P r o c . N a t i . A c a d . S c i .

US A
V o l . 9 0 , p p . 1 6 2 9 - 1 6 3 3 , F e b r u a r y 1 9 9 3
P l a n t B i o l o g y
I n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o o x i d a t i v e s t r e s s i n t r a n s g e n i c p l a n t s t h a t
o v e r e x p r e s s c h l o r o p l a s t i c Cu /Zn s u p e r o x i d e d i s m u t a s e
( t o b a c c o /p h o t o i n h i b i t i o n /m e t h y l v i o l o g e n )
A S HI MA S EN G UP T A * , J EA N I E L . HEI N EN * , A . S c o r r HO L A D A Y * , J O HN J . B UR K Et , A N D R A N D Y D . A L L EN * *
D e p a r t m e n t s o f * B i o l o g i c a l S c i e n c e s a n d A g r o n o m y , t Ho r t i c u l t u r e a n d En t o m o l o g y , T e x a s T e c h Un i v e r s i t y , L u b b o c k , T X 7 9 4 0 9 ; a n d t D e p a r t m e n t o f
A g r i c u l t u r e - A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h S e r v i c e Cr o p p i n g S y s t e m s R e s e a r c h L a b o r a t o r y , R o u t e 3 , B o x 2 1 5 , L u b b o c k , T X 7 9 4 0 1
Co m m u n i c a t e d b y J o s e p h E. V a r n e r , N o v e m b e r 2 5 , 1 9 9 2
A B S T R A CT T r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s t h a t e x p r e s s a c h i -
m e r i c g e n e t h a t e n c o d e s c h l o r o p l a s t - l o c a l i z e d Cu /Zn s u p e r -
o x i d e d i s m u t a s e ( S O D ) f r o m p e a h a v e b e e n d e v e l o p e d . T o
i n v e s t i g a t e w h e t h e r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f c h l o r o p l a s t -
t a r g e t e d S O D c o u l d a l t e r t h e r e s i s t a n c e o f p h o t o s y n t h e s i s t o
e n v i r o n m e n t a l s t r e s s , t h e s e p l a n t s w e r e s u b j e c t e d t o c h i l l i n g
t e m p e r a t u r e s a n d m o d e r a t e ( 5 0 0 p m m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s )
o r h i g h ( 1 5 0 0 p m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s ) l i g h t i n t e n s i t y .
D u r i n g e x p o s u r e t o m o d e r a t e s t r e s s , t r a n s g e n i c S O D p l a n t s
r e t a i n e d r a t e s o f p h o t o s y n t h e s i s - 2 0 % h i g h e r t h a n u n t r a n s -
f o r m e d t o b a c c o p l a n t s , i m p l i c a t i n g a c t i v e o x y g e n s p e c i e s i n t h e
r e d u c t i o n o f p h o t o s y n t h e s i s d u r i n g c h i l l i n g . Un l i k e u n t r a n s -
f o r m e d p l a n t s , t r a n s g e n i c S O D p l a n t s w e r e c a p a b l e o f m a i n -
t a i n i n g n e a r l y 9 0 % o f t h e i r p h o t o s y n t h e t i c c a p a c i t y ( d e t e r -
m i n e d b y t h e i r p h o t o s y n t h e t i c r a t e s a t 2 5 C) f o f l o w i n g e x p o s u r e
t o c h i l l i n g a t h i g h l i g h t i n t e n s i t y f o r 4 h r . T h e s e p l a n t s a l s o
s h o w e d r e d u c e d l e v e l s o f l i g h t - m e d i a t e d c e l l u l a r d a m a g e f r o m
t h e s u p e r o x i d e - g e n e r a t i n g h e r b i c i d e m e t h y l v i o l o g e n . T h e s e
r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t S O D i s a c r i t i c a l c o m p o n e n t o f t h e
a c t i v e - o x y g e n - s c a v e n g i n g s y s t e m o f p l a n t c h l o r o p l a s t s a n d i n -
d i c a t e t h a t m o d i f i c a t i o n o f S O D e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c p l a n t s
c a n i m p r o v e p l a n t s t r e s s t o l e r a n c e .
T h e i n h i b i t i o n o f p h o t o s y n t h e s i s t h a t c a n o c c u r w h e n
e x c e s s e x c i t a t i o n e n e r g y r e a c h e s t h e r e a c t i o n c e n t e r i s c o m -
m o n l y r e f e r r e d t o a s p h o t o i n h i b i t i o n . Hi g h l i g h t i n t e n s i t y ,
e s p e c i a l l y a t e x t r e m e t e m p e r a t u r e s o r w a t e r d e f i c i t , c a n
c a u s e i n c r e a s e d e l e c t r o n f l o w t o 0 2 , r e s u l t i n g i n g r e a t e r
p r o d u c t i o n o f O 2 a n d H2 0 2 . A l t h o u g h o x y g e n r a d i c a l s a p p e a r
t o b e i n v o l v e d i n p h o t o i n h i b i t i o n ( 9 - 1 1 ) , t h e r o l e o f S O D i n
l i m i t i n g t h e o x i d a t i v e d a m a g e a s s o c i a t e d w i t h p h o t o i n h i b i t i o n
h a s n o t b e e n d i r e c t l y d e m o n s t r a t e d ( 1 2 , 1 3 ) .
