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UNIVERSIDADE DE SO PAULO CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA

"A segurana em laboratrio de biologia molecular"

Disciplina : Ecologia Experimental de Microrganismos CEN5734

Responsvel: Profa. Siu Mui Tsai Monitores: Acacio Navarrete, Lucas Mendes, Ademir Durrer (adurrer@cena.usp.br)

Apoio Tcnico: Jos Elias Gomes, Bilogo Fbio Rodrigo Sanches, Bilogo Wagner Picinini, Tcnico Agrcola Francisco Montrazi, Tcnico Qumico

1 Semestre / 2009 Piracicaba / S.P.

ALGUMAS PALAVRAS SOBRE SEGURANA


CAPELAS So caixas abertas conectadas por um sistema de exausto que empurra o ar para dentro da Capela e o descarta para fora. Quando a Capela utilizada corretamente, o material nocivo pode ser manipulado sem risco de expor o operador e outros trabalhadores do laboratrio de inspirar compostos txicos. O ar deve ser movimentado para dentro da Capela com uma velocidade linear mdia interior (velocidade de rosto) de pelo menos 100 ps por minuto, e a velocidade mnima interior de pelo menos 70 ps por minuto. As Capelas para carcinognios qumicos devem ter uma velocidade de 150 ps por minuto com um ponto mnimo de 125 ps por minuto. O tamanho da abertura da Capela pode ser ajustado por janelas corredias. Ela til para se ter algum meio de indicao de que existe uma corrente interior de ar (manmetro, fitas, etc.). Para garantir o funcionamento prprio da Capela, no deve existir excessivas correntes de ar cruzadas na frente da Capela. Correntes de ar podem causar reverso na corrente interior de ar e assim empurrar material nocivo fora da Capela. Correntes de ar podem ser causadas por janelas abertas, fornecimento de passagem de ar, ventilador ou pelas pessoas caminhando em frente da Capela. As Capelas devem estar localizadas longe das portas, janelas abertas, ou equipamento capaz de criar aprecivel corrente de ar. As capelas servem para conduzir somente material que conduzem ar liberado para uma baixa velocidade, tais como lquidos ferventes ou evaporando. Deve-se trabalhar com eles bem no interior da Capela. Para uma distancia de 3 ps em frente da Capela, a velocidade interior do ar desprende-se para cerca de 10 ps por minuto (menor do que a velocidade do ar corrente gerado ocasionalmente na sala). Lembre-se que o ar na Capela torna-se contaminado pelo material utilizado nela. NO COLOQUE SUA CABEA DENTRO DA CAPELA! CMARAS DE FLUXO LAMINAR Trabalhos com riscos biolgicos devem ser feitos em Cabines Biolgicas de Segurana. Tenha na mente que embora algumas Cabines Biolgicas de Segurana usem Fluxo Laminar, uma Cmara de Fluxo Laminar no necessariamente sinnimo de uma Cabine Biolgica de Segurana. Uma Cmara de Fluxo Laminar produz movimento de ar sem turbulncia, com a direo do fluxo sendo tanto horizontal como vertical. O ar pode ser purificado (clivado) atravs da passagem do ar por um filtro especfico de ar, altamente eficiente. Isto remover virtualmente todas as partculas, incluindo aquelas de tamanho extremamente pequenas, gerando assim uma rea de trabalho livre de contaminao especfica. Cmaras de Fluxo Laminar so especialmente teis em preveno de espalhamento de material aerolizado. Existem 3 classes distintas de Cabines Biolgicas de Segurana : A classe I similar a uma Capela Qumica, produzindo uma corrente de ar interior para o trabalho com abertura de aerosis, onde no pode haver espalhamento para dentro da Capela. O fluxo de ar no laminar, e a rea de trabalho no protegida das correntes de ar geradas na sala. O ar "sujo" exaurido da Capela atravs de um filtro para prevenir descarte de material bioperigoso no meio ambiente. Assim um exaustor necessrio para a operao da Capela, o qual ventilado para o lado de fora. Os produtos qumicos podem ser utilizados no lado de dentro. A classe II geralmente subdividida em 2 grupos. Grupo I contm Capelas que recirculam 70% do ar filtrado e assim no podem ser utilizadas com materiais 2

