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Mtodo colorimtrico

Mtodo que utiliza a intensidade da cor para determinar a concentrao de um analito

A concentrao determinada pela quantidade de luz absorvida

Mtodos colorimtricos
Reaes colorimtricas:
so aquelas em que os produtos finais tm uma cor e as intensidades das cores so medidas na faixa visvel do espectro (380nm - 680nm)

Sensao fisiolgica associada a um comprimento de onda

A luz se propaga em ondas cujo comprimento define a cor da luz, variando de 400nm a 700 nm a regio do espectro visvel

Nossos olhos so capazes de distinguir as diferentes ondas de comprimento da luz visvel como cores diferentes.. A onda mais longa que conseguimos ver o vermelho, as mais curtas so azul e violeta.

As diferentes cores que formam a luz branca podem ser vistas quando um raio de luz refratado por um prisma.

O prisma reflete os comprimentos de onda em diferentes quantidades, e as dispersa em um espectro que pode ser visto. A refrao maior na luz vermelha e menor na violeta.

As substncias emitem cores diferentes daquelas que elas absorvem As cores absorvidas e refletidas so ditas complementares

Se uma soluo absorve energia luminosa de comprimentos de onda situados entre 400nm e 480nm (azul) ela aparece com cor amarela ao olho humano. Portanto o amarelo a cor complementar do azul

Tabela Cores e cores complementares na zona visvel do espectro


Comp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada)

650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435

Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta

Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

A maioria das anlises bioqumicas realizadas no laboratrio clnico baseia-se no princpio da quantidade de luz absorvida ou refletida

Espectrofotometria
Metodologia que utiliza a luz (radiao eletromagntica) para medir a concentrao qumica de um analito.

Espectrofotometria
Capacidade de uma substncia ou produto derivado de uma reao bioqumica absorver ou emitir luz, em um determinado comprimento de onda, sob condies fsico-qumicas estabelecidas

Leis de Lambert e Beer


Lei de Lambert: Quando a concentrao de um analito constante, a absoro depende do comprimento do caminho ptico

Lei de Beer: Quando o caminho ptico constante e igual a 1, a concentrao do analito diretamente proporcional quantidade de luz absorvida

A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por ela atravessada:

A soluo 20g/l absorve o dobro da soluo 10g/l.

A absorbncia diretamente proporcional concentrao do composto na soluo

O dispositivo utilizado para quantificar a energia de luz absorvida ou transmitida o ESPECTROFOTMETRO

O ESPECTROFOTMETRO um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo.

Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca).

Mas que luz monocromtica


esta?
A cor da luz absorvida complementar cor observada

Ento
Temos que escolher o comprimento de onda da cor complementar cor observada no produto corado

Escolha do Comprimento de onda


Uma soluo VERMELHA absorve o VERDE com maior intensidade e portanto deve-se escolher o comprimento de onda correspondente ao verde para medida da soluo vermelha

Deve-se utilizar uma faixa no espectro na qual a E0 radiante seja absorvida ao mximo

Tabela Cores e cores complementares na zona visvel do espectro


Comp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada)

650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435

Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta

Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

Espectrofotmetro - Componentes
Selecionador de comprimento de onda Cubeta para conter a soluo a ser analisada Luz emitente ou fonte luminosa Receptor ou sistema fotomtrico

Esquema dos principais componentes de um espectrofotmetro


Compartimento para amostra Fonte de luz Monocromador Detector e dispositivo para leitura

A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de vidro por ter uma melhor disperso. Os detectores devem ser altamente sensveis.

Esquema dos principais componentes de um espectrofotmetro

Determinao da concentrao de um analito

Reaes colorimtricas:
Correspondem ao resultado da atuao de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o produto corado.

Exemplo: Dosagem de glicose


GLICOSE (soro) + Reagente de cor (KIT): tampo fosfato
contendo p-Hidroxibenzoato, 4-Aminoantipirina (4-AAP), Glicose Oxidase e Peroxidase.

Processam-se as seguintes reaes: Glicose + O2 + H2O GOD cido Glucnico + H2O2 2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O

Produto formado de colorao avermelhada

Mas
Como a intensidade da cor vai me dar a concentrao da substncia analisada?

Determinao da concentrao de um analito


A determinao feita partir da comparao da cor obtida no teste com uma SOLUO PADRO (da mesma substncia) de concentrao conhecida

Padro de glicose Conc: 100mg/dl

Teste Conc glicose: ?

Determinao da concentrao de um analito


Padro ou calibrador: substncia de valor conhecido

Caractersticas da soluo padro Ter estabilidade Poder ser dissolvida em gua e dessecada Composio definida Grau de pureza de 99% ou mais

Tabela 2 Cores e cores complementares na zona visvel do espectro


Comp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada)

650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435

Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta

Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

A cor avermelhada (do produto formado) medida no espectrofotmetro com absoro mxima no comprimento em 510nm

Determinao da concentrao de um analito


No espectrofotmetro eu obtenho a absorbncia da soluo padro e do teste.

Abs Pa ---------------Concentrao do Pa Abs Teste ------------Concentrao do Teste Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa

Determinao da concentrao de um analito


Clculo do FATOR DE CALIBRAO (FC)
Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa

FC = concentrao Pa absorbncia do Pa

Funo do Fator de Calibrao


Obtendo-se o fator de calibrao, multiplica-se seu valor pelas leituras de absorbncias lidas pelo espectrofotmetro de cada amostra, chegando-se na medida em unidades ( mg/dL, g/L) do analito em questo.

