,0 mL

De acordo com a tabela acima, deve-se acrescentar 1,0 mL do oxidante de trabalho em cada um dos tubos que estão no banho. Após isso, homogeneizar levemente, e deixar no banho por mais 5 minutos. Aparecerá uma coloração estável por 60 minutos.

Fig. 49 – Oxidante de trabalho.

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Fig. 50 – Exame ureia sendo realizado.

A primeira etapa da reação ocorre em presença da enzima urease, que catalisa a hidrólise da ureia. (NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2 Na segunda fase da reação a GLDH (glutamato desidrogenase), na presença de NH3 e αcetoglutarato, oxida o NADH para NAD+. 2 NH3 + 2 NADH + 2 α-cetoglutarato  2 L-glutamato + 2 NAD+ + 2 H2O A oxidação de NADH a NAD+, medida pela diminuição de absorbância, é proporcional à concentração de ureia na amostra. O valor de referência deste produto no soro varia de 15 a 40 mg/dL.

7.4. Ácido Úrico (AUR) O ácido úrico é o maior produto do metabolismo das purinas (bases nitrogenadas). Segundo FRAZÃO (2007), o ácido úrico é uma substância formada naturalmente pelo organismo, mas, quando se encontra elevado pode gerar sintomas como inflamação e dor nas articulações, especialmente dos membros inferiores.

65 De acordo com os estudos do Dr. DRÁUZIO VARELLA, o depósito de cristais de urato (sais de ácido úrico) nas articulações, em geral, provoca surtos dolorosos de artrite aguda nos membros inferiores, mas pode comprometer qualquer articulação. O kit de ácido úrico contém o reagente n° 1, um tampão fosfato (pH = 7,5) a 100 mmol L-1 e ácido dihidroxibenzenosulfônico (DHBS) a 4 mmol L-1, o reagente n° 2, enzimático, contém um tampão (pH = 7,5) a 100 mmol L-1, 4-aminoantipirina a 2 mmol L-1, azida sódica a 7,69 mmol L-1, peroxidase > 18000 U L-1 e uricase > 3000 U L-1, e o reagente n° 3, padrão, contém ácido úrico a 6,0 mg/dL.

Tabela 14: Exame Ácido Úrico Método: Enzimático-Colorimétrico UOD-PAP Reagente de Trabalho (Reagente n° 1 + Reagente n° 2) Reagente n° 3 (padrão) Amostra Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL 25 µL Tubo Teste 1,0 mL 25 µL

Deve-se misturar 20 partes do reagente n° 1 com 1 parte do reagente n° 2 (ex.: 20 mL + 1 mL). Ele será estável por 20 dias entre 2 e 8°C (fora do alcance de luz). Após colocar as misturas nos tubos de ensaio, levar em banho-maria (37°C) por 5 minutos. A coloração será estável por 30 minutos. As reações ocorridas são: O ácido úrico sendo hidrolisado em presença da enzima uricase (UOD): Ácido Úrico + 2 H2O Alantoína + CO2 + H2O2 A alantoína, formada na primeira como produto principal da primeira reação, é resultante da degradação hidrolítica do ácido úrico.

Fig. 51 – Estrutura química da alantoína. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Alanto%C3%ADna

66 Seu nome IUPAC é 2,5-dioxo-4-imidazolidinilureia (como o nome da ureia segundo a IUPAC é diaminometanal, o nome correto para a alantoína é 2,5-dioxo-4-

imidazolidinildiaminometanal). A alantoína é um metabólito gerado pela degradação do ácido úrico por uma enzima chamada rasburicase. Não é tóxica, e é ligeiramente solúvel em água. É uma das outras formas de os seres vivos excretarem nitrogênio.

Fig. 52 – Exame ácido úrico sendo realizado.

A segunda fase da reação é dada em presença da peroxidase (PAP). 2 H2O2 + DCHBS* + 4-aminoantipirina  cromógeno cereja + 4 H2O
* DCHBS = ácido 3,5-dicloro-2-hidróxibenzenossulfônico

A intensidade da coloração é diretamente proporcional à concentração de ácido úrico na amostra. Em crianças do sexo feminino valores aceitáveis estão entre 0,5 e 5,0 mg/dL e entre 1,5 e 6,0 mg/dL em crianças do sexo masculino. Em adultos do sexo feminino valores aceitáveis estão entre 1,5 e 6,0 mg/dL e entre 2,5 e 7,0 mg/dL em adultos do sexo masculino.

67 7.5. Fosfatase Alcalina (FAL/ALP) Fosfatase alcalina é uma enzima presente em quase todos os tecidos do organismo, especialmente nas membranas nas células dos túbulos renais, ossos, placenta, intestino e fígado. Sua função está relacionada com o transporte de lipídios no intestino e os processos de calcificação óssea. Há coisas interessantes de se notar, como: a fosfatase alcalina óssea e a hepática partilham proteínas estruturais codificadas por um mesmo gene e, a fosfatase intestinal, só se expressa em indivíduos com grupos sanguíneos O e B. Um kit de fosfatase alcalina é formado por um tampão dietanolamina (pH = 9,9) a 0,3 mol L-1 e citrato de sódio a 10 mmol L-1, surfactante e ativador (reagente n° 1), por um substrato, p-NFF (pnitrofenilfosfato) a 10 mmol L-1 e azida sódica a 15 mmol L-1 (reagente n° 2), por um reagente de cor, composto de carbonato de sódio (CaCO3) a 150 mmol L-1 e hidróxido de sódio (NaOH) a 100 mmol L-1 (reagente n° 3), e por um padrão formado de timolfitaleína a 0,4 mmol L-1 e solubilizante (reagente n° 4). *Importante: os reagentes devem ser conservados em temperatura ambiente. Porém, o padrão e o tampão devem ser colocados em geladeia (2 a 8 °C) após abertos. Todos são muito voláteis e, portanto, devem estar bem fechados.

O preparo das matrizes para análise no BIOPLUS 2000 é feita conforme a tabela abaixo: Tabela 15: Exame Fosfatase Alcalina – parte 1 Método: Timolfitaleína (Roy modificado) Reagente n° 1 (tampão) Reagente n° 2 (substrato) Reagente n° 4 (padrão) Tubo Branco 250 µL 25 µL Tubo Padrão 25 µL 25 µL 25 µL Tubo Teste 250 µL 25 µL -

Incubar em banho-maria, a 37°C, por 2 minutos. Após esse tempo, adicionar 1,0 mL do reagente n° 3 em todos os tubos, conforme tabela abaixo. Tabela 16: Exame Fosfatase Alcalina – parte 2 Método: Timolfitaleína (Roy modificado) Reagente n° 3 (reagente de cor) Tubo Branco 1,0 mL Tubo Padrão 1,0 mL Tubo Teste 1,0 mL

68 A fosfatase alcalina hidrolisa o p-nitrofenilfosfato, que é incolor, produzindo fosfato e pnitrofenol, em pH = 9,0. A velocidade de aparição do ânion p-nitrofenolato (amarelo), a 405 nm, é proporcional à atividade enzimática da amostra. A dietanolamina (DEA), além de regular o pH da reação, intervém na mesma, atuando como receptor de fosfato liberado pela enzima. p-NFF + DEA  p-nitrofenol + DEA-fosfato

Fig. 53 – Exame fosfatase alcalina sendo realizado.

A determinação laboratorial da fosfatase alcalina se aplica muito bem para o diagnóstico de doenças do fígado e dos ossos. Valores elevados podem ser vistos em casos de cirrose, obstrução biliar, tumor primário do fígado ou ossos e doença de Paget (distúrbios no metabolismo ósseo). Valores muito baixos podem ser causados por hipertireoidismo, desnutrição e hipofosfatemia. Consideram-se valores de referência de 75 a 390 U/L para crianças e adolescentes e 27 a 100 U/L para adultos.

69 7.6. Proteínas Totais (PROT) As proteínas do sangue são basicamente compostas por frações, a albumina e as globulinas, além de uma pequena porção de fibrinogênio e outras proteínas menores. A dosagem das proteínas totais é utilizada na avaliação do estado nutricional. Aumentos são encontrados em desidratação, doenças hepáticas, neoplasias, hanseníase e outras enfermidades. Valores baixos são vistos em gravidez, cirrose, neoplasias, queimaduras etc. O kit de proteínas totais é composto de um reagente n° 1, biureto : hidróxido de sódio 0,2 mol L-1, tartarato de potássio e sódio a 32 mmol L-1, iodeto de potássio 6 mmol L-1 e sulfato de cobre 12 mmol L-1, e de um reagente n° 2, o padrão, de albumina a 4,0 g dL-1 e azida sódica 15,38 mmol L-1.

Tabela 17: Exame Proteínas Totais Método: Biureto-Colorimétrico Reagente n° 1 (biureto) Reagente n° 2 (padrão) Amostra Tubo Branco 2,5 mL Tubo Padrão 2,5 mL 50 µL Tubo Teste 2,5 mL 50 µL

Os tubos devem ser homogeneizados e levados ao banho (37°C) por 10 minutos. A coloração será estável por 60 minutos. Na reação, as ligações peptídicas das proteínas ( - COONH - ) reagem com os íons Cu2+, formando um complexo violeta, que é proporcional à concentração de proteínas no meio. A presença do tartarato de sódio e potássio estabiliza o reagente (meio alcalino do biureto) e a concentração adequada de iodeto de potássio previne a sua autorredução. A dosagem isolada das proteínas totais tem pouco valor clínico, pois a alteração em uma das frações pode ser compensada por uma alteração em outra fração, como nas doenças crônicas, onde há diminuição da albumina e aumento da gamaglobulina. Valores normais de proteínas no soro estão entre 6,4 e 8,3 g/dL.