corrosivos, solventes inflamveis, ou qumicos nocivos, porque as Cabines recirculam 30% somente do ar filtrado. Este tipo de Cabine pode ser utilizado com quantias moderadas de qumicos ou solventes. A classe III so caixas com gs compacto que so mantidas em uma presso negativa com relao presso do ar na sala. Este tipo de Cabine utilizado quando o mais alto grau de proteo pessoal requerida. As Capelas so ventiladas internamente, e a filtrao altamente eficiente produzida para entrada e exausto do ar. Cabines Biolgicas de Segurana de todos os tipos devem ser checadas periodicamente (pelo menos 1 vez por ano). Quando a Cabine for descontaminada (para inspeo ou por causa de um derrame de algum produto), sele a Cabine e volatilize Paraformaldedo dentro dela. Tambm checar que os filtros no estejam furados e que o fluxo de ar seja apropriado. LUVAS costume utilizar luvas para proteo quando trabalhar com substancias qumicas irritantes, produtos radioativos, solventes, etc., pois elas do proteo necessria e esperada. Diferentes tipos de luvas so utilizados em laboratrios e a proteo que elas do ao usurio pode variar de alguns segundos para algumas horas, dependendo das condies de uso. Um tipo particular de luva pode ser eficiente parar alguns produtos e ser ineficiente para outros. A Tabela 1 resume a proteo dada por vrios tipos de luvas.

Tabela 1. Proteo dada utilizando tipos diferentes de luvas

Material da Luva ----------------------------------------------------------------------------Neoprene Cloreto lcool Latex Polietileno Polivinil Polivinil -------------------------------------------------------------------------------------------cidos (Diludo) OK OK OK OK Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------lcool OK OK OK OK OK -------------------------------------------------------------------------------------------lcalis (Diludo) OK OK OK OK Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------Solventes clorados OK OK OK Ruim Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------Acetona OK Ruim Ruim OK Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------Destilados, Petrleos Minerais OK Ruim OK Ruim Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------Hidrocarbonetos OK Ruim OK Ruim Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------Resinas epxicas OK OK Ruim Ruim Ruim -------------------------------------------------------------------------------------------LUZ ULTRAVIOLETA A Luz Ultravioleta (UV) pode ser dividida em 3 grupos de comprimento: prximo (315-400 nm), mdio (280-315 nm) e distante (200-280 nm). A sensitividade mxima em humanos est em cerca de 280 nm. Exposio para meia distancia direta ou indireta ou UV distante, pode causar irritao aguda nos olhos aps um perodo latente de -24 3

horas. Devido a retina no ser sensvel UV, o dano aos olhos pode resultar sem a pessoa saber do perigo da exposio. O perodo latente para sentir os sintomas (sensao de areia nos olhos, lacrimejamento, sensitividade luz, dificuldades em abrir as plpebras, etc.) dependente na intensidade da exposio; na exposio mais intensa, o perodo latente mais curto. Geralmente o desconforto desaparece entre 48 horas. Entretanto ele pode ser acompanhado por uma reduo temporria em agudeza visual. A pele tambm sensvel UV. A queimadura d certa proteo contra posterior exposio, mas lembre-se que a UV de meia distancia de luz do sol considerada pior do que o envelhecimento em produo no desejveis de mudanas na pele. A radiao UV tem tambm sido considerada como um fator em causas de cncer de pele. Concluindo, proteja seus olhos e sua pele dos efeitos da radiao UV atravs do uso dos culos com proteo lateral, atravs de vestimenta adequada e atravs de exposio limitante. A luz UV utilizada em laboratrio para vrios propsitos. Dois deles sero considerados abaixo.

