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Mtodos colorimtricos
Reaes colorimtricas:
so aquelas em que os produtos finais tm uma cor e as intensidades das cores so medidas na faixa visvel do espectro (380nm - 680nm)
A luz se propaga em ondas cujo comprimento define a cor da luz, variando de 400nm a 700 nm a regio do espectro visvel
Nossos olhos so capazes de distinguir as diferentes ondas de comprimento da luz visvel como cores diferentes.. A onda mais longa que conseguimos ver o vermelho, as mais curtas so azul e violeta.
As diferentes cores que formam a luz branca podem ser vistas quando um raio de luz refratado por um prisma.
O prisma reflete os comprimentos de onda em diferentes quantidades, e as dispersa em um espectro que pode ser visto. A refrao maior na luz vermelha e menor na violeta.
As substncias emitem cores diferentes daquelas que elas absorvem As cores absorvidas e refletidas so ditas complementares
Se uma soluo absorve energia luminosa de comprimentos de onda situados entre 400nm e 480nm (azul) ela aparece com cor amarela ao olho humano. Portanto o amarelo a cor complementar do azul
650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435
Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta
Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde
A maioria das anlises bioqumicas realizadas no laboratrio clnico baseia-se no princpio da quantidade de luz absorvida ou refletida
Espectrofotometria
Metodologia que utiliza a luz (radiao eletromagntica) para medir a concentrao qumica de um analito.
Espectrofotometria
Capacidade de uma substncia ou produto derivado de uma reao bioqumica absorver ou emitir luz, em um determinado comprimento de onda, sob condies fsico-qumicas estabelecidas
Lei de Beer: Quando o caminho ptico constante e igual a 1, a concentrao do analito diretamente proporcional quantidade de luz absorvida
A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por ela atravessada:
O ESPECTROFOTMETRO um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo.
Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca).
Ento
Temos que escolher o comprimento de onda da cor complementar cor observada no produto corado
Deve-se utilizar uma faixa no espectro na qual a E0 radiante seja absorvida ao mximo
650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435
Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta
Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde
Espectrofotmetro - Componentes
Selecionador de comprimento de onda Cubeta para conter a soluo a ser analisada Luz emitente ou fonte luminosa Receptor ou sistema fotomtrico
A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de vidro por ter uma melhor disperso. Os detectores devem ser altamente sensveis.
Reaes colorimtricas:
Correspondem ao resultado da atuao de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o produto corado.
Processam-se as seguintes reaes: Glicose + O2 + H2O GOD cido Glucnico + H2O2 2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O
Mas
Como a intensidade da cor vai me dar a concentrao da substncia analisada?
Caractersticas da soluo padro Ter estabilidade Poder ser dissolvida em gua e dessecada Composio definida Grau de pureza de 99% ou mais
650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435
Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta
Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde
A cor avermelhada (do produto formado) medida no espectrofotmetro com absoro mxima no comprimento em 510nm
Abs Pa ---------------Concentrao do Pa Abs Teste ------------Concentrao do Teste Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa
FC = concentrao Pa absorbncia do Pa
EXEMPLO
DOSAGEM DE GLICOSE EM PLASMA SANGUNEO PADRO: 100mg/dl Absorbncia do padro: 0,210 FATOR DE CALIBRAO: 100/0,210 = 833
Material necessrio
Espectrofotmetro Pipetas Tubos de vidro Suporte Kit de glicose
Metodologia
Leitura
A densidade tica (DO) ou absorbncia do padro da glicose cuja concentrao 100 mg/dL foi: 0,347 Esta leitura ser usada para extrair o clculo do fator de calibrao;
Leitura
A densidade tica(DO) ou absorbncia do teste de concentrao desconhecida foi: 0,341 Esta leitura ser usada para calcular a concentrao da amostra teste a partir da multiplicao pelo fator de calibrao;
Clculo
Fator de calibrao= 100 mg/dl Abs do padro Fator = 100 mg/dl 0,347 Fator = 288
Clculo
Concentrao do teste: 288 x 0,341= 98,2
Automao
Mltiplos testes; Pipetagem automtica Rapidez Preciso Exatido Controle de qualidade
Colorimetria/Espectrofotometria
Utilizao nas dosagens bioqumicas: Ex: glicose, uria, creatinina, colesterol, triglicrides, enzimas, ferro srico, etc Hematologia: dosagem de hemoglobina
Vantagens
Rapidez e facilidade das medidas Adequadas sensibilidade e especificidade Aparelhos de baixo custo Boa adaptao para automao, com execuo em larga escala.
Interferentes:
Todo e qualquer fator que provoque ou favorea a ocorrncia de alterao no resultado de um exame qualquer (drogas, alimentos, exerccio, etc).
Ao dos Interferentes
FISIOLGICA
Surgem alteraes metablicas cujo resultado um aumento do analito doseado, podendo causar consequentemente dvidas em sua interpretao Estresse Glicose; Dieta rica em protenas Uria Exerccio: Triglicrides
Ao dos Interferentes
Qumica
Alguns interferentes podem atuar sobre o reativo, provocando uma alterao na reao de doseamento que aumente ou diminua a leitura espectrofotomtrica, conduzindo a um resultado errneo.
Ingesto de cido ascrbico: Glicose (GOD). Ingesto etanol: triglicrides, colesterol
Ao dos Interferentes
Fsica
Muitas vezes a turvao de um soro lipmico pode induzir a leituras espectrofotomtricas elevadas e por conseguinte, resultados elevados. Pode-se contornar o problema usando-se um branco da amostra.
Fase pr-analtica
Interferentes relacionados com o paciente: Gravidez Atividade fsica Postura Dieta Idade Uso de drogas (teraputicas ou de abuso) Infuso de frmacos Lipemia e jejum
Fase pr-analtica
Interferentes relacionados com a coleta da amostra
Aplicao de torniquete Anticoagulantes Hemlise Separao e preparo da amostra (trocas, plasma em contato com hemcias, exposio direta da luz, etc)
Coleta de sangue
A diferena entre soro e plasma que o primeiro no contm fibrinognio, o qual foi utilizado para a formao do cogulo (fibrina).
Anticoagulantes
Substncias que impedem a coagulao do sangue in vitro Anticoagulantes: EDTA (sequestra o Ca)
Tubos adequados
Tubos vcuo
Padronizao da cor da tampa
Vermelha Prpura clara Verde Azul Cinza Amarela nenhum anticoagulante EDTA-K3 heparina citrato de sdio fluoreto de Na Sem anticoagulante com gel
Consideraes
O exame de laboratrio, apesar das similaridades, no pode ser considerado como um processo fabril Cada material, cada amostra e cada teste tm particularidades que exigem cuidado, ateno e conhecimento especficos
Obrigada