MAKALAH ANALISIS SEDIAAN KOSMETIK BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTITASI

Oleh : Kelompok 3

Lesti Eko Pangestuti Theresa Nurpeni Eka P. Renysasi Maria Ulfa Yunita Purnamasari Nindya P. Anita Meilina A. Jessica Dwi Puspita

102210101033 102210101035 102210101037 102210101039 102210101041 102210101043 102210101045

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB I PENDAHULUAN

Validasi adalah kebutuhan dasar untuk menjamin kualitas dan reliabilitas hasil untuk semua aplikasi analitis. Namun, dibandingkan dengan analisis kimia, dalam analisis farmasi, beberapa aspek dan kondisi khusus ada yang perlu dipertimbangkan. Oleh karena itu, tingkat pengetahuan dan keahlian harus jauh lebih besar dibandingkan dengan metode standar. Hal yang sama dapat diasumsikan untuk sampel yang dianalisis. Matriks (plasebo) dalam analisis farmasi biasanya konstan dan telah diketahui dalam rentang dimana sampel di bawah analisis didefinisikan dengan baik dan tidak terlalu besar. Evaluasi (batch, investigasi stabilitas) didasarkan pada hasil berbagai prosedur atau tes kontrol, sehingga dapat saling melengkapi. Batas penerimaan dari spesifikasi adalah nilai tetap, sering didasarkan pada tradisi, seperti dalam kasus uji dari bahan aktif atau mungkin didasarkan pada studi toksikologi tertentu, yang mengambil faktor keamanan yang besar untuk diperhitungkan seperti untuk ketidakmurnian. Terakhir, validasi dalam analisis farmasi memiliki peraturan sendiri. Ini merupakan suatu pernyataan yang membuat jelas bahwa pertimbangan khusus akan berdampak pada jalan validasi dalam analisis farmasi yang dilakukan . Tujuan validasi dari prosedur analitis adalah untuk menunjukkan bahwa analisis tersebut cocok untuk tujuan yang telah ditetapkan, ditentukan dengan cara terdokumentasi dengan baik eksperimental studi. Akurasi dan keandalan dari hasil analisis sangat penting untuk memastikan kualitas, keamanan dan kemanjuran obat-obatan. Untuk alasan ini, persyaratan peraturan telah dipublikasikan selama bertahun-tahun. Konferensi Internasional tentang Harmonisasi Persyaratan Teknis untuk Pendaftaran Farmasi (ICH) dimulai pada tahun 1990, sebagai forum untuk dialog yang konstruktif antara pihak berwenang dan industri, dalam rangka harmonisasi persyaratan pengajuan untuk obat-obatan baru antara Eropa, Amerika Serikat dan Jepang. Salah satu topik pertama dalam bagian Kualitas adalah validasi analitis dan ICH sangat membantu dalam harmonisasi istilah dan definisi serta menentukan persyaratan dasar. Tentu saja karena sifat dari proses harmonisasi, ada beberapa kompromi dan inkonsistensi. Dua pedoman validasi dikeluarkan oleh Food and Drug Administration (FDA), pertama untuk pemohon dan yang lain untuk pemeriksa dan peninjau. Pedoman pertama juga dimaksudkan untuk memastikan bahwa prosedur analitis dapat diterapkan dalam FDA laboratorium dan karena itu membutuhkan penjelasan rinci tentang prosedur, referensi bahan,

