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6_Tipos_de_PCR

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26/02/2009

Tipos de PCR
Eduardo Paulino Castan

Tipos de PCR

Tipos de PCR
•PCR-RFLP • RAPD • AFLP • PCR-colony • Hot Start • In situ • Inverse • Nested •Competitive • Multiplex • Long • Touchdown • Degenerate • RT-PCR * • Real-Time PCR *

Tipos de PCR

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26/02/2009

PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

Tipos de PCR

PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

Normal

Mutante

Tipos de PCR

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26/02/2009

PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)
• Variabilidade genética • Identificação de espécies
R. lalandii                R. porosus Gene mit RNAr 16S

Rhizoprionodon lalandii Digestão SspI

Rhizoprionodon porosus

Tipos de PCR

PCRPCR-RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)
• Mapeamento genômico ç genéticas • Análise de doenças g
Fator V Leiden humano Relação com propensão a trombose profunda

Raias 2 e 3: pacientes que não apresentaram a mutação analisada; raias 4 e 6: pacientes com a mutação Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutação Fator V Leiden em homozigose.
Tipos de PCR

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26/02/2009

RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)

DNA Genômico

Primers randômicos

Tipos de PCR

RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)

Tipos de PCR

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RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)
• Identificação dos níveis de diversidade genética populacional
Brycon cephalus (matrinchã da Amazônia)

Estação de piscicultura ‐ CEPTA Rio Amazonas

estoque natural (S)

diversidade genética 

estoques cultivados

diversidade genética 

Tipos de PCR

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)
(a) Preparação de AFLP

Enzimas de  restrição (EcoR1 e Mse1) e DNA  ligase

DNA genômico

Adaptadores

Tipos de PCR

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26/02/2009

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)
(b) Restrição e ligação

Tipos de PCR

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)
(c) Amplificação seletiva com um nucleotídeo

Tipos de PCR

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26/02/2009

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)
(c) Amplificação seletiva com três nucleotídeo

Tipos de PCR

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

Alburnus alburnus

Tipos de PCR

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PCR Colony
• Verificar a presença do fragmento de interesse

Tipos de PCR

Hot Start PCR
• DNA polimerases podem demonstrar uma pequena atividade à temperatura ambiente, ambiente durante a montagem do experimento Essa in/eficiente atividade pode catalisar a extensão de qualquer extremidade 3’ anelada Atividade exonuclease 5'-3' degrada qualquer extremidade 5' parcialmente anelada, destruindo o primer e o substrato molde Anelamento inespecífico de primers e templates

Tipos de PCR

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26/02/2009

Hot Start PCR
• Técnicas manuais • Uso de Barreiras físicas

• Inativação reversível da DNA polimerase
- Inibidores de ligação não covalente
1. Polipeptídio 2. Anticorpo 3. Aptamer

Tipos de PCR

In Situ PCR
• PCR que ocorre dentro da célula em uma lâmina. Pode ser realizada em células ou tecidos fixados

Tipos de PCR

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26/02/2009

PCR Inversa
• Limitação da PCR convencional: as regiões 5' e 3' que flanqueiam seu fragmento de DNA de interesse devem ser conhecidas Inverse PCR permite a PCR quando você possui informação de apenas uma seqüência interna EcoR1
Digestão enzimática

EcoR1

DNA ligase

Tipos de PCR

PCR Inversa
• Sequenciamento de uma região desconhecida
– Vários primers de espécies próximas

Região codificadora do gene da MyoD
Tipos de PCR

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Long PCR
• • PCR cuja extensão é mais longa que as PCR convencionais (acima de 5 Kb); Para obtenção de uma alta precisão → mistura de polimerases específicas:
– Ex: Proficient polymerases + Accurate polymerases (Pfu)

Tipos de PCR

PCR Multiplex
• PCR com dois ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos de uma mesma amostra

• Um tubo • Um template • Dois pares de primers • Dois fragmentos amplificados

Tipos de PCR

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Nested PCR
• Variação da PCR convencional, na qual são utilizados dois pares de primers (ao invés de um), para amplificar um mesmo fragmento

Tipos de PCR

Competitive PCR
• • • Usada para quantificação Densitometria de imagem Adiciona-se à reação, uma quantidade conhecida de um fragmento de DNA (competidor). Esse competidor deve conter sequências para os mesmos primers utilizados para amplificar o alvo

Quantidade de DNA alvo pode ser determinada pela razão Alvo (T) /competidor (C)

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Touchdown PCR
• • • • • Modificação da PCR convencional, que pode resultar na diminuição de amplificações não-específicas Temperatura de anelamento: Inicialmente mais alta que a temperatura ótima dos primers Diminuição de 1°C a cada um ou dois ciclos, até atingir temperatura específica Após atingir temperatura específica (touchdown), ela é mantida nos ciclos restantes

‐ 95° 30 s ‐ 95° 30 s, 60° 30 s, 72° 1min (3 ciclos) 95 30 s, 60 30 s, 72 1min (3 ciclos) ‐ 95° 30 s, 56° 30 s, 72° 1min (3 ciclos) ‐ 95° 30 s, 53° 30 s, 72° 1min (3 ciclos) ‐ 95° 30 s, 50° 30 s, 72° 1min (25 ciclos) ‐ 72° 5 min ‐ 4° infinito
Tipos de PCR

Degenerate PCR
O que são primers degenerados? Primers que possuem um número de opções em várias posições na sequência Exemplos: 5’-TCG AAT TCV CCY AAY TGR CCN T-3’ 5’-TCB AAT TCG CHC AAA TKA CCG T-3’
A+C+G A+C+G+T A+T+G T+C+G A+T+C A+T C+G T+G A+C C+T A+G V N D B H W S K M Y R

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26/02/2009

Degenerate PCR
Aplicações:

Tipos de PCR

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