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Curso Terico y Prctico

IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

13 al 17 de Septiembre de 2010
Servicio Bacteriologa Especial Departamento Bacteriologa Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS -Dr. Carlos G. Malbrn Buenos Aires, Argentina

Directora: Coordinadora: Docentes:

Raquel Callejo Mnica Prieto Raquel Callejo Mnica Prieto Florencia Rocca Lucia Cipolla Lorena Aguerre Claudia Martnez Gastn DAngiolo

Colaboracin tcnica:

Asistencia informtica: Claudia Martnez

Lugar:

Servicio Bacteriologa Especial Departamento Bacteriologa Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI)
ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

NDICE GENERAL

Introduccin .................................................................................................................................... 1-2 Bioseguridad .................................................................................................................................. 3-4 Revisin de los principales cambios taxonmicos .......................................................................... 5-7 Cambios recientes de la nomenclatura ........................................................................................ 8-13 Ubicacin taxonmica de los gneros de importancia mdica.................................................... 14-15 Medios de cultivo. Protocolos de preparacin cido sulfhdrico. Produccin en acetato de plomo ................................................................... 16 Agar almidn ............................................................................................................................ 16 Agar Mac Conkey ..................................................................................................................... 17 Agar SS .................................................................................................................................... 17 Cetrimide agar ........................................................................................................................... 18 Citrato de Simmons agar .......................................................................................................... 18 Coloracin de flagelos ............................................................................................................... 18 Coloracin de flagelos (adaptado) ............................................................................................. 19 Decarboxilacin. Mtodo MOELLER ....................................................................................... 19 Diferenciacin de cocos y cocobacilos (adaptado) .................................................................... 19 DNAsa agar .............................................................................................................................. 20 Escala nefelomtrica de Mac Farland........................................................................................ 20 Esculina .................................................................................................................................... 21 Estras de carbohidratos al 10% ............................................................................................... 21 Flexirrubina ................................................................................................................................ 22 FLN medio (Fluorescencia, Lactosa, Nitrato) ............................................................................ 22 Gelatina .................................................................................................................................... 23 Hidratos de carbono .................................................................................................................. 23 Indol .......................................................................................................................................... 24 Medio base ALP (Aerbico Baja Peptona para bacilos no fermentadores) ............................... 24 Medio acetamida........................................................................................................................ 25 Medio de asimilacin ................................................................................................................. 25 MN (Motilidad - Nitrato).............................................................................................................. 25 OF medio basal.......................................................................................................................... 26 ONPG -galactosidasa (orto-nitro-fenil -D-galactopiransido)................................................. 26 Oxidasa...................................................................................................................................... 27 Pseudomonas F agar (King B)................................................................................................... 27 Pseudomonas P agar (King A) .................................................................................................. 27 Reduccin de nitrato. Caldo nitrato ........................................................................................... 28 Reduccin de nitrito. Caldo nitrito .............................................................................................. 28 TSI (agar hierro tres azucares) .................................................................................................. 29 Urea de Christensen ................................................................................................................. 29 Esquemas y tablas de identificacin Algoritmo inicial de identificacin............................................................................................... 30 Tabla 1. Shewanella spp. .......................................................................................................... 31 Tabla 2. Colonias pigmentadas en rosa ................................................................................... 31 Esquema de identificacin grupo glucosa positiva Grupo glucosa positiva .............................................................................................................. 32 Esquema de identificacin grupo glucosa negativa Grupo oxidasa negativa............................................................................................................. 34

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Grupos Grupo fluorescente .................................................................................................................... 35 Grupo 1...................................................................................................................................... 35 Grupo 2...................................................................................................................................... 36 Grupo 3...................................................................................................................................... 37 Grupo 4...................................................................................................................................... 38 Grupo 5...................................................................................................................................... 38 Grupo 6...................................................................................................................................... 39 Grupo 7...................................................................................................................................... 39 Grupo 8...................................................................................................................................... 40 Grupo 9...................................................................................................................................... 40 Grupo 10.................................................................................................................................... 41 Grupo11..................................................................................................................................... 42 Grupo 12.................................................................................................................................... 43 Grupo 13.................................................................................................................................... 43 Grupo 14.................................................................................................................................... 43 Grupo 15.................................................................................................................................... 44 Grupo 16.................................................................................................................................... 44 Grupo 17.................................................................................................................................... 45 Grupo 18.................................................................................................................................... 46 Grupo 19.................................................................................................................................... 46 Grupo 20.................................................................................................................................... 46 Grupo 21.................................................................................................................................... 47 Grupo 22.................................................................................................................................... 48 Grupo 23.................................................................................................................................... 49 Tablas adicionales Complejo Burkholderia cepacia ................................................................................................. 50 Gnero Neisseria....................................................................................................................... 51 Diferenciacin de Neisseria spp. de Gneros relacionados: Prueba sub CIM........................... 52 Cocoides, oxidasa positiva, asacarolticos ................................................................................ 52 Esquema simplificado ..............................................................................................................53-62 Procedimientos generales para la conservacin de BNF......................................................63-64

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INTRODUCCIN Generalidades. Importancia clnica Los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) constituye un grupo heterogneo de microorganismos que se consideran generalmente patgenos oportunistas y que en la actualidad han cobrado relevancia por su incidencia en las infecciones hospitalarias. Son bacterias no esporuladas, aerobias estrictas que, o bien no utilizan los carbohidratos como fuente de energa, o los degradan a travs de vas metablicas diferentes a la fermentacin. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y dado su ubicuidad, pueden sobrevivir en el ambiente hospitalario en: agua destilada, soluciones salinas, tubuladuras, superficies hmedas, humidificadores, incubadoras, nebulizadores, catteres, soluciones desinfectantes y en superficies inertes, constituyendo reservorios de potenciales infecciones. Algunas especies psicrfilas pueden contaminar sangre de banco y hemoderivados. A continuacin se resumen brevemente la importancia clnica de algunos de los gneros y especies de BGNNF que son ms frecuentemente aislados. P. aeruginosa representa un problema importante de salud, especialmente cuando se trata de pacientes con cncer o quemados. Una vez que se establece la infeccin, P. aeruginosa produce una serie de compuestos txicos que causan no slo dao tisular extenso, sino adicionalmente interfieren con el funcionamiento del sistema inmune. Entre las protenas que intervienen en la infeccin de P. aeruginosa se encuentran toxinas, como las exotoxinas A y S, as como enzimas hidrolticas que degradan las membranas y el tejido conectivo de diversos rganos. Esta situacin se ve agravada por la dificultad para tratar las infecciones por P. aeruginosa, ya que esta bacteria presenta una alta resistencia natural a distintos antimicrobianos y desinfectantes. Existe un grupo poblacional especialmente vulnerable a las infecciones por P. aeruginosa formado por enfermos con fibrosis qustica. Este microorganismo coloniza el tracto respiratorio de estos pacientes, y a medida que progresa la infeccin se seleccionan variedades mucoides que producen grandes cantidades del exopolisacrido alginato. Una vez que se establece la infeccin por cepas mucoides, los pacientes se encuentran en la etapa terminal de la enfermedad. Esto se debe a que stas no pueden ser eliminadas por el sistema inmune y, hasta el momento, no existe un tratamiento efectivo contra las mismas. P. aeruginosa, al igual que otras bacterias cuenta con mltiples sistemas regulatorios que le permiten modificar la expresin de distintos genes en respuesta a cambios en el medio ambiente. Uno de estos sistemas regulatorios no responde directamente a las condiciones medio ambientales, sino a modificaciones en la poblacin bacteriana, ya que promueve el cambio en la expresin gentica en funcin de la densidad celular. Este sistema regulatorio detecta cundo se ha llegado a una masa crtica de bacterias por lo que se ha denominado sensor de qurum. El mecanismo mediante el cual se regula la expresin gentica en altas densidades celulares se basa en la produccin baja y constante por cada clula de un compuesto difusible, llamado autoinductor. Cuando el nmero de clulas llega a cierto umbral en el que la concentracin del autoinductor es suficientemente elevada, este compuesto interacciona y activa a cierto activador transcripcional que, a su vez cambia el patrn de expresin gnica. P. aeruginosa contiene ms de un sistema sensor de qurum y produce mltiples autoinductores. Cuando P. aeruginosa se adhiere a una superficie, las clulas se diferencian para formar microcolonias cubiertas por una matriz extracelular que eventualmente llegan a constituir una pelcula. Las bacterias que forman biofilms tienen un metabolismo diferente al de las clulas que crecen en medios lquidos, una de las diferencias ms aparentes, es la sensibilidad disminuida a los antibiticos y a otros agentes txicos, incluyendo algunos elementos de la respuesta inmune. El anlisis microscpico de los pulmones de pacientes con fibrosis qustica muestra que, P. aeruginosa tambin se encuentra dentro de este tipo de estructuras.

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Acinetobacter baumannii ha sido causa, en los ltimos aos de brotes de infeccin nosocomial en numerosos hospitales, afectando fundamentalmente unidades de cuidados intensivos. El perfil tpico es el de pacientes con enfermedades crnicas de base que han sido tratadas previamente con antibiticos de amplio espectro, o bien han sido sometidos a tcnicas de intubacin orotraqueal. Aunque se lo asociado a infecciones a distintos niveles, como endocarditis, meningitis, bacteriemias, infecciones de heridas quirrgicas o urinarias, A. baumannii desempea un papel preponderante en las infecciones respiratorias, fundamentalmente neumonas, siendo responsable de una elevada morbi-mortalidad, as como de un significativo incremento del perodo de hospitalizacin de los enfermos. Su verdadera importancia radica en la capacidad para adquirir rpidamente resistencia a antimicrobianos de amplio espectro y ser responsable de innumerables brotes de infecciones nosocomiales, fundamentalmente neumonas, en unidades de cuidados intensivos (UCI). El origen de los brotes se debe a la gran capacidad de este microorganismo de colonizar piel, vas respiratorias y tubo digestivo. Los pacientes procedentes de UCI constituyen un foco de propagacin de estos microorganismos en plantas mdicas y quirrgicas. La dificultad para el control de las infecciones por A. baumannii radica en su gran capacidad para fijarse y sobrevivir durante largos perodos de tiempo en superficies secas. Se han aislado de respaldos de camas, mesas, aparatos de electrocardiograma, tomas de oxgeno e incluso almohadas, pero el mecanismo de transmisin ms importante son las manos del personal sanitario. En los ltimos aos se ha observado un incremento importante en la prevalencia de Stenotrophomonas maltophilia en materiales clnicos. Este microorganismo es frecuentemente aislado como patgeno intrahospitalario, as como tambin en pacientes con fibrosis qustica, quemados, pacientes inmunosuprimidos o con SIDA. Aunque raramente se asocia con shock sptico, S. maltophilia generalmente produce bacteriemia persistente y est frecuentemente asociado a infecciones del tracto respiratorio o asociadas a catteres. S. maltophilia ha sido aislado de un 10% de pacientes con fibrosis qustica en USA y de un 25% de pacientes en Europa. Los estudios epidemiolgicos sugieren que a diferencia de las infecciones del complejo Burkholderia cenocepacia y de Pseudomonas aeruginosa, el aislamiento de S. maltophilia en pacientes fibroqusticos no es de tan mal pronstico como el aislamiento de los anteriores, sin embargo, la mayor dificultad radica en la resistencia natural de este microorganismos a los -lactmicos y aminoglucsidos y el rpido desarrollo de resistencia a las fluoroquinolonas. El problema es similar para la erradicacin de S. maltophilia cuando se aisla de sitios normalmente estriles. Burkholderia pseudomallei produce un cuadro clnico especfico llamado de melioidosis, es agente de bioterrorismo categora B y es endmico de ciertas zonas tropicales. La mayora de las infecciones por B. pseudomallei son asintomticas. La enfermedad sintomtica puede ser localizada o septicmica. El foco de infeccin incluye pulmn, piel y tracto genitourinario. Aunque la infeccin puede ocurrir en personas sanas, B. pseudomallei es un patgeno oportunista. Los factores de riesgo incluyen diabetes, falla renal crnica y alcoholismo entre otros. Burkholderia pseudomallei es endmica del sudoeste asitico (Vietnam, Laos, Tailandia, Malasia), y el norte de Australia. Adems se han observado casos en el Pacfico Sur, India, Africa y en el Este Medio. En muchos de estos pases, Burkholderia pseudomallei es tan prevalente, que es un contaminante comn de los cultivos de laboratorio. Adems, se han informado casos espordicos de melioidosis en Mxico, Panam, Ecuador, Hait, Per, Brasil y Guyana. La ruta primaria de infeccin es la inoculacin, sin embargo, la infeccin podra ocurrir a travs de la inhalacin, aspiracin e ingestin. Los reservorios ambientales son el agua superficial y el suelo. El perodo medio de incubacin de melioidosis es de 9 das (rango: 1 - 21 das), aunque la reactivacin de la forma asintomtica previa puede ocurrir despus de meses o aos. Se han informado dos accidentes de laboratorio de melioidosis; uno asociado con una exposicin masiva al aerosol y a la piel y el segundo como resultado de un aerosol creado durante la sonicacin a frasco abierto de un cultivo que se presume era B. cepacia. Las recomendaciones para B. pseudomallei, para todas las actividades en las que se utilizan fluidos, tejidos y cultivos corporales infecciosos o potencialmente infecciosos, se recomiendan las prcticas, el equipo de contencin y las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 2.

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BIOSEGURIDAD Es el conjunto de normas que estn diseadas para la proteccin del individuo, la comunidad y el medio ambiente del contacto accidental con agentes que son potencialmente nocivos. Contencin Mtodos seguros para el manejo de materiales infecciosos dentro del laboratorio donde son manipulados y/o conservados, previniendo impactos nocivos y asegurando que, el desarrollo o producto final de dichos procedimientos, no atenten contra la salud del personal. Contencin primaria Proteccin personal y del medio ambiente inmediato expuesto a agentes infecciosos, provista mediante el conocimiento de los principios de la bioseguridad Universalidad: deben aplicarse todas las precauciones y normas del laboratorio ya que, todo microorganismo puede ser potencialmente patgeno. Barreras: elementos que protegen al trabajador de la transmisin de infecciones. Medidas de eliminacin: normas correctas de descarte de elementos de riesgo patolgico, protegiendo al personal y al medio ambiente. Contencin secundaria Proteccin del medio ambiente externo al laboratorio de la exposicin a materiales infecciosos, logrado a travs de la combinacin del diseo de la instalacin y prcticas operativas. Medidas de Precaucin Lavado de manos: es el medio ms importante de evitar la diseminacin de infecciones. El personal debe lavarse las manos antes de iniciar cualquier prctica de laboratorio, an si ha usado guantes, despus de atender a un paciente, de haber tocado excretas o secreciones, despus de sacarse los guantes y antes de salir del laboratorio. En el caso de tratar con microorganismos particularmente virulentos o epidemiolgicamente importantes, el lavado de manos debe hacerse con antispticos, adems de agua y jabn. Sin embargo, estos antispticos no deben usarse como sustituto de un adecuado lavado de manos sino como un complemento. Guantes: en general hay tres razones distintas para usar guantes: 1. Reducen la posibilidad que el personal se infecte con microorganismos con los que va a trabajar. 2. Protegen las manos contra cualquier accidente que pueda producirse al manipular reactivos qumicos. 3. Reducen la posibilidad que el personal sea colonizado por microorganismos y luego transmita a otros pacientes, aunque este riesgo puede evitarse con un adecuado lavado de manos. Respiradores: deben tener filtro y cubrir la boca y la nariz; en general se recomienda su uso para prevenir transmisin de infecciones a travs del aire. Los respiradores protegen al trabajador de la inhalacin de: 1. Aerosoles de partculas grandes (gotas), que se transmiten por contacto cercano. 2. Aerosoles de partculas pequeas (ncleo de gotas) que permanecen suspendidas en el aire y por lo tanto, se desplazan a travs de distancias mayores. Tambin previenen la transmisin de ciertas infecciones que se diseminan por contacto directo con las membranas mucosas, el uso correcto de respiradores evita el contacto con boca y nariz, ya que, antes de ser retirado se debe proceder al lavado de manos. 3. Evita la inhalacin de aerosoles que pueden producirse por la manipulacin de microorganismos. Batas, guardapolvos (vestimenta especial): se recomiendan para evitar mancharse la ropa y asegurar no transmitir posibles infecciones a la vestimenta de uso corriente. Usar vestimenta especial, limpia, recin lavada o descartable, de mangas largas. No se debe usar el guardapolvo fuera del laboratorio. Calzado: debe ser ergonmico, cerrado e impermeable. Los mismos no deben usarse fuera del rea de trabajo, desinfectndose posteriormente mediante procedimientos adecuados. Gafas de seguridad: deben proteger los ojos contra salpicaduras.