7.7. Albumina (ALB) A albumina é a proteína mais abundante no soro. É sintetizada no fígado, por células chamadas hepatócitos. Níveis elevados podem ocorrer na desidratação aguda. Níveis baixos podem ser vistos em casos de cirrose, infecções agudas, queimaduras e doenças inflamatórias intestinais. O kit de albumina contém o reagente n° 1: verde de bromocresol a 01, mmol L-1, tampão

70 citrato a 20 mmol L-1 (pH = 3,6), preservativos e surfactantes e o reagente n° 2: padrão de albumina a 3,8 mg/dL e azida sódica 15,38 mmol L-1. Para o teste, procede-se desta forma:

Tabela 18: Exame Albumina Método: Verde de Bromocresol (VBC) Reagente n° 1 (VBC) Reagente n° 2 (padrão) Amostra Tubo Branco 2,5 mL Tubo Padrão 2,5 mL 10 µL Tubo Teste 2,5 mL 10 µL

A dosagem utiliza o que se chama de “erro proteico dos indicadores”. Em presença da albumina, o verde de bromocresol forma um complexo corado, que exibe um espectro de absorção diferente do corante no seu estado livre, permitindo a dosagem. Valores normais de albumina no soro estão entre 3,5 a 5,5 g/dL e o de globulinas, de 1,4 a 3,2 g/dL. Abaixo, a figura 54 mostra a primeira etapa da realização do exame de proteínas totais, que é feito ao mesmo tempo que o de albumina. De azul, as soluções de proteínas e, de amarelo, as soluções de albumina.

Fig. 54 – Reagentes proteínas totais (azul) e albumina (amarelo).

Os testes com proteínas totais e albumina não precisam ser aquecidos em banho. Após adicionar a amostra deve-se homogeneizar os tubos e deixar sob repouso por 10 minutos. A coloração azul-arroxeada aparecerá no teste de proteínas e a coloração esverdeada aparecerá no teste de albumina. Os tubos do ‘branco’ permanecerão com a mesma coloração incial.

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Fig. 55 – Reações de coloração proteínas totais / albumina.

7.8. Creatinina (CR) A creatinina é um produto da degradação da fosfocreatina (depósito de energia nos músculos esqueléticos). Seu nome IUPAC é 2-amino-1-metil-5-H-imidazol-4-ona.

Fig. 56 – Fórmula estrutural da creatinina. Fonte: http://dredisondacreatinina.com.br/mandato/pronunciamentos/saude/creatinina-2/ O kit de creatinina possui 3 reagentes. O reagente n° 1, tampão, contém NaOH 110 mmol L-1 e CaCO3 a 75 mmol L-1. O reagente n° 2, contém ácido pícrico ( 2,4,6-trinitrofenol) a 60 mmol L-1, cuja estrutura é mostrada na figura abaixo.

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Fig. 57 – Estrutura química do ácido pícrico. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_p%C3%ADcrico

O reagente n° 3, padrão, contém creatinina a 3,0 mg/dL. A creatinina reage com o picrato alcalino em meio tamponado, formando um cromógeno, cuja absorbância é proporcional à concentração de creatinina na amostra. Valores aumentados de creatinina podem ocorrer em função de doenças renais e valores mais baixos podem ocorrer em função de perda de massa muscular.

Tabela 19: Exame Creatinina Método: Cinético-Colorimétrico Reagente n° 1 (tampão) Reagente n° 2 (ácido pícrico) Reagente n° 3 (padrão) Amostra Tubo Branco 800 µL 200 µL 100 µL Tubo Teste 800 µL 200 µL 100 µL

No exame creatinina não existe um tubo apenas para o padrão. Nesse ensaio bioquímico ele é colocado no mesmo tubo do branco. Após adicionar os reagentes no tubo deve-se ajustar o BIOPLUS 2000 para o teste de creatinina. Apenas no momento da leitura a amostra será agregada ao tubo de leitura.

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Fig. 74 – Exame creatinina sendo realizado.

Em mulheres, valores considerados normais estão entre 0,5 e 1,0 mg/dL e, em homens, entre 0,7 e 1,2 mg/dL.

7.9. Mucoproteínas (MUC) As mucoproteínas são conhecidas como proteínas de fase aguda e são um importante índice da atividade reumática. Sua concentração aumenta ou diminui em resposta a processos inflamatórios. O kit de ensaio bioquímico das mucoproteínas é composto da seguinte forma: reagente n° 1: ácido perclórico (HClO4) a 2,0 mol L-1; reagente n° 2: ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) a 15 mmol L-1; reagente n° 3: carbonato de sódio (Na2CO3) a 1,8 mol L-1; reagente n° 4: Reagente de Folin: tungstato de sódio (Na2WO4) a 300 mmol L-1, molibidato de sódio (Na2MoO4) a 100 mmol L-1, ácido fosfórico (H3PO4) a 500 mmol L-1, ácido clorídrico (HCl) a 1,0 mol L-1 e sulfato de lítio (Li2SO4) a 1,2 mol L-1; reagente n° 5: padrão de tirosina a 40 mg dL-1 (5 mg dL-1 de mucoproteínas). A tirosina é um dos componentes das proteínas nos seres vivos.

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Fig. 59 – Fórmula estrutural da tirosina. Fonte: http://www.tradegopt.com/product-pharmaceutical/l-tyrosine-789285.html

Para a análise das mucoproteínas, quando necessário, deve-se preparar o reagente n° 3, chamado de também de reagente carbonato ou CAR. Para prepará-lo deve-se colocar 50 mL do reagente e completar para 250 mL de solução com água deionizada (solução estável por 6 meses). O teste das mucoproteínas é divido em três partes: desproteinização, precipitação e colorimetria.

7.9.1. Desproteinização É o processo pelo qual as proteínas serão isoladas como analito de interesse. Para esse passo deve-se proceder da seguinte maneira: Tabela 20: Exame Mucoproteínas – desproteinização Método: Colorimétrico (Winzler-modificado) NaCl 0,9% Reagente n° 1 (HClO4) Amostra Tubo Teste 3,0 mL 1,5 mL 0,5 mL

Perfazendo 5,0 mL em cada tubo de análise, agitar manualmente ou em vórtex por 2 minutos até observar a formação de uma densa espuma. Deixa filtrar em papel de filtro qualitativo, até que todo o filtrado seja obtido. O mesmo deve ser límpido.

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Fig. 60 – Etapa de desproteinização das mucoproteínas.

7.9.2. Precipitação As proteínas séricas são precipitadas pelo HClO4, permanecendo as mucoproteínas no sobrenadante. A precipitação das mucoproteínas (filtrado) acontece na presença de H3PW12O40, posteriormente dissolvidas e dosadas em níveis de tirosina pelo Reagente de Folin. Tabela 21: Exame Mucoproteínas – precipitação Método: Colorimétrico (Winzler-modificado) Filtrado Reagente n° 2 (H3PW12O40) Tubo Teste 2,0 mL 0,8 mL

Feito o segundo passo, conforme a tabela acima, deve-se agitar os tubos de teste e deixá-los sob repouso por 10 minutos. Depois de passado esse tempo, centrifugar por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e deixa os tubos de “cabeça para baixo” sobre papel absorvente. Deixar repousar por mais 10 minutos para retirar o excesso de líquido.

76 7.9.3. Colorimetria É a última etapa do procedimento. Devem-se seguir os passos da tabela, conforme mostrado abaixo: Tabela 22: Exame Mucoproteínas – colorimetria Método: Colorimétrico (Winzler-modificado) Reagente n° 5 (Padrão) Reagente n° 3 (Na2CO3) Tubo Branco 2,5 mL Tubo Padrão 2,5 mL 2,5 mL Tubo Teste 2,5 mL

Agitar fortemente até que o precipitado se dissolva. Após isso, adicionar o Reagente de Folin (FOL) em todos os tubos. Reagente n° 4 (Reagente de Folin) 100 µL 100 µL 100 µL

Agitar fortemente e incubar em banho-maria, 37°C, por 15 minutos.

Realizada a última etapa, será vista uma coloração azul-arroxeada, estável por 120 minutos, cuja intensidade é proporcional à concentração de tirosina na amostra.

Fig. 61 – Teste de mucoproteínas.

77 As mucoproteínas são uma fração heterogênea de glicoproteínas solúveis que podem ser separadas por eletroforese em subfrações, conhecidas como proteínas da fase aguda. Existem aproximadamente 30 dessas frações. Durante o processo inflamatório alguns eventos costumam acontecer e, muitas vezes, servem como elementos ou sinais de alerta.

Segundo SZJUBOK (2013), esses eventos, geralmente descritos como eventos da fase aguda, podem acompanhar tantos os processos inflamatórios agudos como os crônicos. Dentre eles podem ser citados: febre, leucocitose, proteólise muscular, alterações endócrinas etc. Valores aumentados nos resultados das mucoproteínas podem ser observados em casos de tuberculose (TBC), doenças do colágeno, diabetes mellitus, gota e neoplasias.

