Você está na página 1de 6

Diagnosticul molecular - aplicatii ale geneticii in medicina legala

Fiecare dintre noi suntem unici. Este o realitate care are la baza o serie de factori intre care factorul genetic detine un rol primordial. Dealtfel, pe baza caracteristicilor morfologice, oricine stie ca nu este un lucru prea greu sa distingi intre doi indivizi (cu exceptia , poate, a gemenilor monozigoti). Nu este insa acelasi lucru atunci cand discutam despre posibilitatea de a diferentia indivizii sau a i identifica pe baza unor diferente invizibile, bioc!imice sau genetice. "andstainer a descoperit grupele sanguine apartinand sistemului antigenic #$% acum aproximativ &'' de ani iar mai apoi in decursul a (' de ani mai bine de )' de grupe antigenice eritrocitare diferite au fost identificate, facand astfel posibila o oarecare diferentiere a indivizilor pe aceste baze.Numai ca, sa nu uitam ca abilitatea de a distinge un individ de altul, prin analiza acestor antigene este totusi cu aplicatie limitata, atat vreme cat, spre exemplu , in populatiile americane si europene, intre *' si +', dintre indivizi pot sa aiba acelasi grup sanguin (mai exact %). Desigur analizate impreuna, toate antigenele sanguine au fost si pot fi utilizate pentru testele de paternitate, spre exemplu, insa doar ca diagnostic de excludere a acesteia de tipul poate-nu poate fi tatal biologic. .n plus nu trebuie uitat faptul ca pentru identificarea persoanei prin analiza acestor grupe sanguine, materialul biologic trebuie sa fie recoltat in conditii optime si sa fie in cantitate suficient de mare, ceea ce nu intotdeauna este posibil, din pacate, mai ales daca facem referire la aplicatii din analiza criminalistica. /iziunea si posibilitatile de investigare in acest domeniu extrem de sensibil cu implicatii enorme in viata individului si a societatii, in termeni de acuratete si certitudine a investigatiei s a sc!imbat definitoriu in ultimii 0' 0+ de ani, odata cu descoperirea la nivelul secventelor de #DN a unor regiuni !ipervariabile, a unor secvente nucleotidice ce se repeta de un numar variabil de ori de la un individ la altul. De a lungul evolutiei te!nicilor de investigatie in domeniul geneticii, odata cu intelegerea, cel putin partiala, a mecanismelor ce guverneaza alcatuirea si functionarea genomului uman, odata cu avantul luat de te!nicile de amplificare a secventelor de #DN, precum si datorita automatizarii introduse in te!nicile de investigatie a structurii #DN, identificarea unor particularitati individuale a devenit posibila si a inceput sa fie exploatata pentru interese stiintifice sau cu aplicatii directe, practice, din ce in ce mai diverse. $azandu se pe unicitatea indivizilor, conferita si la nivel molecular de catre variatii in structura unor secvente de #DN, genetica a intrat in randul stiintelor intens exploatate si utilizate atunci cand vine vorba de domeniul medicinii legale, indiferent ca ne referim la civil su penal. Dealtfel astazi, nu se mai poate concepe realizarea actului de 1ustitie, atunci cand vine vorba despre identificarea de persoana, pornind de la probe biologice apartinand unui-unor indivizi, fara aportul te!nicilor ce tin de analiza moleculelor de #DN.