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Las ansas de platino deben terminar en un anillo completamente cerrado y la longitud del mango no pasar de 6 cm. Cuando el material infeccioso pueda salpicar al flamearlo en el mechero, se deber utilizar un microincinerador. Otra posibilidad es emplear asas descartables. Para manipular lquidos infecciosos usar pipetas automticas o neumticas, en ningn caso pipetear con la boca. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales de material infeccioso, deben ser notificadas inmediatamente al jefe del laboratorio y se proceder a su desinfeccin con los equipos destinados para tal fin. No comer, beber o fumar, no aplicar cosmticos o manipular lentes de contacto en lugares donde se pueda estar expuesto a sangre u otros materiales potencialmente infecciosos.

Nivel de Bioseguridad BSL1

Grupo de riesgo

Prctica

Barreras Primarias

Barreras Secundarias

GR1 No causan enfermedad en adultos sanos BSL2 GR2 Asociados con riesgo de enfermedad por autoinoculacin, ingestin, exposicin de membranas mucosas GR3 Agentes exticos con potencial transmisin por aerosoles. Riesgo de enfermedad con consecuencias serias o letales GR4 Agentes exticos que implica alto riesgo de enfermedad y muerte, transmitido por aerosoles. Agente de riesgo de transmisin desconocido

Prcticas normales

No se requieren

Ventilacin

Descontaminacin de residuos. Supervisin mdica. Precaucin en manejo de instrumental

Equipos de proteccin personal. Contenedores adecuados para cada tipo de residuos

Autoclaves

BSL3

Descontaminacin de todos los residuos. Descontaminacin del rea Descontaminacin de ropa previo su lavado

Equipos de proteccin personal. Proteccin espiratoria Proteccin para manipular objetos contaminantes

Ventilacin sin recirculacin Recintos con presin negativa

BSL4

Cambio de ropa y ducha al finalizar la prctica Descontaminacin de todo el material tras su uso

Todos los procedimientos de bioseguridad y equipos de proteccin personal para todo el cuerpo

Inyeccin de aire con presin positiva rea de intervencin aislada

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REVISIN DE LOS PRINCIPALES CAMBIOS TAXONMICOS La divisin o phylum Proteobacteria se divide en cinco clases: Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria, Deltaproteobacteria y Epsilonproteobacteria. A excepcin del phylum Proteobacteria que no cumple con las reglas del Cdigo de Nomenclatura, todas las

restantes fueron validadas en noviembre del 2005. Estas clases se definieron en base a los estudios filogenticos de las secuencias del GEN 16S rARN. La clase Alfaproteobacteria incluye bacterias con secuencias del 16S rARN relacionadas con miembros del orden Caulobacterales, la clase Betaproteobacteria rene bacterias con 16S rARN relacionados con el orden Burkholderiales. De la misma manera, la clase Gamaproteobacteria est relacionada con microorganismos del orden Pseudomonadales, la clase Deltaproteobacteria con el orden Myxococcales y la clase Epsilonproteobacteria con el orden Campylobacterales. El gnero Pseudomonas fue descripto por primera vez en 1894 y desde entonces ha estado sujeto a continuas revisiones y reclasificaciones. En 1973, Palleroni y col. (Int. J. Syst. Bacteriol., 23: 333-339), definieron mediante hibridacin ADN-ADN, cinco grupos de homologa de rARN dentro del gnero Pseudomonas. Posteriormente y de manera progresiva, el gnero Pseudomonas se limit a las especies del grupo de homologa que comprenda la especie tipo del gnero: P. aeruginosa. Las continuas revisiones del gnero promovi la creacin de nuevos gneros. a. Las especies del grupo II de homologa rARN se clasifican actualmente en los gneros Burkholderia, Pandoraea, Ralstonia , Cupriavidus y Lautropia, cuya nica especie es L. mirabilis. Las especies que haban sido clasificadas dentro del gnero Ralstonia fueron reorganizadas en el ao 2004 por Vandamme y col. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54: 2285-2289), en dos linajes genticos: - Linaje Ralstonia eutropha: bacilos mviles que no oxidan glucosa, sensibles al colistin. Reclasificados al gnero Cupriavidus. C. gilardii, C. pauculus, C. respiraculi (aislados en humanos). - Linaje Ralstonia pickettii: bacilos mviles, activos frente a los carbohidratos, resistentes al colistin. Mantenidos en el gnero Ralstonia. R. pickettii, R. mannitolytica, R. insidiosa (aislados en humanos) b. Las especies del grupo III comprende en la actualidad los gneros Acidovorax, Comamonas y Delftia. c. Las especies del grupo IV se reclasificaron en el gnero Brevundimonas. d. La nica especie del grupo V ha sido inicialmente clasificada como Xanthomonas y actualmente reclasificada como Stenotrophomonas maltophilia. e. El gnero Chryseomonas que inclua Chryseomonas luteola (Pseudomonas luteola) y el gnero Flavimonas (propuesto para reclasificar Pseudomonas oryzihabitans), son sinnimos heterotpicos de Pseudomonas por lo tanto, en la actualidad, se consideran estas especies como pertenecientes al gnero Pseudomonas.

Grupo de homologa rARN I II III IV V

Nomenclatura anterior

Nomenclatura actual

Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

Pseudomonas Burkholderia, Ralstonia, Wautersia Comamonas, Acidovorax, Delftia Brevundimonas Stenotrophomonas

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El grupo de homologa rARN I que actualmente incluye la familia Pseudomonadaceae y el gnero Pseudomonas, puede clasificarse desde el punto de vista fenotpico en cuatro grupos: a. Grupo fluorescente b. Grupo stutzeri c. Grupo alcaligenes d. Grupo pigmentado amarillo

Grupo

Especies Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida

Marcador fenotpico

Grupo fluorescente

Pseudomonas fluorescens Pseudomonas veronii Pseudomonas monteilii Pseudomonas stutzeri

Produccin de fluorescena

Grupo stutzeri

Pseudomonas mendocina CDC grupo Vb-3 Pseudomonas alcaligenes

Produccin de gas a partir de nitrato

Grupo alcaligenes

P. pseudoalcaligenes Pseudomonas CDC grupo 1

Inactividad frente a los hidratos de carbono

Grupo pigmentado amarillo

Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans

Produccin de pigmento insoluble amarillo

1. 2. 3. 4.

El grupo de homologa II incluye a la familia Burkholderiaceae que comprende en la actualidad los gneros: Burkholderia, Lautropia, Pandoraea, Ralstonia, Cupriavidus. El grupo de homologa III comprende los gneros Comamonas, Delftia y Acidovorax que pertenecen actualmente a la familia Comamonadaceae. La familia Caulobacteraceae incluye el gnero Brevundimonas y corresponde al grupo de homologa IV. En el grupo V, la familia Xanthomonadaceae incluye los gneros Stenotrophomonas y Xanthomonas. En el ao 1997, se describi la especie Stenotrophomonas africana como un patgeno oportunista en humanos (Drancourt y col. (Int. J. Syst. Bacteriol., 47: 160-163). Sin embargo, en el 2004, Coenye y col (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54: 1235-1237) demostraron que S. africana es un sinnimo de S. maltophilia. Por lo tanto, hasta el momento, la nica especie con significacin clnica de la familia Xanthomonadaceae, sigue siendo S. maltophilia

Con respecto al resto de los gneros de importancia clnica incluidos en este manual, son un grupo muy heterogneo de microorganismo que comparten el rasgo fenotpico de no fermentar la glucosa y desarrollar mejor en condiciones aerbicas que en anaerobiosis, de hecho, muchas cepas no desarrollan en ausencia de oxgeno. El gnero Acinetobacter fue considerado como un representante de la familia Neisseriaceae durante muchos aos. Actualmente, pertenece a la familia Moraxellaceae que adems comprende los gneros Moraxella y Psychrobacter. Estudios de hibridacin ADN-ADN han definido 25 genoespecies dentro de este gnero. Slo 10 especies han sido nombradas, y slo se han descrito pruebas fenotpicas diferenciales para 19 genoespecies. Debido a la dificultad que representa la identificacin de los miembros de este gnero en los laboratorios de microbiologa clnica, se propone una clasificacin meramente pragmtica en este manual, considerando que la mayora de las cepas que oxidan glucosa y no producen beta hemlisis corresponden a A. baumannii.

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La mayora de los aislamientos inertes frente a la glucosa y no hemolticos son A. lwoffii y la mayora de las cepas hemolticas A. haemolyticus. En 1986, se demostr por medio de estudios genotpicos (hibridacin ARNr-ADN) y fenotpicos (auxonogramas), que los gneros Bordetella y Alcaligenes estn filogenticamente relacionados, por lo tanto se defini una nueva familia para agruparlos, la familia Alcaligenaceae. Posteriormente, la comparacin de las secuencias del 16S ARNr permiti consolidar la validez de esta familia que comprende adems, los siguientes gneros de importancia clnica: Achromobacter, Advenella, Kerstersia y Oligella. La clasificacin del gnero Flavobacterium en la primera edicin del Manual Bergeys, se basaba en criterios fenotpicos que ya no son utilizados en taxonoma. Por lo tanto, este gnero ha sufrido numerosas reorganizaciones durante los ltimos aos.

1.

En

1994,

Flavobacterium

balustinum,

Flavobacterium

gleum,

Flavobacterium

indologenes,

Flavobacterium indoltheticum, Flavobacterium meningosepticum y Flavobacterium scophthalmum se clasificaron dentro de un nuevo gnero: Chryseobacterium, siendo C. gleum la especie tipo. 2. En el 2005, se demostr que Chryseobacterium meningosepticum representaba un taxn genticamente distinto y se cre un nuevo gnero Elizabethkingia. 3. Flavobacterium breve fue reclasificado como Empedobacter brevis, Flavobacterium odoratum como Myroides odoratus / odoratimimus y Weeksella zoohelcum fue reclasificada como Bergeyella zoohelcum, por lo tanto Weeksella virosa permanece como la nica especie dentro del gnero Weeksella. 4. En la actualidad, la familia Flavobacteriaceae est constituida por los siguientes gneros de importancia clnica: Bergeyella, Capnocytophaga, Chryseobacterium, Elizabethkingia, Empedobacter, Flavobacterium, Myroides y Weeksella.

El resto de los BGNNF de importancia clnica pertenecen a las siguientes familias:

FAMILIA

GNEROS Y ESPECIES Shewanella putrefaciens

Alteromonadaceae

Shewanella algae Alishewanella fetalis

Halomonadaceae Methylobacteriaceae Rhizobiaceae Brucellaceae

Halomonas vetusta Methylobacterium spp. Roseomonas spp. Rhizobium Brucella spp. Ochrobactrum spp. Sphingobacterium

Sphingobacteriaceae Pedobacter

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CAMBIOS RECIENTES DE LA NOMENCLATURA NOMENCLATURA ACTUAL NOMENCLATURA/S ANTERIORES REFERENCIA BIBLIOGRFICA NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 118-124. NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60: 896-903. NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60: 896-903. NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 118-124. YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 429-438.] COENYE (T.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1819-1824. YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 429-438.] COENYE (T.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1819-1824. YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 429-438.] WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 384-398. WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 384-398. WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 384-398. COENYE (T) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55: 251-256

Acinetobacter beijerinckii

Especie nueva

Acinetobacter berenziniae

Especie genmica 10

Acinetobacter guillouiae

Especie genmica 11

Acinetobacter gyllenbergii

Especie nueva

Alcaligenes xylosoxidans subespecie denitrificans Achromobacter denitrificans Alcaligenes denitrificans subespecie denitrificans

Achromobacter insolitus

Especie nueva

Achromobacter piechaudii

Alcaligenes piechaudii

Achromobacter spanius

Especie nueva

Achromobacter xylosoxidans subespecie xylosoxidans

Alcaligenes xylosoxidans subespecie xylosoxidans Alcaligenes denitrificans subespecie xylosoxidans

Acidovorax delafieldii

Pseudomonas delafieldii

Acidovorax facilis

Pseudomonas facillis

Acidovorax temperans

Especie nueva

Advenella incenata

Gnero y especie nuevos

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NOMENCLATURA ACTUAL

NOMENCLATURA/S ANTERIORES

REFERENCIA BIBLIOGRFICA FONNESBECH VOGEL (B.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 1133-1142 WOO (PC) y col. Sist. Appl. Microbiol. 2005, 28: 316-322 [DAUGA (C.) y col. Res. Microbiol., 1993, 144: 35-46. VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831. SEGERS (P.) y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 499-510. SEGERS (P.) y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 499-510. Von WINTZINGERODE (f) y col.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51: 1257-1265. COENYE (T.) y col.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51: 1481-1490. [VANDAMME (P.) y col. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2002, 33: 143-149.] VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590 VALIDATION LIST N 87. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52: 1437-1438 Aun no validado VALIDATION LIST N 46. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 624-625.

Alishewanella fetalis

Gnero y especie nuevos

Alkanindiges hongkongensis

Gnero y especie nuevo

Balneatrix alpica

Gnero y especie nuevos

Bergeyella zoohelcum

Weeksella zoohelcum

Brevundimonas diminuta

Pseudomonas diminuta

Brevundimonas vesicularis

Pseudomonas vesicularis

Bordetella petrii

Especie nueva

Burkholderia ambifaria

Burkholderia cepacia genomoespecie VII

Burkholderia anthina

Burkholderia cepacia genomoespecie VIII

Burkholderia arboris

Burkholderia cenocepacia

Burkholderia cepacia genomoespecie III

[VANDAMME (P.) y col. Res. Microbiol., 2003, 154: 91-96.] YABUUCHI (E.) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.] VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 102-111. VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590

VALIDATION LIST N 92. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 935-937 VALIDATION LIST N 45. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 398-399.

Burkholderia cepacia

Pseudomonas cepacia

Burkholderia contaminans

Burkholderia diffusa

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NOMENCLATURA ACTUAL

NOMENCLATURA/S ANTERIORES

REFERENCIA BIBLIOGRFICA VERMIS (K.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 689-691 [YABUUCHI (E.) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.] VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 102-111. VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590 [YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.] VANLAERE ( y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590 VALIDATION LIST N 45. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 398-399. VALIDATION LIST N 45. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 398-399

Burkholderia dolosa

Burkholderia cepacia genomoespecie VI

Burkholderia gladioli

Pseudomonas gladioli

Burkholderia lata

Burkholderia latens

Burkholderia mallei

Pseudomonas mallei

Burkholderia metallica

Burkholderia multivorans

Burkholderia cepacia genomoespecie II

VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47: 1188-1200. [YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.] [STORMS (V.) y col. Syst. Appl. Microbiol., 2004, 27: 517-526.] [VANDAMME (P.) y col. J. Clin. Microbiol., 2000, 38: 1042-1047.] VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590 YABUUCHI (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 1415-1417. VALIDATION LIST N 75. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 1415-1417 VALIDATION LIST N 75. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 1415-1417 VALIDATION LIST N 45. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 398-399.

Burkholderia pseudomallei

Pseudomonas mallei

Burkholderia pyrrocinia

Pseudomonas pyrrocinia

Burkholderia stabilis

Burkholderia cepacia genomoespecie IV

Burkholderia seminalis

Burkholderia ubonensis

Burkholderia vietnamiensis

Burkholderia cepacia genomoespecie V

GILLIS (M.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1995, 45: 274-289. KAMPFER (P) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 2421-2428. VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831

Chryseobacterium anthrophi

Chryseobacterium gleum

Flavobacterium gleum

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NOMENCLATURA ACTUAL

NOMENCLATURA/S ANTERIORES

REFERENCIA BIBLIOGRFICA VANEECHOUTTE (M) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2007, 57: 2623-2628. VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831 YASSIN y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60: 1993-1998 DE VOS (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1985, 35: 443-453 WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1991, 41: 427-444 VANDAMME (P.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289 VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289 VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289 TAMAOKA (J.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37: 52-59. KIM (K.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55: 1287-1293. VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831 DOBSON (S.J.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 550-558 BALDANI (J.I.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 802-810 COENYE (T.) y col. J. Clin. Microbiol., 2002, 40: 2062-2069 VALIDATION LIST N 87. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52: 1437-1438.

Chryseobacterium hominis

CDC grupo llh y llc

Chryseobacterium indologenes

Flavobacterium indologenes

Chryseobacterium treverense

Comamonas terrigena

Pseudomonas terrigena

Comamonas testosteroni

Pseudomonas testosteroni

Cupriavidus gilardii (1)

Ralstonia gilardii Wautersia gilardii CDC IV C-2

Cupriavidus pauculus (1)

Ralstonia paucula Wautersia paucula Ralstonia respiraculi Wautersia respiraculi Pseudomonas acidovorans

Cupriavidus respiraculi (1)

Delftia acidovorans Comamonas acidovorans Flavobacterium meningosepticum Elizabethkingia meningoseptica Chryseobacterium meningosepticum

Empedobacter brevis

Flavobacterium brevis

Halomonas venusta

Alcaligenes venustus

Herbaspirillum especie 3

CDC grupo EF-1

Inquilinus limosus

Gnero y especie nuevos

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NOMENCLATURA ACTUAL

NOMENCLATURA/S ANTERIORES

REFERENCIA BIBLIOGRFICA COENYE (T) y col .Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1825 VALIDATION LIST N [YUEN (K.Y.) y col. J. 87. Int. J. Syst. Evol. Clin. Microbiol., 2001, Microbiol., 2002, 52: 39: 4227-4232.] 1437-1438 GERNER-SMIDT (P.) y col. Microbiology, 1994, 140: 1787-1797 LA SCOLA (B.) y col. J. Clin. Microbiol., 1998, 36: 2847-2852 VANCANNEYT (M.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 926-932. VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1801-1805 HAN (X Y), J. Clin. Microbiol. 2006, 44: 474 - 479 VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1801-1805 HOLMES (B.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38: 406-416. [DANESHVAR (M.I.) y col. J. Clin. Microbiol., 2003, 41: 1289-1294.] KMPFER (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1823-1829. KMPFER (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1823-1829. ANZAI (Y.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47: 249-251 ANZAI (Y.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47: 249-251 BOWMAN (J.P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 841-848 VALIDATION LIST N 92. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 935-937. VALIDATION LIST N 110. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 14591460 VALIDATION LIST N 53. Int. J. Syst. Bacteriol., 1995, 45: 418-419. VALIDATION LIST N 73. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 423424

Kerstersia gyiorum

Gnero y Especie nuevos

Laribacter hongkongensis

Gnero y especie nuevos

Lautropia mirabilis

Gnero y especie nuevos

Massilia timonae

Gnero y especie nuevos

Myroides odoratus

Flavobacterium odoratum

Neisseria animaloris

CDC grupo EF 4a

Neisseria bacilliformis

Especie nueva

Neisseria zoodegmatis

CDC grupo EF 4b

Ochrobactrum anthropi

CDC grupo Vd

Paracoccus yeei

CDC grupo EO-2

Pseudochobactrum asacharolyticum

Gnero y especie nueva

Pseudochobactrum sacharolyticum

Gnero y especie nueva

Pseudomonas luteola Pseudomonas luteola Chryseomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas oryzihabitans Flavimonas oryzihabitans

Psychrobacter phenylpyruvicus

Moraxella phenylpyruvica

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NOMENCLATURA/S ANTERIORES

REFERENCIA BIBLIOGRFICA COENYE (T) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1075-1080. VANEECHOUTTE (M.), y col.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 317327. DE BAERE (T.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51: 547-558 [YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1995, 39: 897-904.] YOUNG (J.M.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51: 89-103 MACDONELL (M.T.) y col. Syst. Appl. Microbiol., 1985, 6: 171-182 HOLMES (B.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38: 348-353 YABUUCHI (E.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33: 580-598 YABUUCHI (E.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33: 580-598 TAKEUCHI (M.) y col. J. Gen. Appl. Microbiol., 1992, 38:465-482 YABUUCHI (E.) y col. Microbiol. Immunol. 1990, 34: 99-119 PALLERONI (NJ) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 606-609 KMPFER (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 2323-2329. VALIDATION LIST N HOLMES (B.) y col. 23. Int. J. Syst. Syst. Appl. Microbiol., Bacteriol., 1987, 1986, 8: 185-190 37:179-180 VALIDATION LIST N 47. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 864-865. VALIDATION LIST N 47. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 864-865 VALIDATION LIST N 34. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 320-321. VALIDATION LIST N 20. Int. J. Syst. Bacteriol., 1986, 36: 354-356. VALIDATION LIST N 57. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 625-626.

Ralstonia insidiosa

Genero y especie nueva

Ralstonia mannitolytica

Ralstonia pickettii biovar 3 thomasi

Pseudomonas pickettii Ralstonia pickettii Burkholderia pickettii Agrobacterium radiobacter Incluye tambin Agrobacterium tumefaciens

Rhizobium radiobacter

Shewanella putrefaciens

Pseudomonas putrefaciens

Sphingobacterium mizutaii

Flavobacterium mizutaii

Sphingobacterium multivorum

Flavobacterium multivorum

Sphingobacterium spiritivorum

Flavobacterium spiritivorum

Sphingobacterium thalpophilum

Flavobacterium thalpophilum

Sphingomonas paucimobilis

Pseudomonas paucimobilis

Pseudomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia Xanthomonas maltophilia

Wautersiella falsenii

Gnero y especie nuevos

Weeksella virosa

CDC grupo IIf

(1) Segn Vandamme y Coenye (Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of lost and found. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289), el gnero Cupriavidus es un sinnimo del gnero Wautersia y ha sido descripto con anterioridad por lo tanto, de acuerdo a la normativa taxonmica, todas las cepas del gnero Wautersia, deberan ser reclasificadas como Cupriavidus

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UBICACIN TAXONMICA DE LOS GNEROS DE IMPORTANCIA MEDICA

Divisin "Bacteroidetes" Clase Flavobacteria Orden "Flavobacteriales" Familia Flavobacteriaceae Gnero Aequorivita - Algibacter - Aquimarina - Arenibacter - Bergeyella - Bizionia Capnocytophaga - Cellulophaga - Chryseobacterium - Cloacibacterium - Coenonia Costertonia - Croceibacter - Dokdonia - Donghaeana - Elizabethkingia - Empedobacter Epilithonimonas - Flaviramulus - Flavobacterium - Formosa - Gaetbulibacter Gaetbulimicrobium - Gelidibacter - Gillisia - Gilvibacter - Gramella - Kaistella - Kordia Krokinobacter - Lacinutrix - Leeuwenhoekiella - Lutibacter - Maribacter - Mariniflexile Marixanthomonas - Mesonia - Muricauda - Myroides - Nonlabens - Olleya Ornithobacterium - Persicivirga - Pibocella - Polaribacter - Psychroflexus Psychroserpens - Riemerella - Robiginitalea - Salegentibacter - Sandarakinotalea Sediminibacter - Sediminicola - Sejongia - Stanierella - Stenothermobacter Subsaxibacter - Subsaximicrobium - Tenacibaculum - Ulvibacter - Vitellibacter Wautersiella - Weeksella - Winogradskyella - Yeosuana - Zhouia Clase "Sphingobacteria" Orden "Sphingobacteriales" Familia Sphingobacteriaceae Gnero Olivibacter - Pedobacter - Sphingobacterium Divisin "Proteobacteria" Clase Alfaproteobacteria Orden Caulobacterales Familia Caulobacteraceae Gnero Asticcacaulis - Brevundimonas - Caulobacter - Phenylobacterium Orden Rhizobiales Familia Bartonellaceae Gnero Bartonella - Grahamella - Rochalimaea Familia Brucellaceae Gnero Brucella - Crabtreella - Mycoplana - Ochrobactrum - Pseudochrobactrum Famla Methylobacteriaceae Gnero Meganema - Methylobacterium - Microvirga - Protomonas Familia Rhizobiaceae Gnero Agrobacterium - Allorhizobium - Carbophilus - Chelatobacter - Ensifer - Kaistia Rhizobium - Sinorhizobium Orden Rhodobacterales Familia Rhodobacteraceae Gnero Ahrensia - Albidovulum - Amaricoccus - Antarctobacter - Catellibacterium Citreicella - Citreimonas - Dinoroseobacter - Donghicola - Gemmobacter Jannaschia - Ketogulonicigenium - Leisingera - Loktanella - Maribius - Marinovum Methylarcula - Nereida - Nesiotobacter - Oceanibulbus - Oceanicola Octadecabacter - Palleronia - Pannonibacter - Paracoccus - Pelagibaca Phaeobacter - Pseudovibrio - Rhodobaca - Rhodobacter - Rhodothalassium Rhodovulum - Roseibacterium - Roseibium - Roseicyclus - Roseinatronobacter Roseisalinus - Roseivivax - Roseobacter - Roseovarius - Rubellimicrobium Rubrimonas - Ruegeria - Sagittula - Salipiger - Shimia - Silicibacter - Staleya Stappia - Sulfitobacter - Thalassobacter - Thalassobius - Thioclava - Thiosphaera Woodsholea - Yangia Orden Rhodospirillales Familia Rhodospirillaceae Gnero Azospirillum - Conglomeromonas - Defluviicoccus - Inquilinus - Magnetospirillum Phaeospirillum - Rhodocista - Rhodospira - Rhodospirillum - Rhodovibrio Roseospira - Skermanella - Thalassospira - Tistrella Orden Sphingomonadales Familia Sphingomonadaceae Gnero Blastomonas - Erythromonas - Novosphingobium - Rhizomonas (nombre rechazado) Sandaracinobacter - Sandarakinorhabdus - Sphingobium - Sphingomonas Sphingopyxis - Sphingosinicella - Zymomonas

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Clase Betaproteobacteria Orden Burkholderiales Familia Alcaligenaceae Gnero Achromobacter - Advenella - Alcaligenes - Azohydromonas - Bordetella Brackiella - Castellaniella - Derxia - Kerstersia - Oligella - Pelistega Pigmentiphaga - Pusillimonas - Sutterella - Taylorella - Tetrathiobacter Familia Burkholderiaceae Gnero Burkholderia - Chitinimonas - Cupriavidus - Lautropia - Limnobacter - Pandoraea Paucimonas - Polynucleobacter - Ralstonia - Thermothrix - Wautersia Familia Comamonadaceae Gnero Acidovorax - Alicycliphilus - Brachymonas - Caenibacterium - Caldimonas Comamonas - Curvibacter - Delftia - Diaphorobacter - Giesbergeria Hydrogenophaga - Hylemonella - Lampropedia - Macromonas - Malikia - Ottowia Pelomonas - Polaromonas - Ramlibacter - Rhodoferax - Schlegelella - Simplicispira Variovorax - Xenophilus Familia Oxalobacteraceae Gnero Collimonas - Duganella - Herbaspirillum - Herminiimonas - Janthinobacterium Massilia - Naxibacter - Oxalicibacterium - Oxalobacter - Telluria Orden Neisseriales Familia Neisseriaceae Gnero Alysiella - Aquaspirillum - Aquitalea - Bergeriella - Chitinibacter Chromobacterium - Conchiformibius - Deefgea - Eikenella - Formivibrio Iodobacter - Kingella - Laribacter - Microvirgula - Morococcus - Neisseria Prolinoborus - Silvimonas - Simonsiella - Uruburuella - Vitreoscilla - Vogesella Clase Gamaproteobacteria Orden Alteromonadales Familia Alteromonadaceae Gnero Aestuariibacter - Agarivorans - Alishewanella - Alteromonas - Glaciecola Marinimicrobium Marinobacter Marinobacterium Microbulbifer Saccharophagus - Salinimonas Familia Shewanellaceae Gnero Shewanella Orden Oceanospirillales Familia Halomonadaceae Gnero Carnimonas - Chromohalobacter - Cobetia - Deleya - Halomonas - Halovibrio Salicola - Volcaniella - Zymobacter Familia Oceanospirillaceae Gnero Balneatrix - Marinomonas - Marinospirillum - Neptunomonas - Nitrincola Oceanobacter - Oceanospirillum - Oleispira - Pseudospirillum - Reinekea Thalassolituus Orden Pseudomonadales Familia Moraxellaceae Gnero Acinetobacter - Alkanindiges - Branhamella - Enhydrobacter - Moraxella Psychrobacter Familia Pseudomonadaceae Gnero Azomonas - Azomonotrichon - Azorhizophilus Azotobacter - Cellvibrio Chryseomonas - Flavimonas - Mesophilobacter - Pseudomonas - Rhizobacter Rugamonas - Serpens Orden Xanthomonadales Familia Xanthomonadaceae Gnero Aquimonas - Dokdonella - Dyella - Frateuria - Fulvimonas - Hydrocarboniphaga Ignatzschineria - Luteibacter - Luteimonas - Lysobacter - Nevskia Pseudoxanthomonas - Rhodanobacter - Silanimonas - Stenotrophomonas Thermomonas - Xanthomonas - Xylella

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Medios de cultivo Protocolos de preparacin

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MEDIOS DE CULTIVO Y PROTOCOLOS DE PREPARACIN cido sulfhdrico. Produccin en acetato de plomo a) Siembra en medios lquidos de cultivo Fundamentos de la prueba: Algunos microorganismos producen la enzima cistenasa que es capaz de liberar cido sulfhdrico a partir del azufre del aminocido cistena. Para la determinacin de cido sulfhdrico se pueden utilizar medios de cultivo ricos en aminocidos que contengan azufre, tales como el caldo nutritivo o el caldo tripticasa de soja, entre otros. El cido sulfhdrico puede evidenciarse en medios lquidos o slidos con la utilizacin de tiras impregnadas en acetato de plomo. El sulfhdrico reacciona con el plomo y se observa ennegrecimiento en la tira de papel. Este mtodo posee alta sensibilidad y detecta trazas de sulfhdrico que no pueden ser detectadas en el medio TSI. Ingredientes: (Caldo tripticasa de soja) Peptona tripticasa....................................................... 5.0 g Peptona de soja ......................................................... 3.0 g Cloruro de sodio ......................................................... 5.0 g Fosfato de potasio...................................................... 2.5 g Glucosa ...................................................................... 2.5 g Agua destilada .........................................................1000 ml Preparacin del medio: Reactivo: Preparacin de las tiras: Mezclar los ingredientes y calentar hasta fundir el agar. Ajustar pH 7.3. Distribuir 4-5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar 121 C durante 15 minutos. Se utiliza solucin acuosa de acetato de plomo Pb(CH3C00)2x3H20 saturada y caliente Cortar papel de filtro en tiras de aproximadamente 12 mm de ancho y 24 mm de largo. Sumergir las tiras en solucin de acetato de plomo caliente. Colocar las tiras, con pinzas, en placa de Petri de vidrio o en frasco de boca ancha con tapa a rosca. Dejar secar al aire o en estufa a 50 60 C. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar y secar. Las tiras no utilizadas deben volverse a esterilizar cada tres semanas. Existen tiras comerciales. Sembrar los tubos de medio con un inculo denso del microorganismo. Suspender una tira de acetato de plomo estril por encima del nivel del caldo, de modo que quede sujeta por la tapa del tubo. Incubar a 35 C durante 12 horas a 6 das Reaccin positiva: la tira presenta coloracin negro-pardusca (puede tener cierto brillo) Reaccin negativa: la tira de papel no produce alteraciones ni coloraciones. Se puede producir un resultado positivo dentro de las 12 primeras horas. Algunas veces es necesaria una incubacin prolongada y antes de dar un resultado negativo deben transcurrir unos 7das, con lectura diaria y sin cambiar de tira

Realizacin de la prueba:

Lectura e interpretacin:

b) Siembra en medios de cultivo slidos Se utilizan medios que contengan aminocidos sulfurados. Los medios pueden estar preparados en tubo como el agar Kliger o el agar triple azcar hierro (TSI) o en placa como el agar sulfito de bismuto y el agar SS. El fundamento es el mismo en todos los casos, varan los indicadores del SH2. La descripcin de estos medios y la interpretacin de los resultados se describen en sus apartados correspondientes. Agar almidn Fundamentos de la prueba: Este medio evala la capacidad de un microorganismo de hidrolizar almidn por accin enzimtica. Se utilizan placas con medio de cultivo que contiene almidn al 0,1%. Se utiliza como revelador lugol (solucin de yodo utilizada en la coloracin de Gram) Agar nutritivo (Triptena soya) .................................... 23.0 g Almidn de papa ........................................................ 10.0 g Agua destilada........................................................... 1000 ml Solucin A: en 500 ml de agua destilada disolver el agar por calentamiento Solucin B: disolver el almidn en 250 ml de agua destilada. Enfriar la solucin A a 60 C. Mezclar la solucin A y la solucin B y completar con el agua destilada restante. Ajustar pH a 7.2 7.5. Fraccionar en volmenes adecuados para plaquear. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Plaquear. Inocular la superficie del medio en spot o en lnea con la cepa a estudiar. Pueden ser probadas varias cepas en una placa. Incubar a 35 C durante 48 horas. Inundar la placa con lugol. La placa vira al color azul por la reaccin del lugol con el almidn. Una zona clara alrededor de la siembra indica que el microorganismo ha hidrolizado el almidn. Reaccin positiva: zona clara alrededor del cultivo Control positivo: Bacillus cereus ATCC 11778 Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

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Agar Mac Conkey Fundamentos de la prueba:

Este medio evala la capacidad de un microorganismo de desarrollar en concentraciones moderadas de sales biliares. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben considerablemente la flora gram positiva. La lactosa junto con el indicador de pH rojo neutro, sirven para la comprobacin de la degradacin de dicho azcar. Peptona.................................................................... 17.0 g Proteosa peptona ....................................................... 3.0 g Lactosa..................................................................... 10.0 g Sales biliares N 3 ...................................................... 1.5 g Cloruro de sodio ......................................................... 5.0 g Agar...........................................................................13.5 g Rojo neutro.................................................................0.03 g Cristal violeta............................................................0.001 g Agua destilada...........................................................1000 ml Mezclar los ingredientes y calentar hasta disolucin. Ajustar el pH a 7.1. Fraccionar en volmenes apropiados para el preparado de placas. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Plaquear o conservar el medio a 4 C hasta su uso. Sembrar la placa con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C. Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa positiva son rojas con un halo turbio debido al descenso de pH provocado por los cidos biliares. Escherichia coli ATCC 25922 Salmonella typhimurium ATCC 13311 Color de las colonias y del medio: rojo Precipitado: positivo Color de las colonias: incoloro Color del medio: amarillo Precipitado: negativo