LUZ GERMICIDA So utilizadas em locais onde a reduo do nmero de microorganismos em superfcies e no ar se faz necessria. Estas incluem Cabines Biolgicas de Segurana, Cmara de Fluxo Laminar, e Laboratrios Bacteriolgicos e Cultura de Tecido. A luz germicida UV semelhante a tubos fluorescentes claros sem cobertura e produz uma luz brilhante azulada. Ns sugerimos o uso de interruptores automticos para desligar a UV quando a porta for aberta, por causa da luz azulada produzida atravs dos tubos que pode no ser percebida durante a luz do dia em uma sala clara. Coloque sinais de cuidado na portas. Geralmente os tubos germicidas so colocados no teto. Se instaladas apropriadamente elas no devem ser perigosas para as pessoas. Os tubos devem ser periodicamente limpos e trocados to logo sua intensidade tenha cado para 60% da porcentagem inicial. Recomendamos o uso de pintura nas paredes e no teto para reduzir reflexo da luz UV. Tambm esteja ciente que uma quantidade de materiais plsticos so progressivamente degradados pela exposio de UV.

DETECO DE DNA ATRAVS DA ILUMINAO UV Deteco de molculas de DNA utilizando Brometo de Etdio feita atravs de iluminao com luz UV. Qualquer onda de UV longa ou curta pode ser utilizada. Entretanto, a iluminao com comprimento curto de luz UV pode induzir danos na molcula de DNA, e, em alguns casos, no permitir posterior clonagem ou interfirir com a expresso do fragmento clonado. Trs tipos de transiluminadores so utilizados para detectar fragmentos de DNA em gis de Agarose ou Poliacrilamida aps colorao com Brometo de Etdio. Os tres comprimentos utilizados so 254 nm, 302 nm e 365 nm. Os transiluminadores de 302 nm so recomendados para deteco fcil de pequenas quantidades de DNA coloridos com Brometo de Etdio sem induzir dano, permitindo assim posterior clonagem dos fragmentos purificados.

FENOL Fenol (cido carblico, hidroxibenzeno) tem sido largamente utilizado como um desinfetante e germicida. sua utilizao como antissptico em cirurgias no sculo 19 resultou em muitos casos de envenenamento crnico e sub-agudo entre os cirurgies e seus assistentes. O fenol puro um cristalino slido branco com um ponto de fuso de 41oC. Por causa da oxidao ele torna-se cor-de-rosa plido. Ele um produto perigosamente txico que pode produzir envenenamento quando ingerido, inalado ou absorvido pela pele. Os efeitos txicos incluem dor de cabea, vertigem, nusea, fraqueza, dificuldade na respirao, inconscincia e morte. O fenol corrosivo para a pele, inicialmente produzindo uma rea branca amolecida, seguida por vrias queimaduras. Ele rapidamente absorvido pela pele, e por causa das propriedades anestsicas locais, queimaduras de pele podem no ser sentidas at ocorrerem vrios danos. a) PRIMEIROS SOCORROS Se o fenol derramado na pele, lave imediatamente com grandes quantidades de gua. NO USE ETANOL! Por causa da presso de vapor relativamente baixa do Fenol, o envenenamento das vias respiratrias geralmente resulta do contato da pele com o Fenol ou solues compostas, ao contrrio da inalao. Se os olhos forem contaminados, lavar com gua corrente por cerca de 15 minutos; pea ajuda mdica. b) REDISTILAO DO FENOL Alm das suas propriedades txicas, o Fenol combustvel. Quando aquecido acima de 80oC, os vapores podem formar uma mistura explosiva com o ar. O fogo causado pelo Fenol pode ser extinto com gua ou extintores de fogo qumico ou Dixido de Carbono. A destilao do Fenol desenvolvida em uma Capela com boa aspirao. No refrigere pois isto poder aumentar a condensao dos vapores, conduzir a cristalizao do Fenol, aumentar a presso causando uma exploso. Adicione um pouco de Zinco no Fenol lquido que voce aumentar o aquecimento. O Fenol comercial contm uma impureza que eleva o ponto de fuso para 182oC. Quando a temperatura de vapor atingir 181oC, inicie a coleta. Recomendamos manter o fenol redestilado sob Nitrognio para evitar oxidao e formao de quinonas os quais podem reagir com aminas primrias para formar produtos de ligao cruzada estvel. A formao de quinonas estar acompanhada por uma colorao amarela da soluo de Fenol. A adio de 8-Hidroxiquinolina pode ajudar a retardar a oxidao. As solues de Fenol oxidam rapidamente a 4oC, mas so estveis no estado cristalino por vrios meses quando guardados a -20oC. O Fenol redestilado mantido em frascos de vidro. Antes da tampa ser rosqueada, o Nitrognio soprado sobre a superfcie do Fenol por alguns minutos.

COQUETIS DE CINTILAO LQUIDA Estas solues contm solventes inflamveis tais como Tolueno, Xileno ou Dioxano. Como estas misturas tm pontos de ignio mais baixos do que 38oC, no guarde em grandes frascos de vidro. Note que o Dioxano pode formar um Perxido expressivo quando ele envelhece. No guarde por mais de tres meses aps abrir o frasco. O Dioxano est listado entre os carcinognios suspeitos. 5

CLOROFRMIO Ele utilizado em extraes de cidos Nucleicos em combinao com lcool Isoamlico (24 partes de Clorofrmio/1 parte de lcool Isoamlico). O clorofrmio um composto no inflamvel, pesado, muito voltil, miscvel com lcool, Benzeno e ter. Como ele sensvel luz quando puro, mantido em frascos menores escuros. Manuseie o Clorofrmio com cuidado. A mistura de Clorofrmio com outros solventes pode envolver srios danos. O Clorofrmio sofre uma reao endotrmica com Acetona em soluo bsica para formar Cloretona. No misture Clorofrmio com Acetona. A mistura de base forte com Clorofrmio ou outros Hidrocarbonetos Clorinados tem implicado em exploses.

LCOOL ISOAMLICO O lcool Isoamlico, tambm denominado de lcool Isopentlico utilizado em combinao com Clorofrmio para ajudar a separar as fases em extraes de cidos Nucleicos. Ele tem um odor desagradvel e miscvel com lcool, ter, Benzeno e Clorofrmio. Manuseie o lcool Isoamlico em Capelas. Seus vapores so venenosos.

TER ETLICO Extrao com ter frequentemente o ltimo passo em purificao de cido Nucleico, seguido de tratamento com Fenol e Clorofrmio. O ter um composto muito voltil e altamente inflamvel com vapor mais denso do que o ar. Sempre utilize ter sob uma Capela e longe de alguma fasca de fogo. A temperatura de autoignio 180190oC.

DIETIL PIROCARBONATO Este composto comumente utilizado para inativar Nucleases. Ele um produto perigoso porque pode formar Uretano (um poderoso carcinognio) na presena de Amnia. Ele se decompe rapidamente para Etanol e Dixido de Carbono quando gua pura adicionada (pH 7.0). Ele pode ser descartado durante noite, atravs de diluio em uma soluo aquosa livre de Amnia. Ele deve ser manuseado com muito cuidado porque pode reagir com a Amnia Endgena do corpo e, por ser irritante aos olhos, membranas mucosas e pele.

METIL MERCRIO um reagente venenoso que deve ser manuseado com muito cuidado. absolutamente necessrio quando o p de Metil Mercrio manipulado, trabalhar em uma Capela. O uso de solues diludas de Metilmercrio no requer trabalho em Capelas. De acordo com Junghans (Environ. Res. 1981, 33: 1-31), o Metilmercrio levemente voltil (5000 vezes menor do que a gua). A maioria dos americanos tem uma concentrao normal no corpo de 1 mg de Metilmercrio (o qual excretado), enquanto que a mdia em japoneses 2-3 vezes superior devido ao regime alimentar, mas esto ainda 40 vezes abaixo dos nveis txicos. No existe preocupao especial para mulheres grvidas com relao a este produto (Junghans, 1981). Autoridades da Sade nos Estados Unidos permitem que se jogue nos esgotos Metilmercrio nas quantidades consideradas aqui.