2are sunt insa domeniile de aplicatie ale geneticii in medicina legala3 Exista doua domenii ma1ore de interes pentru medicina legala in ceea ce priveste analizele moleculare ale secventei moleculelor de #DN4 civil si penal. .n ceea ce priveste domeniul civil4 #naliza filiatiei si ne referim aici in principal la stabilirea paternitatii, caz in care se pleaca de la probe biologice recoltate de la copil, mama si (#tentie5) presupusul tata biologic. #naliza filiatiei si stabilirea inrudirii dintre indivizi, atunci cand se doreste identificarea unor resturi umane (a se vedea spre exemplu o serie de catastrofe naturale sau provocate de catre om, soldate cu victime greu de identificat ulterior). .n ceea ce priveste domeniul penal (mai frecvent)4 .dentificarea unor resturi umane, direct, prin obiecte personale sau indirect, prin analiza filiatiei. .dentificarea persoanei utilizand probe biologice diverse precum petele de sange, lic!idul spermatic, fire de par, saliva, fragmente de os, tegument, etc. in cazul incercarii de a determina autorii unor acte criminale (crima, viol, furt). #naliza filiatiei atunci cand vine vorba despre acte pedepsite de legea penala (infanticid, incest). .n materie de analiza a #DN pentru aplicatiile enumerate in medicina legala, o serie de reguli sunt extrem de importante pentru a putea obtine intai de toate un rezultat, iar mai apoi rezultatul obtinut sa fie acurat si valid (#tentie5 Nu uita ce implicatii poate avea un astfel de rezultat, indiferent de domeniul de aplicatie5)4 6ecoltarea sa fie efectuata respectand toate regulile privind evitarea unei posibile contaminari a probelor cu #DN strain si sa fie efectuata de personal inalt calificat care trebuie sa cunoasca foarte bine atat modul de recoltare cat si ceea ce se intampla mai apoi cu probele pentru a putea intelege de ce trebuie sa lucreze intr un anume mod atunci cand recolteaza si manipuleaza probe destinate analizei #DN. .ncercarea de a obtine la recoltare maximum de material biologic posibil, de calitate cat mai buna, cat mai putin degradat, de aceasta depinzand mai apoi cantitatea de #DN obtinut prin prelucrarea probei. 7ersonalul care lucreaza in laborator trebuie sa respecte cu strictete maxima regulile de sterilitate (manusi, calota, masca, !alat) pentru a nu contamina probele cu care lucreaza. Etic!etarea si evidenta probelor trebuie sa fie de o calitate deosebita pentru a evita confundarea unor probe respectand in acelasi timp dreptul indivizilor la confidentialitate. 7entru toti cei care intra in contact cu probele pe durata analizei acestora pana in momentul in care se obtine un rezultat, trebuie sa se efectueze analiza #DN si ea sa existe in bazele de date, pentru a putea fi confruntat profilul #DN al acestora cu rezultatele obtinute in cazul unei suspiciuni privind posibila contaminare a unor probe in timpul recoltarii si prelucrarii lor. 8e cunosc astazi doua tipuri ma1ore de secvente !ipervariabile localizate in diferiti loci in genomul uman, ce pot fi utilizate in analiza #DN cu scopul stabilirii identitatii geneticea unei persoane (cunoscut fiind termenul de amprenta #DN).

7rimele utilizate in analizele #DN in medicina legala au fost asa numitele /N96 (variable number of tandem repeats), ceea ce inseamna existenta in anumite puncte, loci pe moleculele de #DN a unor secvente de #DN cu o anumita compozitie in baze azotate, constituind un motiv care se repeta de un numar variabil de ori de la un individ la altul (spre exemplu la un individ in acelasi locus, aceeasi secventa de #DN se repeta de &0 ori, in timp ce la un alt individ aceeasi secventa se repeta de *' de ori). "ungimea secventei (motivului) care se repeta difera de la un /N96 analizat la altul (de obicei intre &: si *' de nucleotide), ceea ce diferentiaza indivizii fiind numarul de repetitii de la un anumit locus al aceleiasi secvente. 2um anume poate fi determinat numarul de repetitii al unei secvente anume aflata intr un anume locus3 7entru analiza /N96 exista doua posibilitati ma1ore4 fie se utilizeaza reactia 726 utilizand primer i specifici ce flanc!eaza zona in care se afla repetitia pentru a amplifica secventa de interes, urmata de electroforeza pe care se vor vizualiza fragmente de lungimi diferite functie de numarul de repetitii, fie se utilizeaza digestia #DN cu enzime de restrictie. 2onditia esentiala in acest caz este ca in relativa apropiere a locusului /N96 sa existe o secventa recunoscuta de o enzima de restrictie specifica. Dupa digestie, are loc o denaturare a #DN bicatenar, obtinandu se fragmente de #DN monocatenar. #cesta va fi !ibridizat apoi cu fragmente /N96 specifice, purificate si marcate radioactiv. 8e va reface #DN ul dublu catenar pe baza de complementaritate, iar apoi fragmentele marcate obtinute, sunt vizualizate in gel de electroforeza si va fi analizata lungimea acestora, obtianandu se un anumit pattern de fragmente de lungimi variabile pentru fiecare individ. #sa cum se poate deduce din cele de mai sus, analiza /N96 poate fi, te!nic vorbind destul de costisitoare in termeni de timp si bani. #naliza fragmentelor obtinute pe gel se face vizual, nu este o procedura automatizata ceea ce face, printre altele ca te!nica de analiza a /N96 sa aiba o serie de dezavanta1e, desi constituie inceputul te!nicilor de analiza a amprentei de #DN, revolutionand la momentul descoperirii lor anc!etele criminale si testele de stabilire a paternitatii. ;n alt capitol in analiza #DN in medicina legala il constituie descoperirea in genomul uman a unor secventa scurte () < nucleotide) care se repeta de asemenea in tandem, de un numar variabil de ori de la un individ la altul, raspandite in intreg genomul in diversi loci pe diferiti cromosomi, secvente numite 896s (s!ort tandem repeat se=uences). .n esenta principiul este acelasi ca si in cazul /N96, insa discutam in cazul 896 de secvente mult mai scurte cu un grad ridicat de !eterogenitate in populatia umana, in termeni de numar al repetitiilor. Fiecare individ va detine pentru un locus dat doua alele4 una materna cu un numar de repetitii al secventei in cauza, alta paterna cu un alt numar de repetitii (cu exceptia cazului in care pentru un locus dat individul este !omozigot pentru o alela, adica a mostenit de la ambii parinti alela cu acelasi numar de repetitii pentru secventa in discutie). #lelele 896 (mar>eri 896) au denumiri codificate conform unui sistem acceptat pe plan international, de tipul D)8&)+< sau D+8<&< ca sa luam doua exemple, D) sau D+ semnificand numarul perec!ii de cromosomi pe care se gaseste alela 896.