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

Agar SS Fundamentos de la prueba: Este medio fue diseado para el aislamiento selectivo de Salmonella y Shigella. El verde brillante, la bilis de buey, la elevada concentracin de tiosulfato y citrato inhiben considerablemente muchos microorganismos. Con el tiosulfato y los iones de hierro se evidencia la formacin de sulfuro por el ennegrecimiento de las correspondientes colonias. La lactosa junto con el indicador de pH rojo neutro, sirven para la comprobacin de la degradacin de dicho azcar. Extracto de carne ....................................................... 5.0 Proteosa peptona ....................................................... 5.0 Lactosa......................................................................10.0 Sales biliares N 3 ...................................................... 8.5 Citrato de sodio .......................................................... 8.5 Tiosulfato de sodio ......................................................8.5 Agar...........................................................................13.5 Verde brillante .......................................................0.0003 Rojo neutro..............................................................0.025 Agua destilada..........................................................1000 g g g g g g g g g ml

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Mezclar los ingredientes y calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.0. Fraccionar en volmenes apropiados para el preparado de placas. No esterilizar en autoclave. Plaquear o conservar el medio a 4 C hasta su uso. Sembrar la placa con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Las colonias de microorganismos lactosa negativas son incoloras y las lactosa positiva son rosadas a rojas. Las colonias de microorganismos formadores de cido sulfhdrico presentan un centro negro. Color de las colonias: rojo Centro negro de las colonias: negativo Viraje del medio: rojo / rosa + precipitado Salmonella typhimurium ATCC 13311 Color de las colonias: incoloras Centro negro de las colonias: positivo Viraje del medio: amarillo Escherichia coli ATCC 25922

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

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Cetrimide agar Fundamentos de la prueba: Es un medio selectivo que contiene cetrimide, una sal de amonio cuaternaria (bromuro de hexadecil-trimetil-amonio), que acta como detergente catinico. Provoca la liberacin de nitrgeno y fsforo de clulas bacterianas inhibiendo el desarrollo de algunos organismos. Pseudomonas aeruginosa y algunos otros BGNNF pueden desarrollar en este medio. Peptona.....................................................................20.0 Cloruro de magnesio .................................................. 1.4 Sulfato de potasio......................................................10.0 Cetrimide..................................................................... 0.3 Agar...........................................................................13.6 Glicerol ......................................................................10.0 Agua destilada.......................................................... 1000 g g g g g ml ml

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Mezclar los ingredientes (sin agregar el glicerol) y calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.2. Agregar el glicerol una vez fundidos los ingredientes. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca, 3 4 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta. Inocular la estra con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C hasta 7 das. Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Reaccin positiva: se observa desarrollo Reaccin negativa: no se observa desarrollo Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

Citrato de Simmons agar Fundamentos de la prueba: Ingredientes: Las pruebas de asimilacin son indispensables para la identificacin a nivel de especie. Sulfato de magnesio..................................................... 0.2 g Fosfato cido de potasio .............................................. 1.0 g Fosfato dicido de amonio ........................................... 1.0 g Citrato de sodio ............................................................ 2.0 g Cloruro de sodio ........................................................... 5.0 g Agar............................................................................. 15.0 g Azul de bromotimol...................................................... 0.08 g Agua destilada............................................................ 1000 ml Calentar los ingredientes hasta disolucin. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca, 3 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta. Inocular la estra con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C hasta 7 das. Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. La degradacin del citrato por los microorganismos da lugar a la alcalinizacin del medio de cultivo, lo que se manifiesta por un viraje a azul oscuro del indicador de pH azul de bromotimol. Reaccin positiva: medio azul (alcalinizado) Reaccin negativa: medio verde (sin cambio) Control positivo: Enterobacter cloacae ATCC 13047 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Preparacin del medio: Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

Coloracin de flagelos Limpieza del material:

Limpiar los portaobjetos con detergente y esponja. Si los portaobjetos tienen bordes esmerilados, colocar en solucin sulfocrmica durante 2 das y lavar con abundante agua corriente; luego con agua destilada. Enjuagar los portaobjetos dos veces con alcohol y secar a la llama. Guardar. Antes de usar flamear en llama azul. SOLUCION A = Fucsina bsica 1.2 g / Etanol 95 C 100 ml SOLUCION B = Acido tnico 1.5 g / Cloruro de sodio 0.75 g / Agua destilada 100 ml Se parte de un cultivo en caldo triptena soya o caldo para flagelos, incubado a 35 C durante 24 horas. Agregar a 1 ml de cultivo, 0.05 ml de solucin de formaldehdo 37% y dejar 15 a 20 minutos. Realizar dos lavados con agua destilada. Centrifugar 10 minutos a 1600 g. Hacer con el sedimento una suspensin dbilmente opalescente. El extendido se hace sobre una superficie 20 x 30 mm, calculando que el volumen de colorante es de aproximadamente 0.004 ml. Secar el preparado a temperatura ambiente o en estufa de 35 C. Agregar el colorante y esperar 10 minutos. Se debe formar una pelcula uniforme sobre todo el extendido. Calcular el tiempo de coloracin para cada lote, cada vez que se utilice. En caso que la coloracin no resulte, repetir incubando el caldo a temperatura ambiente.

Preparacin de reactivos: Preparacin de extendidos:

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Coloracin de flagelos (adaptado de Kodaka y col. J. Clin. Microbiol, 1982, 16: 948-952) Preparacin de reactivos: SOLUCION A = Fenol (5%) 10.0 ml / Acido tnico 2.0 g Sulfato de aluminio y potasio (SC. saturada) 10.0 ml SOLUCION B = Cristal violeta 12.0 g / Etanol 100 ml Mezclar 10 volmenes de la solucin A con 1 volumen de la solucin B. Esta mezcla debe ser usada despus de 2 o 3 das. No filtrar, solo centrifugar o agitar. Se puede guardar a temperatura ambiente hasta un ao. A partir de un cultivo fresco, realizar una suspensin con turbidez menor al patrn 0.5 de la escala de Mac Farland en una solucin 30% de etanol en agua corriente. Flamear un cubreobjeto y colocar una gota de la suspensin bacteriana. La gota se disemina espontneamente y se deja secar. Este preparado se cubre con la mezcla colorante por 1 a 4 minutos, se lava con agua corriente y se deja secar en estufa de 30-35 C. El cubre se coloca sobre un portaobjeto con la cara coloreada hacia arriba. Observar al microscopio con el aumento 100X.

Realizacin de la prueba:

Decarboxilacin. Mtodo MOELLER Fundamentos de la prueba: Las decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminocidos, con formacin de aminas de reaccin alcalina. Cada decarboxilasa es especfica para un aminocido. Lisina, ornitina y arginina son los tres aminocidos habitualmente ensayados y producen cadeverina, putrescina y citrulina respectivamente. Ingredientes: Peptona (Orthana) (Thiotone) ...................................... 5.0 g Extracto de carne ......................................................... 5.0 g Prpura de bromocresol..............................................0.01 g Rojo cresol ................................................................0.005 g Glucosa ........................................................................ 0.5 g Piridoxal ....................................................................0.005 g Agua destilada .......................................................... 1000 ml Calentar suavemente hasta disolucin si es necesario. Ajustar el pH a 6.0. Dividir el medio base en cuatro porciones iguales. Porcin 1: Agregar L-Arginina monoclorhidrato concentracin final 1% (A) Porcin 2: Agregar L-Lisina diclorhidrato concentracin final 1% (L) Porcin 3: Agregar L_Ornitina diclorhidrato concentracin final 1%(O) Porcin 4: sin agregado de aminocido (control de desarrollo C) Si se usan aminocidos D-L, la concentracin se duplica. El pH de la fraccin con ornitina se reajusta antes de la esterilizacin. Fraccionar en tubos 13/100 tapa rosca aproximadamente 2 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 10 minutos. Para microorganismos no fermentadores deben prepararse suspensiones muy densas de cultivos jvenes (no ms de 18 a 24 horas de incubacin). Despus de sembrados los tubos, agregar una capa de vaselina estril de 4 5 mm de espesor. Inocular los tubos por puncin a partir de cultivo de 24 horas. Incubar a 35 C durante 7 a 10 das, si fuera necesario. En ausencia de la enzima decarboxilasa se produce viraje del indicador al amarillo por fermentacin de la glucosa. Cuando la bacteria produce la enzima decarboxilasa se alcaliniza el medio, intensificndose el color prpura inicial. En el caso de los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF), no se observar viraje al amarillo por fermentacin de la glucosa en las reacciones negativas. No se observar ningn viraje de color. Reaccin positiva para BGNNF: intensificacin del color prpura inicial. Reaccin negativa para BGNNF: medio sin cambio Arginina deshidrolasa positiva Lisina decarboxilasa negativa Burkholderia cepacia ATCC 25416 Arginina deshidrolasa negativa Lisina decarboxilasa positiva Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba:

Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

Diferenciacin de cocos y cocobacilos (adaptado de Catlin y col. J. Clin. Microbiol. 1975: 102-105) Fundamentos de la prueba: En concentraciones sub-inhibitorias, los antibiticos que actan sobre la sntesis de la pared celular tienden a inhibir la formacin del septo en vez de actuar sobre la sntesis de los componentes laterales de la pared celular. Por lo tanto, las bacterias cuyas clulas normalmente se dividen en forma de cocobacilos, continuaran creciendo sin dividirse, formando as largos filamentos. Las especies de Neisseria retienen la forma cocoide al ser expuestas a bajas concentraciones de antibitico, sin embargo las especies de Acinetobacter y Moraxella producen bacilos largos y filamentosos. A partir de un cultivo fresco realizar una suspensin en solucin fisiolgica. Hisopar una placa con agar Mueller Hinton o agar sangre. Colocar un disco de penicilina o ampicilina. Incubar a 35 C toda la noche. Realizar una coloracin de Gram a partir del margen exterior del halo de inhibicin alrededor del disco. Observar presencia de filamentos. Presencia de filamentos o bacilos largos: forma cocobacilar (Moraxella spp., Acinetobacter spp.) Presencia de formas cocoides: Neisseria spp.

Realizacin de la prueba:

Lectura e interpretacin:

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DNAsa agar Fundamentos de la prueba: Se utiliza esta prueba para detectar presencia de desoxirribonucleasa. Se fundamenta en la reaccin de DNAsa extracelular con medio conteniendo DNA. Los oligonucletidos liberados por hidrlisis son solubles en cido. Se revela la reaccin con agregado de cido clorhdrico, resultando positiva una zona clara alrededor del inculo. El azul de toluidina produce zonas mucho ms delineadas de actividad de DNAsa. Triptosa ....................................................................... 20.0 g Acido deoxirribonucleico ............................................... 2.0 g Cloruro de sodio ............................................................ 5.0 g Agar............................................................................. 15.0 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml Calentar suavemente hasta disolucin. Ajustar el pH a 7.3. Fraccionar en tubos 16/150 tapa a rosca, 15 20 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Distribuir en placas de Petri, dejar solidificar el medio y secar. Inocular la superficie del medio en spot o en lnea con la cepa a estudiar. Pueden ser probadas varias cepas en una placa. Incubar a 35 C durante 24 48 horas. Inundar la placa con cido clorhdrico. Una zona clara alrededor de la siembra indica una reaccin positiva. Tambin se puede utilizar azul de toluidina; observar durante 30 minutos a intervalos de 5 minutos. El azul de toluidina forma complejo con el DNA hidrolizado y produce zonas de color rosa brillante alrededor de las colonias sobre un fondo azul. Puede incorporarse al medio 0.05g de verde de metilo. Seguir las indicaciones anteriores para la preparacin del medio y la realizacin de la prueba. Reaccin positiva: se observa zona clara que aparece alrededor de la siembra Control positivo: Serratia marcescens ATCC 8100 Staphylococcus aureus ATCC 25923

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

Escala nefelomtrica de Mac Farland Tcnica de preparacin: Ordenar en gradilla 11 tubos del mismo tamao de los usados para la dilucin del material a comparar (vacunas, suspensiones bacterianas, etc.). Rotular desde 0.5 a 10 Agregar a cada tubo una dilucin de sulfato de bario anhidro al 1% y solucin fra de cido sulfrico 1% qumicamente puro (v/v), de acuerdo a lo indicado en la tabla. Sellar los tubos y guardar en heladera. Cada tubo posee diferente densidad, la cual corresponde aproximadamente a las suspensiones bacterianas sealadas. Para la comparacin, agitar bien el tubo correspondiente hasta obtener una suspensin homognea.

CONTENIDO (ml) TUBO N 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 (1%) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 H2SO4 (1%) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

SUSPENSION BACTERIANA / ml 8 CORRESPONDIENTE (10 ) 1.5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

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Esculina Fundamentos de la prueba: a) En medio slido Ingredientes: Determina la facultad de un microorganismo de hidrolizar el glucsido esculina en esculetina y glucosa Agar nutritivo *............................................................ 40.0 g Esculina........................................................................ 1.0 g Citrato frrico................................................................ 0.5 g Agua destilada........................................................... 1000 ml * Utilizar agar triptena soya o similar Calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.0. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca aproximadamente 3 ml por tubo. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta Inocular por estriado. Incubar a 35 C durante 48 horas. Reaccin positiva: Desarrollo en la superficie y ennegrecimiento del medio Reaccin negativa: Desarrollo en la superficie sin ennegrecimiento del medio Control positivo: Enterococcus faecalis ATCC Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: Control de calidad: b) En medio lquido Ingredientes:

Peptona...................................................................... 10.0 g Extracto de carne ......................................................... 3.0 g Cloruro de sodio ........................................................... 5.0 g Esculina........................................................................ 3.0 g Citrato frrico................................................................ 0.5 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml Ajustar pH a 7.2 7.4. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca aproximadamente 3 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Inocular el caldo. Incubar a 35 C durante 48 horas o ms. Reaccin positiva: ennegrecimiento del medio Reaccin negativa: sin ennegrecimiento del medio Control positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Preparacin del medio: Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: Control de calidad: Estras de carbohidratos al 10% Ingredientes:

Base caldo rojo de fenol............................................. 15.0 g Carbohidrato ............................................................... 100 g Agar............................................................................ 15.0 g Agua destilada .......................................................... 1000 ml Mezclar los ingredientes sin agregar el carbohidrato y calentar hasta disolucin del agar. Enfriar a 60 C y agregar el carbohidrato. Ajustar pH a 7.7 antes de autoclavar. Fraccionar aproximadamente 5 ml por tubo. Autoclavar a 121C durante 12 minutos. Solidificar en pico de flauta Inocular por estriado. Incubar a 35 C Reaccin positiva: viraje al amarillo Reaccin negativa: medio sin cambio rojo Control positivo para lactosa al 10%: Burkholderia cepacia ATCC 25416 Control negativo para lactosa al 10%: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: Control de calidad:

Filancia. Prueba del hidrxido de potasio Realizacin de la prueba: Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de hidrxido de potasio al 3%. Suspender una ansada de un cultivo joven a partir de medio slido. Mezclar bien y elevar el ansa para ver formacin de hilo viscoso. Reaccin positiva (formacin de hilo viscoso): bacteria gram negativa Reaccin negativa (sin formacin de hilo viscoso): bacteria gram positiva Algunas cepas de Bacillus forman hilo, especialmente en cultivos viejos, los cuales pierden su gram-positividad por alteracin de la pared celular. Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923

Lectura e interpretacin: Importante: Control de calidad:

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Flexirrubina Fundamentos de la prueba: Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: La flexirrubina es un pigmento amarillo insoluble microorganismos de la familia Flavobacteriaceae. Realizar siembra en agar cerebro corazn o tripticasa soya. Incubar 18 horas a 35 C. Inundar la placa con solucin de hidrxido de potasio al 10%. La presencia de flexirrubina se pone en evidencia por el desarrollo de un color naranja fuerte producido por algunos

FLN medio (Fluorescencia, Lactosa, Nitrato) Fundamentos de la prueba: El medio est formulado para detectar la capacidad de producir fluorescena, la acidificacin a partir de lactosa y la reduccin de nitrato o nitrito a nitrgeno gas. La fluorescena es un pigmento orgnico luminiscente, el cual al ser excitado con luz ultravioleta emite una fluorescencia verde-amarillenta. La fluorescencia de colonias no puede detectarse en los medios comunes de aislamiento. Deben emplearse medios con sales catinicas como sulfato de magnesio, que actan como activadores o coactivadores para intensificar la luminiscencia. La reduccin de nitrato a gas nitrgeno corresponde a la siguiente ecuacin qumica: 2 NO3 + 10 e
-

