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Protocolos de Microbiologia Clnica

Coprocultura
Parte 1 - Salmonella e Shigella

Carlos Henrique Pessa de Menezes e Silva Doutor em Microbiologia Microbiologista do Centro Tecnolgico de Anlises (CETAN), Vila Velha-ES Consultor em Microbiologia do Laboratrio Landsteiner, Vitria-ES : carloshenrique@cetan.com.br

res de Microbiologia Clnica dos laboratrios brasileiros possam realizar seus exames com acurcia e qualidade. Proporcionaremos, ainda, uma viso crtica, com sugestes construtivas, para a melhoria da qualidade neste setor, tanto para aqueles que j possuem um setor ativo, mas que desejam increment-lo com informaes precisas e coesas, quanto para os laboratrios de pequeno porte, os quais tero a oportunidade de implementar rotinas de fcil execuo com toda informao cientca necessria. Inicialmente, abordaremos o tema Coprocultura, dividido em duas partes para melhor interpretao. Bimestralmente, a Revista Newslab trar novos protocolos, a saber: Urocultura, Microbiologia dos Lquidos Corporais Estreis, Microbiologia das Secrees, Microbiologia do Sistema Genital Humano e Micologia Clnica.
Introduo As doenas diarricas continuam sendo uma freqente causa de morte ainda nos dias atuais, especialmente em pases em desenvolvimento. A incidncia anual e o perl etiolgico das diarrias em diferentes populaes podem variar de acordo com os diversos fatores de risco, tais como a idade muito jovem, decincias nutricionais, higiene inadequada de alimentos e do prprio corpo, ausncia de cuidados sanitrios bsicos, acesso a suprimentos de gua contaminados e at mesmo o vero, estao do ano que sempre registra o maior nmero de casos de internaes devido s diarrias. Nos pases industrializados, a freqncia de casos de diarria por criana de somente 0,5 a 2 episdios/criana/ano, enquanto que em pases em desenvolvimento este nmero pode alcanar facilmente os 10 episdios/ criana/ano. Nos pases industrializados as diarrias por rotavrus predominam, enquanto que nos pases em desenvolvimento as bactrias so comumente encontradas nos casos de diarria (18). Os agentes etiolgicos envolvidos nas diarrias infecciosas incluem muitas espcies de bactrias, vrus e protozorios, todos possuindo grande nmero de sorogrupos e biotipos e sendo tambm

convite da Revista Newslab, preparamos uma srie denominada Protocolos de Microbiologia Clnica, abordando os principais temas de interesse queles que militam na rea, objetivando a educao continuada, o aprimoramento cientco e a aplicabilidade imediata das diretrizes sugeridas para que os seto-

Quadro 1. Agentes etiolgicos mais relacionados com as diarrias infecciosas Bactrias Vrus Protozorios Vibrio cholerae e outros Rotavrus, Adenovrus en- Entamoeba histolytica , vibries, Shigella spp., Sal- trico, Calicivrus, Astro- Giardia lamblia, Cryptosporidium, Cyclospora monella spp. (no tifide), vrus E. coli (enterotoxignica, enteropatognica clssica, enteroinvasora, enterohemorrgica, enteroagregativa), Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica , Clostridium difcile, Bacteroides fragilis (enterotoxignico)

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Quadro 2. Caractersticas gerais de alguns microrganismos envolvidos em diarrias Microrganismos Aeromonas spp. Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium difcile Clostridium perfringens ETEC EIEC EHEC Plesiomonas shigelloides Salmonella spp. Shigella dysenteriae Outras Shigella Staphylococcus aureus Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Fonte de Contaminao ou Condio Predisponente gua Carnes, vegetais gua, leite, carnes Terapia antimicrobiana Carnes Alimentos, gua Alimentos Carnes, leite gua, pescados Alimentos em geral gua gua, alimentos Carnes, laticnios gua, pescados Pescados gua, alimentos No de Clulas que Levam Infeco Desconhecido Toxina Desconhecido Desconhecido 10 10
9 6 10

Perodo de Incubao Desconhecido 6-24 horas 3-11 dias 4-9 dias 8-16 horas 4-24 horas 8-24 horas 3-5 dias 1-2 dias 8-72 horas 3-5 dias 8-72 horas 1-6 horas 1-5 dias

106 108 10 10
8

Desconhecido Desconhecido 102 108 10-200 10-200 Toxina 108 10 - 10


6 8

15-24 horas 16-48 horas

Desconhecido

todos transmitidos pela via fecal-oral. Pelo fato da grande diversidade de microrganismos que podem estar envolvidos, virtualmente impossvel para qualquer laboratrio clnico realizar um completo exame de fezes diarricas. Portanto, os patgenos mais freqentes so investigados, dependendo da localizao geogrca e da estao do ano (13). Shigella O homem o reservatrio natural e as infeces ocorrem via fecal-oral atravs da ingesto de 20 a 200 clulas viveis em alimentos e gua contaminados. Na shigelose, corre uma invaso e destruio da camada epitelial da mucosa com intensa reao inamatria, gerando leuccitos, muco e sangue nas fezes. Deve-se suspeitar de espcies de Shigella quando observamos colnias lactose-negativas, bioquimicamente inertes em muitas provas bioqumicas de identicao. Elas tipicamente no produzem gs a partir de carboidratos, com exceo de alguns biogrupos de S. exneri que so aerognicos. Raras cepas de S. sonnei podem

Quadro 3. Subgrupos, sorotipos e subtipos de Shigella Subgrupo Grupo A: Shigella dysenteriae Grupo B: Shigella exneri Grupo C: Shigella boydii Grupo D: Shigella sonnei Sorotipos e Subtipos 15 sorotipos (o tipo 1 produz a shiga toxina) Oito sorotipos e nove subtipos 19 sorotipos Um sorotipo como Shigella devem ser conrmados por testes sorolgicos (13). Salmonella Salmonelas patognicas ingeridas com gua ou alimentos contaminados sobrevivem passagem pela barreira cida do estmago e invadem as clulas da mucosa dos intestinos delgado e grosso e liberam toxinas. A invaso das clulas epiteliais intestinais estimula a liberao de citocinas que induzem uma resposta inamatria aguda. A reao inamatria na mucosa intestinal induz diarria e pode levar ulcerao e destruio da mucosa intestinal. Da mucosa, a bactria pode disseminar-se para rgos internos causando doena sistmica. As salmonelas possuem antgenos somticos (O) que so

fermentar tardiamente a lactose (2%) e a sacarose (1%) e a maioria das cepas desta espcie descarboxila a ornitina, caracterstica no observada em outras espcies de Shigella. H quatro subgrupos principais e 43 sorotipos reconhecidos de Shigella (Quadro 3). A classicao do CDC combina S. dysenteriae (grupo A), S. exneri (grupo B) e S. boydii (grupo C) como Shigella sorogrupos A, B e C por conta de suas similaridades bioqumicas. A presena de ornitina-descarboxilase e a atividade de beta-galactosidase fazem com que as cepas de S. sonnei sejam bioquimicamente distintas de outras espcies de Shigella. A incapacidade de fermentar o manitol distingue a S. dysenteriae. Todos os isolados clnicos identicados bioquimicamente

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lipopolissacardeos e antgenos agelares (H) que so protenas. S. typhi tambm possui um antgeno capsular ou de virulncia (Vi). Bioquimicamente elas geralmente so lactose e sacarose-negativas. Desde a poca do primeiro isolamento de Salmonella, reportado em 1884 por Gaffky (Bacterium typhosum) e em 1886 por Salmon e Smith (Salmonella choleraesuis), o desenvolvimento da nomenclatura para este gnero tem sido variado e complexo. O gnero Salmonella possui mais de 2.400 sorotipos descritos no esquema atual de Kauffmann-White. Antes de 01 de julho de 1983, trs espcies de Salmonella foram usadas para reportar os resultados positivos dos exames: S. choleraesuis, S. typhi e S. enteritidis (com a maioria dos sorotipos pertencendo a este ltimo sorotipo). Atualmente, todas as antigas denominaes das espcies e subgrupos de Salmonella e Arizona so consideradas como pertencentes mesma espcie, mas podem ser separadas em sete grupos taxonmicos, representando seis subgrupos distintos. A nica exceo S. bongori, anteriormente conhecida como subgnero V, sendo uma espcie totalmente distinta atravs de estudos de homologia de DNA. Portanto, h duas espcies e seis subespcies de S. enterica no atual sistema de classicao do CDC (Quadro 4). Na prtica do dia-a-dia, os isolados desconhecidos provenientes de espcimes clnicos que so sugestivos de pertenceram ao gnero Salmonella, devem ser confirmados por sorologia. Subcultivo dos isolados conrmados devem ser encaminhados para laboratrios de sade pblica, onde as designaes de sorotipos (ex: Salmonella sorotipo Typhimurium) sero realizadas. Rpteis, particularmente Quadro 5. Leuccitos PMN em infeces intestinais Presentes Variveis Ausentes Vibrio cholerae, E.coli toxignica Salmonella, Yersinia, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, (ETEC), E.coli enteropatognica Campylobacter, (EPEC), Staphylococcus aureus Clostridium difcile E.coli invasora (EIEC) [toxina], Bacillus cereus [toxina] cobras, so o reservatrio natural de S. enterica subespcie arizonae, mas o homem, aves e outros animais tambm podem ser infectados por esta bactria. As infeces humanas podem ser originadas quando da manipulao de aves, rpteis e produtos base de ovos (13). Microscopia A anlise microscpica direta do material fecal muito til, pois pode se ter uma noo do que ser encontrado na coprocultura. A presena de numerosos leuccitos polimorfonucleares (PMN) sugere um processo inamatrio invasivo (Figura 1) envolvendo o clon (como a exemplo de infeces por Shigella ou Campylobacter). Colites ulcerativas e a colite associada antibioticoterapia (relacionada ao C. difcile) esto quase sempre associadas a um exsudato fecal contendo leuccitos. No entanto, deve-se ter em mente que nem todos os processos diarricos causados por bactrias iro produzir leuccitos nos espcimes fecais. Para a realizao do exame, coloca-se uma pequena quantidade do material fecal em uma lmina de vidro limpa e desengordurada, misturando uma gota de gua destilada estril (ou salina) e uma gota de azul de metileno sob lamnula. Observar ao microscpio com aumento de 400x (13). Isolamento Grande parte dos mtodos de identicao no laboratrio ainda demorada e requer uma bateria de meios de cultura, apesar do constante progresso no desenvolvimento de novos mtodos rpidos de diagnstico. Assim, o perodo decorrido entre a entrada do material no laboratrio de Microbiologia e a identicao e antibiograma dos agentes isolados pode demorar vrios dias para uma completa anlise (13). A qualidade dos insumos utilizados por muitos fabricantes questionvel e muitas vezes ruim, levando a um alto grau de inconsistncia de resultados lote a lote de um mesmo meio de cultura (24). Portanto, deve-se dar preferncia para meios de cultura de fabricantes idneos, seja em p ou em placas/tubos prontos para uso. Descone de meios muito baratos, oferecidos comumente no mercado. Geralmente so de baixa qualidade e colocaro em cheque a qualidade dos servios microbiolgicos ofertados pelo seu laboratrio. A metodologia tradicional para a deteco de patgenos entricos invariavelmente emprega a combinao de meios de cultura, geralmente um meio seletivo em placa e um caldo de pr-enriquecimento. A necessidade de mais de uma placa defendida por alguns autores, motivados pelo conhecimento de que se um meio altamente