T o i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b l e p r o t e c t i v e f u n c t i o n s o f S O D i n
p l a n t c h l o r o p l a s t s , w e h a v e d e v e l o p e d t r a n s g e n i c t o b a c c o
p l a n t s t h a t o v e r e x p r e s s c h l o r o p l a s t - l o c a l i z e d Cu /Zn S O D .
T h e s e p l a n t s w e r e a n a l y z e d f o r p h o t o s y n t h e t i c r a t e w h e n
e x p o s e d t o l i g h t a n d t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s t h a t i n h i b i t
p h o t o s y n t h e s i s a n d f o r t h e i r a b i l i t y t o r e c o v e r p h o t o s y n t h e t i c
c a p a c i t y a f t e r s t r e s s . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e s e t r a n s -
g e n i c p l a n t s h a v e i m p r o v e d p h o t o s y n t h e t i c f u n c t i o n a t c h i l l -
i n g t e m p e r a t u r e s a n d m o d e r a t e l i g h t i n t e n s i t y , a n d t h e y
r e c o v e r m o r e e f f e c t i v e l y f r o m s e v e r e s t r e s s t h a n c o n t r o l
p l a n t s . T h e s e c h a n g e s c o r r e l a t e w i t h i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o
o x i d a t i v e d a m a g e c a u s e d b y t h e h e r b i c i d e m e t h y l v i o l o g e n
( MV ) .
O x y g e n i s e s s e n t i a l f o r t h e e x i s t e n c e o f a e r o b i c l i f e , b u t t o x i c
o x y g e n s p e c i e s , w h i c h i n c l u d e t h e o x y g e n - c e n t e r e d s u p e r -
o x i d e ( O ) , a n d h y d r o x y l ( - O H) , f r e e r a d i c a l s , a s w e l l a s
h y d r o g e n p e r o x i d e ( H2 0 2 ) , a r e g e n e r a t e d i n a l l a e r o b i c c e l l s .
I n j u r y c a u s e d b y t h e s e o x y g e n d e r i v a t i v e s i s k n o w n a s
o x i d a t i v e s t r e s s ( s e e r e f s . 1 - 3 f o r r e v i e w s ) . S u p e r o x i d e
d i s m u t a s e ( S O D ; s u p e r o x i d e : s u p e r o x i d e o x i d o r e d u c t a s e , EC
1 . 1 5 . 1 . 1 ) c o n s t i t u t e s t h e f i r s t l i n e o f c e l l u l a r d e f e n s e a g a i n s t
o x i d a t i v e s t r e s s .
O x i d a t i v e s t r e s s i s a m a j o r d a m a g i n g f a c t o r i n p l a n t s
e x p o s e d t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s , a n d t h e r e i s s t r o n g e v i d e n c e
f o r t h e p r o t e c t i v e r o l e o f S O D i n p l a n t s ( s e e r e f s . 4 a n d 5 f o r
r e v i e w s ) . Mo s t p l a n t s c o n t a i n a n u m b e r o f S O D i s o z y m e s
t h a t a r e l o c a t e d i n v a r i o u s c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s . I n p e a ,
Cu /Zn - c o n t a i n i n g S O D i s o f o r m s a r e f o u n d i n c h l o r o p l a s t s
a n d i n t h e c y t o s o l , w h e r e a s a Mn - c o n t a i n i n g e n z y m e i s
l o c a t e d i n m i t o c h o n d r i a ( 6 ) . T o b a c c o h a s a m o r e c o m p l e x
c o m p l e m e n t o f S O D s t h a t i n c l u d e s a t l e a s t f i v e d i s t i n c t
i s o z y m e s ( 7 , 8 ) . Mo s t n o t a b l y , t o b a c c o i n c l u d e s a d i s t i n c t
F e - c o n t a i n i n g S O D i n c h l o r o p l a s t s , a s w e l l a s c h l o r o p l a s t i c
a n d c y t o s o l i c Cu /Zn S O D s a n d m i t o c h o n d r i a l Mn S O D .
S u p e r o x i d e r a d i c a l s a r e p r o d u c e d c o n t i n u o u s l y i n p l a n t
c h l o r o p l a s t s a s 0 2 i s r e d u c e d t o 2 b y e l e c t r o n s f r o m t h e
p h o t o s y s t e m s ( t h e Me h l e r r e a c t i o n ) ( 4 , 5 ) . S O D c o n v e r t s 2
t o H2 0 2 t h a t i s t h e n s c a v e n g e d i n c h l o r o p l a s t s b y a s e r i e s o f
o x i d a t i o n /r e d u c t i o n r e a c t i o n s , k n o w n a s t h e Ha l l i w e l l -
A s a d a p a t h w a y , t h a t u s e a s c o r b a t e , r e d u c e d g l u t a t h i o n e , a n d
N A D P H a s e l e c t r o n d o n o r s ( 4 ) .