+ 12 H

N2 + 6 H2O

En esta reaccin de reduccin, cinco electrones son aceptados por el radical nitrato, lo cual da como resultado la formacin de gas nitrgeno y seis molculas de agua. Este proceso se conoce como denitrificacin y es muy til para diferenciar especies de Pseudomonas (muchas cepas son positivas) de otros bacilos no fermentadores. El agregado de lactosa y rojo de fenol permite detectar la formacin de cido a partir de la utilizacin de lactosa, til para identificar el grupo de bacilos gram negativos no fermentadores lactosa positiva fuerte (va oxidativa). Ingredientes: Proteosa peptona N 3 ............................................. 10.0 g Lactosa .................................................................... 20.0 g Agar ......................................................................... 15.0 g Nitrato de potasio sodio........................................... 2.0 g Nitrito de potasio sodio ........................................... 0.5 g Sulfato de magnesio x 7 H2O .................................... 1.5 g Fosfato cido de potasio ............................................ 1.5 g Glucosa ..................................................................... 0.5 g Acetato de sodio x 3 H2O ........................................... 0.5 g Rojo de fenol ............................................................0.02 g Agua destilada..........................................................1000 ml Disolver las sales por separado para evitar la precipitacin de las mismas. Antes de adicionar el agar, ajustar pH 7.8. Distribuir en tubos medianos (16/150) con tapa a rosca (aproximadamente 7 ml por tubo). Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar mitad en puncin y mitad estriado. Examinar el tubo sembrado con fuente de luz ultravioleta para detectar fluorescencia. Fluorescencia positiva: brillo amarillo-verdoso. Acido de lactosa positivo: pico de flauta amarillo. Denitrificacin positiva: burbujas la en profundidad del medio por produccin de gas nitrgeno Control de calidad: Florescencia positiva y denitrificacin positiva: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Fluorescencia y denitrificacin negativa, lactosa positiva: Burkholderia cepacia ATCC 25416

Preparacin del medio:

Lectura e interpretacin:

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Gelatina Fundamentos de la prueba: Se detecta produccin de enzimas proteolticas, que hidrolizan gelatina (gelatinasa). a) Mtodo de KOHN Ingredientes: Gelatina..................................................................... 200.0 g Carbn ........................................................................ 30.0 g Agua corriente............................................................ 1000 ml Suspender la gelatina en agua corriente. Disolver por calentamiento a bao mara a 100 C. Agregar el carbn en polvo cuando la gelatina est bien disuelta. Enfriar suavemente antes de volcar la preparacin en un cristalizador grande (para obtener 0.5 cm de espesor), previamente lubricado con vaselina lquida estril o recubierto con papel apergaminado. Enfriar rpidamente para evitar que precipiten las partculas de carbn. Cubrir con una solucin de formol al 15% durante 1 hora. Volcar el formol y despegar el disco de gelatina del fondo del cristalizador y cortar en trozos pequeos. Agregar nuevamente formol al 15% y dejar durante 24 horas. Envolver los trozos de gelatina en bolsitas de gasa y lavar con agua corriente durante 24 horas, dejando que fluya constantemente un chorro suave de agua. Fraccionar los trozos de gelatina en tubos 25/150 de boca ancha con tapa a rosca, llenando solamente un tercio del volumen y los dos tercios restantes cubiertos con agua destilada estril. Esterilizar por vapor fluente (100 C), durante 2 das, 1 hora cada vez, o tres das durante 30 minutos. Inocular un caldo nutritivo (o caldo Tarozzi), de modo que resulte una suspensin densa. Agregar un trocito de gelatina. Incubar a 35 C durante 2 3 semanas Observar los tubos diariamente Reaccin positiva: por licuacin de gelatina, se liberan partculas de carbn al medio lquido.

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

b) Mtodo de FRAIZER Ingredientes: Caldo infusin cerebro corazn.................................. 70.0 g Gelatina...................................................................... 8.0 g Agar............................................................................ 30.0 g Agua destilada............................................................ 1000 ml Calentar los ingredientes hasta disolucin. Fraccionar en tubos 16/150 tapa a rosca aproximadamente 15 20 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Distribuir en placas de Petri, dejar solidificar el medio y secar. Cloruro de mercurio.................................................... 15.0 g Agua destilada............................................................ 100 ml Acido clohdrico concentrado ..................................... 20 ml Inocular la superficie del medio en spot o en lnea con la cepa a estudiar. Pueden ser probadas varias cepas en una placa. Incubar a 35 C durante 48 horas. Inundar la placa con el reactivo. Una zona clara alrededor de la siembra indica una reaccin positiva. Control positivo: Bacillus cereus ATCC 11778 Control negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633

Preparacin del medio:

Revelador de Gelatina

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: Control de calidad:

Hidratos de carbono Hidratos de carbono que pueden ser autoclavados: adonita, dextrosa, dulcita, inositol, manita, salicina, glicerol (los medios con glicerol deben autoclavarse 10 minutos a 121 C). Hidratos de carbono que no deben ser autoclavados: arabinosa, celobiosa, lactosa, ramnosa, sacarosa, xilosa. Se recomienda agregar al medio base esterilizado y enfriado a 60 C soluciones estriles de hidratos de carbono.

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Indol Fundamentos de la prueba: Ingredientes: Preparacin del medio: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir indol a partir de triptofano. Caldo triptena soya (rico en triptofano). Para aquellos microorganismos exigentes que no desarrollan bien en caldo triptena soya utilizar caldo infusin corazn. Prepara caldo triptena saya segn las instrucciones del medio deshidratado (o caldo infusin corazn segn corresponda). Calentar hasta disolucin. Fraccionar de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Conservar el medio a 4 C hasta su uso. Inocular el caldo con una ansada de un cultivo de 18 horas o una gota de un cultivo de 18 horas-24 horas en caldo infusin corazn. Sembrar la placa con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C por 48 horas. Agregar al cultivo 1 ml de xileno y agitar vigorosamente. Luego agregar 0,5 ml de Reactivo de Ehrlich sobre las paredes del tubo. La presencia de indol se evidencia por la aparicin de un anillo rosa debajo de la capa de xileno. En el caso de Delftia acidovorans, se observa la aparicin de un complejo naranja debido a la formacin de cido antranlico. Etanol 95................................................................. 95.0 ml Paradimetil amino benzaldhedo ................................ 1.0 g Acido clorhdrico........................................................20.0 ml El aldehdo se disuelve en el alcohol y luego se agrega el cido lentamente. Preparar pequeas cantidades de reactivo y almacenar a 4 C Reaccin positiva: Escherichia coli ATCC 25922 Reaccin negativa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Reactivo de Ehrlich:

Control de calidad:

Medio base ALP (Aerbico Baja Peptona para bacilos no fermentadores) Fundamentos de la prueba: El CDC aconseja este medio basal que usa rojo de fenol como indicador de pH, ya que el de Hugh Leifson con azul de bromotimol, puede inhibir algunos bacilos gram negativos no fermentadores. Los fundamentos de esta prueba son los mismos que los expuestos para el medio basal OF. Fosfato cido de diamonio ........................................ 1.0 Cloruro de potasio ..................................................... 0.2 Sulfato de magnesio x 7 H2O .................................... 0.2 Extracto de levadura .................................................. 0.5 Casitone ..................................................................... 0.5 Rojo de fenol ............................................................0.02 Agar ..........................................................................15.0 Agua destilada .........................................................1000 g g g g g g g ml

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Para carbohidratos y otras sustancias acidognicas, ajustar pH a 7.8. El medio base para sales (sales de cidos orgnicos y otros substratos alcalinognicos) se suplementa con 0.02% de glucosa y se ajusta pH 6.5. Calentar para fundir el agar. Distribuir 3 ml en tubos 13/100 con tapa a rosca. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Las soluciones de los sustratos se esterilizan por filtracin. Adicionar estrilmente los sustratos al medio base aun fundido y estriar Carbohidratos y gelatina ............................................ 1.0 Sales de cidos alifticos ........................................... 0.1 Otras sales ................................................................. 0.2 N-butanol.................................................................. 0.05 % % % %

Concentraciones final:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Inocular por estriado. Incubar a 35 C durante 7 das o ms. Para sales Reaccin positiva: rojo Para azcares Reaccin positiva: amarilla Reaccin negativa: amarillo Reaccin negativa: rojo

Control de calidad:

ALP acetamida Reaccin positiva: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ALP glucosa Reaccin positiva: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ALP lactosa Reaccin positiva: Burkholderia cepacia ATCC 25416 Reaccin negativa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

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Medio acetamida Fundamentos de la prueba: Ingredientes: Se utiliza para evaluar la deaminacin de acetamida por accin de la enzima acilamidasa resultando en la alcalinizacin del medio por liberacin de amonio. Acetamida ............................................................... 10.0 g Cloruro de potasio ..................................................... 5.0 g Fosfato dipotsico ..................................................... 1.3 g Fosfato monopotsico ...............................................0.73 g Rojo de fenol ..........................................................0.012 g Agua destilada ......................................................... 1000 ml Ajustar pH a 6.9 7.2. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca aproximadamente 3 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Inocular el caldo. Incubar a 35 C durante 48 horas o ms. Reaccin positiva: viraje al color rosa del medio Reaccin negativa: medio sin cambio Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo:

Preparacin del medio: Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: Control de calidad:

Medio de asimilacin (Bouvet P., Joly-Guillou M. L.: Acinetobacter. In: J. Freney, F. Renaud, W. Hansen y C. Boullet: Prcis de Bactriologie Clinique, editions ESKA, Paris, 2000, PP.1239-1258) Fundamentos de la prueba: Las pruebas de asimilacin son indispensables para la identificacin a nivel de especie. Los auxonogramas se efectan en un medio qumicamente definido como el medio de Cruze o medio M639 que contiene una concentracin final de 0,1 % de cada substrato. La tcnica descripta por Bouvet y Joly-Guillou consiste en colocar 0.1 ml de una suspensin de opacidad equivalente al patrn 0,5 de la escala de Mac Farland en 3 ml de medio de Cruze. El medio de Cruze se fracciona en tubos de 13/100 mm tapa a rosca. Los tubos son inclinados con el fin de favorecer la aerobiosis. La lectura se efecta entre las 48 horas y los 6 das de incubacin.

Ingredientes del medio de CRUZE: Fosfato cido de potasio................................... 10.0 g Fosfato cido de sodio ........................................ 5.0 g Sulfato de magnesio x 7H2O ............................... 0.2 g Sulfato de amonio ............................................... 2.0 g Cloruro de calcio x 2H2O..................................0.001 g Sulfato ferroso x 7H2O .....................................0.001 g Agua destilada ................................................. 1000 ml Ingredientes del medio M63: Fosfato dicido de potasio ................................ 13.6 g Sulfato de amonio ................................................2.0 g Sulfato de magnesio x 7H2O ................................0.2 g Sulfato ferroso x 7H2O ...................................0.0005 g Agua destilada .................................................. 1000 ml MN (Motilidad - Nitrato) Fundamentos de la prueba: Este medio permite la observacin de la movilidad y simultneamente la reduccin de nitrato por el agregado de los reactivos A y B. La movilidad se puede observar por tcnicas microscpicas (entre porta y cubre), o por cultivo del microorganismo en tubos con medios semislidos. Si el microorganismo es mvil se observar una zona de difusin del crecimiento alrededor de la siembra, si es inmvil slo crecer en la siembra. Peptona...................................................................... 5.0 g Extracto de carne ....................................................... 3.0 g Nitrato de potasio ....................................................... 1.0 g Agar............................................................................ 3.0 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml Calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.0. Fraccionar en tubos 16/150 tapa a rosca aproximadamente 5 ml por tubo. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Inocular los tubos por puncin a partir de cultivo de 24 horas. Incubar 48 horas a 35 C

Ingredientes:

Preparacin del medio: Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Observar el desarrollo del microorganismo para determinar su movilidad. Movilidad positiva: zona difusa de desarrollo alrededor de la siembra Agregar 0.25 ml de reactivo A y 0.25 ml de reactivo B para la determinacin de nitrato Reduccin de nitrato a nitrito positiva (sin produccin de gas): cultivo + reactivos rojo Reduccin de nitrato a nitrito positiva (con produccin de gas): cultivo + reactivos incoloro + zinc incoloro Reduccin de nitrato a nitrito negativa: cultivo + reactivos incoloro + zinc rojo Se observa la produccin de nitrgeno gas por formacin de burbujas en el medio. Reduccin de nitrato positiva con produccin de gas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Reduccin de nitrato positiva sin produccin de gas: Escherichia coli ATCC 25922 Reduccin de nitrato a nitrito negativa: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Control negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

Control de calidad:

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OF medio basal Fundamentos de la prueba: Los microorganismos glucidolticos degradan la glucosa por mecanismos fermentativos u oxidativos. Los productos finales de la fermentacin son cidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectarse en medios de fermentacin convencionales. Los cidos formados en la degradacin oxidativa de glucosa son sumamente dbiles y se requiere un medio ms sensible para detectarlos (Hugh - Leifson). El CDC aconseja un medio basal OF que usa rojo de fenol como indicador de pH, ya que el de Hugh Leifson con azul de bromotimol, puede inhibir algunos bacilos gram negativos no fermentadores. Triptona ...................................................................... 2.0 Cloruro de sodio ......................................................... 5.0 Fosfato cido de potasio ............................................ 0.3 Azul de bromotimol................................................... 0.08 Agar ........................................................................... 2.0 Agua destilada ........................................................ 1000 g g g g g ml

Ingredientes:

Preparacin del medio:

Mezclar los ingredientes y calentar hasta fundir el agar. Ajustar pH 6.8. Distribuir 3 ml en tubos 13/100 con tapa a rosca. Autoclavar 121 C durante 15 minutos. Agregar al medio base soluciones de carbohidratos al 10%, para obtener una concentracin final de 1%. Sembrar hasta el fondo dos tubos por puncin. Sellar uno de los tubos con vaselina lquida estril. Incubar ambos tubos a 35 C durante 7 das o ms si fuese necesario. La produccin de cidos se detecta por la aparicin de color amarillo. En microorganismos oxidativos, la produccin de color puede verse primero cerca de la superficie del medio. Tubo abierto Acido (amarillo) Acido (amarillo) Alcalino (verde) Tubo sellado Alcalino (verde) Acido (amarillo) Alcalino (verde) Metabolismo Oxidativo Fermentativo No oxidativo

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Patrones de reacciones:

Para las especies que crecen lentamente, puede ser necesaria una incubacin de 3 das o ms para detectar las reacciones positivas. Control de calidad: Tubo sellado positivo / Tubo abierto positivo Escherichia coli ATCC 25922 Tubo sellado negativo / Tubo abierto positivo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Tubo sellado negativo / Tubo abierto positivo Alcaligenes faecalis ATCC 19209 ONPG -galactosidasa (orto-nitro-fenil -D-galactopiransido) Fundamentos de la prueba: El ONPG tiene una estructura similar a la lactosa excepto que la glucosa es reemplazada por el orto-nitro-fenil, como se muestra en la siguiente reaccin: H2O ONPG galactosa + orto-nitro-fenol -galactosidasa La -galactosidasa hidroliza al ONPG en galactosa y orto-nitro-fenol. El ONPG es un compuesto incoloro y el orto-nitro-fenol es amarillo. Las bacterias que fermentan lactosa poseen dos enzimas: lactosa permeasa y -galactosidasa, ambas necesarias para la fermentacin de lactosa. La permeasa permite que la molcula de lactosa penetre en la clula bacteriana mientras que la -galactosidasa hidroliza el galactsido en glucosa y galactosa. Las bacterias que no fermentan lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir acidificacin. Algunas especies bacterianas parecen ser no fermentadoras de lactosa porque carecen de permeasa, pero al poseer -galactosidasa hidrolizan el ONPG. Aquellas que fermentan tardamente lactosa poseen una lenta actividad de su permeasa y por lo tanto son ONPG positivas. Realizacin de la prueba: Hacer una suspensin densa proveniente de un medio que contenga lactosa, por ejemplo TSI (no usar EMB o Levine) en 0.5 ml de solucin fisiolgica, hasta obtener una suspensin densa. Adicionar un disco de ONPG e incubar 20 minutos a 35 C. Observar y continuar incubacin hasta 4 horas. Reaccin positiva: suspensin color amarillo Reaccin negativa: suspensin incolora Control positivo: Escherichia coli ATCC 25922 Control negativo: Proteus mirabilis ATCC 14153

Lectura e interpretacin: Control de calidad:

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Oxidasa Fundamentos de la prueba: El sistema citocromo acta transfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno con formacin de agua. Se encuentra en organismos aerobios y anaerobios facultativos. La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de tetrametil-para-fenilendiamina que acta como aceptor terminal de electrones, el compuesto es incoloro en estado reducido. En presencia de oxidasa y oxgeno atmosfrico se oxida formando azul de indofenol. Diclorhidrato de tetrametil-para-fenilen-diamina........1.0 g Acido ascrbico ......................................................... 0.1 g Agua destilada...........................................................100 ml Impregnar con el reactivo, tiras o discos de papel de filtro. Secar en estufa a 35 C. Guardar en frascos color caramelo. Sobre un portaobjetos colocar la tira de papel reactivo y humedecer con agua. Tocar una porcin de colonia, no usar ansas con xido (falsos positivos) Reaccin positiva: aparicin rpida de coloracin azul violcea (indofenol-oxidasa) Reaccin negativa: sin aparicin de color Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Ingredientes:

Preparacin del medio: Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin: Control de calidad: Pseudomonas F agar (King B) Fundamentos de la prueba: Ingredientes:

Favorece la sntesis del pigmento verde fluorescente (pioverdina), el cual se manifiesta coloreando el medio Digerido pancretico de casena ...............................10.0 Proteosa peptona N3 ...............................................10.0 Fosfato dipotsico ...................................................... 1.5 Sulfato de magnesio................................................... 1.5 Agar...........................................................................15.0 Agua destilada ........................................................ 1000 g g g g g ml

Preparacin del medio:

Mezclar los ingredientes y calentar hasta disolucin del agar. Agregar 10 g de glicerol. Distribuir 3 ml en tubos 13/100 con tapa a rosca. Autoclavar 121 C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta. Inocular por estriado. Incubar a 35 C durante 7 das o ms. Algunas cepas de P. fluorescens o P. putida, generalmente procedentes de agua o suelo (ambientales) producen pioverdina lentamente, por lo tanto incubarlas a 20 C durante 2 3 semanas. En casos dudosos observar la fluorescencia bajo la luz de Wood, comparando con un medio no inoculado. El pigmento no es soluble en cloroformo. Reaccin positiva: aparicin de color en el medio Reaccin negativa: medio sin cambio Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Realizacin de la prueba:

Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

Pseudomonas P agar (King A) Fundamentos de la prueba: Ingredientes: Favorece selectivamente la sntesis de piocianina y/o piorrubina Digerido pancretico de gelatina .............................. 20.0 Cloruro de magnesio .................................................. 1.4 Sulfato de magnesio..................................................10.0 Agar.......................................................................... 15.0 Agua destilada ........................................................ 1000 g g g g ml

Preparacin del medio:

Mezclar los ingredientes y calentar hasta disolucin del agar. Agregar 10 g de glicerol. Distribuir 3 ml en tubos 13/100 con tapa a rosca. Autoclavar 121 C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta. Inocular por estriado. Incubar a 35 C. El medio no necesita ser examinado ms all del cuarto da de incubacin. Reaccin positiva: Se colorea el medio de cultivo en azul, verde si los dos pigmentos de P. aeruginosa son sintetizados simultneamente, o marrn si el microorganismo produce piorrubina. Reaccin negativa: medio sin cambio En caso de duda, agregar al tubo 0.5 ml de cloroformo, dejar durante algunos minutos en posicin inclinada. La piocianina es muy soluble en cloroformo y lo colorea en azul (vira al rojo si se agregan unas gotas de cido fuerte). Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

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Reduccin de nitrato. Caldo nitrato Fundamentos de la prueba: Algunos microorganismos utilizan el nitrato para obtencin de energa reducindolo a nitrito o nitrgeno gas. Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de reducir nitrato a nitrito y/o nitrgeno gas. La presencia de nitrito en el medio se revela con alfa-naftilamina y cido sulfanlico, formndose un compuesto de color rojo. La reduccin de nitrito a nitrgeno molecular puede observarse por la produccin de gas en el medio o por el agregado de zinc. Para esta prueba pueden emplearse medios lquidos y medios semislidos. Peptona ...................................................................... 20.0 g Nitrato de potasio........................................................ 2.0 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml Caldo infusin corazn ............................................... 25.0 g Nitrato de potasio........................................................ 2.0 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml En ambos casos ajustar pH a 7.0. Distribuir aproximadamente 4 ml en tubos 16/150 con campanitas de Durham invertidas. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Controlar que no queden burbujas dentro de las campanitas. Inocular los tubos a partir de cultivo de 24 horas. Incubar 48 horas a 35 C Observar las campanitas para detectar presencia de gas. Sobre el caldo determinar la presencia de nitrito agregando 0.25 ml de reactivo A y 0.25 ml de reactivo B

Ingredientes:

Para grmenes exigentes

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Reactivos para la determinacin de nitrito SOLUCIN A Acido sulfanlico........... 8.0 g Acido actico glacial.300 g Agua destilada.1000 ml Interpretacin de resultados: Reduccin de nitrato a nitrito positiva (sin produccin de gas): cultivo + reactivos rojo Reduccin de nitrato a nitrito positiva (con produccin de gas): cultivo + reactivos incoloro + zinc incoloro Reduccin de nitrato a nitrito negativa: cultivo + reactivos incoloro + zinc rojo Control de calidad: Reduccin de nitrato positiva con produccin de gas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Reduccin de nitrato positiva sin produccin de gas: Escherichia coli ATCC 25922 Reduccin de nitrato a nitrito negativa: Enterococcus faecalis ATCC 29212 SOLUCIN B Dimetil--naftilamina...... 5.0 g Acido actico glacial.......300 g Agua destilada .............1000 ml

Reduccin de nitrito. Caldo nitrito Fundamentos de la prueba: Determina la capacidad de un microorganismo de reducir nitrito a nitrgeno gas. La reduccin se evidencia con el agregado de alfa-naftilamina y cido sulfanlico. En este caso no se observa la formacin del compuesto de color rojo. El nitrito del medio es reducido a nitrgeno gas. Caldo infusin corazn ............................................... 25.0 g Nitrito de potasio......................................................... 1.0 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml pH .............................................................................. 7.0 Inocular los tubos a partir de cultivo de 24 horas. Incubar 48 horas a 35 C. Sobre el caldo determinar la presencia de nitrito agregando 0.25 ml de reactivo A y 0.25 ml de reactivo B. La preparacin de los reactivos A y B ha sido descripta en el punto 5.29. Reduccin de nitrito positiva: cultivo + reactivos incoloro Se observa la produccin de nitrgeno gas acumulado en la campanita de Durham.

Ingredientes:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

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TSI (agar hierro tres azucares) Fundamentos de la prueba: Ingredientes:

Determina la capacidad de un microorganismo para fermentar los hidratos de carbono, con produccin o no de gas. Tambin permite observar la produccin de cido sulfhdrico. Peptona ...................................................................... 20.0 g Cloruro de sodio .......................................................... 5.0 g Lactosa ...................................................................... 10.0 g Sacarosa ................................................................... 10.0 g Glucosa ....................................................................... 1.0 g Sulfato de hierro y amonio............................................ 0.2 g Tiosulfato de sodio ....................................................... 0.2 g Rojo de fenol ........................................................... 0.025 g Agar ........................................................................... 13.0 g Agua destilada .......................................................... 1000 ml Ajustar pH 7.3. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca (4 5 ml por tubo). Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en estra para obtener 2 cmaras de reaccin: fondo o profundidad (anaerobiosis); pico (aerobiosis). Con ansa aguja introducir hasta el fondo y salir inoculando la superficie. Incubar a 35 C. Efectuar la lectura luego de 18-24 horas de incubacin. La fermentacin de azcares provoca acidificacin del medio con viraje del indicador (rojo de fenol) al amarillo. Las reacciones que pueden observarse son:

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

a) k/n = pico alcalino (rojo) / Fondo neutro (sin cambio): No hay fermentacin de azcares b) k/a = pico alcalino (rojo) / Fondo cido (amarillo): Glucosa fermentada / Lactosa y sacarosa no fermentadas c) a/a = pico cido (amarillo) / Fondo cido (amarillo): Glucosa fermentada / Lactosa y / o sacarosa fermentadas La produccin de gas durante la fermentacin de los azcares se evidencia por la aparicin de burbujas o fragmentacin del medio. La formacin de cido sulfhdrico se detecta por ennegrecimiento debido a la produccin de sulfuro ferroso. Control de calidad: k/n: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 k/a: Shigella flexneri ATCC 12022 k/a con produccin de cido sulfhdrico: Salmonella typhimurium ATCC 14028 a/a con produccin de gas: Escherichia coli ATCC 25922 a/a con produccin de sulfhdrico: Proteus vulgaris ATCC 13315 Detecta la hidrlisis de urea, por accin de la enzima ureasa, dando como producto final amonaco. Este ltimo alcaliniza el medio con viraje del indicador rojo de fenol, del amarillo al rojo. ureasa C=O + 2 H2O CO3 (NH4) 2 CO2 + H2O + 2 NH3 Peptona ...................................................................... 1.0 g Cloruro de sodio ......................................................... 5.0 g Fosfato monopotsico ................................................ 2.0 g Glucosa ...................................................................... 1.0 g Rojo de fenol .............................................................. 0.012 g Agar ............................................................................ 15.0 g Agua destilada............................................................ 1000 ml pH ............................................................................... 6.8 6.9 Calentar los ingredientes hasta disolucin. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Al medio base esterilizado y enfriado a 60 C, agregar solucin de urea al 40% esterilizada por filtracin para obtener una concentracin final del 2%. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca, 2 3 ml por tubo. Solidificar en pico de flauta. Inocular la superficie del medio con un inculo denso de un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C. Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Reaccin positiva: por alcalinizacin del medio viraje del amarillo al rojo Reaccin positiva rpida: viraje del medio luego de 1 a 6 horas de incubacin Reaccin positiva lenta: viraje slo del pico a las 24 horas de incubacin Reaccin negativa: no se produce cambio de color Control positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Urea de Christensen Fundamentos de la prueba: NH2 NH2 Ingredientes:

Preparacin del medio:

Realizacin de la prueba: Lectura e interpretacin:

Control de calidad:

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ESQUEMAS Y TABLAS

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Algoritmo inicial de identificacin de bacilos Gram negativos no fermentadores

Produccin de sulfhdrico

Shewanella spp. Tabla 1


pag. 31

Pigemento rosado

Tabla 2
pag. 31

Oxidacin de glucosa

Grupo Glucosa positiva


Tabla 1. Shewanella spp. pag. 32

Grupo Glucosa negativa


pag. 33 30

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Acidificacin
glucosa sacarosa maltosa

Observaciones Representa la mayora de aislamientos humanos Representa la mayora de aislamientos no humanos

Shewanella algae Shewanella putrefaciens

Tabla 2. Colonias pigmentadas en rosa Oxidasa Asaia spp. Methylobacterium spp. Roseomonas cervicalis Roseomonas gilardii Roseomonas mucosa Roseomonas genomoespecie 4 Roseomonas genomoespecie 5 Azospirillum spp. Roseomonas genomoespecie 6 Azospirillum spp. Roseomonas fauriae + (96) + V (52) V (27) + + + + Movilidad + + + V (33) + V(67) + + Desarrollo en agar Mac Conkey v v + V (43) V (50) + V (67) + V (60) Acidificacin glucosa + v V (43) xilosa + + (94) V (43) V (19) + V (67) V (80) manitol + V (14) Hidrlisis de urea V (29) + (86) V (71) V (95) V (67) + + + Reduccin de nitrato v V (5) V (5) + + + Hidrlisis de esculina v + +

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ESQUEMA DE IDENTIFICACIN GRUPO GLUCOSA POSITIVA

GRUPO GLUCOSA POSITIVA Oxidasa + + + + + + + + + + + + + + + Movilidad V + + + + + + + + + + + + Pigmento Agar P Agar F V + + + + naranja V V V + Acidificacin Reduccin Produccin Denitrificacin Colistin de agar de nitrato de Indol Lactosa 10% V V + V V V V V V V V V ND ND ND ND V V + + + V V V V + V + V + + + + V V V V S S S S S R R R R R R S R V V + + + Hidrlisis de urea V V + V V V V V + + + V GRUPO OXIDASA NEGATIVA GRUPO FLUORESCENTE Pannonibacter phragmitetus GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 5 GRUPO 6 GRUPO 7 GRUPO 8 GRUPO 9 Balneatrix alpica Chryseobacterium gleum GRUPO 10 GRUPO 11

ESQUEMA DE IDENTIFICACIN GRUPO GLUCOSA NEGATIVA 32

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GRUPO GLUCOSA NEGATIVA Oxidasa + + + + + + + + + + + + Movilidad + + v + + + Denitrificacin + + Reduccin de nitrato + V V + + v + + V + Colistin S S S R V S ND v R R nd ND R S S V V Hidrlisis de urea + V V V V +++ +++ + + + +++ Produccin de indol + + + GRUPO 12 Bordetella parapertussis CDC NO-1 GRUPO 13 GRUPO 14 GRUPO 15 Alishewanella fetalis GRUPO 16 Bergeyella zoohelcum GRUPO 17 GRUPO 18 GRUPO 19 Bergeyella zoohelcum GRUPO 20 GRUPO 21 GRUPO 22 GRUPO 23 Sensible a penicilina Halfilo, crece en ClNa 6.5% Hidrlisis de esculina + Hidrlisis de gelatina + Pigmento difusible en agar tirosina Caractersticas

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GRUPO OXIDASA NEGATIVA Desarrollo en agar Mac Conkey Acidificacin Lisina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Hidrlisis de esculina Produccin de DNAsa Hidrlisis de gelatina Reduccin de nitrato Pigmento

Colistin

manitol V + + V V + + +

Ms frecuentes Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter sacarolticos (1) complejo Burkholderia cepacia Inusuales Burkholderia gladiolii Burkholderia mallei (1) Inquilinus limosus Pandoraea spp. CDC grupo EO5 Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans Massilia timonae + V V V V + + + V + V V V V + + + + + ND R R R R S S S S + V V + + + + V V + Amarillo soluble Amarillo soluble Amarillo insoluble Amarillo insoluble Amarillo paja insoluble + + + + + V V V v V + S/V S/V R V V + + V V Verdoso soluble V Soluble V Soluble V

(1) Acinetobacter complejo calcoaceticus baumannii: desarrolla a 42 y 45 C; acidifica agar lactosa al 10%; hemlisis negativa. Acinetobacter haemolyticus: hemlisis positiva

xilosa

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GRUPO FLUORESCENTE Pioverdina Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas veronii Pseudomonas monteilii Pseudomonas mosseilii v + + + + + Arginina dehidrolasa + + + + + + Denitrificacin + + Desarrollo a 42 C + Desarrollo en NaCl 6,5% V V + ND + Hidrlisis de gelatina V + + Hidrlisis de acetamida + Acidificacin de xilosa + + + + Reduccin de nitrato + + -

GRUPO 1 Desarrollo en agar Mac Conkey V + + V ND 35 Acidificacin Arginina dehidrolasa Hidrlisis de esculina Reduccin de nitrato + V maltosa Colistin lactosa Pigmento Utilizacin de citrato + + + Movilidad sacarosa Hidrlisis de urea V + V

Agrobacterium grupo amarillo Massilia timonae Pannonibacter phragmitetus Sphingomonas paucimobilis Sphingomonas parapaucimobilis CDC grupo O2 Brevundimonas vesicularis Advenella incenata

amarillo amarillo seco amarillo tostado V amarillo amarillo amarillo naranja amarillo naranja marrn claro

V + + + + V + ND

+ V + + + + + v

+ -

xilosa + + + + + -

+ V + V -

+ + + + V -

+ + V + V V + -

S S S S S S V ND

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GRUPO 2 Desarrollo en NaCl 6,5% V V + V + V 36 Fenilalanina deaminasa Acidificacin Hidrlisis de esculina Arginina dehidrolasa Utilizacin de citrato Hidrlisis de acetamida + V

Pigmento

Ms frecuentes Pseudomonas aeruginosa Achromobacter xylosoxidans Menos frecuentes Ochrobactrum anthrophi Pseudomonas mendocina Pseudomonas stutzeri Pannonibacter phragmitetus OFBA1 Acidovorans temperans Amarillo marrn soluble Tostado rugosas Amarillo-tostado insoluble v Amarillo marrn soluble Amarillo soluble + V V + V V + V + + + + V V V + + + + + V V V + V V + V V V + + + + ND ND ND ND + ND ND ND V V + + + + + + ND ND ND

OFBA1 (1): Produce cido en Medio Basal OF sin carbohidratos

Hidrlisis de almidn

Hidrlisis de urea

sacarosa

maltosa

manitol

lactosa

xilosa

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GRUPO 3 Desarrollo NaCl 6,5% Acidificacin Hidrlisis de esculina Reduccin de nitrato Acidificacin de agar lactosa al 10% Hidrlisis de urea Arginina dehidrolasa V + Utilizacin de citrato

Movilidad

sacarosa

Pigmento

Desarrollo en agar Mac Conkey

Microscopa

maltosa

manitol

lactosa

Achromobacter xylosoxidans Agrobacterium grupo amarillo Rhizobium radiobacter CDC Grupo O1 CDC Grupo O2 CDC Grupo O3 CDC Grupo Ic Brevundimonas diminuta Herbaspirillum spp. Advenella incenata

+ + + + V + + + + v

Amarillo insoluble Amarillo naranja insoluble Amarillo naranja insoluble V Marrn tostado soluble marrn claro insoluble

