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Revendo Cincias Bsicas

O objetivo desta subseo apresentar revises concisas sobre temas relacionados com as cincias bsicas, ou seja, procurar rever as bases da prtica mdica. A justificativa para a incluso de tpicos dessa natureza relaciona-se com os significativos progressos dessas cincias nas ltimas dcadas e necessidade absoluta de atualizao por parte da equipe de sade, para o benefcio dos pacientes. Magda M. S. Carneiro-Sampaio
Editora Associada da einstein

Srie - Biologia molecular Atualizao Parte 2 - Uso das tcnicas de biologia molecular para diagnstico
Adriana Lopes Molina1, Patrcia Renovato Tobo2
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Pesquisadoras do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein - So Paulo (SP). 2 Pesquisadoras do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein - So Paulo (SP).

As tcnicas hoje utilizadas na gentica molecular tm sido desenvolvidas a partir da pesquisa acadmica bsica, em diferentes campos da atividade cientfica(1-3). O trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla-fita do DNA, marcou a revoluo molecular. Em 1975, Nathans e Smith purificaram enzimas de restrio, ferramentas essenciais para a manipulao in vitro do DNA. Estas foram de fundamental importncia para o isolamento e amplificao de fragmentos especficos de DNA para a clonagem in vivo, tecnologia desenvolvida a partir das tcnicas de DNA recombinante descritas por Berg em 1972. Tambm em 1975 uma nova metodologia, denominada Southern blotting, comeou a ser usada para investigar a localizao de genes e marcou o incio da aplicao destas tecnologias no estudo das doenas genticas. Em 1977, tcnicas de seqenciamento permitiram a identificao de alteraes especficas na seqncia de DNA e a associao destas com diferentes doenas genticas. Depois disso, o principal marco no desenvolvimento das tcnicas de diagnstico molecular foi a tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR), um mtodo de clonagem in vitro proposto por Kary Mullis em 1987. Desde a introduo da tcnica de PCR, rpidos avanos nas tcnicas de gentica molecular tm

revolucionado a prtica da patologia, anatomia e anlises clnicas. As tcnicas moleculares so agora aplicveis a todas as reas do laboratrio clnico. Na anatomia patolgica, apesar das anlises morfolgicas ainda serem a principal ferramenta de trabalho, resultados dos estudos de gentica molecular tm integrado, cada vez mais, os diagnsticos nas anlises cirrgicas(3-5). Os estudos genticos moleculares utilizam uma variedade de tcnicas para analisar os cidos nuclicos (DNA e RNA). Dentre estas tcnicas destacam-se: tcnica de hibridizao do tipo dot ou blot, Southern e Northern, e hibridizao in situ; tcnicas de amplificao de alvos-especficos como a PCR, PCR competitiva, PCR-transcriptase reversa (RT-PCR) e a PCR em tempo-real; mtodos de amplificao de sinal, como por exemplo branched DNA (bDNA); tecnologia de arrays. Os resultados destes ensaios podem ser teis no diagnstico, prognstico, determinao da terapia a ser utilizada, e at mesmo na avaliao da suscetibilidade a doenas. As principais reas de aplicao das tcnicas moleculares de diagnstico so: doenas infecciosas, cncer, doenas genticas, transplantes e patologia clnica(4-8). Estes estudos podem ser realizados no sangue perifrico, fluidos corporais, materiais obtidos atravs de puno, tecidos frescos e tecidos embebidos em parafina. Na rea de doenas infecciosas, a deteco rpida de microrganismos de crescimento lento, ou daqueles no cultivveis, se torna possvel atravs das tcnicas de biologia molecular. As tcnicas moleculares tambm podem ser empregadas na determinao de resistncia antimicrobiana, no monitoramento de doenas atravs da quantificao da infeco e em estudos epidemiolgicos(4). Na rea de gentica humana, a biologia molecular tornou-se ferramenta fundamental no diagnstico das doenas monognicas, permitindo no s a identificao do gene afetado, mas tambm da mutao responsvel pela doena. A disponibilidade dos mtodos diagnsticos tem possibilitado tambm a identificao de portadores heterozigotos, o diagnstico pr-natal e a triagem populacional para estas doenas. Embora a maioria dos testes genticos ainda se destine ao diagnstico e preveno de doenas raras, os avanos tecnolgicos tm permitido o uso destes testes para a avaliao de risco de doenas como cncer e doenas cardiovasculares (9-11). A correlao entre mutaes gnicas e suscetibilidade a doenas particularmente importante no cncer, sendo que cerca de 5% a 10% do casos ocorrem em indivduos que herdaram alguma predisposio a essa doena. Dentre