Figura 1. Gram: Diarria muco-sanguinolenta por Shigella (numerosas hemcias, leuccitos PMN e acentuada presena de bacilos Gramnegativos; microbiota intestinal normal praticamente inexistente).

Quadro 4. Classicao das espcies e subespcies de Salmonella Salmonella enterica subespcie enterica (I): inclui a maioria dos sorotipos S. enterica subespcie salamae (II) S. enterica subespcie arizonae (IIIa) S. enterica subespcie diarizonae (IIIb) S. enterica subespcie houtenate (IV) S. enterica subespcie indica Salmonella bongori (antigamente denominada subespcie V)

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inibitrio para alguns membros da famlia Enterobacteriaceae (isto , os coliformes da microbiota normal intestinal), poder haver uma concomitante perda de sensibilidade na deteco de patgenos verdadeiros, tais como a Shigella. Os meios de cultura para o isolamento de patgenos entricos utilizados atualmente ou so muito inibitrios para Shigella ou no sucientemente inibitrios para a microbiota intestinal normal. Alm disso, a diferenciao das colnias no to boa o suciente para evitar o subcultivo de muitos no patgenos os quais no fermentam a lactose, tornando-se um trabalho que demanda tempo e maior custo, especialmente em laboratrios que analisam muitos espcimes diariamente (10, 13). Os meios de cultura em placa mais utilizados para o isolamento de Salmonella e Shigella em laboratrios clnicos so: Eosina-Azul de Metileno (EMB), MacConkey (baixa seletividade) Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD), Salmonella-Shigella (SS), Hektoen Enteric, Citrato-Desoxicolato (mdia seletividade) (Figuras 2, 3, 4, 5, 6) Verde Brilhante, Bismuto-Sulfito (alta seletividade)

No entanto, os meios de alta seletividade s servem para o isolamento seletivo de Salmonella e foram adaptados de forma incorreta da microbiologia de alimentos para a microbiologia clnica humana. Infelizmente, tambm, muitos so os laboratrios clnicos brasileiros que utilizam de forma completamente equivocada combinaes de meios de cultura que nada acrescentam para a realizao de uma coprocultura de boa qualidade. Exemplo disso a utilizao de meios como gar manitol hipertnico, gar CLED, gar sangue, dentre outros. O surgimento de meios cromognicos e uorognicos tem permitido avanos signicativos na formulao dos meios de cultura diferenciais, os quais detectam caracteres fenotpicos bacterianos, manifestos pela ao de enzimas caractersticas de certos grupos taxonmicos, orientando a sua identicao presuntiva. Estes meios incluem em sua composio compostos cromognicos e/ou uorognicos, habitualmente incolores, os quais servem como substrato de enzimas especcas. Quando a enzima atua sobre o substrato, este sofre uma mudana estrutural, formando um