+ + ND ND ND ND ND V ND

+ + + V -

v + V + v

+ + ND

+ + + + + ND

+ + + ND

+ + V + + ND

+ + V + ND

ONPG + ND ND ND ND ND -

xilosa

V + + V ND

V V V ND

+ V + V + +

+ + V +

Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilos helicoidales Cocoide

Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia

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GRUPO 4 Hidrlisis de urea Achromobacter xylosoxidans Burkholderia pseudomallei (1) Burkholderia thailandensis (1) Ralstonia pickettii Ochrobactrum intermedium (1) V V + + Arginina Hidrlisis de esculina dehidrolasa V V ND + + v Acidificacin manitol + + xilosa + + + + + lactosa + + V sacarosa V V V maltosa + + V V Utilizacin de citrato + V V ND V Fenilalanina deaminasa ND ND +

Burkholderia pseudomallei: Acidificacin de arabinosa negativa Burkholderia thailandensis : Acidificacin de arabinosa positiva

GRUPO 5 Pigmento Reduccin de nitrato V Hidrlisis de urea V Lisina decarboxilasa + Acidificacin lactosa + + V sacarosa V + + Desarrollo en agar Mac Conkey + V -

Complejo Burkholderia cepacia Brevundimonas vesicularis Sphingomonas paucimobilis Sphingomonas parapaucimobilis

Insoluble variable Naranja insoluble Amarillo insoluble Amarillo insoluble

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GRUPO 6 Desarrollo en agar lactosa al 10% Complejo Burkholderia cepacia Ralstonia mannitolytica Brevundimonas diminuta + V Colistin R R V Reduccin de nitrato V Hidrlisis Lisina de urea decarboxilasa V + V + Acidificacin manitol V + xilosa + + PYR + V

GRUPO 7 Pigmento Complejo Burkholderia cepacia Inquilinus limosus (1) Brevundimonas diminuta (1) Pandoraea spp. (2) excepto Burkholderia stabilis Inquilinus limosus desarrolla colonias mucoides. Es sensible a imipenem con dimetros de halo muy grandes (40-55mm), ciprofloxacina y es resistente a penicilinas, cefalosporinas, aminoglucsidos, colistin y co-trimoxazol Soluble variable Marrn tostado soluble Movilidad + V + + Colistin R R V R Hidrlisis Lisina de urea decarboxilasa V V V + Hidrlisis de esculina V + Acidificacin de maltosa + + ONPG + (2) ND ND -

(1) Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia

39

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GRUPO 8 Lisina decarboxilasa Complejo Burkholderia cepacia Ochrobactrum intermedium Pandoraea spp. Ralstonia mannitolytica Brevundimonas diminuta Inquilinus limosus Pseudomonas like grupo 2 (1) Rhizobium radiobacter (1) Fenilalanina deaminasa positiva + Fenilalanina deaminasa + Acidificacin lactosa + + V + + manitol + + + sacarosa V V + + maltosa V V + + + PYR + ND + v + ND +

GRUPO 9 Colistin Complejo Burkholderia cepacia Achromobacter xylosoxidans Inquilinus limosus Pandoraea spp. R S/R (1) R R Hidrlisis de urea v v Lisina Hidrlisis decarboxilasa de esculina + V + Acidificacin maltosa + + xilosa + + v Desarrollo en agar SS ND + ND PYR + + ND

(1) Achromobacter xylosoxidans es sensible a colistin, sin embargo se aislaron algunas especies resistentes 40

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GRUPO 10 Pigmento insoluble Amarillo intenso Amarillo intenso ex CDC grupo llc y llh Utilizacin de citrato + Hidrlisis de esculina + + + Acidificacin manitol + + sacarosa V + Hidrlisis de almidn + ND V ND ND Desarrollo en Hidrlisis agar Mac Conkey de gelatina V + + + + + + -

Elizabethkingia meningoseptica Chryseobacterium indologenes Chryseobacterium hominis Empedobacter brevis CDC grupo lle CDC grupo lli Chryseobacterium hominis

41

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GRUPO 11 Microscopa Pedobacter spp. Flavobacterium mizutaii Sphingobacterium multivorum Sphingobacterium spiritivorum Sphingobacterium thalpophilum Burkholderia mallei Inquilinus limosus Neisseria elongata subespecie nitroreducens Neisseria zoodegmatis CDC grupo EO-3 CDC grupo EO-4 Advenella incenata Paracoccus yeei Brucella spp. Psychrobacter immobilis Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Clulas vacuoladas Gram variable Cocobacilos pequeos Cocobacilos pequeos Pigmento insoluble Amarillo Amarillo V Amarillo V Amarillo V Amarillo V Amarillo V Amarillo Amarillo V Marrn claro Amarillo V Reduccin Hidrlisis Desarrollo de nitrato de urea Mac Conkey + + V + + + + v + V + V V v v v + ++ V + V + + V + + + ND V + Acidificacin manitol + V V ND lactosa V + + + + V + V ND V Desarrollo a 42 C ND + V V V V V Utilizacin Hidrlisis Colistin de citrato de esculina + S V V + + V R S + v + + + + + + R R R R R R R ND ND ND ND ND S R S (3) (4) ADH + (1) ADH ADH (2) Observaciones

(1) Inquilinus limosus desarrolla colonias mucoides. Sensible a imipenem con dimetros de halo muy grandes (40-55mm), ciprofloxacina. ADH negativo y resistencia a penicilinas, cefalosporinas, aminoglucsidos, colistin y co-trimoxazol (2) Olor caracterstico: popcorn (3) Cocobacilos (similar a Haemophilus), que se tien dbilmente. Produccin de ureasa RPIDA

(4) Psychrobacter immobilis: generalmente no desarrollan a 35 C. Temperatura ptima de desarrollo: 20 C. Fenilalanina deaminasa positiva

42

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GRUPO 12 Movilidad Acinetobacter especies Kerstersia gyiorum Bordetella holmesii (NO-2) V Hidrlisis de urea V Reduccin de nitrato Hidrlisis de gelatina V Utilizacin de agar citrato V + Pigmento marrn 10% 100% Desarrollo a 42 C V + Desarrollo en Agar SS + -

Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia GRUPO 13 Oxidasa Acinetobacter especies Inquilinus limosus V Movilidad V Reduccin de nitrato V Colistin S (1) R Acidificacin sacarosa + maltosa +

(1) Se han descripto aislamiento Colistin resistente en Acinetobacter pero principalmente correspondientes al grupo baumanii-calcoaceticus Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia GRUPO 14 Movilidad Bordetella ansorpii Bordetella trematum Kerstersia gyiorum Pandoraea spp. Inquilinus limosus + + V V V Reduccin de nitrato V V V Colistin S S ND R R Hidrlisis de esculina + Pigmento marrn soluble ND 100% Hidrlisis de gelatina + Acidificacin maltosa + sacarosa + Desarrollo a 42 C ND + + V 43

Inquilinus limosus: sacarosa y maltosa positiva

Pandoraea spp.: sacarosa y maltosa negativa

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GRUPO 15 Hidrlisis de urea Achromobacter denitrificans CDC Alcaligenes like grupo1 Oligella ureolytica V +++ Desarrollo en agar SS + ND Fenilalanina deaminasa +

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GRUPO 16 Desarrollo en agar Mac Conkey Cupriavidus pauculus Psychrobacter phenylpiruvicus Bordetella bronchiseptica Oligella ureolytica (1) Brucella spp. + V + V V Desarrollo en agar SS + + ND Utilizacin de agar citrato + + V ND Reduccin de nitrato V + V + Fenilalanina deaminasa ND + V + PYR + ND ND Colistin S S S S R

La diferenciacin entre Psychrobacter phenylpiruvicus y Brucella spp. es de gran importancia clnica y la microscopa es esencial. Brucella spp. son cocobacilos diminutos que se tien muy dbilmente. Otras pruebas diferenciales son la acidificacin de glucosa y xilosa (Brucella spp. utiliza xilosa y generalmente glucosa cunado el mtodo de deteccin es lo suficientemente sensible). Algunos sistemas comerciales de identificacin pueden misidentificar estos microorganismos. (1) Oligella ureolytica reduce nitratos y nitritos por lo cual es denitrificador pero se incluye en este grupo dado que la denitrificacin puede no detectarse segn la sensibilidad del mtodo empleado.

45

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GRUPO 17 Microscopa Myroides odoratus Inquilinus limosus (1) Pandoraea spp. (1) Advenella incenata (1) Brucella spp. (2) Haematobacter spp. (1) Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Cocobacilar pequeo Cocoide Produccin de DNAsa + ND Hidrlisis de gelatina + ND Reduccin de nitrato V V + Colistin R R R ND R ND Hidrlisis de urea + V V V + rpida + Utilizacin de citrato V ND + ND Pigmento insoluble marrn brillante Cocobacilar pequeos dbilmente teidos Caractersticas Pigmento insoluble amarillo verdoso. Olor frutal fuerte Generalmente desarrollo mucoide Hidrlisis de esculina + ND ND ND

(1) Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia (2) Ante la sospecha de Brucella spp., realizar serologa Inquilinus limosus: desarrolla colonias mucoides. Es sensible a imipenem con dimetros de halo muy grandes (40-55mm), ciprofloxacina y es resistente a penicilinas, cefalosporinas, aminoglucsidos, colistin y co-trimoxazol Inquilinus limosus: sacarosa y maltosa positiva Pandoraea spp.: sacarosa y maltosa negativa

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GRUPO 18 Movilidad Moraxella catarrhalis Laribacter honkongensis Brucella spp. Psychrobacter immobilis Inquilinus limosus V Produccin de DNAsa + ND Colistin S ND R S R Desarrollo en agar Mac Conkey + V V + Utilizacin de citrato + ND V V Caractersticas Colonia puntiforme Colonia 1 mm griscea a las 24 horas Ureasa rpida Desarrollo ptimo a 25 C Colonia mucoide

Inquilinus limosus es sensible a imipenem con dimetros de halo muy grandes (40-55mm), ciprofloxacina y es resistente a penicilinas, cefalosporinas, aminoglucsidos, colistin y co-trimoxazol GRUPO 19 Movilidad Pigmento insoluble Desarrollo en agar Mac Conkey + + Hidrlisis de esculina V + Acidificacin sacarosa + + maltosa + + Colistin ND R R Microscopa Bacilar pleomrfico Bacilar Bacilar

CDC grupo O-2


Pandoraea spp. Inquilinus limosus

+ + V

amarillo -

Inquilinus limosus: sacarosa y maltosa positiva GRUPO 20 Desarrollo en Acidificacin agar Mac Conkey de maltosa CDC grupo IIg Weeksella virosa Empedobacter brevis - / dbil + V Hidrlisis de esculina + -

Pandoraea spp.: sacarosa y maltosa negativa

Hidrlisis de gelatina + +

Pigmento insoluble V

Desarrollo a 42 C + V -

Colistin S S R

Penicilina ND S R

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Grupo 21 Reduccin de nitritos Utilizacin de citrato

Microscopia

Desarrollo en agar Mac Conkey

Desarrollo a 42 C

Prod. de catalasa

Prod. de DNAsa

Reduccin de nitratos

Utilizacin de acetato

Fenilalanina deaminasa

Otras caractersticas

Moraxella atlantae Moraxella canis Moraxella catarrhalis Moraxella lacunata Moraxella lincolnii Moraxella nonliquefaciens Moraxella osloensis Psychrobacter immobilis Neisseria zoodegmatis ( ex CDC grupo EF-4b) Oligella urethralis Bordetella petrii Gilardi bacilo grupo 1 Neisseria elongata subespecie elongata Neisseria elongata subespecie nitroreducens Neisseria elongata subespecie glycolytica Neisseria weaveri Aquaspirillum spp.

Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Cocoide Cocobacilar Bacilar Bacilar Cocobacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar

+ + + + V V + + -

V/+ ND + + + + + + + ND

dbil/+ + + + + + + + + + + + + V

ND ND ND + ND + ND ND ND ND ND ND

V V V ND ND

Colistin S ND S ND

+ + -

+ V ND V + + ND + ND ND ND ND ND

V + V V V V ND + V V V V

+ + V/+ V V + + + V V V V V

Puede retener el cristal violeta

Digiere Loeffler. Desarrolla a 5 C. Hidrlisis de gelatina V. Fosfatasa cida negativa.

S ND S S S ND ND ND S ND

ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Desarrollo no es estimulado por sales biliares. No digiere Loeffler. Fosfatasa cida positiva. Hidrlisis de gelatina negativa Generalmente no desarrolla a 35 C. Desarrolla a 25 C No digiere Loeffler. Olor tpico a maz inflado (popcorn). Hidrlisis gelatina negativa Generalmente no desarrolla a 35 C. Puede retener el cristal violeta

Pigmento insoluble mbar

Pigmento soluble amarillo. S a vancomicina colonias blanco grisceas Bacilos helicoidales. No desarrolla en NaCl al 3%

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GRUPO 22 Acidificacin de fructosa Acidificacin de manitol Desarrollo en agar Mac Conkey Desarrollo en agar SS

Acidificacin de xilosa

Utilizacin de citrato

Reduccin de nitrito

Pigmento

Produccin de indol

Otras caractersticas

Colistin

Achromobacter piechaudii Comamonas terrigena Comamonas testosteroni Pseudomonas pseudoalcaligenes (Oleovorans) Pseudomonas alcaligenes Bordetella trematum Cupriavidus respiraculi Cupriavidus taiwanensis CDC grupo O-2 Pandoraea spp. Delftia acidovorans Inquilinus limosus Brevundimonas diminuta

ND ND ND ND -

+ + + + + + + ND + + V +

Tostado soluble V Amarillo insoluble V Marrn soluble V

+ + v V + + ND + V -

+ V + ND ND ND V -

S S S S S S S S ND R R R V

+ V -

PYR + ND + ND ND ND ND ND + + V

v -

v + -

(1) (1) Delftia acidovorans produce cido antranlico a partir de triptofano (color amarillo) Fosfatasa alcalina negativa Benzil arginina arilamidasa positiva Fosfatasa alcalina negativa

Inquilinus limosus: sacarosa y maltosa positiva

Pandoraea spp.: sacarosa y maltosa negativa

Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia 48

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Grupo 23 Pigmento intracelular Advenella incenata Alcaligenes faecalis Brevundimonas diminuta Cupriavidus gilardii Cupriavidus respiraculi Pseudomonas alcaligenes CDC Grupo O-1 CDC Grupo O-2 Aquaspirillum spp. Bordetella avium Bordetella hinzii Pandoraea spp. Marrn Amarillo Amarillo Desarrollo en agar Mac Conkey ND + + + + + + + + Hidrlisis de esculina + V ND ND ND Reduccin Utilizacin Desarrollo de nitrato de citrato a 42 C V V V V V + + V V V + ND V V V + ND + + + V Desarrollo en agar Cetrimide V ND V ND Desarrollo Fosfatasa en NaCl alcalina 6,5% V + V V V + ND + + ND ND ND ND ND ND + Cocobacilos Malonato positivo Fenilalanina variable Colistin R Bacilos helicoidales Pigmento soluble amarillo variable Olor frutal intenso Puede producir pigmento soluble marrn tostado Hidroliza la tirosina Caractersticas

Brevundimonas diminuta Resistencia a desferrioxamina negativa / Benzil arginina arilamidasa positiva / PYR variable / Lipasa negativa Pseudomonas alcaligenes Utilizacin de acetato positiva / Benzil arginina arilamidasa positiva / PYR negativo Para confirmar la identificacin debe remitirse a Laboratorio de Referencia

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TABLAS ADICIONALES

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Complejo Burkholderia cepacia El complejo Burkholderia cepacia comprende hasta el momento, un grupo de 17 especies que poseen un alto grado de similitud en la secuencia del gen 16S rADN (98 a 99%) Burkholderia multivorans y, sobre todo, Burkholderia cenocepacia (Burkholderia cepacia genoespecie III) son patgenos responsables de pequeas brotes nosocomiales asociados a la utilizacin de lquidos contaminados (soluciones inyectables, antispticos) o materiales contaminados (sondas, catteres, respiradores). La identificacin de este grupo no puede basarse nicamente en los nicos caracteres fenotpicos y debera ser confirmada por tcnicas moleculares por un laboratorio de referencia.