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os genes mais estudados de predisposio ao cncer esto o BRCA1 e BRCA2, nos cnceres de mama e ovrio hereditrios e os genes de reparo do DNA, MLH1 e MSH2, para os tumores colorretais. Assim, entre as diversas possibilidades de aplicaes da biologia molecular no diagnstico, os testes moleculares mais comumente empregados so: os de avaliao de carga viral para HIV e hepatite C, testes para trombofilia hereditria, testes para mutaes genticas nos casos de cncer familial, hibridizao in situ fluorescente (FISH) para estudos das trissomias mais comuns no lquido amnitico, para a amplificao do gene HER-2 em cncer de mama, alm de numerosos testes genticos disponveis para a avaliao de doenas hematolgicas.

polimerase tambm bastante flexvel, permitindo uma srie de modificaes que possibilitam o seu emprego na anlise de uma grande variedade de amostras. Para a realizao da PCR, utiliza-se uma enzima termoestvel (DNA polimerase) que, na presena de um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers) e dos nucleotdeos que compem a molcula de DNA, amplifica a regio de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA. Esta amplificao ocorre durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 94C para desnaturao do DNA, 45C a 70C para hibridizao dos oligonucleotdeos s seqncias-alvo e 72C para a sntese do DNA, em equipamentos chamados de termocicladores. O DNA amplificado pode, ento, ser separado e visualizado em gis de agarose ou poliacrilamida e utilizado para diversos fins (figura 1).

Tcnicas de amplificao do sinal (hibridizao) Esta tecnologia, introduzida primeiramente por Southern em 1975, emprega sondas de DNA com homologia seqncia do DNA-alvo em estudo. Atualmente, apesar da disponibilidade de diversas outras tcnicas mais rpidas, o Southern blotting continua a ser muito utilizado. As sondas de DNA podem ser usadas para identificar seqncias especficas de DNA ou RNA em diversas amostras, sendo empregadas tanto em ensaios de deteco como de atividade. As sondas podem ser marcadas com radioatividade ou com quimiofluorescncia. Uma vez hibridizada amostra de DNA, que est imobilizada numa membrana de nitrocelulose ou nylon, a sonda poder ser detectada por exposio a um filme de raio X. Mais recentemente, em 1995, foi introduzida por Schena e colaboradores outra tecnologia baseada na amplificao de sinal, a tecnologia de microarrays. So lminas com uma alta densidade de seqncias de DNA que permitem estudos de nveis de expresso gnica, analisando-se uma grande quantidade de genes ao mesmo tempo, utilizando sondas de cDNA.
Figura 1. Esquema representativo da reao da PCR

Reao em cadeia da polimerase (PCR) A reao em cadeia da polimerase (PCR) uma das tcnicas mais empregadas nas diversas reas do diagnstico molecular. A sua introduo resultou em grande revoluo tecnolgica, permitindo a amplificao de uma seqncia de interesse contida em uma amostra complexa de DNA e possibilitou a adoo de mtodos automatizados para a anlise do genoma. A tecnologia da reao em cadeia da

Entre as principais tcnicas resultantes de modificaes da reao em cadeia da polimerase, podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers randmicos e PCR em tempo real. O RT-PCR utiliza uma enzima chamada transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificao por PCR, permitindo estudo de vrus de RNA e anlises de expresso gnica. O nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificao com um par de primers