Valores muito baixos são observados em nefroses e insuficiências hepáticas e hipofisárias. Os valores de referência em função de tirosina são 1,9 a 4,9 mg/dL. Para converter o valor de tirosina em mucopoteína, multiplica-se o mesmo por 23,8. Assim, o valor de referência passa a ser de 45,22 a 116,62, que pode ser simplificado para 45 a 117 mg/dL.

7.10. Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO) A enzima AST (aspartato aminotransferase), também conhecida por TGO, é encontrada em diversos órgãos e tecidos, como o fígado e coração, e em células, como os eritrócitos. Valores altos de TGO podem ser decorrentes de hepatites (virais ou tóxicas), hepatites por drogas, mononucleose, cirrose e pancreatite. O kit de TGO possui quatro reagentes: o reagente n° 1 é um substrato, formado por: LDH (lactato desidrogenase) + MDH (malato desidrogenase), ácido L-aspártico a 100 mmol L-1, azida sódica a 15,4 mmol L-1, α-cetoglutarato a 2,0 mmol L-1, tampão tris pH = 7,8 e estabilizante; o reagente n° 2 é uma coenzima, formada por NADH, azida sódica e estabilizantes. Para o ensaio procede-se da seguinte forma:

78 Não há tubos de ‘branco’ e padrão neste exame. Assim, no mesmo tubo, deve-se misturar 9 partes do reagente n° 1 com 1 parte do reagente n° 2, ou seja, 900 µL com 100 µL.

Tabela 23: Exame TGO Método: Cinético UV Reagente n° 1 (substrato) Reagente n° 2 (coenzima) Tubo Branco Tubo Padrão Tubo Teste 900 µL 100 µL

Incubar em banho-maria, 37°C, por 1 minuto. Adicionar a amostra na hora de fazer leitura no fotômetro. Amostra 100 µL

A primeira fase da reação ocorre em presença da TGO. Ácido L-aspártico + α-cetoglutarato  Oxalacetato + NADH+ + L-glutamato

A segunda fase da reação é catalisada pela enzima MDH (malato desidrogenase): Oxalacetato + NADH + H+  L-malato + NAD+ A TGO catalisa a transferência de grupos amina do aspartato para o α-cetoglutarato levando à formação de glutamato e oxalacetato que, por sua vez, em presença de MDH, reage com NADH, reduzindo-se a malato e o NADH oxida-se a NAD+. A velocidade da oxidação é proporcional à atividade da TGO na amostra. Valores desejados para TGO variam de 10 a 37 U/L para mulheres e 11 a 39 U/L para homens. *Obs.: como os métodos das Transaminases são cinéticos o conteúdo nos tubos fica incolor.

7.11. Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP) A enzima ALT (alanina aminotransferase), também conhecida como TGP é encontrada abundantemente no fígado, moderadamente nos rins e em quantidades pequenas no coração. O aumento da atividade da TGP reflete alterações nos tecidos. A maior atividade desta enzima acontece no tecido hepático, estando aumentada em virtude de hepatites (virais ou tóxicas). O kit de TGP é composto por dois reagentes: o reagente n° 1 é um substrato, formado por

79 tampão Hepes (pH = 7,8), ácido α-cetoglutário a 2,0 mmol L-1, LDH > 2300 U/L, azida sódica (NaN3) a 15,4 mmol L-1 e L-alanina a 100 mmol L-1 e estabilizante. Hepes é o nome dado ao tampão bioquímico formado por ácido 2-[4-(2-hidróxietil)piperazin-1-il]-etanossulfônico.

Fig. 62 – Fórmula química do Hepes. Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/File:HEPES.png O reagente n° 2 é uma coenzima, contendo NADH a 1,13 mmol L-1, azida sódica a 14,6 mmol L-1 e estabilizante. O ensaio de determinação da TGP é semelhante ao da TGO, mudando apenas na quantidade de reagentes utilizada. Assim, não há tubos de ‘branco’ e padrão neste exame. E, misturar 8 partes do reagente n° 1 com 2 partes do reagente n° 2, ou seja, 900 µL com 100 µL.

Tabela 24: Exame TGP Método: Cinético UV Reagente n° 1 (substrato) Reagente n° 2 (coenzima) Tubo Branco Tubo Padrão Tubo Teste 800 µL 200 µL

Incubar em banho-maria, 37°C, por 1 minuto. Adicionar a amostra na hora de fazer leitura no fotômetro. Amostra 100 µL

A primeira etapa da reação é catalisada pela TGP: L-alanina + ácido α-cetoglutárico  Piruvato + L-glutamato

A segunda parte da reação ocorre em presença da LDH: Piruvato + NADH + H+  L-lactato + NAD+

80 A TGP catalisa a transferência de grupos amina da alanina para o α-cetoglutarato levando à formação de glutamato e piruvato que, por sua vez, em presença de LDH, reage com NADH, reduzindo-se a lactato e o NADH oxida-se a NAD+. A velocidade da oxidação é proporcional à atividade da TGP na amostra. Valores desejados para TGP variam de 10 a 37 U/L para mulheres e 11 a 45 U/L para homens.

Todo o resíduo gerado das análises feitas no BIOPLUS 2000 vão para frascos com um funil, conectados a bombas peristálticas. Após as análises são descartados adequadamente.

Fig. 63 – Descarte de bioquímica.

As ponteiras e pipetas de vidro usadas na análise são desprezadas em recipientes separados, contendo água deionizada e hipoclorito de sódio a 1%.

Quando as dosagens realizadas no BIOPLUS 2000 terminam, deve-se fazer com que o aparelho aspire uma solução de limpeza (uma espécie de sabão), que irá limpar as vias de succção, impedindo entupimento. O sabão é feito utilizando-se 10 gotas da solução de limpeza com 10 mL de H2O deionizada. * deve ficar claro que os reagentes (concentrações, quantidades e marcas) variam entre os laboratórios, bem como os métodos utilizados.

81 8. Imunologia (Sorologia) É a parte das análises clínicas que visa a compreender os mecanismos de defesa do corpo (sistema imunológico). Os órgãos ligados ao sistema imunológico são: amígdalas (ou tonsilas), linfonodos, timo, medula óssea e baço. O corpo humano tem três barreiras de defesa: a primeira é formada pela pele, mucosas, ceras e cílios. A segunda é formada por células e substâncias químicas que não diferenciam os invasores. A terceira é formada por células específicas para cada tipo de invasor. O funcionamento do sistema de defesa baseia-se em especificidade e memória. Segundo LOPES & ROSSO (2008), a especificidade refere-se à capacidade do sistema de reconhecer e combater certos microrganismos ou substâncias estranhas ao corpo. Esse ato de defesa é estimulado pelos antígenos (proteína ou polissacarídeo) que podem estar em vírus, bactérias e outras substâncias. Os antígenos induzem que as células brancas, como os linfócitos, a reconheçam e produzam proteínas específicas chamadas anticorpos, para combatê-los. Na área clínica chamamos os anticorpos de Imunoglobulinas (Ig). Cada anticorpo é específico para um antígeno. A memória refere-se à capacidade do sistema de reconhecer novamente um mesmo antígeno e produzir os mesmos anticorpos específicos. Basicamente o sistema imunológico é formado por uma hierarquia de células brancas. As células que podemos denominar principais são os fagócitos e os linfócitos.  Fagócitos: são as células brancas com função de fagocitar (digerir) os organismos estanhos ao corpo. Essas células são: monócitos, mastócitos, basófilos e eosinófilos.  Linfócitos: são um tipo de leucócito, produzidos na medula óssea vermelha. Podem ser do tipo T ou B. Os linfócitos T ora atuam estimulando os linfócitos B a produzirem anticorpos, ora atuam como próprios destruidores de corpos estranhos no organismo. Os linfócitos T podem ser de vários tipos, sendo que os principais são: a) CD8 (T-citotóxicos ou linfócitos matadores): unem-se a células infectadas para destruí-las. Eles não têm atividade fagocítica, por isso, atacam as células do corpo que foram infectadas e não o invasor. São capazes de reconhecer células cancerígenas e destruí-las antes de formarem um tumor maligno. b) CD4 (T-auxiliares): ativam os linfócitos T e estimulam os linfócitos B a produzirem imunoglobulinas.

Durante o estágio realizou-se alguns ensaios imunológicos, os quais detalham-se a seguir.