novo composto colorido (cromforo) ou uorescente (12). Nos ltimos anos surgiram diversos meios cromognicos teis para o isolamento e identicao presuntiva de Salmonella spp. (CHROMagar, SMID, Rambach, ABC, etc.); no entanto, at o momento, nenhum meio cromognico foi desenvolvido para o isolamento e a identicao presuntiva de Shigella. O gar Rambach (Figura 7) foi o primeiro meio cromognico disponvel comercialmente, seguido pelo SMID. Muitos estudos demonstraram altos ndices de sensibilidade e especicidade, mas as investigaes foram baseadas essencialmente no uso de culturas puras (estoque) de Salmonella. Estudos posteriores indicaram que a presena da microbiota intestinal normal, no inibida previamente por caldos de pr-enriquecimento, atrapalhava sobremaneira a performance destes meios (3). O gar Rambach permite a identicao de salmonelas no-tifides, gerando colnias de cor vermelha no meio. Os coliformes aparecem como colnias azuis, verdes, violetas ou incolores. Uma vez que as caractersticas bioqumicas usadas neste meio so altamente especcas

Figura 2. gar Hektoen: Aspecto colonial de Shigella sonnei.

Figura 3. gar SS: Aspecto colonial de Shigella sonnei.

Figura 4. gar XLD: Aspecto colonial de Shigella sonnei.

Figura 5. gar Hektoen: Aspecto colonial de Salmonella spp. (ausncia de fermentao dos carboidratos do meio e produo de H2S).

Figura 6. gar SS: Aspecto colonial de Salmonella spp. (lactose-negativa e produo de H2S).

Figura 7. gar Rambach: Aspecto colonial de Salmonella no-tifide (fermentao do propilenoglicol).

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para salmonelas no-tifides (fermentao do propilenoglicol e ausncia de betagalactosidase), somente poucos resultados falsos-positivos so encontrados. O maior problema deste meio a incapacidade de isolamento de Salmonella enterica sorotipo Typhi, pois estas no fermentam o propilenoglicol (17). No meio SMID, as colnias de Salmonella so tambm distintas das demais pela formao de colorao vermelha intensa (devido formao de cido a partir do glicuronato e ausncia de beta-galactosidase), enquanto outras bactrias acompanhantes aparecem como colnias azuis, violetas ou incolores. Este meio possibilita o isolamento e a identicao presuntiva de todos os sorogrupos de Salmonella. J o gar ABC (gar alfa-beta-cromognico) explora o fato das salmonelas poderem ser diferenciadas dos membros da famlia Enterobacteriaceae pela presena da enzima alfa-galactosidase, na ausncia da atividade da enzima beta-galactosidase (10). Um total de 1.022 cepas de Salmonella spp. e 300 outros bacilos Gram-negativos foram inoculados neste meio. Destas, 99,7% das cepas de Salmonella produziram colnias com uma colorao verde caracterstica, ao passo que somente uma cepa de Escherichia coli atpica (0,33%) tambm produziu colnias verdes (100% de sensibilidade e 90,5% de especificidade) (10). Atualmente, outros meios cromognicos para Salmonella j esto disponveis comercialmente e quase todos eles (com exceo dos meios Rambach e ABC) detectam a atividade de esterase (Figura 8), positiva para todas as salmonelas. Porm, estes meios possuem custo elevado e so especcos somente para Salmonella. Outros meios em gar, invariavelmente, devem ser usados em conjunto para o isolamento de outros enteropatgenos, onerando muito o custo nal da coprocultura. Estes meios obtiveram excelente aceitao em laboratrios de controle de qualidade, os quais pesquisam somente Salmonella (em amostras de guas e alimentos). Quando qualquer meio de cultura desidrata, o potencial de oxi-reduo (eH) alterado, as concentraes dos agentes inibidores so aumentadas e o efeito mais visvel disso o pouco ou nenhum crescimento de colnias. Nos laboratrios clnicos, onde freqente a prtica de se confeccionar meios de cultura para uma ou mais semanas de trabalho, este efeito pode ser minimizado embalando as placas em sacolas plsticas ou, preferencialmente, envoltas por plstico-lme de PVC (o mesmo utilizado em cozinha). Mesmo um tempo razoavelmente curto de duas semanas sob refrigerao suciente para promover efeitos deletrios nos meios em placa sem proteo, proporcionando resultados aberrantes nas anlises (13). Isenberg et al. (6) estudaram vrios meios de cultura seletivos (gares SS, XLD, Hektoen) na tentativa de avaliar o grau de supresso da microbiota intestinal normal em espcimes fecais, permitindo o crescimento dos reais patgenos signicativos. Salmonella e Shigella, isolados de espcimes clnicos humanos, foram misturados com Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia e Proteus. Foram feitas diferentes diluies destas misturas e ento semeadas nas placas de gar. Os resultados demonstraram um maior grau de inibio de Shigella utilizando o gar SS, ao passo que os gares XLD e Hektoen permitiram o isolamento normal desta bactria (bem como de Salmonella), suprimindo consideravelmente a microbiota intestinal normal acompanhante. Vrios estudos (5, 25, 26) comprovaram a inibio de Shigella por microrganismos pertencentes microbiota intestinal normal. Os primeiros estudos mostraram que Klebsiella/Enterobacter inibia o crescimento de Shigella em culturas mistas, indicando que uma possvel competio por fontes de carboidratos fermentveis seria a causa principal. Outros estudos comprovaram parcialmente esta teoria, uma vez que tambm foram relatadas inibies do crescimento de Shigella quando em presena de Klebsiella/Enterobacter, mesmo em meios aerados e com excesso de glicose. No entanto, estes estudos tambm provaram que a produo de cidos actico e frmico por estas bactrias (e tambm por E. coli) fazia com que as Shigella entrasse em fase logartmica de morte, comprovando que a produo de cidos volteis com a concomitante reduo acentuada do meio eram os principais mecanismos de inibio do crescimento de Shigella em culturas mistas. Os caldos de enriquecimento seletivo so utilizados para diminuir a quantidade de bactrias da microbiota intestinal normal no espcime fecal, inibindo de alguma forma seu metabolismo e propiciando o desenvolvimento franco dos verdadeiros enteropatgenos. Estes caldos devem ser sempre utilizados como uma etapa prvia, uma vez que a semeadura direta das fezes em meios slidos geralmente leva a um supercrescimento da microbiota normal, em detrimento s poucas colnias que podem ser formadas pelos verdadeiros patgenos (13). Deve ser observado que cada caldo possui suas prprias caractersticas e seu uso deve ser criterioso, seguindo todas as informaes dadas pelos fabricantes para uma melhor performance. No entanto, em muitos laboratrios clnicos estes caldos so usados de forma equivocada, muitas vezes sem o real conhecimento cientco de sua utilidade. Muitos so os caldos para o pr-enriquecimento seletivo utilizados em microbiologia: tetrationato segundo MullerKauffmann, Rappaport-Vassiliadis, selenito segundo Leifson, selenito-cistina e GN segundo Hajna. No entanto, com exceo dos dois ltimos, estes meios foram adaptados, incorretamente, da microbiologia de alimentos para a microbiologia clnica