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internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibilidade e especificidade do mtodo. J PCR multiplex uma reao de amplificao desenhada para detectar mltiplas seqncias-alvo numa mesma amostra. PCR a partir de primers randmicos utiliza seqncias curtas de oligonucleotdeos para amplificar regies repetitivas do DNA genmico e bastante empregado em estudos epidemiolgicos. Finalmente, PCR em tempo real permite que a amplificao e a deteco ocorram simultaneamente, num sistema fechado, sendo necessrio para isto um termociclador que possua sistema de monitoramento de emisso de fluorescncia. Esta tcnica empregada para quantificao de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doena residual mnima.

mutantes, durante os ltimos ciclos podero se formar heteroduplexes entre essas duas espcies de molculas e que estes tero um padro de migrao eletrofortica diferente dos homoduplexes (figuras 2 e 3).

Tcnicas de deteco de mutaes em genes conhecidos Existem diversas tcnicas para deteco de mutaes em genes conhecidos, sendo o seqenciamento o gold standard. Ele o mtodo com maior nvel de resoluo, permitindo analisar cada uma das bases de determinada seqncia de DNA. Atualmente, as tcnicas de escrutnio de mutaes tm, cada vez mais, sensibilidade e especificidade para detectar alteraes de uma nica base na seqncia de DNA. Uma vez identificada a regio do gene que contm uma alterao, esta ser confirmada pela tcnica de seqenciamento. Existem vrias tcnicas descritas para escrutnio de mutaes de ponto em fragmentos de DNA que utilizam a tcnica da PCR. Algumas destas tcnicas baseiam-se nas diferenas de mobilidade eletrofortica de fragmentos com seqncias de DNA selvagens e mutantes: DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis); SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism); HA (Heteroduplex Analysis); CSGE (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis). Existem ainda outras tcnicas que se baseiam na clivagem de bases no pareadas em heteroduplexes: (CCM Chemical Cleavage Method e EMC Enzyme Mismatch Cleavage), ou utilizam a deteco de alteraes na protena transcrita por um determinado fragmento de DNA (PTT Protein Truncation Test). Uma das tcnicas mais empregadas o SSCP e o HA. A tcnica de SSCP baseia-se no fato de que a conformao tridimensional de fragmentos de DNA simples-fita depende da seqncia de nucleotdeos, sendo que a diferena de um nucleotdeo altera o padro de migrao eletrofortica. Por sua vez, a tcnica de HA baseia-se no fato de que se numa reao de PCR estiverem presentes molculas de DNA selvagens e

Figura 2. Esquema do mtodo de SSCP, mostrando que diferentes seqncias podem apresentar conformaes especficas possibilitando a identificao de diferentes alelos quando submetidos a uma corrida eletrofortica

Figura 3. Esquema representativo da anlise de heteroduplexes. a) Produtos de PCR referentes aos dois alelos de um indivduo heterozigoto (+/-) para uma mutao ponto (-). Aps a denaturao e renaturao dos produtos de PCR, molculas homoduplexes (azuis) e heteroduplexes (rosas) so formadas. b) Os heteroduplexes tendem a migrar mais em um gel de poliacrilamida (banda superior) do que as homoduplexes (inferior)

Atualmente, outra tcnica que tem sido empregada na anlise de heteroduplexes a DHPLC (Denaturing high-performance liquid chromatography). O escrutnio de mutaes atravs da DHPLC baseia-se na diferena de afinidade dos heteroduplexes e homoduplexes, de um determinado fragmento amplificado de DNA, pela

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fase slida da cromatografia, em condies parcialmente denaturantes. Esta tcnica tem sensibilidade e especificidade estimada entre 96% e 100% e tem sido empregada com sucesso na deteco de mutaes em diferentes genes de interesse mdico, mostrando-se mais eficiente do que outras tcnicas rotineiramente utilizadas para este fim. Alm da alta sensibilidade na deteco de mutaes, esta tcnica permite um alto grau de automao e no requer nenhum tratamento especial ao produto de PCR. Desta forma, facilita a anlise de um grande nmero de amostras, bem como de genes com vrios xons (figura 4).

Referncias
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Figura 4. Cromatograma representativo da anlise de heteroduplexes por dHPLC

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