82 8.1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1/2) O HIV (vírus da imunodeficiência humana) é o retrovírus causador da AIDS, frequentemente transmitido por contato sexual, transfusão de sangue, durante o parto, e até mesmo na lactação. Segundo CANINI et.al (2004), o HIV causa no organismo disfunção imunológica crônica e progressiva devido ao declínio dos níveis de linfócitos CD4, sendo que quanto mais baixo for o índice desses, maior o risco do indivíduo desenvolver AIDS. É como se o vírus ficasse latente. Do ponto de vista de SARAIVA et. al. (2010), o vírus impede que o sistema imunológico proteja o organismo contra agentes agressores, como outros vírus, bactérias, protozoários, células cancerígenas etc. O kit de HIV contêm placas de teste (popularmente chamadas de ‘sabonete’) e o reagente chamado diluente. Deve-se escrever o número do paciente na placa de teste e, em seguida proceder à análise. Tabela 25: Exame HIV-1/2 Método: Imunocromatográfico Amostra Reagente (Diluente) 10 µL 04 gotas

O sangue colhido deve ser o mesmo utilizado na bioquímica. Deve-se pipetar 10 µL de soro e despejar na câmara de teste. Depois, adicionar 04 gotas do diluente na mesma câmara. Após alguns segundos, na coluna cromatográfica a fase estacionária (soro diluído) e a fase de arraste (diluente) irão determinar o resultado dependendo de onde a coloração da linha roxa parar. Porém, é importante que a fase de arraste cruze a linha vermelha que, nos ensaios cromatográficos, chamamos “linha de chegada”.  Linha C: HIV–  Linha C + Linha 1: HIV+ (tipo 1)  Linha C + Linha 2: HIV+ (tipo 2)  Linha C + Linha 1 + Linha 2: HIV+ (tipos 1 e 2)

Na figura abaixo, mostra-se o resultado gráfico do resultado. Caso a linha C não apareça, devese repetir o teste.

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Fig. 64 – Esquema da visualização dos resultados HIV-1/2. Fonte: bula Hexagon-HIV

Fig. 65 – Teste HIV-1/2 sendo iniciado.

8.2. VDRL O teste de VDRL, também solicitado pelos médicos como Sorologia para LUES, é utilizado no diagnóstico da sífilis, causada pela bactéria Treponema pallidum. De acordo com os dizeres de SANTOS et. al. (2009), pode ocorrer contaminação por contato com lesões mucocutâneas ricas em treponemas, transfusão de sangue, via placentária e relação sexual. Um teste negativo quase sempre significa que a pessoa nunca teve contato com a sífilis, ou que teve e o tratamento foi eficaz ao ponto de torná-lo negativo. Entretanto, num estado avançado da sífilis e numa

84 pessoa a quem nunca tenha sido diagnosticada a doença e recebido tratamento adequado, o VDRL poderá dar resultado negativo. Isto é chamado de resultado falso negativo e acontece devido ao elevado número de anticorpos produzidos pelo organismo durante o estado latente ou terciário da doença. Estando o médico na suspeita de um paciente encontrar-se nesta fase é crucial a realização de um exame comprovativo, por norma o FTA-ABS. Por outro lado, o VDRL é às vezes positivo na ausência da sífilis. Chama-se de resultado falso positivo. Como exemplo, há: mononucleose infecciosa, lúpus, hepatite A, hanseníase, malária e,

ocasionalmente, até na gravidez podem ser encontrados pequenos títulos que não significam a presença de sífilis.

O kit de teste apresenta apenas dois reagentes. O reagente n° 1 é um antígeno da sífilis. Ele deve ficar na geladeira, entre 2 e 8°C; deve ser homogeneizado bem antes de usar. É composto de cardiolipina a 0,44 µmol L-1, lecitina 3,12 a µmol L-1, colesterol 23,3 a µmol L-1 e tampão (pH = 6,0) fosfato com cloreto de colina e EDTA a 10 mmol L-1. A cardiolipina é um lipídio da membrana mitocondrial da bactéria da sífilis. Seu nome IUPAC é 1,3-bis-3’fosfatidilglicerol.

Fig. 66 – Cadeia orgânica de cardiolipina. Fonte: http://es.wikipedia.org/wiki/Cardiolipina.

A lecitina é um tipo de gordura essencial em todos os tecidos orgânicos. Seu nome IUPAC é 1hexadecil-2-oleilfosfatidil-2-hidróxieiltrimeillamônio (ou, mais facilmente, 1-palmitil-2oleilfosfatidilcolina). É uma mistura de glicolipídios, triglicérides e fosofolipídios. Essa substância capaz de reduzir a taxa de colesterol do sangue, reduzindo o risco à saúde causado por várias doenças provenientes do colesterol alto, principalmente LDL e VLDL.

85 O reagente n° 2 é o controle positivo e o reagente n° 3 é o controle negativo.

Fig. 68 – Reagentes VDRL. O reagente de tampa vermelha é o controle positivo, o reagente de tampa branca é o antígeno e o reagente de tampa preta é o controle negativo. Fig. 67 – Cadeia química da lecitina. Fonte: http://engenhariadealimentosufc.blogspot.com.br/2009/11/o-que-e-lecitina.html Para iniciar o teste deve-se pipetar 50µL de soro e colocar em uma das escavações da Placa de Kline de vidro (mostrada abaixo). Junto do soro, adicionar 20 µL do reagente. Homogeneizar de maneira circular sobre a bancada durante 5 minutos.

Tabela 26: Exame VDRL Método: Floculação Amostra 50 µL

Reagente n° 1 (antígeno) 20 µL

Fig. 69 – Placa de Kline para VDRL. Fonte: http://www.hexasystens.com.br/produto/placade-kline-moldada-em-vidro-12-pocos-gk-12-glasscyto.aspx Após a homogeneização, observar a placa ao microscópio na objetiva amarela (10x/0.25). Se forem observados grumos, o resultado será positivo.

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Fig. 70 – Observação da placa ao microscópio. Fonte: Bula reagente VDRL

Ao microscópio serão observados resultados semelhantes ao da figura acima, onde o primeiro é SNR (soro não-reativo), o segundo e o terceito são SR (soro reativo). Quando o resultado é positivo deve-se efetuar a diluição da amostra nos outros campos da placa (utilizar solução salina: NaCl 0,9%). Diluição

Pegando uma placa de Kline limpa, escolher uma das 12 escavações para ser a primeira (podese marcar com um pincel a borda da primeira para evitar confusões). Depois, seguir os passos abaixo:  1° escavação: 50 µL de soro + 50 µL de salina  2° escavação: 50 µL da 1° escavação + 50 µL de salina  3° escavação: 50 µL da 2° escavação + 50 µL de salina e assim por diante...

Após a diluição seriada, adicionar em 20 µL do reagente em cada escavação. Agitar novamente por 5 minutos. Observar a microscópio na mesma objetiva. O resultado deve ser dado em função da última diluição, assim:

Tabela 27: Diluição VDRL positivo N° da escavação Diluição 1 2 3 4 5 6

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

87 8.3. Antiestreptolisina O (ASO/ASLO/AEO) O teste de ASO é indicado para diagnosticar infecções causadas por bactérias do tipo estreptococo, que provoca febres reumáticas e glomerulonefrite aguda. A reação ocorrida consiste em aglutinar partículas de látex revestidas com anticorpos ASO presente nessa bactéria. O kit de diagnóstico contém o reagente n° 1: partículas de látex em suspensão, sensibilizadas com antiestreptolisina O; reagente n° 2: controle positivo (solução aglutinante de látex) e reagente n° 3: controle negativo (solução salina de NaCl a 0,9%).

Tabela 28: Exame ASO Método: Látex Amostra 20 µL

Reagente n° 1 (partículas) 20 µL

Fig. 71 – Reagentes ASO.

Na realização do teste, deve-se colocar 20 µL de soro em um dos círculos da placa e, em seguida, adicionar 20 µL do reagente. Vale saber que apenas o VDRL é feito na placa de Kline. Homogeneizar com um palito de plástico (acompanha o kit). Logo em seguida, homogeneizar a placa nas mãos de maneira thundeler-burgger, semelhante ao do homogeneizador de sangue. Observar se houve aglutinação.

Se não houver, o resultado é transcrito na planilha como < 200 UI/mL. Em caso de aglutinação, deve-se proceder à diluição. Diluição

Pegando uma placa de teste limpa, escolher um dos poços para ser o primeiro. Semelhante ao procedimento para VDRL, deve-se efetuar a diluição seriada.  1° poço: 20 µL de soro + 20 µL de salina  2° poço: 20 µL do 1° poço+ 20 µL de salina  3° poço: 20 µL do 2° poço+ 20 µL de salina e assim por diante...

88 Após a diluição seriada, adicionar em 20 µL do reagente em cada escavação. Homogeneizar da mesma forma. O resultado será dado em função do número de diluições.

Tabela 29: Diluição ASO N° do poço 1 2 3 4 5 Amostra Sem diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentração (Ul/mL) 200 400 800 1600 3200

8.4. Proteína C Reativa (PCR) É uma proteína plasmática produzida no fígado. Sua concentração é muito baixa em indivíduos sadios, elevando-se bastante em presença de processos inflamatórios ou infecções, sendo um indicador extremamente sensível das mesmas, muito mais que a VHS. O princípio da reação também ocorre em função da aglutinação de partículas de látex com ɣ-globulinas anti-PCR.

O kit de determinação da PCR é composto por: reagente n° 1: partículas de látex sensibilizadas em suspensão; reagente n° 2: controle positivo de soro > 6 mg L-1 e azida sódica a 15,38 mmol L-1; reagente n° 3: controle negativo de soro < 6 mg L-1 e azida sódica a 15,38 mmol L-1.

Tabela 30: Exame PCR Método: Látex Amostra Reagente n° 1 20 µL 20 µL

Fig. 72 – Reagentes PCR.

89 Assim como na realização do látex-ASO, na realização desse teste, deve-se colocar 20 µL de soro em um dos círculos da placa e, em seguida, adicionar 20 µL do reagente. Homogeneizar com um palito de plástico (acompanha o kit). Logo em seguida, homogeneizar a placa nas mãos de maneira thundeler-burgger, semelhante ao do homogeneizador de sangue. Observar se houve aglutinação.

Se não houver, o resultado é transcrito na planilha como < 6 mg/L. Em caso de aglutinação, deve-se proceder à diluição. Diluição

Pegando uma placa de teste limpa, escolher um dos poços para ser o primeiro. Semelhante ao procedimento para ASO, deve-se efetuar a diluição seriada.  1° poço: 20 µL de soro + 20 µL de salina  2° poço: 20 µL do 1° poço+ 20 µL de salina  3° poço: 20 µL do 2° poço+ 20 µL de salina e assim por diante...

Após a diluição seriada, adicionar em 20 µL do reagente em cada escavação. Homogeneizar da mesma forma. O resultado será dado em função do número de diluições.

Tabela 31: Diluição PCR N° do poço 1 2 3 4 5 Amostra Sem diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentração (mg/L) 6 12 24 48 98

8.5. Fator Reumatóide (FR) O fator reumatoide positivo não significa reumatismo nem artrite reumatoide, mas, sim, anticorpos contra anticorpos. Como se sabe, na imunologia diz-se que “anticorpos são proteínas formadas por estímulo de corpos estranhos ao organismo”, porém, alguns est udiosos provaram

90 que são possíveis algumas substâncias produzidas pelo corpo também atuarem como anticorpos contra outras substâncias do mesmo, ou seja, seria possível o corpo produzir anticorpos para anticorpos. Alguns cientistas, não concordando com a ideia, mas não podendo negar a existência de tais substâncias, optaram por chamá-las de “fator”, para que fossem diferenciadas dos verdadeiros anticorpos. Com o passar do tempo provou-se que essas substâncias tinham a mesma composição química dos anticorpos sendo, portando, imunoglobulinas. O nome fator permaneceu, pois a sociedade acadêmica não quis reconhecer essas substâncias realmente como anticorpos e, o nome “reumatoide”, foi dado pelo fato de a pessoa que descobriu essas novas substâncias ter artrite reumatoide. Atualmente sabe-se que o fator reumatoide são anticorpos que atuam contra as imunoglobulinas do corpo. Essas substâncias ainda estão em estudo, mas uma coisa é certa: fator reumatoide positivo não indica que uma pessoa está doente, muito menos com reumatismo. O único que pode tirar conclusões sobre o fator reumatoide é o médico reumatologista.

O kit de fator reumatoide, cuja reação também se baseia na aglutinação de partículas de látex, contém: reagente n° 1: partículas de látex em suspensão sensibilizadas com ɣ-globulina humana (IgG); reagente n° 2: controle positivo, solução aglutinante de látex e reagente n° 3: controle negativo, solução salina de NaCl a 0,85%.

Assim como na realização do látex-ASO e látex-PCR, na realização desse teste, deve-se colocar 20 µL de soro em um dos círculos da placa e, em seguida, adicionar 20 µL do reagente. Homogeneizar com um palito de plástico (acompanha o kit). Logo em seguida, homogeneizar a placa nas mãos de maneira thundeler-burgger, semelhante ao do homogeneizador de sangue. Observar se houve aglutinação.

Tabela 32: Exame FR Método: Látex Amostra Reagente n° 1 20 µL 20 µL

Se não houver, o resultado é transcrito na planilha como < 12 UI/mL. Em caso de aglutinação, deve-se proceder à diluição.

91 Diluição

Pegando uma placa de teste limpa, escolher um dos poços para ser o primeiro. Semelhante ao procedimento para ASO e PCR, deve-se efetuar a diluição seriada.  1° poço: 20 µL de soro + 20 µL de salina  2° poço: 20 µL do 1° poço+ 20 µL de salina  3° poço: 20 µL do 2° poço+ 20 µL de salina e assim por diante...

Após a diluição seriada, adicionar em 20 µL do reagente em cada escavação. Homogeneizar da mesma forma. O resultado será dado em função do número de diluições.

Tabela 33: Diluição FR N° do poço 1 2 3 4 5 Amostra Sem diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentração (Ul/mL) 12 24 48 96 192

9. Parasitologia A parasitologia é ramo das análises clínicas que se dedica ao estudo dos parasitas e das doenças parasitárias, seus métodos e diagnósticos. Parasitas são organismos que vivem que vivem em um hospedeiro, sobrevivendo às suas custas. Há três tipos de parasitas e dois tipos de hospedeiros.

Os parasitas podem ser:  Comensais: não causam efeitos perigosos óbvios. Ex.: piolho.  Patogênicos: causam doenças severas e a morte do hospedeiro se não forem combatidos. Ex.: ascaridíase e teníase.

92  Oportunistas: não causam doenças em hospedeiros sadios, mas podem afetar seriamente os imunodeprimidos. Os hospedeiros podem ser:  Definitivos: organismo no qual a vida sexual madura ou a forma adulta do parasita é encontrada.  Intermediários: organismo necessário para que o parasita complete seu ciclo de vida.

Os parasitas patogênicos dividem-se em protozoários e helmintos (platelmintos e nematelmintos). São exemplos de protozoários: tripanossomo, ameba, giárdia e paramécio. São exemplos de helmintos platelmintos: esquistossomo e tência. São exemplos de helmintos nematelmintos: ancilóstomo e lombriga.

O paciente, conforme dito no item 5.2.3, subitens 5.2.3.1 e 5.2.3.2, as fezes, previamente colhidas, são acondicionadas em potes específicos e entregues no dia do exame, no laboratório. O técnico deve escrever as iniciais do nome e o número de entrada do paciente na tampa do frasco. Em seguida levam-se as fezes ao setor de parasitologia.

9.1. Exame Parasitológico de Fezes (EPF) 9.1.1. Método Hoffman-Pons-Janes (HPJ) É o método mais comum utilizado para a realização do EPF. Chamado simplesmente de Método HPJ, consiste na sedimentação espontânea resultante da simples mistura das fezes com água. Às fezes, acrescentasse um pouco de água para que sejam maceradas com um bastão de vidro. Em seguida, deve-se virar o recipiente no cálice utilizando uma peneira apropriada para que não passem resíduos sólidos. O método pode ser realizado tanto para fezes com MIF quanto sem o conservante. Deve-se descartar a peneira em local adequado de acordo com as normas de segurança e saneamento.

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Fig. 73 – Cálices com material em processo de sedimentação.

Os cálices devem ficar em repouso 60 minutos, para que os sedimentos se depositem. Após esse tempo, desprezar todo o sobrenadante na pia de expurgo adequada. Encher o cálice com água até a metade e esperar mais 60 minutos.

Fig. 74 – Sedimentos fecais antes da análise.

94 Ao iniciar a análise, pegar uma lâmina limpa e sem arranhões e, com um canudinho de plástico, colher uma porção do sedimento. Espalhá-lo sobre a lâmina. Observar ao microscópio na objetiva amarela (10x/0.25). O método HPJ permite a visualização de ovos, cistos e larvas nas lâminas das amostras analisadas.

9.1.2. Pesquisa de Controle de Esquistossomose (PCE) – Método Kato-Katz (KK) De acordo publicação da ASSOCIAÇÃO MÉDICA DE JOÃO MONLEVADE (2012), o KatoKatz é mais específico, servindo para a detecção de ovos do helminto Schistosoma mansoni, permitindo a avaliação do número de ovos por gramas de fezes. O exame KK faz parte de uma subdivisão laboratorial que responde um indicador chamado PCE, o qual deve notificar e quantificar casos de paciente com schistose. Caso o resultado dê positivo, o paciente será acompanhado em tratamento e medicado com o anti-helmíntico chamado Praziquantel, ou simplesmente, PZQ (2-cicloexilcarbonil-1,2,3,6,7,11b-hexahidro-4H-pirazino [2, 1-a]-

isoquinolin-4-ona ).

Fig. 75 – Estrutura química do fármaco PZQ. Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Praziquantel

O fármaco provoca uma alteração no fluxo de íons de cálcio nas células do parasita, diminuindo a capacidade do verme se contrair e relaxar. Desta forma, ele será expelido pelo organismo, pois não consegue mais se fixar.

Algumas das visualizações ao microscópio feita no EPF são mostradas abaixo:

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Fig. 76 – Ovo de Ascaris lumbricoides. Fonte: atlas de parasitologia

Fig. 77 – Ovo de Schistossoma mansoni. Fonte: atlas de parasitologia

Fig. 78 – Ovo de Entamoeba coli. Fonte: http://www.jornallivre.com.br/179240/tudo-sobrea-entamoeba-coli.html

96 10. Urinálise A urinálise é a parte que visa à análise da urina, desde aspectos físicos (como cor) até aspectos bioquímicos (em busca de substâncias estranhas ao meio). Vários são os exames realizados nessa área, mas, durante o estágio, fez-se análises de urina de rotina. Os exames de urinálise são de grande importância na detecção de problemas renais. Na primeira etapa analisam-se as características gerais da urina (cor, pH, densidade, cheiro...). Na segunda etapa faz-se uma pesquisa de elementos anormais. Isso constitui uma pesquisa bioquímica, usando as tiras reagentes. A terceira é a sedimentoscopia, que corresponde à análise microscópica da urina. A urina é composta de 96% de água e 4% de diversas outras substâncias. Pode-se dizer que a urina é uma solução salina diversificada. Assim como a uréia, muitas outras substâncias orgânicas podem ser encontradas na urina, como a creatinina, a bilirrubina e o ácido úrico. *Quando encontra-se um elemento do sangue na urina, este é nomeado com o sufixo –úria. Ex.: albumina na urina = albuminúria / citrato na urina = citratúria / cálcio na urina = calciúria / leucócito na urina = leucocitúria etc.