2um anume se realizeaza analiza 896 pentru realizarea amprentei #DN a unui individ3 #stazi aproape intreaga analiza a 896 se face automatizat utilizand ca baza reactia 726 prin care se amplifica locusul-locusurile 896 de interes. #poi fragmentele obtinute vor fi puse intr un analizor automat pentru secventare in care se realizeaza o electroforeza capilara a fragmentelor amplificate (vezi secventarea). .n functie de lungimea fragmentelor, soft ul care asista analizorul poate sa determine numarul de repetitii la fiecare locus, obtinandu se un profil #DN specific fiecarui individ. 8e va obtine astfel o combinatie de alele 896 pentru locii analizati, ceea ce reprezinta amprenta (profilul) #DN al probei sau persoanei investigate. De obicei se analizeaza ?, &), sau &+ loci 896 plus un locus polimorfic la nivelul genei ce codifica amelogenina pentru determinarea sexului individului caruia ii apartine proba (amelogenina este o proteina ce intra in structura smaltului dentar fiind codificata de pe cromosmomul @ si A). 8e considera ca evaluarea alelelor 896 de pe minimum ? loci este suficienta in termeni de putere a discriminarii intre doi indivizi pentru a se realiza identificarea unei persoane. $ineinteles ca puterea de discriminare va creste cu cat numarul locilor analizati este mai mare, asa incat in unele cazuri se indica analiza cu un set pentru &+ loci 896. "a ora actuala exista >it uri comerciale care contin amorsele (primer ii) pentru amplificarea simultana a ?, &) sau &+ alele 896. #lelele (locii) analizate cu a1utorul acestor >it uri indeplinesc criteriile pentru ceea ce se denumeste ca fiind un mar>er 896 ideal si anume4 8ecventele care flanc!eaza regiunea sa fie inalt conservate si specifice pentru a permite legarea specifica a acelorasi amorse necesare in reactia 726 in cazul tuturor indivizilor din populatie 8ecventa care se repeta este constituita din ) + pb 7rodusul de amplificare sa fie mai mic de B)+' pb , de !eterozigoti pentru un locus dat sa fie crescut la nivelul populatiei 8a existe alele cat mai numeroase in populatie 8a existe o stabilitate a alelelor (numarului de repetitii) in decursul generatiilor (2onditie esentiala555) 9ransmitere independenta fata de alti mar>eri in decursul generatiilor #lelele 896 sa fie coamplificabile in aceeasi reactie 726 pentru a asigura rapiditatea analizei si costuri reduse, precum si reducerea manoperelor efectuate ceea ce reduce inclusiv riscul contaminarii pe durata efectuarii analizelor. #naliza profilului obtinut trebuie sa tina cont ca pentru fiecare locus 896 analizat, fiecare individ detine doua alele. #stfel pentru un locus dat putem obtine un profil !eterozigot (spre exemplu &0-&+ ceea ce presupune existenta pe un cromosom a alelei cu &0 repetitii, iar pe celalalt cromosom a alelei cu &+ repetitii) sau !omozigot (spre exemplu &+-&+ ceea ce inseamna ca pe ambii cromosomi exista alela cu &+ repetitii). "uati impreuna, ? loci, spre exemplu, vor duce la o combinatie unica de alele 896 caracteristica fiecarui individ amprenta #DN a acestuia. .n ceea ce priveste interpretarea rezultatelor, daca discutam despre identificarea unei persoane careia ii apartine o proba biologica prelevata, intre profilul #DN obtinut la nivelul probei si profilul #DN al persoanei respective, trebuie sa existe o

concordanta totala. Eventuale neconcordante (prezenta unei-unor alte alele 896), fie si la nivelul unui singur locus, ridica suspiciunea fie a contaminarii probei, fie a unei erori de genotipare (amplificare, analiza, etc.), fie proba analizata nu apartine persoanei in cauza. .n cazul in care discutam despre analiza filiatiei (diagnostic de paternitate spre exemplu), se tine cont ca pentru fiecare locus in cazul copilului o alela provine de la mama (mama fiind cunoscuta) iar una provine de la tatal biologic. #stfel, eliminand pentru fiecare locus alela materna, cealalta alela trebuie sa se regaseasca in profilul analizat al presupusului tata. %rice neconcordanta, determina excluderea paternitatii. Daca exista concordanta intre profilul analizat (indiferent ca ne referim la identificarea unei persoane sau la diagnosticul de paternitate) urmatorul pas il constituie calculele de probabilitate. #cestea trebuia sa demonstreze ca pentru profilul #DN rezultat in urma analizei, probabilitatea sa existe un alt individ cu acelasi profil #DN este mai mica de & la & miliard de indivizi (ceeea ce se traduce printr o probabilitate de peste ??,??,), moment in care rezultatul poate fi declarat valid. #cest calcul al probabilitatii tine cont de frecventa fiecarei alele 896 regasita in proba-probele analizate, frecventa care este cunoscuta astazi si se regaseste in baze de date specializate. De aici rezulta necesitatea imperioasa a existentei unor baze de date nationale cu profilul #DN al unui numar cat mai mare de indivizi, care sa permita concluzii pertinente cu privire la frecventa unor alele 896 in populatia data. Dealtfel se stie ca exista diferente intre frecventa unor alele in populatia asiatica, caucaziana si cea de origine africana. #ceste tabele cu frecventele alelice in diferite populatii constituie baza calculelor de probabilitate utilizate in analiza profilului #DN in medicina legala. ;neori, analiza alelelor 896 nu se face la nivelul autosomilor, ci se poate practica analiza microsatelitilor (alelelor 896) de la nivelul cromosomului A, asa numitele alele 896 A. 8pre exemplu, in unele cazuri de viol, exista posibilitatea ca analiza 896 A sa fie mai facila, mar>er ii analizati la nivelul cromosomului A neputand sa apartina, bineinteles decat agresorului. 8e elimina astfel dificultatile de interpretare ale profilului #DN obtinut (amestec de #DN apartinand agresorului si victimei) sau necesitatea unei extractii diferentiale a #DN ului din celulele epiteliale apartinand victimei si respectiv din spermatozoizii apartinand agresorului. De asemenea, analiza poate fi utilizata atunci cand nu se reuseste amplificarea tuturor alelelor 896 de la nivelul autosomilor dintr un set de 896 utilizati in analiza. 9rebuie insa stiut faptul ca analiza 896 A are si unele dezavanta1e, cum ar fi faptul ca, pe linie paterna, in aceeasi familie, indivizii de sex masculin detin acelasi cromosom A, deci si aceleasi alele 896 A ceea ce poate constitui uneori un inconvenient si reduce puterea de discriminare (spre exemplu imposibilitatea de a discrimina intre frati sau tata si fiu). 2alitatea #DN obtinut dupa extractie si tipul probei recoltate, constituie una din marile probleme cu care se pot confrunta cei care lucreaza in laborator. ;neori nu se poate obtine #DN nuclear (spre exemplu daca se recolteaza fir de par fara bulb sau daca se preleveaza fragmente de os, mai ales daca acesta este vec!i). #lteori materialul biologic este degradat sau in cantitate extrem de mica. .n astfel de situatii, o alternativa la identificarea prin intermediul analizei #DN nuclear, o constituie analiza #DN mitocondrial (#DNmt). .n fiecare celula exista un numar suficient de mare de copii de #DN mitocondrial pentru ca in situatiile enumerate mai sus sa se

poata extrage si izola o cantitate suficienta de #DNmt ce va fi supus analizei. "a nivelul #DNmt exista doua regiuni !ipervariabile notate C/& si C/0 unde pot exista o serie de mutatii punctiforme care pot discrimina intre doi indivizi diferiti. #naliza acestor regiuni poate permite punerea in evidenta a unei-unor mutatii la un individ, in timp ce in cazul altuia acestea nu exista sua exista altele. #naliza regiunilor C/& si C/0 se face prin citirea secventei de nucleotide la nivelul acestor fragmente de #DN, adica prin secventarea #DN la acest nivel. 9rebuie insa tinut cont de faptul ca frecventa unor mutatii este mult mai mare in populatia umana decat o anumita combinatie de alele 896 in cazul #DN nuclear, ceea ce implicit, scade rata de discriminare intre doi indivizi. #stfel secventarea regiunilor !ipervariabile de la nivelul #DNmt constituie o analiza de rezerva pentru acele situatii in care analiza #DN nuclear nu poate fi efectuata sau atunci cand nu se poate obtine #DN nuclear.