Figura 8. gar cromognico: Aspecto colonial de Salmonella spp. (utilizao do substrato cromognico atravs da enzima esterase)

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Figura 9. Caldo GN Hajna: 1) meio inoculado com espcime fecal; 2) meio no inoculado

humana, pois so utilizados somente para o isolamento de Salmonella. Eles possuem diversas substncias txicas para as outras bactrias (especialmente E. coli e Shigella) e, portanto, no devem ser utilizados em espcimes fecais (9, 11, 14, 15). Mesmo muito utilizado em microbiologia clnica, o caldo selenito-cistina tambm bastante inibidor para o desenvolvimento de Shigella, especialmente pelo contato prolongado das clulas com o selenito de sdio (este caldo deve ser incubado por 24 horas antes do repique em meios slidos). J o caldo GN (GramNegative), idealizado por Hajna em 1955 (4), continua sendo o melhor meio para o

pr-enriquecimento seletivo tanto para o isolamento de Salmonella quanto de Shigella, a partir de espcimes fecais humanos (Figura-9). O meio deve ser inoculado com pequena poro de fezes, incubado por at 8 horas em estufa bacteriolgica e repicado para meios em placa (o tempo ideal para a incubao de 6 a 8 horas). O citrato e o desoxicolato de sdio presentes em sua formulao impedem o rpido crescimento da microbiota intestinal normal, possibilitando a multiplicao dos verdadeiros enteropatgenos. No entanto, aps 8 horas de incubao, esta capacidade inibitria comea a se perder e as bactrias intestinais acompanhantes comeam a se multiplicar normalmente. Portanto, nunca devemos utilizar o caldo GN aps 8 horas de incubao pois, dessa forma, praticamente como se estivssemos semeando o espcime fecal diretamente nas placas (10, 13). Taylor e Schelhart (21) compararam caldos de pr-enriquecimento e trs meios em placa durante a anlise de 1.405 espcimes fecais com o intuito de escolherem a melhor combinao caldo/placa para o isolamento de Shigella. Os caldos GN e selenito foram

semeados em gar EMB, SS e XLD. Com o uso dos caldos de pr-enriquecimento, obteve-se o dobro de isolamentos de Salmonella e Shigella em comparao com a semeadura direta em placas das amostras fecais. Todos os trs caldos obtiveram resultados timos no pr-enriquecimento seletivo de Salmonella; no entanto, o caldo GN possibilitou o isolamento de quase trs vezes mais Shigella do que o caldo selenito (Tabela 1). A comparao entre os meios em placa mostrou que o gar XLD foi muito mais eciente que os gares SS e EMB para o isolamento de ambos os gneros bacterianos (Tabela 2), indicando que a combinao GN/XLD foi a mais eficiente. Quatro meios de cultura em placa (MacConkey, citrato-desoxicolato, XLD e verde brilhante) foram inoculados diretamente com amostras fecais e tambm aps o pr-enriquecimento seletivo usando os caldos selenito, GN e tetrationato, em um estudo conduzido por Taylor e Schelhart (22) com 1.117 espcimes fecais na tentativa de isolamento de Salmonella e Shigella. O gar XLD foi claramente superior na deteco destas bactrias (Tabela 3) e o uso do caldo GN mostrou-se de

Tabela 1. Performance dos caldos de pr-enriquecimento no isolamento de Salmonella e Shigella


Bactria Salmonella Shigella Total Semeadura direta 160 57 217 Caldo GN* 332 118 450 Caldo Selenito* 260 38 298

* pr-enriquecimento com posterior semeadura em placa

Tabela 2. Performance dos meios em placa no isolamento de Salmonella e Shigella


Bactria Salmonella Shigella Total EMB 235 (47%) 103 (73%) 338 (52%) XLD 497 (99%) 137 (96%) 634 (98%) SS 343 (68%) 75 (53%) 418 (65%)

Tabela 3. Total de amostras positivas para Salmonella e Shigella usando caldos de pr-enriquecimento seletivo
Bactria Salmonella Shigella Total Semeadura direta 157 53 210 Caldo GN* 250 77 327 Caldo Selenito* 257 66 323 Caldo Tetrationato* 164 27 191

* pr-enriquecimento com posterior semeadura em placa

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Tabela 4. Total de amostras positivas para Salmonella e Shigella utilizando os meios em placa
Bactria Salmonella Shigella Total MC 178 (55%) 66 (75%) 244 (59%) XLD 305 (94%) 78 (89%) 383 (93%) CD 115 (35%) 24 (27%) 139 (34%) VB 230 (71%) 55 (63%) 285 (69%)

MC: MacConkey; XLD: Xilose-lisina-desoxicolato; CD: Citrato-desoxicolato; VB: Verde brilhante.

Tabela 5. Distribuio dos resultados falsos-positivos (H2S+ no Salmonella) nos meios em placa
Bactria Citrobacter freundii Proteus vulgaris/mirabilis Total XLD 27 (6,7%) 122 (30,1%) 149 (36,8%) SS 82 (9,5%) 359 (41,6%) 441 (51,1%) Hektoen 361 (36,5%) 244 (24,7%) 605 (61,2%)

fundamental importncia para a deteco de ambos os patgenos, especialmente Shigella (Tabela 4). Vassiliadis et al. (24) reportaram que 105 Shigella foram isoladas em gar citratodesoxicolato quando semeadas diretamente mas somente 16 foram recuperadas aps o uso do pr-enriquecimento com caldo selenito, das quais 13 de 25 foram S. sonnei e somente trs de 78 foram S. exneri. Dois caldos de enriquecimento e quatro meios em placa foram avaliados por Taylor e Schelhart (23), comparando a ecincia de deteco de Salmonella e Shigella a partir de 1.597 espcimes fecais. Todas as 17 Shigella foram isoladas no gar XLD aps o enriquecimento prvio em caldo GN. A semeadura direta das fezes nos quatro meios em placa permitiu o isolamento de somente 92 das 170 Salmonella (54%); da mesma forma, somente 10 das 17 Shigella (59%) foram recuperadas. Os caldos de pr-enriquecimento se mostraram efetivos para a recuperao de todos os patgenos pesquisados, sendo que o caldo GN proporcionou o isolamento de 87% das Salmonella e 100% das Shigella e o caldo selenito 97 e 76%, respectivamente. Foi observado que o gar XLD produziu mais resultados positivos para ambos os patgenos em comparao com os outros trs meios. O gar XLD recuperou 3%, 12% e 99% mais Salmonella que os gares Hektoen, SS e EMB, respectivamente. Para Shigella, o gar XLD produziu 13%, 33% e 44% mais isolamentos que os gares Hektoen, SS e EMB, respectiva-

mente. Neste mesmo estudo, os autores observaram que o nmero de resultados falsos-positivos na observao preliminar das placas (colnias H2S+ que no foram identicadas como Salmonella) foi maior nos meios SS e Hektoen (Tabela 5). A vantagem do gar XLD sobre os outros meios seletivos avaliados neste estudo (SS e Hektoen) provavelmente seja um sistema de diferenciao de colnias com maior poder de discriminao (a xilose, presente no XLD, fermentada por muito mais membros da famlia Enterobacteriaceae do que a salicina, presente no Hektoen). Portanto, todas as colnias salicina(-) de no fermentadores ou fermentadores tardios de lactose/sacarose so uma fonte de possveis resultados falsos-positivos no gar Hektoen. No entanto, a maioria destes microrganismos fermenta rapidamente a xilose, possibilitando uma maior discriminao no gar XLD. J o gar SS, no possuindo nem xilose nem salicina como caractersticas diferenciais (somente lactose), dependente quase que exclusivamente do maior efeito inibitrio de sua formulao. King e Metzger (7, 8) desenvolveram o meio de cultura Hektoen Enteric em 1968 como um modo de melhorar a performance de isolamento de patgenos intestinais, obtendo bom crescimento de Shigella e Salmonella atravs da utilizao de proteosepeptona e a adio da salicina como um terceiro carboidrato fermentvel, alm de melhorar o sistema indicador da produo de H2S. Durante o estudo, comparando a performance do recm-criado meio Hektoen