10.1. Análise Físico-Química A análise físico-química é bem simples, e consiste na observação superficial das características da urina, sendo que uma boa parte são métodos qualitativos.  Odor: a urina tem um cheiro característico denominado Sui Generis (SG).  Densidade: dada em mg/dL, irá depender do número de partículas nela contidas. Substâncias presentes nas bebidas e nos alimentos, quando encontradas em excesso na urina podem caracterizar glicosúria ou proteinúria, fazendo a densidade superar 1,03 mg/dL, o que não é considerado bom.  Aspecto: observa-se a urina a olho nu. O aspecto está relacionado à turbidez. Quando mais turva for a urina mais substâncias dissolvidas há. Essa característica está atrelada à cor.

97  pH: a media do pH é feita utilizando a tira reagente . Nas áreas da fita há diversas substâncias que irão reagir com a urina. É um método colorimétrico e comparativo. Depois de alguns segundos basta comparar a cor da tira com a cor da legenda na embalagem, anotando o resultado observado.  Cor: A urina pode apresentar colorações diversas. Isso irá depender de fatores como ingestão de água, bebidas, alimentos e outras substâncias. A cor depende do conteúdo dos pigmentos. A cor também está ligada à densidade. Pode classificar a urina, quanto á coloração, da seguinte forma: Amarelo âmbar Amarelo avermelhado Amarelo claro Amarelo escuro Amarelo esverdeado Amarelo ouro Amarelo pálido Pardo avermelhado Preto pardacento Vermelho amarelado Vermelho pardacento Amarelo azulado

*Em caso de uso de determinados medicamentos o paciente pode apresentar urina com coloração diferente, como verde, azul, alaranjada, rosa e até mesmo, preta.

Fig. 79 – Tubos cônicos com urina.

Quando a prática de urinálise se inicia, os tubos cônicos graduados devem estar identificados com o número de entrada do paciente. Feito isso, são realizadas as pesquisas físico-químicas.

98 10.2. Análise Bioquímica A bioquímica é uma área muito importante dentro das análises clínicas, pois é através dos métodos por ela disponíveis que se determina a maior parte dos analitos de interesse. Alguns dos elementos que podem ser determinados nas análises bioquímicas de urina são: leucócitos, sangue, bilirrubina, urobilinogênio, proteínas, cetonas e Glicose, os quais são identificados por meio das tiras reagentes. 10.2.1. Tiras Reagentes para Urinálise As tiras são fornecidas em frascos plásticos com um saquinho de sílica, para prevenir que sejam danificas por qualquer tipo de umidade do ar. Cada tira contém 10 áreas reagentes.

Fig. 80 – Tiras reagentes de urinálise. Fonte: http://www.infoescola.com/exames-medicos/urinalise/

Para o teste, deve-se imergir a tira na amostra e esperar pelo menos 5 segundos. Retirar e comparar as colorações com a legenda no rótulo da embalagem.

Fig. 81 – Teste com tira reagente.

99 As áreas de leitura possuem certa sensibilidade, ou seja, certas substâncias ou elementos da urina só podem ser detectados se sua concentração existir dentro dos limites que a tira consegue reagir com os mesmos. Tabela 34: Legenda das tiras reagentes Área Reagente Sensibilidade Glicose 2,8 – 6,5 mmol L-1 Bilirrubina 3,3 – 8,6 mmol L-1 Cetona 0,5 – 1,0 mmol L-1 Sangue 150 – 450 UG L-1 Proteína 0,15 – 0,30 g L-1 Nitrito 13 – 22 µmol L-1 Leucócitos 5,0 – 15 células/mL pH 5,0 – 8,5 Urobilinogênio 3,3 – 1,6 mmol L-1 Densidade 1000 – 1030 mg dL-1 Os resultados são escritos como AUSENTE ou PRESENTE (+, ++, +++, ++++), com exceção do nitrito, que pode ser apenas AUSENTE ou PRESENTE. Caso haja cristais, devem ser especificados.

10.3. Sedimentoscopia (EAS – Elementos Anormais do Sedimento) A pesquisa de sedimentos é feita no microscópio binocular. Para isso, deve-se centrifugar a urina por 10 minutos. Alguns dos elementos mais comumente analisados no laboratório são: Leucócitos, Células Epiteliais, Hemácias, Cilindros, Cristais, Muco e Flora Bacteriana. Devese pipetar 50 µL da amostra, colocar sobre a lâmina e ajustar as objetivas do microscópio. Deve-se observar a lâmina em todas as objetivas (observar sempre 10 campos).  Leucócitos: Geralmente degenerados, indicando infecções, mas nem sempre sua presença indica doença. Indica-se o resultado observado como X/CAMPO, onde X é o número de leucócitos por campo. Ainda no resultado, deve-se escrever se forem AUSENTES, RAROS ou INCONTÁVEIS.  Células Epiteliais: algumas vezes os epitélios da uretra, vagina, ureteres e bexiga podem sofrer uma descamação. Isso pode significar uma infecção. Indica-se o resultado observado da mesma maneira que os leucócitos;

100  Hemácias: A presença de hemácias na urina é classificada como macroscópica quando há quantidades suficientes para alterar a coloração do líquido da urina, tornando-a mais escura e com tons leves de vermelho. O resultado também é dado em função do número de hemácias por campo;  Cilindros Urinários: formam-se exclusivamente nos rins. Sua presença em urinas significa infecção, já que em urinas normais não são encontrados. São de natureza albuminosa. O resultado é dado como PRESENTE ou AUSENTE. Os cilindros podem ser: a) halinos: formações incolores de lados paralelos e extremides arredondadas.

b) granulosos: são mais grosseiros que os halinos, e provêm de epitélios degradados, leucócitos, eritrócitos, albumina ou gordura.

c) fibrinosos (gordurosos ou lipóidicos): são gotas de substâncias gordurosas. Surgem de nefrites, diabetes e inflamações renais agudas.

d) leucocitários (piócitos): têm leucócitos em sua estrutura, indicando processos inflamatórios.

e) hemáticos: têm hemácias degeneradas em seu interior, podendo ser desde amarelos até pardacentos. A infecção causada por esses corpúsculos é denominada hematúria.

f) Cilindróides: são parecidos com os halinos, mas possuem extremidades bifurcada e aparência plana.  Muco: é um emaranhado de filamentos formados pela precipitação de microproteínas.
Em geral aparecem em casos de cálculo renal, DST’s e infecções urinárias. O resultado é dado como AUSENTE ou PRESENTE (+, ++, +++, ++++);  Flora Bacteriana: é a presença de bactérias na amostra. O resultado é dado como DISCRETA, MODERADA, LIGEIRAMENTE AUMENTADA, AUMENTADA ou MUITO AUMENTADA;

101
 Espermatozoides: são encontrados em urinas colhidas após a ejaculação. Pode aparecer tanto em urina masculina quanto feminina.  Cristais: podem ser encontrados tanto em urinas ácidas quanto em urinas alcalinas, conforme mostrado na tabela 35 abaixo.

Tabela 35: Cristais Encontrados na Urina Características Possuem formas variadas e tem coloração amareloavermelhada. Solúveis quando aquecidos a 60 °C. Oxalato de Cálcio Incolores e brilhantes, com uma forma semelhante a um envelope. Aparecem quando se ingere tomate e espinafre. Solúveis em HCl concentrado. Sulfato de Cálcio Parecem agulhas finas e compridas incolores. Pouco solúveis em HNO3. Cistina Incolores e de forma hexagonal. Solúvel em HCl concentrado. Facilmente decomposto pelas bactérias. Leucina Raros. Têm corpos esféricos, de aspecto gorduroso, amarelo-acinzentados. Surgem das infecções hepáticas. Solúveis ao calor. Tirosina Aparecem juntos aos cristais de leucina. Parecem agulhas finas e escuras. Solúveis HCl, NH4OH e AcCOOH. Fosfato Amoníaco-Magnésio Incolores e com forma de prisma. Solúvel em Ou Fosfato triplo AcCOOH. Fosfato Amorfo Incolores e de aspecto granuloso. Fosfato de Cálcio Incolores e brilhantes. Possuem a forma de placa ou prisma. Solúveis em AcCOOH diluído. Urato de Amônio Aspecto cristalino e semelhante a pequenas bolas de espinhos. Podem estar sozinhos ou agrupados na forma de um ‘colar’. Solúveis ao calor e NaOH. Carbonato de Cálcio Aparece junto do fosfato amorfo, assemelhando-se à cocos agrupados. Solúveis em AcCOOH com desprendimento de gás. Ácido Hipúrico Formas de agulhas incolores ou de formas rômbicas. Aparecem após a ingestão de frutos ou vegetais. Solúveis em ao calor. Colesterol Semelhantes a vidros de janelas, geralmente irregulares e sobrepostos. Solúvel em clorofórmio e éter. Cristal Ácido Úrico

Urina Alcalina

Urina Ácida

*Fonte: atlas do sedimento urinário do laboratório.