serta diskusi tentang potensi pengotor dan lain-lain. Pedoman kedua berfokus pada kromatografi fase terbalik dan memberikan banyak rincian dengan berkenaan dengan isu metodologi kritis, serta beberapa indikasi penerimaan hasil. Sebuah draft revisi pedoman pertama diterbitkan pada tahun 2000. Menurut judul "Prosedur analitis dan metode validasi", juga termasuk konten dan format prosedur analitis, persyaratan untuk standar referensi dan berbagai jenis teknik analitis. Oleh karena itu, pedoman ini lebih komprehensif dari Pedoman ICH, tapi agak terlalu difokuskan pada penyediaan instrumen keluaran / data mentah. Karena ini adalah inspeksi dan masalah dokumentasi, hal tersebut harus dipisahkan dari validasi. Sebuah diskusi yang sangat rinci disediakan dalam pedoman Kanada sehubungan dengan persyaratan dan khususnya kriteria penerimaan, meskipun ini memungkinkan beberapa orientasi, kriteria penerimaan yang diberikan kadang-kadang agak terlalu ambigu, misalnya antara presisi / reproduktifitas kurang dari 1 % untuk bahan obat.

BAB II PEMBAHASAN

Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Otoritas pengaturan mensyaratkan profil kemurnian substansi obat dan produk obat sebagai bagian dari proses pemasaran. Persyaratan keamanan dihubungkan dengan uji toksikologi untuk bahan aktifnya, seperti halnya kemurnian sintesis dan degradasi. Oleh karena itu, diperlukan profil kemurnian dalam rentang uji pada uji toksikologi dan untuk membatasi berbagai degradasi produk. Pembahasan ini ditujukan untuk menguji ketersediaan metode untuk menentukan adanya analit (Batas Deteksi/LOD) dan menetukan jumlah terkecil analit yang dapat diukur dengan terpercaya (Batas Kuantitasi/LOQ). Menurut ICH, Limit deteksi dari prosedur analisis individual merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi, tapi tidak perlu dikuantifikasi sebagai suatu nilai pasti. Limit kuantifikasi dari prosedur analisis individual merupakan konsentrasi analit dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang sesuai. Bermacam pendekatan dapat diaplikasikan, yaitu: Definisi visual Kalkulasi dari perbandingan signal-to-noise (LOD dan LOQ berkorespondensi 3 atau 2 dan 10 kali level noise, berturut-turut) Kalkulasi dari deviasi standar blanko (persamaan 1) Kalkulasi dari garis kalibrasi pada konsentrasi rendah (persamaan 1) LOD; LOQ = Keterangan : F SD : faktor 3,3 untuk LOD dan 10 untuk LOQ : deviasi standar blanko, deviasi standar intersep ordinat atau deviasi standar residual regresi linier b : slope garis regresi (persamaan 1)

1. Respon Detektor Analisis Tipe analisis kemurnian yang sering digunakan yaitu pemisahan kromatografi. Biasanya detektor analisis HPLC memberikan output tegangan listrik berkelanjutan. Untuk dapat mengkomputerisasi area puncak, dan lain sebagainya, dibutuhkan konversi tegangan menjadi sebuah rangkaian sinyal waktu terpisah yang dapat diproses oleh Sistem Data Kromatografi. Untuk menghasilkan konversi ini, digunakan sebuah konverter A/D (Analog ke Digital) seperti dalam gambar 1.

Detektor
Analisis Misal: LC UV Analog 0 1 Volt

Konverter Analog ke Digital

Digital V.detik

Sistem Data Kromatografi

Gambar 1. Konversi tipe A/D sinyal kromatografi.

a. Noise dan Drift (Penyimpangan) Noise dan drift adalah gangguan/masalah yang sering terjadi pada kromatografi. Semakin rendah tingkat analit yang dapat dideteksi atau diukur, maka semakin buruk masalah yang terjadi. Adanya drift atau spiking akan membuat masalah lebih buruk dalam penetuan puncak tanpa noise. Contoh-contoh khas yang dihadapi dalam kromatografi ditunjukkan pada gambar 2. Pada gambar 2, dapat kita lihat berbagai tipe noise dan drift.

Gambar 2. Tipe noise dan drift

Metode yang paling umum digunakan untuk mengukur noise adalah metode peak-to-peak. Metode ini dapat dilihat pada gambar 3. Sepasang garis paralel digambar di atas sepanjang grafik waktu yang dibutuhkan dan kemudian jarak maksimum antara 2 garis tersebut diukur.