MATERIAL PLSTICO E QUMICO Diferentes tipos de containers plsticos (Erlenmeyers, Bequers, tubos, tubos de centrfuga, etc.) so comumente utilizados em laboratrios. Esteja ciente que alguns plsticos podem se tornar alterados por contato prolongado com produtos qumicos. TRABALHANDO COM COMPOSTOS 32P-MARCADOS Fsforo-32 largamente utilizado como um traador por ser facilmente detectado. Como as partculas beta em 32P tm uma energia de 1.71 MeV, compostos marcados devem ser manuseados com cuidado e protetores devem ser utilizados. Lembre-se como que o efeito de radiao eletromagntica das partculas beta conhecidas como bremsstrahlung produzido. O bremsstrahlung diretamente proporcional densidade do material escolhido para proteo. O corpo de um material de baixa densidade (tal como plstico) deve ser utilizado como primeira proteo. Um segundo material de alta densidade pode ser adicionado, se necessrio absorver o bremsstrahlung emitido. imprescindvel utilizar luvas (dois pares so frequentemente necessrios), proteja seus olhos, submeta amostras de urina para checagem, e use dosmetros. Tambm recomendvel proteger balces com papel absorvente (tais como Benchkote) e usar contador Geiger-Mller para deteco de respingos. Nunca coma, fume ou beba manipulando compostos radioativos. Use fita especial para identificar containers e tubos nos quais os materiais ativos esto mantidos. O mximo permissvel de fsforo-32 para o corpo de 30 Ci, o mximo permissvel para o osso somente 6 Ci .

TRABALHANDO COM CARCINOGNIOS CONHECIDOS E POTENCIAL A Segurana Ocupacional e Administrao de Sade do Governo dos Estados Unidos tm compilado uma lista de compostos carcinognicos conhecidos e suspeitos entre mais de 800 produtos altamente txicos. A Categoria I inclue carcinognios confirmados, como estabelecido atravs de dados obtidos em humanos ou com pelo menos duas espcies de mamferos. A categoria II contm os compostos cujos carcinognicos tm sido demonstrados em somente uma espcie, ou no esto ainda confirmados por outros testes. Produtos com potencial carcinognico conhecido se encaixam na Categoria III. Vrios dos produtos rotineiramente utilizados no curso de clonagem molecular se encaixam nas Categorias I e II (veja Tabela 2). Abaixo esto algumas das recomendaes elementares que se aplicam para manuseio de todos carcinognicos conhecidos ou suspeitos, e mais geralmente, para manuseio de todos os compostos altamente txicos. Sempre vista roupa apropriada de proteo e luvas e identifique claramente a rea dos balces onde os compostos txicos esto sendo manuseados. prudente utilizar ao inoxidvel ou bandejas plsticas, placas de vidro inquebrvel e papel absorvente tais como Benchkote (Whatman). Quando trabalhar com um carcinognico potencial, confira se h respingos e evite usar todos os procedimentos que gere aerosis. Marque todos os recipientes apropriadamente e no descarte nenhum carcinognico conhecido ou suspeito sem antes fazer a sua inativao. Limpeza e ordem so eficientemente obtidas atravs de um destes trs mtodos:

1. Imerso em cido Crmico seguido por lavagem extensiva direta no tanque com gua. No esquecer de renovar o cido Crmico periodicamente.

2. A oxidao atravs da imerso em gua Sanitria por 24 horas temperatura ambiente seguido de lavagem extensiva com gua. 3. Inativao com 5 % de KOH seguido por lavagem extensiva com gua.

Todo refugo slido deve ser enterrado em um local apropriado para evitar alguma contaminao ao redor.

Tabela 2. Carcinognico potencial de alguns produtos comuns utilizados em clonagem ----------------------------------------------------------------------------------------------Compostos Solvente Descarte Riscos sade*

----------------------------------------------------------------------------------------------Actinomicina gua Enterrar ou cido Crmico C HT Colchicina Etanol Enterrar ou cido Crmico T HT Ciclohexamida Etanol Enterrar ou cido Crmico T HT DEP 5%KOH Veja texto _ T Brometo Etdio gua 24 hs em Cndida C T cido Iodoactico gua 24 hs em Cndida T T Metrotexato 5%KOH 5%KOH T HT ICR170,191 Etanol 24 hs em Cndida C HT Micostatina Metanol Enterrar ou cido Crmico _ T Espermina gua Enterrar ou cido Crmico _ T ----------------------------------------------------------------------------------------------*= Carcinognico(C) Teratognico (T) Txico(T) AltamenteTxico (HT)