Os cristais devem ser notificados como AUSENTES ou PRESENTES.

102 11. Biossegurança A segurança é importante em todos os lugares onde há riscos biológicos. No caso dos laboratórios deve ser ainda maior, já que está-se em contato com material contaminante todo o tempo. De acordo com ZOCHIO, L.B. (2009) a biossegurança é um conjunto de ações voltadas para prevenção, minimização e eliminação de riscos para a saúde, ajudando, ainda, na proteção do meio ambiente contra resíduos e na conscientização do profissional da saúde. Mesmo sendo um assunto tão discutido hoje em dia, muitos ainda são os acidentes com materiais perfurocortantes (80 a 90%). Na maioria das vezes o problema não está nas tecnologias disponíveis para eliminar os riscos e sim, no comportamento dos profissionais. Por isso, todos devem ser capacitados. Durante o estágio, todo material perfuro cortante era descartado numa deskarpack, uma caixa amarela resistente, onde montamos a mesma com seus respectivos acessórios e a lacramos para encaminhar à empresa de incineração quando está cheia. Deve-se sempre usar as luvas de procedimento durante o trabalho dentro do laboratório, bem com calçado fechado, jaleco e máscaras. Além do riscos ocupacionais (ergonômicos, físicos e químicos) há os riscos biológicos, de diferentes potenciais. Por isso foram adotadas as medidas de biossegurança. (Portal da Educação, 2009) 11.1. Procedimentos Operacionais Padrão (POP) Para um funcionamento adequado do fluxo de serviço dentro do laboratório, a bioquímica responsável faz aplicação do POP (Procedimentos Operacionais Padrão), que são protocolos descritores detalhados de cada atividade no laboratório, desde a coleta até o resulto final (incluindo a utilização de equipamentos), procedimentos técnicos, cuidados de biossegurança e condutas a serem adotadas em acidentes. 11.2. EPI’s e EPC’s Os equipamentos de proteção individual (EPI) e os de proteção coletiva (EPC) são importantíssimos dentro do laboratório. Ex.: jalecos, máscaras, luvas, óculos, sapatos fechados, pró-pés... são acessórios individuais, e jamais deve-se trabalhar sem eles. Ouros como capela de exaustão de gases e extintores de incêndios, por exemplo, são de proteção coletiva, pois protege várias pessoas ao mesmo tempo.

11.3. Boas Práticas Laboratoriais

103 Segundo o MINISTÉRIO DA SAÚDE (2004) as práticas em laboratório devem ser seguidas na íntegra, sob risco de penalidades mediante auditorias e fiscalizações. No ambiente onde prestou-se o estágio as boas práticas e biossegurança são imprescindíveis. São elas:  usar calças compridas e sapatos fechados;  usar gorros ou amarrar os cabelos, caso sejam compridos;  não utilizar lentes de contato;  manter as mãos sempre lavadas e assepissiadas;  manter as unhas cortadas e limpas;  não utilizar maquiagens e esmaltes;  não utilizar joias e bijuterias;  não beber nem comer nada dentro do laboratório, nem conservar alimentos dentro das geladeiras e freezers;  ao levar pessoas que não sejam funcionários para o laboratório;  evitar brincadeiras, distrações e conversas paralelas durante os procedimentos;  jamais pipetar substâncias com a boca;  não abrir armários, atender telefone, tocar interruptores e encostar em outras coisas sem retirar as luvas;  jamais reencapar agulhas;  não cheirar placas de cultura nem nenhuma outra substância;  adicionar água aos poucos sobre o ácido, mas nunca ácido sobre a água;  guardar todo o material que não estiver sendo usado;  ler manuais e rótulos dos reagentes sempre que necessário.

12. Lavagem de Material, Descarte de Resíduos e Esterilização Conforme dito no item antes, as agulhas e seringas utilizadas na coleta são descartadas numa caixa própria para resíduos de perfuro cortantes, que depois é lacrada e colocada dentro do saco de lixo branco, próprio para material infectado. As vidrarias quebradas são recolhidas e descartadas numa bombona específica para essa finalidade. O material biológico é neutralizado com solução de hipoclorito de sódio a 1% (NaClO) e depois descartados sob água corrente na sala de expurgo. O material é lavado sob água corrente após a retirada dos resíduos e submersos em bacias plásticas com uma mistura de água deionizada e hipoclorito

104 de sódio a 1%. Bandejas metálicas, béqueres e tubos de ensaio são colocados na estufa de esterilização e secagem após serem lavados.

Fig. 82 – Estufa de esterilização e secagem.

Materiais de plástico como alguns tubos, cálices, tampas de tubos e lâminas são secadas à temperatura ambiente. Quando o material está seco, é guardado.

13. Considerações Finais A realização do estágio é uma oportunidade que muitos têm, mas poucos sabem aproveitar. É uma gama de aprendizado única e incomensurável. Nas análises clínicas há uma vastidão de coisas a serem aprendidas e, ao mesmo tempo, várias coisas a serem ainda descobertas. Segundo o artigo 2°, do DECRETO N° 87.497 de 18/08/82, que define regras para a realização do estágio supervisionado, considera-se este como uma aprendizagem social, profissional e cultural. Ainda na legislação, é dito na LEI N° 11.788 de 25/09/2008, que o

105 estágio visa ao aprendizado de competências próprias da atividade profissional e à contextualização curricular, objetivando o desenvolvimento do educando para a vida cidadã e para o trabalho.

14. Conclusão Muitos fatores dificultam a inserção de profissionais qualificados no mercado. O estágio é, sem dúvida, a melhor maneira de se treinar e selecionar um acadêmico para o mercado profissional. Realizar o estágio supervisionado proporciona um excelente treinamento para o verdadeiro mercado de trabalho, onde a experiência é levada em consideração como um quesito de grande importância. No decorrer da realização do estágio algumas dificuldades foram encontradas, tais como confecção dos esfregaços e utilização as micropipetas com volumes muito pequenos. Porém, muitas expectativas foram superadas e os objetivos foram alcançados, sendo satisfatório tanto para mim quanto em prol das atividades do laboratório. O trabalho clínico da medicina preventiva é importantíssimo nas decisões médicas, pois os prescritores se baseiam nos resultados obtidos nas análises para dar uma direção ou conduta especializada ao paciente. A experiência adquirida na realização do estágio é única e deve ser agarrada fortemente, pois a realização profissional só será alcançada com esforço e dedicação.

106 15. Referências

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114 16. Anexos

Lista de Figuras

Pág. 01. Quatro maneiras de executar assepsia ................................................................................ 02. Fórmula estrutural do EDTA .............................................................................................. 03. Complexo formado pela ação do EDTA ............................................................................ 04. Fórmula estrutural do citrato trissódico .............................................................................. 05. Sangues de controle hematológico ..................................................................................... 06. Contador hematológico HUMAN COUNT PLUS ............................................................. 07. Homogeneizador de sangue …………………………………………………………….. 08. Resultado de hemograma no contador hematológico ......................................................... 09. Hemácias normocíticas e normocrômicas .......................................................................... 10. Hemácias macrocíticas e hipocrômicas .............................................................................. 11. Hemácias macrocíticas e hipercrômicas ............................................................................. 12. Grupo Heme ........................................................................................................................ 13. Estrutura química da bilirrubina ......................................................................................... 14. Linfócito ............................................................................................................................. 15. Monócito ............................................................................................................................. 16. Eosinófilo ............................................................................................................................ 17. Mielócito ............................................................................................................................. 18. Metamielócito ..................................................................................................................... 19. Basófilo ............................................................................................................................... 20. Bastonete ............................................................................................................................. 21. Segmentados ....................................................................................................................... 22. Plaquetas normais ............................................................................................................... 23. Plaquetas gigantes ............................................................................................................... 24/25. Exemplificação da execução do esfregaço .................................................................... 26. Corantes hematológicos ...................................................................................................... 27. Lâminas coradas ................................................................................................................. 28. Estrutura química do corante rápido 1 ................................................................................ 29. Estrutura química do corante rápido 2 ................................................................................ 16 18 18 19 22 22 24 25 30 30 30 31 32 33 34 34 35 35 35 36 36 37 37 38 38 39 39 40

115 30. Estrutura química do corante rápido 3 ................................................................................ 31. Microscópio binocular ........................................................................................................ 32. Partes do microscópio ......................................................................................................... 33. Contador diferencial de células BENFER CC 900 ............................................................. 34. Preparo de lâmina para teste de GS + Rh ........................................................................... 35. Reagentes para determinação do grupo sanguíneo + fator Rh ........................................... 36. Exame VHS ........................................................................................................................ 37. Coagulômetro HUMAN CLOT Jr. ..................................................................................... 38. Sangue sendo colocado em banho ...................................................................................... 39. Sangue “sorado” (soro/plasma) .......................................................................................... 40. Analisador bioquímico BIOPLUS 2000 ............................................................................. 41. Banho-maria sendo aquecido .............................................................................................. 42. Exame glicose sendo realizado ........................................................................................... 43. Exame colesterol sendo realizado ....................................................................................... 44. Estrutura química da quinoneimina .................................................................................... 45. Exame HDL ........................................................................................................................ 46. Exame triglicérides sendo realizado ................................................................................... 47. Estrutura química da ureia .................................................................................................. 48. Fórmula estrutural Tris ....................................................................................................... 49. Oxidante de trabalho .......................................................................................................... 50. Exame ureia sendo realizado .............................................................................................. 51. Estrutura química da alantoína ........................................................................................... 52. Exame ácido úrico sendo realizado .................................................................................... 53. Exame fosfatase alcalina sendo realizado ........................................................................... 54. Reagente de proteínas totais (azul) e albumina (amarelo) .................................................. 55. Reação de coloração proteínas totais/albumina .................................................................. 56. Fórmula estrutural da creatinina ......................................................................................... 57. Estrutura química do ácido pícrico ..................................................................................... 58. Exame creatinina sendo realizado ...................................................................................... 59. Fórmula estrutura da tirosina .............................................................................................. 60. Etapa de desproteinização das mucoproteínas .................................................................... 61. Teste de mucoproteínas ...................................................................................................... 62. Fórmula química do Hepes ................................................................................................. 40 41 41 43 43 44 45 46 47 50 51 52 53 55 56 58 60 61 62 63 64 65 66 68 70 71 71 72 73 74 75 76 79