Gambar 3. Noise peak to peak

Adanya baseline shift akan merumitkan penetuan peak. Cara yang lebih baik dalam memperkirakan noise untuk masing-masing daerah dapat diilustrasikan dengan garis putus-putus. Seperti yang tergambar pada gambar 4.

Gambar 4. baseline shift dan noise peak to peak

American Society for Testing and Materials (ASTM) telah mengembangkan sebuah pendekatan dalam pengukuran noise dan drift untuk detektor fotometri yang digunakan dalam HPLC. Short-term noise (noise jangka pendek) didefinisikan sebagai noise yang terjadi pada rentang setengah sampai satu menit selama 15 menit. Longterm noise (noise jangka panjang) adalah noise yang terjadi pada rentang sepuluh menit selama 20 menit dan drift selama 60 menit. Metode peak-to-peak pengukuran noise dan drift pada detektor UV LC dapat dilihat pada gambar 5.

Gambar 5. Noise ASTM dan ukuran drift dengan detector LC UV

2. Persyaratan untuk LOD/LOQ dalam Penentuan Ketidakmurniaan/Pengotor dalam Bidang Farmasi a. Variabilitas dari LOQ Secara ekperimental (berdasarkan percobaan), didapatkan variasi LOQ dalam kisaran faktor antara 2 dan 5. Ketika kondisi eksperimental sederhana (elusi isokratik, dilusi/pengenceran analit dari suatu larutan stok ke dalam fase gerak), hasil dari penelitian sebagian besar mencerminkan pengaruh instrumental. (Oleh karena itu, batas penerimaan standar deviasi relatifnya sebesar 10% yang digunakan sebagai acuan dalam memperkirakan kepresisian LOQ). Dalam kondisi otentik, yaitu analit (pengotor) dalam matriks kompleks pada bahan aktif, pengotor lainnya dan plasebo (dalam kasus produk obat), variabilitas tambahan dapat diterima. Namun, dalam penerapan perhitungan yang sama, variabilitas yang tinggi dalam hasil LOQ perlu dipertimbangkan. Hal ini penting, karena dalam analisis farmasi, batas penerimaan konstan (fixed acceptance limit) untuk pengotor sangat diperlukan dan prosedur analisis harus mampu melakukan pengukuran terpercaya dalam semua aplikasi. Khususnya untuk aplikasi jangka panjang seperti studi stabilitas atau ketika peralatan yang digunakan berbeda atau suatu metode digunakan pada laboratorium yang berbeda. Sebagai konsekuensinya, nilai LOQ dari prosedur analisis memiliki karakter yang tercantum pada parameter umum.

Gambar 6. Studi LOQ menggunakan lima sistem LC dengan pengulangan sebanyak 1 sampai 6 kali per sistem selama sembilan bulan. Kolom yang memiliki warna yang sama menggambarkan bahwa sistem LC yang digunakan adalah sama dan urutan pangulangannya yaitu, kolom oranye pertama untuk setiap jenis cara perhitungan berhubungan/sesuai dengan studi LOQ-pertama pada sistem LC-1, sedangkan kolom kedua untuk seri kedua pada sistem 1

b. Batas kuantitatif umum (General Quantitation Limit) Secara statistik, Quantitation limit (QL) secara umum dapat diartikan sebagai batas atas distribusi dari tiap-tiap nilai QLs. Dengan demikian, dibutuhkan satu metode untuk mendapat hasil yang sebenarnya dalam melakukan uji intermediate QL. Berdasarkan pada penentuan angka berulang, batas atas mungkin dideskripsikan sebagai suatu hasil penelitian yang terbesar atau (sedikitnya terdapat 6 angka penentuan QL, hal ini dilakukan untuk memastikan metode yang dapat dipercaya) menghitung dari hasil rata-rata dan standart deviasi. Untuk penelitian standart deviasi dapat dilihat pada gambar 6. Pedoman ICH memberikan batasan mengenai substansi-substansi yang tidak diketahui seperti berikut (Tabel 1).

Tabel 1. Nilai ambang penerimaan syarat untuk kemurnian yang tidak diketahui sesuai dengan ICH

Pelaporan batasan/ambang ini dapat diartikan sebagai batasan kuantitatif minimum dan nilai ini langsung dapat dipergunaklan sebagai QLgeneral. Bila dibutuhkan untuk menentukan (aksi) batasan dari prosedur analisis, nilai QL dapat secara spesifik dihitung menggunakan presisi aktual dari prosedur analisis pada konsentrasi ini. Perhitungan berdasarkan pada penerimaan/kompatibel antara variabilitas dan spesifikasi batasan penerimaan. QL dapat diartikan sebagai suatu kandungan kemurnian zat maksimum dari suatu proses produksi batch (gambar 7).

Gambar 7. Batas penerimaan dari spefikasi (AL) termasuk analitikal dan variablitas produksi. Batas kuantitatif yang sebenarnya (QL) menggambarkan variabilitas produksi maksimum dengan kemurnian kandungan. Variabilitas analitikal dapat dideskripsikan dengan interval prediksi 95%.

3. Pendekatan Berdasarkan Blanko Terdapat 2 pendekatan yang berbeda untuk estimasi DL dan QL dari blanko. Pertama berdasarkan pengukuran sederhana rasio puncak signal-to-noise menggunakan pendekatan peak-to-peak. Rasio signal to noise dihitung dari persamaan:

H merupakan tinggi puncak dalam kromatogram yang diperoleh dari larutan referensi tertentu dan diukur dari puncak maksimum ke dasar ekstrapolasi dari sinyal yang diamati melalui jarak yang setara 20 kali lebar setengah tinggi puncak. h merupakan background noise dari peak-to-peak pada kromatogram yang ditentukan setelah injeksi atau pengaplikasian blanko, mengobservasi melalui jarak yang setara 20 kali lebar setengah puncak dari kromatogram yang ditentukan. Pendekatan ini ditentukan dalam Farmakope Eropa. Penting bahwa sistem ini bebas dari pergeseran baseline yang signifikan.

Gambar 8. Contoh signal-to-noise dari 10:1 (atas) dan 3:1 (bawah), menggunakan metode EP. Pendekatan ini hanya untuk penentuan tinggi puncak.

Untuk pengukuran daerah puncak, harus berdasarkan standar deviasi blanko. Dasar statistik dari DL didefinisikan seperti yang ditunjukkan melalui grafik pada gambar 9. Kurva putus-putus mewakili distribusi nilai-nilai blanko dan garis tebal adalah dari analit untuk dideteksi. Adanya kurva overlap menunjukkan adanya kemungkinan kita telah mendeteksi analit padahal sebenarnya sinyal blanko (positif palsu, error atau error tipe 1). Alternatif lain, kita dapat menyimpulkan bahwa analit tidak terdeteksi ketika faktanya ada (negatif palsu, error atau error tipe 2). Pada beberapa teknik analisis, khususnya spektroskopi atom,

bila terdapat negatif palsu, yaitu, sebesar 50% kesalahan. Hal ini diilustrasikan dalam gambar 9.

Gambar 9. Basis statistic untuk batas deteksi

Dalam ICH, batas deteksi dan kuantitasi dijelaskan dalam istilah yang serupa tetapi dengan dasar risiko yang berbeda. DL dan QL didefinisikan sebagai kelipatan dari standar deviasi noise blanko (Persamaan 1). kelipatan 3,3 untuk DL dan 10 untuk QL. Hal Ini diilustrasikan dalam gambar 10.

Gambar 10. Dasar statistic untuk batas deteksi ICH dan batas kuantitatif (DL dan QL)

4. Penentuan DL/QL dari Linearitas Pendekatan ini didasarkan pada parameter dari suatu regresi linier unweighted menggunakan analit konsentrasi rendah. Syarat yang harus dipenuhi yaitu, perbedaan homogenitas dan respon fungsi linear. Parameter regresi digunakan untuk medeskripsikan penyebaran (disperse) tentang hasil analisis. Sebagai peraturan yang sudah disetujui, untuk

LCUV, range konsentrasi menggunakan garis kalibrasi yang mestinya tidak melebihi 1020 lipatan DL. Pada range ini, peningkatan variasi pada umumnya dapat diasumsikan mempunyai pengaruh minor pada parameter disperse yang regresi linear unweighted Kepercayaan penghitungan QL pada banyaknya data yang digunakan ditunjukkan pada Gambar 16. Seperti yang diharapkan, suatu jumlah besar pada data meningkatkan keandalan parameter dispersi, dan sebagai konsekuensi QL yang dihitung, untuk perbedaan luas bergantung pada cara perhitungan. Pada umumnya, sedikitnya sekitar delapan konsentrasi direkomendasikan. a. Standar Deviasi dari Respons Salah satu pilihan yang sesuai dengan ICH, (persamaan 1), adalah dengan menggunakan standar deviasi residual berdasarkan regresi. Parameter tersebut menjelaskan bahwa variasi dari data eksperimental di sekitar garis regresi dan dapat dianggap sebagai ukuran variabilitas. Dengan cara membagi standar deviasi dari slope kurva untuk mengubah respon (sinyal) ke konsentrasi yang sesuai. Untuk faktor sebesar 3,3 dan 10 pada DL dan QL, masing masing digunakan untuk membedakan antara distribusi pada blanko dan analit. Perhitungan tersebut ditunjukkan pada estimasi QL, hal tersebut dimungkinkan karena konsentrasi standar deviasi residual lebih tinggi (dalam berbagai contoh ditunjukkan meningkat 10x lipat). Pendekatan ini kurang sensitif terhadap jumlah data yang kecil, tetapi sebagian besar dipengaruhi oleh konsentrasi. Standar deviasi dari intersep dapat dianggap sebagai variabilitas ekstrapolasi dari determinasi blanko. Nilai QL dihitung sedemikian rupa secara substansial lebih rendah dari yang diperoleh dari regresi standar deviasi residual. Kondisi tersebut dapat dijelaskan dari masing masing persamaan.

b. 95% Interval Prediksi dari Garis Regresi Interval prediksi dari garis regresi adalah ukuran variabilitas dari penentuan percobaan. DL dan QL dapat didefinisikan oleh berbagai derajat tumpang tindih distribusi probabilitas mereka dengan yang blangko. Dengan batas kuantitasi yang tumpang tindih berkurang sampai 5%, sehingga menjamin kuantifikasi terpercaya. Perbedaan pada pendekatan perhitungan dengan menggunakan standar deviasi dari blangko adalah bahwa hasil percobaan dari konsentrasi analit terkecil yang digunakan untuk regresi, bukan dari blangko saja, melainkan dari interval prediksi yang

menggambarkan penentuan probabilitas masa depan. Oleh karena itu, ketidakpastian yang lebih besar dapat disertakan, sehingga asumsi risiko dapat berbeda. Gambar 11 menggambarkan derivasi grafis dari DL dan QL pada interval prediksi 95%.

Gambar 11. Pemanfaatan interval prediksi 95% (garis putus-putus) dari sebuah garis linier dengan regresi setimbang (garis tebal) untuk mendapatkan DL dan QL. Garis horisontal menunjukkan lebar 95% dari distribusi probabilitas (setengah atas) blangko (P-BL), batas deteksi (P-DL), dan batas kuantisasi (P-QL).

5. Pendekatan Berbasis Presisi Batas kuantisasi juga dapat diperoleh dari studi presisi. Untuk pendekatan ini, penurunan konsentrasi analit dianalisis berulang kali dan standar deviasi relatif diplot terhadap konsentrasi yang sesuai (fungsi presisi). Jika batas yang ditetapkan telah terlampaui (seperti 10 atau 20%), konsentrasi yang sesuai ditetapkan sebagai batas kuantisasi. Dalam literatur yang menggambarkan pendekatan ini, seringkali peningkatan variabilitas menyebabkan penurunan konsentrasi menjadi hal yang harus dipertimbangkan (seperti garis putus-putus dalam gambar 12. Namun, dalam prakteknya, karena variabilitas yang tinggi dari standar deviasi), fungsi presisi yang benar jauh lebih sulit untuk digambarkan (lihat dalam gambar 12), kecuali konsentrasi dalam jumlah besar ditambahkan. Perlu dicatat, bahwa kurva presisi rata-rata mewakili variabilitas untuk konsentrasi tertentu, sedangkan hasil yang terpencar secara individu diperoleh dalam rentang yang lebih besar, misalnya, pada 0,05 mg / ml dari 5 sampai 25%, dengan rata-rata sekitar 15%.

Gambar 12. Rangkaian presisi yang diulangi dengan mengurangi konsentrasi. Enam penentuan telah dilakukan untuk masing-masing konsentrasi. Estimasi fungsi presisi rata-rata diilustrasikan oleh garis putus-putus, batas penerimaan ketepatan yang digambarkan oleh suatu garis tebal. Catatan, presisi secara individu untuk dapat diterima (secara umum didefinisikan sebagai QL), batas yang lebih besar akan diperlukan, misalnya, pada 20% RSD

6. Poin kunci Mode perhitungan senantiasa diperlukan untuk ditentukan dan harus cukup mendetail. Variabilitas tinggi dalam penentuan QL yang sebenarnya harus dipertimbangkan. Batas penerimaan yang tetap untuk pengotor diperlukan (dalam analisis farmasi), karena itu 'QLgeneral harus ditetapkan, dari persyaratan atau penentuan eksperimental yang cukup dipercaya. Untuk penentuan QL secara praktis dan relevan, pengotor harus ditentukan pada substansi obat atau produk obat, sebagai contoh, masing-masing matriks. Jika benar diterapkan, semua pendekatan QL menunjukkan hasil yang sebanding dan benar. Oleh karena itu, pendekatan yang paling pragmatis dapat dipilih. Jika diperoleh dari penentuan linieritas, menghindari rentang konsentrasi yang terlalu besar (>sepuluh sampai 20 kali lipat) dan ekstrapolasi, dan menggunakan jumlah penentuan yang memadai (setidaknya delapan). Validitas QL harus secara rutin dikonfirmasi dalam uji kesesuaian sistem.

BAB III PENUTUP

Dalam pembahasan yang telah kami sampaikan dapat diperoleh beberapa kesimpulan, antara lain : Batas deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Keberadaan analit dapat dideteksi, tetapi konsentrasinya tidak dapat diukur secara kuantitatif. Batas kuantitasi (LOQ) yaitu jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang cocok. Batas kuantitasi merupakan parameter tes kuantitatif untuk konsentrasi rendah senyawa dalam matriks sampel dan digunakan terutama untuk penentuan kotoran dan atau produk degradasi. ICH menjelaskan tiga metode untuk menentukan LOD dan LOQ yaitu Inspeksi visual, Standar deviasi dari respon berdasarkan standar deviasi dari blanko dan Standar deviasi dari respon berdasarkan kemiringan kalibrasi kurva.

DAFTAR PUSTAKA

Bliesner, David M. 2006. Validating Chromatographic Methods A Practical Guide. New Jersey: John Wiley Sons, Inc. Ermer, J. dan Miller, J.H.Mcb. 2005. Method Validation In Pharmaceutical Analysis. Weinheim: Wiley-Vch Verlag Gmbh & Co. Kgaa. Huber, Ludwig. 2007. Validation And Qualification In Analytical Laboratories. Germany: Waldbronn Agilent Technologies