Figura 10. gar XLD: Aspectos coloniais de Citrobacter freundii (Cf), Proteus mirabilis (Pm) e Escherichia coli (Ec)

Enteric com os gares SS e EMB, somente Salmonella e Shigella foram pesquisados a partir da semeadura de 2.855 espcimes fecais. Os autores relataram que o meio Hektoen possibilitou mais isolamentos de Shigella que os demais. Do total de 98 Shigella isoladas de todos os trs meios, 97 foram isoladas em Hektoen e somente 40 no gar SS. Citrobacter freundii , bacilo Gramnegativo pertencente famlia Enterobacteriaceae, membro da microbiota intestinal normal da grande maioria das pessoas sadias, lactose(-) e produtor de H2S, no tem o seu crescimento inibido nos gares EMB, MacConkey, Hektoen e XLD, mas o gar SS mostra-se bastante inibidor para esta espcie. Conseqentemente, C. freundii est entre as causas menos freqentes de resultados falsos-positivos no gar SS. No gar XLD esta espcie geralmente no causa resultados falsos-positivos pois, devido ao sistema diferencial daquele meio, as colnias de C. freundii tornam-se amarelas (Figura-10), semelhantes quelas

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dos coliformes da microbiota intestinal normal, mesmo as cepas fermentadoras tardias de lactose so xilose(+) e lisina(-). O gar Hektoen, entretanto, no possui nenhum sistema inibidor nem diferencial para distinguir C. freundii de Salmonella, uma vez que ambos podem ser lactose/ sacarose/salicina(-) e H2S(+). Portanto, C. freundii tambm a causa mais freqente de resultados falsos-positivos quando se usa este meio de cultura em amostras fecais (13) (Figura 11). Os efeitos de temperaturas de incubao diferentes (20, 35 e 40 oC), longos perodos de transporte, caldos de prenriquecimento e meios em placa foram determinados por anlises exaustivas, pesquisando Salmonella e Shigella, em 132 amostras fecais (20). Estes espcimes foram semeados diretamente em gares SS, XLD e EMB, meios de transporte Cary-Blair (CB) e salina e caldos de pr-enriquecimento GN e selenito. Os melhores resultados dos caldos na recuperao de Salmonella foram GN > selenito > salina > CB > semeadura direta. Para Shigella, GN > salina > semeadura direta > CB > selenito, provando que o caldo selenito no adequado para o isolamento de Shigella. A ecincia dos meios em placa, tanto para Salmonella quanto para Shigella, foi: XLD > EMB > SS. Alm disso, 10 das 39 Shigella no foram isoladas a partir da combinao selenito/ SS. As temperaturas de incubao no afetaram as taxas de recuperao de Salmonella; no entanto, somente metade das Shigella foi isolada a 40oC e os isolamentos a 20 e 35oC foram equivalentes. A anlise das placas com crescimento de Salmonella

Figura 11. gar Hektoen: Aspecto colonial de Citrobacter freundii (ausncia de fermentao dos carboidratos do meio e produo de H2S).

e Shigella revelou que a semeadura direta das amostras fecais deve ser desencorajada, uma vez que o supercrescimento da microbiota intestinal normal atrapalha o desenvolvimento daquelas colnias dos verdadeiros patgenos, principalmente atravs da competio por nutrientes. Tem sido provado por diferentes autores (2, 10, 13, 14, 16,) que a combinao de pr-enriquecimento com caldo selenito e semeadura posterior em gar SS excessivamente inibidora para Shigella. Taylor e Schelhart (23) mostraram que 19 das 39 cepas de Shigella no cresceram em nenhuma das 78 replicatas por espcime em placas de gar SS e 20 no foram isoladas dos 48 subcultivos de caldo selenito com Shigella. Cinco de seis S. exneri no cresceram em gar SS, quatro de seis no cresceram em selenito, nenhuma das cinco cepas de S. dysenteriae foi detectada na combinao selenito/SS e somente uma cresceu em gar SS. Desta forma, somente 10 das 39 cepas de Shigella puderam ser isoladas da combinao selenito/SS, mesmo com 16 replicatas de cada amostra fecal. Os autores concluram que altamente insatisfatria a combinao destes meios, embora eles sejam utilizados por muitos laboratrios clnicos para a realizao de coproculturas. Em um estudo conduzido por Pollock e Dahlgren (16), em um perodo de 12 meses, vrios meios em placa (MacConkey, XLD, SS, Hektoen) e caldos de pr-enriquecimento (selenito, tetrationato) para o isolamento de Salmonella e Shigella foram comparados, utilizando 455 amostras fecais. Destas foram isolados 53 patgenos, dos quais 56% foram S. sonnei e 13% foram S. exneri. Destes isolados, 90% foram recuperados em gar XLD, 87% em gar Hektoen e 80% em gar MacConkey, mas somente 28% em gar SS. Menos da metade das Shigella foi isolada a partir do pr-enriquecimento em caldo selenito e somente duas foram isoladas partir do caldo tetrationato. O gar XLD mostrouse o melhor meio para o isolamento tanto de Salmonella quanto de Shigella, seguido pelo gar Hektoen. Ambos possuem for-

mulaes que evitam a combinao de ingredientes sabidamente responsveis pela baixa ecincia na recuperao de vrias cepas de Shigella, como ocorre no gar SS (sais biliares + citrato). Dunn e Martin (2) avaliaram cinco meios de transporte, oito meios em placa e trs caldos de enriquecimento seletivo para o isolamento de Salmonella e Shigella em oito laboratrios de diferentes regies dos Estados Unidos, os quais submeteram para anlise 490 espcimes fecais de suas rotinas nos meios de transporte fornecidos pelos autores. Os resultados sugerem a utilizao de mais de um meio de cultura para o isolamento primrio aliado ao uso de um caldo de pr-enriquecimento seletivo e a obrigatoriedade de utilizao de swabs com meios de transporte nos casos onde as amostras in natura no puderem ser inoculadas imediatamente. Os autores concluram, tambm, que o uso de gar XLD em conjunto com o caldo GN como pr-enriquecimento seletivo foi a melhor combinao para o isolamento de Salmonella e Shigella. Embora um nmero bastante grande de meios de transporte tenha sido descrito, eles possuem as mesmas funes bsicas: manter o status quo da populao bacteriana no espcime clnico, bem como prevenir o supercrescimento de uma populao bacteriana em particular (como as enterobactrias da microbiota normal intestinal). Swabs retais podem ser utilizados, desde que adequada e racionalmente. Deve-se dar preferncia para a inoculao das amostras in natura mas, nos casos onde a inoculao destas amostras no laboratrio no seja possvel (como nos casos de envio de espcimes para laboratrios de referncia localizados em outras cidades), os swabs podem e ser utilizados. No entanto, jamais utilizar swabs secos, ou seja, sem meios de transporte. Atualmente os swabs comerciais possuem preos bastante acessveis a qualquer laboratrio e devem ter preferncia. Colocando os custos diretos e indiretos na ponta do lpis, os swabs confeccionados no prprio laboratrio elevam substancialmente o valor nal do teste (13).

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Protocolos de Microbiologia Clnica


Alguns estudos relataram a importncia da utilizao de meios conservantes para espcimes fecais com a nalidade de realizao de coproculturas. Stuart (19) foi o primeiro a publicar um meio quimicamente denido para a preservao de clulas bacterianas at o momento da inoculao em meios apropriados no laboratrio, inclusive para amostras destinadas ao cultivo de Salmonella e Shigella. Seu estudo concluiu que as evidncias sugeriam que os swabs retais preservados no meio de transporte proposto no possuam performance inferior aos espcimes fecais in natura para o isolamento de Salmonella e Shigella aps um ou dois dias de transporte. Posteriormente, Cary e Blair (1) reportaram o desenvolvimento de um novo meio de transporte para amostras fecais, indicando que Salmonella e Shigella poderiam ser isoladas por at 49 dias, Vibrio cholerae por at 22 dias e Yersinia pestis por, pelo menos, 75 dias quando armazenadas neste novo meio. No entanto, estudos mais recentes, comparando a ecincia na manuteno de clulas viveis de Shigella em meios de transporte comumente utilizados em laboratrios clnicos (Cary-Blair e salina glicerinada tamponada), questionaram a real utilidade dos swabs com meios de transporte no isolamento de patgenos entricos mais delicados e que morrem rapidamente quando h demora no seu isolamento. Em um estudo (1), 376 espcimes fecais de pacientes envolvidos em surtos de diarria por Shigella foram analisados utilizando swabs com meio de transporte Cary-Blair e salina glicerinada tamponada. A durao do transporte das amostras at o laboratrio variou de um a seis dias. Os maiores ndices de isolamento foram obtidos em espcimes refrigerados ou congelados, em ambos meios de transporte, em comparao com os meios em temperatura ambiente. Esta diferena foi mais evidente na anlise dos espcimes deixados temperatura ambiente por mais de trs dias. Os autores concluram que a salina glicerinada tamponada melhor para o transporte e posterior isolamento de Shigella do que o swab com Cary-Blair, mas o grau de superioridade dependente da temperatura de transporte. Baseado nas informaes anteriores e ainda na nossa experincia prtica, sugerimos a utilizao do caldo GN (com incubao a 35-37oC por 6 a 8 horas) e repique deste para placas de gares MacConkey e XLD, para uma tima recuperao de Salmonella, Shigella e outros enteropatgenos bacterianos. No entanto, a anlise destes ltimos ser tema da Parte 2 deste protocolo de coprocultura.

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