Ornitina decarboxilasa

Hidrlisis de esculina

Hidrlisis de gelatina

Pigmento

Burkholderia cepacia Burkholderia multivorans Burkholderia cenocepacia Burkholderia stabilis Burkholderia vietnamiensis Burkholderia dolosa Burkholderia ambifaria Burkholderia anthina Burkholderia pyrrocinia Burkholderia ubonensis Burkholderia latens Burkholderia diffusa Burkholderia metallica Burkholderia seminales Burkholderia arboris Burkholderia contaminans Burkholderia lata

Amarillo Amarillo V V V Marrn V Amarillo brillo metlico Amarillo Amarillo Amarillo brillo metlico Amarillo amarillo violceo

V V V + ND +

+ + + + V + + + + + + + + V

V + + + + + V + + V + + + + V

+ + + + + + + + + + + + + + + + +

+ V + + + + V + + + + V + + +

V V + + V + V

V V + + + + V V + + + + V

V V V + V + + V

ONPG

Sacarosa Adonita Lactosa

+ + + + + + V + + + + + + + V

V + + + V V V V + V + V + -

50

Reduccin de nitrato + V V + V V V V + + V V

Lisina decarboxilasa

Oxidacin Beta hemlisis

Desarrollo a 42 C

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Gnero Neisseria Morfologa de la colonia en AC gris-beige lisa 0.5-1 mm gris-beige lisa 1-3 mm gris-beige lisa 1-2 mm gris-beige amarillento 1-2 mm gris-beige amarillento 1-2 mm verdosa amarilla lisa o rugosa adherente blanca opaca adherente 1-3 mm verdosa amarilla opaca 1-3 mm amarilla opaca 1-2 mm gris marrn lisa 1-2 mm Desarrollo en TM (35C) + + + V V V 0 AS o AC (22C) V + + + + + + Agar nutritivo (35C) V + + + + + + + + glucosa maltosa + + + + + + + + + + + + + Acidificacin lactosa + sacarosa fructosa V V + + V + + Reduccin de nitrato Polisacridos a partir de sacarosa + V + + + -

Neisseria .gonorrhoeae Neisseria meningitidis Neisseria lactamica Neisseria cinerea Neisseria polysaccharea

+ -

Neisseria subflava

Neisseria sicca Neisseria mucosa Neisseria flavescens Neisseria elongata AC: agar chocolate

TM: agar Thayer Martn

AS: agar sangre

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Diferenciacin de Neisseria spp. de Gneros relacionados: Prueba sub CIM Subcultivar en AS colocando un disco de penicilina de 10U. Incubar 18horas en atmsfera de CO2. Realizar una coloracin de Gram del desarrollo en la zona proximal de inhibicin del disco y otra coloracin de la zona distal. Resultados: A concentraciones subinhibitorias de Penicilina (zona proximal al disco), Neisseria spp. y Moraxella catarrhalis mantienen la morfologa cocoide (Fig. 1) mientras que Moraxella spp se observan como filamentos largos(Fig.2).

Fig. 1 Neisseria spp y Moraxella catarrhalis mantienen la morfologa cocoide

Fig. 2 Moraxella spp. se observan como filamentos largos

Cocoides, oxidasa positiva, asacarolticos Organismo Moraxella atlantae Moraxella canis Moraxella catarrhalis Moraxella lacunata Moraxella lincolnii Moraxella nonliquefaciens Moraxella osloensis Oligella ureolytica Oligella urethralis Psycrobacter phenylpyruvicus Psycrobacter immobilis Haematobacter spp. Movilidad + Hidrlisis de urea + (68) + ++ V + Hidrlisis de gelatina + Reduccin de nitrato + + + + V (26) + (60) V (89) Reduccin de nitrito V (20) V + V + + ND Fenilalanina deaminasa V ND + + + ND ND Produccin de DNAsa + + + (84) + (43) ND ND Utilizacin de acetato + Penicilina S ND ND S ND S S ND S S (73) ND ND

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ESQUEMA SIMPLIFICADO

Produccin de SH2 en TSI

Pigmentos fluorescentes

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Produccin de indol

Colonias amarillas

Morfologa

Bacilos

Rosa

Movilidad

Grupo de organismos

Oxidasa

Asaia spp. Azospirillum spp. Methylobacterium spp. Roseomonas spp. + + + Shewanella spp. + Balneatrix alpica + +

No rosa

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida + Agrobacterium spp. Grupo amarillo, O-1, O-2 Sphingomonas spp.

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Produccin de SH2 en TSI

Pigmentos fluorescentes

Fenilalanina deaminasa

Acidificacin de manitol

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Arginina dehidrolasa

Lisina decarboxilasa

Produccin de indol

Grupo de organismos

Morfologa

Movilidad

Oxidasa

Colistin

ONPG

Bacilos

No rosa

+ -

Pseudomonas like Grupo 2 Complejo Burkholderia cepacia + + + Burkholderia stabilis Burkholderia pseudomallei Ralstonia mannitolytica Ralstonia spp. / Pandoraea spp. Achromobacter xylosoxidans subespecie xylosoxidans (*) Brevundimonas diminuta (*) Brevundimonas vesicularis (*)

V R

ND

+ V V + V (*) Laffineur y col. 2002. J.Clin.Microbiol.40:1085-1087 v + + + ND ND V ND + V -

Burkholderia mallei oxidasa v Ochrobactrum intermedium Stenotrophomonas maltophilia (*) Sphingomonas paucimobilis/parapaucimobilis (*) Rhizobium radiobacter (*)

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Produccin de SH2 en TSI

Pigmentos fluorescentes

Acidificacin de maltosa + -

Acidificacin de manitol

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Hidrlisis de esculina

Arginina dehidrolasa

Lisina decarboxilasa

Produccin de indol

Hidrlisis de urea

Morfologa

Movilidad

Grupo de organismos

Oxidasa

Colistin

Bacilos

No rosa

ONPG -

+ Ochrobactrum anthropi Achromobacter grupo B, E + CDC Vb-3 OFBA-1 Ochrobactrum spp. Ochrobactrum spp. Acidovorax spp. Pseudomonas like grupo 2 Pseudomonas mendocina CDC grupo Ic Ochrobactrum spp. Ochrobactrum anthropi Achromobacter spp. Halomonas venusta Rhizobium radiobacter ONPG ONPG +

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Produccin de SH2 en TSI

Pigmentos fluorescentes

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Hidrlisis de esculina

Arginina dehidrolasa

Produccin de indol

Hidrlisis de urea

Bacilos

No rosa

Denitrificacin

Grupo de organismos

Morfologa

Movilidad

Oxidasa

Colistin

+ -

Pseudomonas stutzeri Ochrobactrum anthropi Pseudomonas like grupo 2 Herbaspirillum spp. CDC grupo 1 no fermentador halfilo CDC grupo O-3 Massilia timonae

+ + -

Pseudomonas stutzeri Achromobacter xylosoxidans Achromobacter xylosoxidans

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Reduccin de nitrato a nitrito

Produccin de SH2 en TSI

Hidrlisis de urea rpida

Acidificacin de manitol

Hidrlisis de acetamida

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Arginina dehidrolasa

Reduccin de nitrito

Produccin de indol

Bacilos curvos

Grupo de organismos

Morfologa

Movilidad

Oxidasa

Bacilos

No rosa

Colistin R

+ + + + + + + -

Pandoraea spp. Delftia acidovorans Inquilinus limosus Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas especie grupo 1 Bordetella bronchiseptica Oligella ureolytica Cupriavidus pauculus Pseudomonas especie grupo 1 Achromobacter denitrificans Alcaligenes faecalis Delftia acidovorans Achromobacter piechaudii Bordetella avium

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Reduccin de nitrato a nitrito

Produccin de SH2 en TSI

Desarrollo en NaCl 6.5%

Hidrlisis de urea rpida

Hidrlisis de acetamida

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Arginina dehidrolasa

Reduccin de nitrito

Produccin de indol

Grupo de organismos

Morfologa

Movilidad

Oxidasa

Bacilos

No rosa

Colistin S

+ CDC grupo halofilo 1

Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas alcaligenes Comamonas terrigena Comamonas testosteroni Achromobacter piechaudii Cupriavidus taiwanensis

Bordetella hinzii Pseudomonas alcaligenes Cupriavidus gilardii Cupriavidus respiraculi

58

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Hidrlisis de urea rpida

Acidificacin de manitol

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Hidrlisis de gelatina

Produccin de indol

Colonias amarillas

Hidrlisis de urea

Morfologa

Grupo de organismos

Bacilos

No rosa

Movilidad -

Oxidasa

+ +

Chryseobacterium indologenes /gleum Empedobacter brevis CDC grupo IIi Bergeyella zoohelcum + + Elizabethkingia meningoseptica + CDC grupo IIc, IIh, IIi Weeksella virosa Empedobacter brevis CDC grupo IIe, IIg

59

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Reduccin de nitrato a nitrito

Hidrlisis de urea rpida

Acidificacin de manitol

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Hidrlisis de esculina

Produccin de indol

Hidrlisis de urea

Grupo de organismos

Morfologa

Bacilos

No rosa

Movilidad -

Oxidasa

+ + + -

Sphingobacterium spiritivorum Inquilinus limosus Sphingobacterium thalpophilum Sphingobacterium multivorum Sphingomonas paucimobilis/parapaucimobilis Flavobacterium mizutaii + Neisseria zoodegmatis Paracoccus yeei Psychrobacter immobilis CDC grupo EO-3 CDC grupo EO-4 Myroides spp. Oligella ureolytica Alishewanella fetalis Neisseria weaveri Neisseria elongata Gilardi bacilo grupo1 + Laribacter hongkongensis

+ + -

+ -

Bacilos curvos

60

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Pigmento marrn difusible

Acidificacin de maltosa

Acidificacin de manitol

Lisina decarboxilasa Acidificacin de lactosa

Colonias pigmentadas

Oxidacin de glucosa

Hidrlisis de esculina

Hidrlisis de gelatina

Reduccin de nitrato

Lisina decarboxilasa

Desarrollo a 42 C

Hidrlisis de urea

Grupo de organismos

Morfologa

Bacilos

No rosa

Movilidad +

Oxidasa

+ + + -

Complejo Burkholderia cepacia Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitants Burkholderia gladioli Stenotrophomonas maltophilia + + Sphingomonas parapaucimobilis (oxidasa v) Bordetella ansorpii Massilia timonae (glucosa y oxidasa v) Kerstersia gyorum (movilidad v) Bordetella trematum Pandoraea spp. (oxidasa y glucosa v )

+ -

+ + + + -

Acinetobacter baumannii Bordetella parapertussis CDC NO-1 Bordetella holmesii Acinetobacter lwoffii

61

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Produccin de Dnasa

Oxidacin de glucosa

Reduccin de nitrito

Reduccin de nitrato

Movilidad

Morfologa

Pigmento marrn difusible

Hidrlisis de urea

Oxidasa

Grupo de Organismos Neisseria spp. Moraxella catarrhalis Acinetobacter spp.

Diplococos

+ -

Cocobacilos

+ + + + + + +

Oligella ureolytica Neisseria zoodegmatis Paracoccus yeei Psycrobacter immobilis (sacarolitico) CDC grupo EO-3 CDC grupo EO-4 Moraxella canis Moraxella catarrhalis Psychrobacter phenylpyruvica Brucella spp. Oligella urethralis Moraxella lacunata Moraxella liquefaciens Moraxella osloensis Psychrobacter immobilis (asacaroltico) Moraxella atlantae Moraxella lincolnii Moraxella osloensis Psychrobacter immobilis (asacarolltico) Acinetobacter baumannii CDC grupo EO-5 Bordetella parapertussis CDC NO-1 Bordetella holmesii Acinetobacter lwoffii

+ + + + -

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Procedimientos generales para la conservacin de bacilos negativos no fermentadores Mtodo Repique Vaselina Congelamiento Ultra-congelamiento Liofilizacin Crioprotector Sacarosa Glicerol Sacarosa Glicerol Leche descremada Leche descremada Sacarosa Temperatura de almacenamiento Temperatura ambiente 4 C -20 C -70 C -196 C 4 C Duracin del almacenamiento 1-3 meses 1-2 aos 1-2 aos 2-30 aos 30 aos

Condiciones de conservacin: Algunos laboratorios mantienen sus cultivos por cortos periodos de tiempo en agar nutritivo a temperatura ambiente. Sin embargo, es conveniente repicar los cultivos en tubos con tapa a rosca y mantenerlos protegidos de la luz y de los cambios de temperatura para prevenir la desecacin. Si se utilizan tubos con tapn de goma, es conveniente sellarlos con film . El mantenimiento de los cultivos a temperaturas de 5 C a 8 C disminuyen la velocidad metablica y mantiene la viabilidad por periodos ms prolongados Frecuencia de repique: La frecuencia del pasaje depende del mtodo de conservacin utilizado. Al realizar los repiques, es importante utilizar de 5 a 10 colonias representativas para evitar la introduccin de caractersticas feno o genotpicas alteradas. Control de calidad: Peridicamente (no es necesario en cada repique) deben realizarse controles de viabilidad, de estabilidad del fenotipo e identidad del microorganismo Mtodos de preservacin Vaselina: Sembrar 5 a 10 colonias del aislamiento, en estra de agar nutritivo o en un caldo nutritivo. Incubar , y una vez observado el desarrollo aadir vaselina, formando una capa de 1 a 2 cm. La vaselina debe ser de grado medicinal esterilizada por calor seco a 170 C por 1-2 horas. Congelamiento a -20 C: En algunos casos, la viabilidad pude mantenerse por 1-2 aos, sin embargo, en la mayora de los casos, la sobrevida a esta temperatura no es buena, debido al dao producido por los cristales de hielo sobre la clula bacteriana y por las fluctuaciones de electrolitos que se producen a esta temperatura. Ultracongelamiento: Los microorganismo pueden ser mantenidos viables por largos periodos a temperaturas de -70 C o menores. Los sistemas para alcanzar estas temperaturas son elctricos u tanques de almacenamiento con nitrgeno lquido (-196 C). Se pueden producir calentamientos indeseados con ambos sistemas , por cortes elctricos o prdida de nitrgeno lquido. Por lo tanto, es importante contar con un sistema de control que mecanismos de alarma ya que cualquier aumento de la temperatura reducir la viabilidad. Los viales para el almacenamiento en ultrafro deben soportar estas temperaturas y mantenerse sellados . Pueden utilizarse tubos plsticos (polipropileno) o ampollas de vidrio (borosilicato) que deben ser selladas con soplete. En general, los viales plsticos con tapa a rosca y anillo de silicona representan el sistema ms apropiado.

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Crioprotectores Glicerol: penetra la clula y protege el ambiente intracelular. Se agrega a caldo nutritivo para una concentracin final de 10% (vol/vol). Previo a su uso, el glicerol se debe esterilizar por autoclave y puede mantenerse a temperatura ambiente por meses Sacarosa: No penetra la clula y protege la membrana celular. Se prepara una solucin acuosa al 24% (peso/vol) y luego se agrega en partes iguales a caldo nutritivo (Tripticasa soya, Cerebro Infusin Corazn, etc) Leche descremada: Se prepara una solucin acuosa de leche descremada al 20% (peso/vol) y se esteriliza por autoclave a 116 C, teniendo cuidado de no sobrecalentar y producir la caramelizacin.

Procedimiento Congelamiento: la cepa debe sembrarse en un medio slido nutritivo apropiado para obtener una importante masa bacteriana. El cultivo jven se suspende en el medio crioprotector elegido . La American Type Culture Collection (ATCC) recomienda un congelamiento lento y controlado, con una velocidad enfriamiento de 1 C por minuto hasta que el vial llegue a una temperatura de al menos -30 C, seguido por un enfriamiento rpido hasta llegar a la temperatura deseada. Sin embargo, en los aos 1970s, se realizaron estudios que demostraron que el congelamiento no controlado es efectivo para la mayora de los microorganismos y es menos laborioso y mas econmico. Cuando el cultivo deba almacenarse en nitrgeno lquido, an es recomendable colocar inicialmente los viales en ultrafro (-60 C) por una hora y luego transferirlos al tanque de nitrgeno lquido. Cuando el cultivo deba almacenarse permanentemente a -60 C, -80 C, los viales pueden ser colocados directamente en las unidades de ultrafro. Existen perlas plsticas y de vidrio, que pueden agregarse al vial previo al congelamiento. La suspensin bacteriana se adsorber en la superficie de las perlas. Cada vez que sea necesario recuperar el microorganismo, se puede remover una perla individual y de esta forma se evitar el descongelamiento de toda la muestra. Descongelamiento: Cuando se descongela un cultivo se producen serios daos en las clulas bacterianas. Las temperaturas crticas son entre -40 C y -5C. El rpido calentamiento en dicho intervalo de temperaturas aumenta significativamente la recuperacin del microorganismo. Por lo tanto, el vial debe ser descongelado rpidamente en un bao a 35 C. Una vez finalizado el proceso de descongelamiento, la suspensin bacteriana debe ser sembrada inmediatamente en un medio de cultivo apropiado. Durante la fase de descongelamiento pueden ocurrir explosiones de los viales debido al rpido cambio de temperatura y el consecuente cambio en las presiones de aire dentro del vial. Por lo tanto, se recomienda utilizar gafas e indumentaria protectoras . Liofilizacin: Este es un mtodo de desecacin, en el cual se congela inicialmente la suspensin bacteriana con crioprotectores adecuados y posteriormente se evapora toda el agua en una cmara de vaco. Es el mejor mtodo de preservacin debido a que la eliminacin del agua previene el dao resultante de la accin de los microcristales de hielo en el ambiente intracelular. Para la reconstitucin se agrega una pequea cantidad de caldo nutritivo (0.1-0.4 ml) al vial liofilizado, se agita hasta completa disolucin y se siembra inmediatamente en medios de cultivo apropiados. Durante el proceso de reconstitucin, se debe trabajar en una cabina y deben utilizarse siempre gafas protectoras para evitar los aerosoles producidos al abrir un vial o ampolla con vaco en su interior.

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