CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

AULA PRTICA 07 TCNICAS DE SEMEADURA. 1) Material necessrio: - Tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-slido. - Placas de Petri com Agar simples. - Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri). - Ala e agulha de platina. 2) Fundamentao terica: Meios de cultura O estudo das bactrias necessita normalmente do seu prvio isolamento e identificao. Para tanto diversos meios de cultura so utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrognio, sais minerais e gua, que propiciam o crescimento in vitro de bactrias. A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. Excees so as riqutsias e clamdias que por serem parasitas intracelulares obrigatrios s se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema pallidum. A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de semeadura. Toda a manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumental necessrio deve ser feita seguindo-se os procedimentos bsicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de contaminao. 3) Classificao dos meios de cultura A) Quanto composio: A.1) Naturais so aqueles de origem vegetal (um pedao de batata, po, frutas) ou animal (gema de ovo). A.2) Artificiais so aqueles constitudos de substncias qumicas podendo ser definidos ou indefinidos (complexos). Definidos: sabido toda a sua composio qumica. Indefinidos ou Complexos: desconhecido por si. Sabe-se apenas aproximadamente sua composio. Os meios utilizados na rotina so complexos.

1
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

B) Quanto ao seu estado fsico: Lquido so os caldos, desprovidos de Agar. Utilizados para transporte e para bactrias que j sofreram a ao de antimicrobianos. Semi-slido so aqueles que apresentam em sua composio at 1% de Agar. Geralmente utilizados para bactrias microaerfilas. Slido so aqueles que apresentam em sua composio 1,5 a 2,5% de Agar. OBS: O Agar um polissacardeo extrado de algas, utilizado para solidificar os meios e que escolhido por no reagir com nenhuma bactria e por ser altamente resistente a variaes. C) Quanto finalidade e caractersticas: Simples contm apenas componentes bsicos para o crescimento de uma bactria. Enriquecido meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a bactria pela adio de substncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro, leite. De uso frequente para bactrias de difcil crescimento (fastidiosas). De enriquecimento meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactrias acompanhantes e permitir o crescimento da bactria alvo que se pretende posteriormente isolar, aumentando assim a proporo desta em relao s demais. Por ser um meio lquido no se destina ao isolamento da bactria. Seletivo contm substncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactrias e permitem o crescimento de outras. So meios slidos e tm como objetivo isolar culturas puras. Indicadores meios que permitem a diferenciao visual do crescimento bacteriano facilitando a sua identificao. Frequentemente os meios seletivos so tambm indicadores e todos os meios utilizados na confirmao bioqumica dos isolamentos so indicadores. A indicao mais freqente a alterao de cor do meio por mudana no pH do mesmo, podendo ainda ser a produo de gs, precipitao de componentes do meio por atividade proteoltica e lipoltica das bactrias, etc. Estoque so meios normalmente semi-slidos com a finalidade de preservar uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizaes no laboratrio. 3) Tcnicas de semeadura A finalidade bsica das tcnicas de semeadura permitir a transferncia (inoculao) de bactrias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreo,
2
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

alimento, etc) ou de um meio de cultura para outro (s) garantindo que apenas os microrganismos em questo sejam semeados. Procedimento para remover as bactrias de um meio lquido com a ala de platina.

De acordo com o tipo de meio de origem e destino bem como da finalidade especfica da inoculao, diferentes tcnicas so executadas, a saber:

3
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

I - Semeadura em meios slidos. A. Meio Inclinado em tubos (utilizar ala ou agulhas).

Em estria sinuosa: semear com ala de platina, em ziguezague, partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio. Este tipo de semeadura permite a obteno de intensa massa de microorganismos.

Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio, ou em profundidade e superfcie. Este tipo de semeadura utilizado quando se necessita um inoculo pequeno de bactrias, como em provas bioqumicas para identificao bacteriana.

4
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de uma Placa de Petri

5
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

Procedimento para repique de um meio inclinado para outro

6
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

B. Meios em p (camada alta).

Em picada em profundidade: com agulha de platina perfurar o centro do meio, sem movimentos de lateralidade e fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de cultura. Este tipo de semeadura bastante utilizado para conservao de bactrias no meio de cultura e quando o meio utilizado semislido, esta semeadura utilizada para a verificao da motilidade (As bactrias que cresceram somente ao redor do pico de semeadura no so mveis).

C. Em Placa de Petri. C.1. Em superfcie Estrias mltiplas ou esgotamento: faz-se o inculo num ponto da superfcie do meio espalhando-se o mesmo por estrias em toda a placa, de modo a gradativamente esgotar o material contido no inculo. Preferencialmente usa-se um esquema de diviso da placa em 4 quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no final da estria do quadrante anterior arrastando bactrias deste ltimo. Nesse caso, deve-se flambar a ala aps a inoculao de cada quadrante. Pode-se tambm optar por no tocar no final da estria do quadrante anterior, no sendo assim necessrio flambar a ala aps cada quadrante. A estria do ltimo quadrante ocupa a maior parte da placa. Alternativamente pode-se fazer 3 estrias, a primeira ocupando metade da placa e as outras duas um quarto da placa cada. Neste modo as estrias no se tocam. Este tipo de semeadura empregado para o isolamento de colnias bacterianas e obteno culturas puras.

7
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

Por distenso: com pipeta, colocar no centro da superfcie do meio 0,1 mL da suspenso e espalhar uniformemente com swab ou ala de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento confluente, para realizao de antibiogramas, por exemplo. Com ala de Drigalski, utilizamos para obteno de colnias dispostas de modo regular para

8
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

C.2. Em profundidade ou disseminao. Pour plate (derramanento): depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspenso bacteriana. Adicionar 10 mL do meio fundido (O Agar funde a 85 C) em tubo de ensaio e resfriado a 45-50 C. Homogeneizar com movimentos giratrios da placa sobre uma superfcie plana. Utilizado para isolamento, contagem e identificao bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado. Pour Plate.

9
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

Inoculao na Placa de Petri.

10
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM

CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral

D. Repique por pescaria: colnia em placa de Petri retirada atravs de uma agulha para um meio de cultura lquido ou slido. Mtodo empregado para isolamento bacteriano. II. Semeadura em meios lquidos. Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo (> 0,1 mL) na massa do meio, esfregando contra o interior do tubo na rea exposta pela inclinao do mesmo em 30. Aps se recolocar o tubo na posio vertical, as bactrias inoculadas se difundem para o meio. Este tipo de semeadura empregado para obteno do crescimento bacteriano (o meio fica turvo se houve crescimento). um repique normal. C) Objetivos: 1- Explanao sobre os principais meios de cultura empregados em laboratrios de Microbiologia. 2- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriolgica. 3- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura, ou seja, uma populao onde todas as bactrias se originam de uma nica clula bacteriana. Resultado:
Observaes:

Referncia bibliogrfica: CERQUEIRA, A.M.F. Apostila de aulas prticas. Medicina veterinria. Universidade Federal Fluminense UFF, 2002, 68p.

11
Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM