Pendahuluan

Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh., karena zat ini di samping berfungsi sebagai bahan baker dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsure-unsur C,H,O dan N yang tidak di miliki oleh lemak dan karbohidrat. Molekul protein mengandung pula fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsure logam seperti besi dan tembaga. Sebagai zat pembangun protein merupakan bahan pembentuk jaringan-jaringan baru yang selalu terjadi dalam tubuh. Pada masa pertumbuhan proses pembentukan jaringan terjadi secara besar-besaran, pada masa kehamilan droteinlah yang membenuk jaringan janin dan pertumbuhan embrio. Protein juga mengganti jaringan tubuh yang rusak dan yang di rombak. Fungsi utama protein bagi tubuh ialah untuk membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang telah ada.

Protein dapat juga di gunakan untuk bahan baker apabila keperluan energi tunbuh tidak terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ikut pula mengatur berbagai proses tubuh baik langsung maupun tidak langsung dengan membentuk zat-zat pengatur proses dalam tubuh. Protein mengatur keseimbangan cairan dalam jaringan dan pembuluh darah, yaitu dengan menimbulkan tekanan osmotic koloid yang dapat menarik cairan dari jaringan ke dalam pembuluh darah. Sifat atmosfer protein yang yapat bereaksi dengan asam dan basa, dapat mengatur keseimbangan asam-basa dalam tubuh. Protein dalam tubuh manusia, terutama dalam sel jaringan, bertindak sebagai bahan membrane sel, dapat membentuk jaringan pengikat misalnya kolagen dan elastin, serta membentuk protwin yang inert seperti rambut dan kuku. Di samping itu protein yang bekerja sebagai enzim, bertindak sebagai plasma (albumin), membentuk antibody, membentuk komplek dengan molekul lain, serta dapat bertindak sebagai bagian sel yang bergerak. Kekurangan protein dalam waktu lama dapat menggaggu berbagai proses dalam tubuh dan menurunnkan daya tahan tubuh terhadap penyakit.

Siklus protein --> Di dalam tubuh manusia terjadi suatu siklus protein, artinya protein di pecah menjadi komponen-komponen yang ebih kecil yaitu adam amino dan atau peptide. Terjadi juga suatu sintesis protein baru untuk mengganti yang lama. Praktis tidak ada sebuah molekul protein pun yang di sintesis untuk di pakai seumur hidup. Semuanya akan di pecah dan di ganti dengan yang baru dengan laju yang berbeda tergantung jenis dan keperluanya dalam tubuh. Waktu yang di perlukan untuk mengganti separuh dari sejumlah kelompok protein tertentu dengan protein baru di sebut half life atau waktu paruh jangka hidup protein

 Metode dan Prosedur

Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut. Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV. Digunakan untuk protein terlarut. 1. Metode Kjeldahl Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Penetapan Kadar Prosedur : 1. Timbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl (kalau kandungan protein tinggi, misal kedelai gunakan bahan kurang dari 1 g). 2. Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat. 3. Panaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan teruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan sudah menjadi jernih. Tambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit, matikan pemanasan dan biarkan sampai dingin. 4. Selanjutnya tambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya tambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es. 5. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. 6. Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.

7. Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml. Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko. Kadar Protein Kadar protein dihitung dengan persamaan berikut :

Keterangan : Fk : faktor koreksi Fk N : 16 2. Metode Titrasi Formol Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik. 3. Metode Lowry Prosedur : Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1) Pembuatan reagen Lowry B : Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%.

Penetapan Kadar a. Pembuatan kurva baku Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 g/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut :

Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca absorbansinya

pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas) b. Penyiapan Sampel Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya. 4. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret) Prosedur : Pembuatan reagen Biuret : Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda. Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA): Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li). Penetapan kadar (Metode Biuret) : Pembuatan kurva baku : Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades misal dengan komposisi sebagai berikut:

Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada 550 nm terhadap blanko yang terdiri dari 800 L reagen Biuret dan 200 L aquades. Cara mempersiapkan sampel : Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml.

Ambil sejumlah L larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif. Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva baku. 5. Metode Spektrofotometri UV Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel.

Kadar protein mg/ml = A280 x faktor koreksi x pengenceran

 Diagnosa Dan Pemeriksaan Lab

Tahap destruksi Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya. Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah: H R-C-COOH NH2 Asam amino CuSO4 (protein) NH3 + H2SO4 Na2SO4 (NH4)2SO4 Hasil Destruksi destruksi NH3 + CO2 + H2O

H2SO4

2.

Tahap destilasi

Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP. Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah: (NH4)2SO4 + NaOH NH3 + HCl 0,1 N NH3 NH4Cl + H2O + Na2SO4

Berlebihan

3.

Tahap titrasi

Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP. Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah: HCl 0,1 N + NaOH 0,1 N Kelebihan Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut: %N = ml NaOH blanko ml NaOH sampel N. NaOH 14,008 100% Gram bahan x 1000 Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda. Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut: %N = ml NaOH blanko ml NaOH sampel N. HCl 14,008 100% Gram bahan x 1000 Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan. Kadar protein (%) = % N x faktor konversi Nilai faktor konversi berbeda tergantung sampel: NaCl + H2O

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Sereal Roti Sirup Biji-bijian Buah Beras Susu

5,7 5,7 6,25 6,25 6,25 5,95 6,38

8. 9.

Kelapa Kacang Tanah

5,20 5,46

Apabila faktor konversi tidak diketahui, faktor 6,25 dapat digunakan . Faktor ini diperoleh dari fakta rata-rata nitrogen dalam protein adalah 16 %. Kadar Protein (%) = N x 100/16 = N x 6,25

Bahan Pangan Hewani

Kandungan Protein (% basis basah) 18,5 23,1 12,5 26,5 3,3 36,2 24,9 5,3

Bahan Pangan Nabati

Kandungan Protein (% basis basah) 7,9 13,7 6,9 0,3 0,2 2,0 36,5 15,8

Daging sapi Daging ayam Telur Ikan Tuna Susu Segar Susu skim (kering) Keju cheddar Yoghurt

Beras Tepung gandum Tepung maizena Pati jagung Apel Kentang Kacang kedelai Tahu