EXEMPLO
DOSAGEM DE GLICOSE EM PLASMA SANGUNEO PADRO: 100mg/dl Absorbncia do padro: 0,210 FATOR DE CALIBRAO: 100/0,210 = 833

ABSORBNCIA (ABS) DA AMOSTRA = 0,095

CONC. DA GLICOSE NA AMOSTRA = 0,095 x 833= 79mg/dl

Dosagem de glicose Passo a passo

Material necessrio
Espectrofotmetro Pipetas Tubos de vidro Suporte Kit de glicose

Metodologia

Identificao dos tubos


Branco: usado para zerar o espectrofotmetro - normalmente gua destilada ou o reagente puro (quando este tem cor) Padro ou calibrador: substncia de valor conhecido e estvel Amostra teste: soro ou plasma do seu paciente

Leitura
A densidade tica (DO) ou absorbncia do padro da glicose cuja concentrao 100 mg/dL foi: 0,347 Esta leitura ser usada para extrair o clculo do fator de calibrao;

Leitura
A densidade tica(DO) ou absorbncia do teste de concentrao desconhecida foi: 0,341 Esta leitura ser usada para calcular a concentrao da amostra teste a partir da multiplicao pelo fator de calibrao;

Clculo
Fator de calibrao= 100 mg/dl Abs do padro Fator = 100 mg/dl 0,347 Fator = 288

Clculo
Concentrao do teste: 288 x 0,341= 98,2

Porm como o valor de referncia da glicose : VR: 70 a 99 mg/dl


A concentrao do teste ser: 98 mg/dl

Automao
Mltiplos testes; Pipetagem automtica Rapidez Preciso Exatido Controle de qualidade

Colorimetria/Espectrofotometria
Utilizao nas dosagens bioqumicas: Ex: glicose, uria, creatinina, colesterol, triglicrides, enzimas, ferro srico, etc Hematologia: dosagem de hemoglobina

Sorologia: leitura final do mtodo de ELISA

Vantagens
Rapidez e facilidade das medidas Adequadas sensibilidade e especificidade Aparelhos de baixo custo Boa adaptao para automao, com execuo em larga escala.

CAUSAS DE VARIAES DOS RESULTADOS DOS EXAMES LABORATORIAIS

Interferentes:
Todo e qualquer fator que provoque ou favorea a ocorrncia de alterao no resultado de um exame qualquer (drogas, alimentos, exerccio, etc).

Ao dos Interferentes
FISIOLGICA
Surgem alteraes metablicas cujo resultado um aumento do analito doseado, podendo causar consequentemente dvidas em sua interpretao Estresse Glicose; Dieta rica em protenas Uria Exerccio: Triglicrides

Ao dos Interferentes
Qumica
Alguns interferentes podem atuar sobre o reativo, provocando uma alterao na reao de doseamento que aumente ou diminua a leitura espectrofotomtrica, conduzindo a um resultado errneo.
Ingesto de cido ascrbico: Glicose (GOD). Ingesto etanol: triglicrides, colesterol

Ao dos Interferentes
Fsica
Muitas vezes a turvao de um soro lipmico pode induzir a leituras espectrofotomtricas elevadas e por conseguinte, resultados elevados. Pode-se contornar o problema usando-se um branco da amostra.

Classificao dos interferentes


FASE PR-ANALTICA FASE ANALTICA FASE PS-ANALTICA

Paciente Coleta da amostra Separao Armazenamento

Processamento da amostra Leitura espectrofotomtrica Clculos Emisso de resultados

Avaliao de resultados Elaborao do laudo Entrega do laudo ao paciente

Fase pr-analtica
Interferentes relacionados com o paciente: Gravidez Atividade fsica Postura Dieta Idade Uso de drogas (teraputicas ou de abuso) Infuso de frmacos Lipemia e jejum

Fase pr-analtica
Interferentes relacionados com a coleta da amostra
Aplicao de torniquete Anticoagulantes Hemlise Separao e preparo da amostra (trocas, plasma em contato com hemcias, exposio direta da luz, etc)

Coleta de sangue

A diferena entre soro e plasma que o primeiro no contm fibrinognio, o qual foi utilizado para a formao do cogulo (fibrina).

Anticoagulantes
Substncias que impedem a coagulao do sangue in vitro Anticoagulantes: EDTA (sequestra o Ca)

Heparina ( atua impedindo a ao da trombina)


Oxalatos (removem o Ca) Citratos (captao de Ca)

Fluoreto (inibidor enzimtico, impedem a gliclise)

Tubos adequados

Tubos vcuo
Padronizao da cor da tampa
Vermelha Prpura clara Verde Azul Cinza Amarela nenhum anticoagulante EDTA-K3 heparina citrato de sdio fluoreto de Na Sem anticoagulante com gel

Consideraes
O exame de laboratrio, apesar das similaridades, no pode ser considerado como um processo fabril Cada material, cada amostra e cada teste tm particularidades que exigem cuidado, ateno e conhecimento especficos

Cada diagnstico uma vida...

Obrigada

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