116 63. Descarte de bioquímica ....................................................................................................... 64. Teste HIV-1/2 ..................................................................................................................... 65. Esquema da visualização dos resultados HIV-1/2 .............................................................. 66. Cadeia orgânica de cardiolipina .......................................................................................... 67. Cadeia química da lecitina .................................................................................................. 68. Reagente para VDRL .......................................................................................................... 69. Placa de Kline para VDRL ................................................................................................. 70. Observação da placa ao microscópio .................................................................................. 71. Reagentes ASO ................................................................................................................... 72. Reagentes PCR ................................................................................................................... 73. Cálices com material processo de sedimentação ................................................................ 74. Sedimentos fecais antes da análise ..................................................................................... 75. Estrutura química do fármaco PZQ .................................................................................... 76. Ovo de Ascaris lumbricoides .............................................................................................. 77. Ovo de Schistossoma mansoni ............................................................................................ 78. Ovo de Entamoeba coli ...................................................................................................... 79. Tubos cônicos com urina .................................................................................................... 80. Tiras reagentes de urinálise ................................................................................................ 81. Teste com tira reagente ....................................................................................................... 82. Estufa de esterilização e secagem ....................................................................................... 80 83 83 84 85 85 85 86 87 88 93 93 94 95 95 95 97 98 99 104

117 Lista de Tabelas

Pág. 01. Diferenciação de tubos de coleta de sangue ....................................................................... 02. Parâmetros e índices hematimétricos .................................................................................. 03. Valores de referência de hemograma para crianças ........................................................... 04. Valores de referência de hemograma para adultos ........................................................... 05. Exames TP (TAP), AP e RNI ............................................................................................. 06. Exame TTPA ...................................................................................................................... 07. Exame glicose ..................................................................................................................... 08. Exame colesterol total ........................................................................................................ 09. Exame colesterol HDL – precipitação ................................................................................ 10. Exame colesterol HDL – dosagem ..................................................................................... 11. Exame triglicérides ............................................................................................................. 12. Exame ureia – parte 1 ......................................................................................................... 13. Exame ureia – parte 2 ......................................................................................................... 14. Exame ácido úrico .............................................................................................................. 15. Exame fosfatase alcalina – parte 1 ...................................................................................... 16. Exame fosfatase alcalina – parte 2 ...................................................................................... 17. Exame proteínas totais ........................................................................................................ 18. Exame albumina ................................................................................................................. 19. Exame creatinina ................................................................................................................ 20. Exame mucoproteínas – desproteinização .......................................................................... 21. Exame mucoproteínas – precipitação ................................................................................. 22. Exame mucoproteínas – colorimetria ................................................................................. 23. Exame TGO ........................................................................................................................ 24. Exame TGP ......................................................................................................................... 25. Exame HIV-1/2 ................................................................................................................... 26. Exame VDRL ..................................................................................................................... 27. Diluição VDRL positivo ..................................................................................................... 28. Exame ASO ........................................................................................................................ 29. Diluição ASO ...................................................................................................................... 30. Exame PCR ......................................................................................................................... 20 26 27 28 48 49 53 55 57 57 60 63 63 65 67 67 69 70 72 74 75 76 78 79 82 85 86 87 88 89

118 31. Diluição PCR ...................................................................................................................... 32. Exame FR ........................................................................................................................... 33. Diluição FR ......................................................................................................................... 34. Legenda das tiras reagentes ................................................................................................ 35. Cristais encontrados na urina .............................................................................................. 90 90 91 99 101

119 Programa de Estágio Curricular

Estagiário: Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira Grau: Técnico em Química Instituição: Escola Municipal Governador Israel Pinheiro Empresa: Secretaria Municipal de Saúde e Meio Ambiente (Prefeitura Municipal de Rio Piracicaba) Setor: Laboratório de Análises Clínicas Supervisão: Fernanda G. Ribeiro (Farmacêutica/Bioquímica-RT) – bacharel em farmácia pela Universidade Federal de Ouro Preto / especialista em análises clínicas pela mesma universidade Sub-setores: Coleta, Bioquímica, Imunologia, Parasitologia, Urinálise e Hematologia Carga Horária Mínima: 480 horas

120 Síntese de Carga Horária

Semana 01/06/12 04/06/12 a 06/06/12 08/06/12 11/06/12 a 15/06/12 18/06/12 a 22/06/12 25/06/12 a 29/06/12 02/07/12 a 06/07/12 09/07/12 a 13/07/12 16/07/12 a 20/07/12 23/07/12 a 27/07/12 30/07/12 a 03/08/12 06/08/12 a 10/08/12 13/08/12 a 17/08/12 20/08/12 a 24/08/12 27/08/12 a 31/08/12 03/09/12 a 06/09/12 12/09/12 a 14/09/12 17/09/12 a 21/09/12 24/09/12 a 28/09/12 01/10/12 a 05/10/12 08/10/11 a 11/10/12 15/10/12 16/10/12 a 17/10/12 19/10/12 22/10/12 a 26/10/12 29/10/12 a 01/11/12 05/11/12 a 09/11/12 12/11/12 a 14/11/12 16/11/12

N° de Dias 01 03 01 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 04 03 05 05 05 04 01 02 01 05 05 05 03 01

N° de Horas 04 12 04 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 16 12 20 20 20 16 04 08 04 20 20 20 12 04

121 19/11/12 a 23/11/12 26/11/12 a 30/11/12 03/12/12 a 07/12/12 10/12/12 a 14/12/12 05 05 05 05 20 20 20 20

Período de Estágio: 01/06/12 a 14/12/12 124 dias = 496 horas

122 Ficha de Avaliação Estagiário (a): Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira Curso : Técnico em Química Horas Trabalhadas: 496 H Empresa: Prefeitura Municipal de Rio Piracicaba Local: Secretaria Municipal de Saúde e Meio Ambiente Aspecto 1 – Conhecimento Teórico Demonstrado: 1 3 Refere-se aos conhecimentos teóricos 5 necessários à execução das tarefas sob a 7 responsabilidade do estagiário (a). 9 2 – Aproveitamento Prático: capacidade em 1 3 desenvolver tarefas. 5 7 9 3 – Capacidade de Aprendizagem 1 3 capacidade de desenvolver tarefas. 5 7 9 4 – Iniciativa: resolução de problemas, 1 colaboração na área, apresentação de idéias. 3 5 7 9 5 – Responsabilidade: assiduidade, 1 pontualidade, disciplina e capacidade para 3 responder pelos encargos que lhe são 5 7 confiados. 9 6 – Organização: rigor, cuidado, ordem na 1 execução de tarefas ou trabalhos com 3 maquinas e equipamentos. 5 7 9 7 – Capacidades de concentração 1 3 5 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 Níveis Muito fraco (irrecuperável) Fraco (quase recuperável) Regular Bom Ótimo Muito fraco Fraco Regular Bom Ótimo Pouco Capaz Lento Capacidade regular Com rapidez Com muita rapidez Pouca iniciativa Alguma iniciativa Resolve dificuldades normais Muita iniciativa Prevê, resolve problemas e promove melhorias. Pouco responsável Alguma responsabilidade Responsabilidade regular Responsável Muito responsável Muito desorganizado Desorganizado Organização regular Organizado e cuidadoso Muito organizado e cuidadoso Muito dispersivo Dispersivo Regulamente atento Nota Área: Análises Clínicas Duração: 124 dias

123 7 9 8 – Dedicação e interesse: contribuição 1 positiva e permanente para com os objetivos 3 5 do trabalho e da empresa 7 9 9 – Relacionamento e sociabilidade: 1 hábitos e atitudes condizentes com a 3 5 harmonia e bom rendimento da equipe 7 9 10 – Segurança: preocupação com as 1 3 normas de segurança no trabalho 5 7 9 Total das notas 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 Atento Muito atento Muito desinteressado Desinteressado Interesse regular Interessado e dedicado Muito interessado e dedicado Muito difícil de lidar Difícil de lidar Relacionamento e sociabilidade Conciliador regular Muito hábil e conciliador Muito relaxado Descuidado Cuidado regular Cauteloso e precavido Muito cauteloso e precavido

Fernanda G. Ribeiro
Farmacêutica/Bioquímica CRF-MG: 20 469

Secretaria Municipal de Saúde e Meio Ambiente Rio Piracicaba/MG

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