MA T ER I A L S A N D MET HO D S
P l a n t T r a n s f o r m a t i o n . Ch i m e r i c g e n e c o n s t r u c t s w e r e d e -
v e l o p e d t o o v e r e x p r e s s c h l o r o p l a s t i c S O D s u b u n i t i n p l a n t
c e l l s ( F i g . 1 ) . Ch l o r o p l a s t i c Cu /Zn S O D c D N A f r o m p e a ( 1 4 ,
1 5 ) w a s a m p l i f i e d b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n u s i n g m u t a -
g e n i c p r i m e r s t h a t i n t r o d u c e d a n N c o I s i t e a t t h e t r a n s l a t i o n
s t a r t c o d o n ( A CA T G G t o CCA T G G ) a n d a n Xb a I s i t e w i t h i n
t h e 3 ' u n t r a n s l a t e d s e q u e n c e . A f t e r d i g e s t i o n w i t h N c o I a n d
Xb a I , t h i s f r a g m e n t w a s l i g a t e d i n t o t h e N c o I a n d Xb a I s i t e s
o f t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p R T L 2 ( a g i f t f r o m J . R . Ca r r i n g t o n ,
D e p a r t m e n t o f B i o l o g y , T e x a s A &M Un i v e r s i t y ) . T h i s v e c t o r
i n c l u d e s a c a u l i f l o w e r m o s a i c v i r u s ( Ca MV ) 3 5 S p r o m o t e r
w i t h a d u p l i c a t e d e n h a n c e r a n d a Ca MV 3 5 S t e r m i n a t o r
s e q u e n c e . T h e c D N A i n s e r t w a s f u s e d a t t h e t r a n s l a t i o n
i n i t i a t i o n c o d o n w i t h i n t h e 5 ' u n t r a n s l a t e d s e q u e n c e o f t h e
t o b a c c o e t c h v i r u s ( T EV ) t h a t p r o v i d e s h i g h l y e f f i c i e n t t r a n s -
l a t i o n a l i n i t i a t i o n . T h e c o m p l e t e d c h i m e r i c g e n e c a s s e t t e w a s
e x c i s e d w i t h Hi n d I I I a n d l i g a t e d i n t o t h e Hi n d I I I s i t e o f t h e
b i n a r y s h u t t l e v e c t o r p B I N 1 9 ( 1 6 ) a n d m o b i l i z e d t o A g r o -
b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s s t r a i n L B A 4 4 0 4 b y t r i p a r e n t a l m a t -
i n g . T r a n s f o r m a t i o n o f t o b a c c o l e a f d i s k s w a s p e r f o r m e d
a c c o r d i n g t o Ho r s c h e t a l . ( 1 7 ) , a n d >2 0 p u t a t i v e t r a n s g e n i c
p l a n t s w e r e r e g e n e r a t e d .
S O D I s o z y m e A n a l y s e s . T r a n s g e n i c p l a n t s t h a t e x p r e s s e d
p e a c h l o r o p l a s t i c Cu /Zn S O D w e r e i d e n t i f i e d b y a n a l y s i s o f
S O D i s o z y m e s i n l e a v e s , u s i n g a m e t h o d d e s c r i b e d b y
B e a u c h a m p a n d F r i d o v i c h ( 1 8 ) a s m o d i f i e d b y B o w l e r e t a l .
( 8 ) . L e a f e x t r a c t s f r o m t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s , u n t r a n s -
A b b r e v i a t i o n s : S O D , s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ; MV , m e t h y l v i o l o g e n .
T o w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .
1 6 2 9
T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "
i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C. 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
1 6 3 0 P l a n t B i o l o g y : S e n G u p t a e t a l .
Un c l l P o i l Ec o m N c o I
\ I En h a n c e d 3 1 5 S $
L
P r o m o t e r
I T V I - -
A b c d P s t I Hl n d I A
| W T e r m .
I Ch l o r o p a s k i c Cu /Zn S O D c D N A I
F I G . 1 . Ch i m e r i c g e n e c o n s t r u c t d e v e l o p e d t o o v e r e x p r e s s p e a c h l o r o p l a s t i c S O D s u b u n i t i n p l a n t c e l l s . T h i s g e n e c a s s e t t e w a s i n s e r t e d i n t o
t h e b i n a r y p l a n t t r a n s f o r m a t i o n v e c t o r p B I N 1 9 a n d i n t r o d u c e d i n t o p l a n t c e l l s b y A g r o b a c t e r i u m - b a s e d t r a n s f o r m a t i o n . S e e t e x t f o r f u r t h e r
d e s c r i p t i o n .
f o r m e d t o b a c c o p l a n t s ( Xa n t h i ) , a n d p e a p l a n t s w e r e e l e c -
t r o p h o r e s e d i n n o n d e n a t u r i n g p o l y a c r y l a m i d e g e l s a n d n e g -
a t i v e l y s t a i n e d f o r S O D a c t i v i t y . I n t e n s i t i e s o f p e a Cu /Zn
S O D b a n d s a n d n a t i v e t o b a c c o S O D b a n d s o n a c t i v i t y g e l s
w e r e e s t i m a t e d w i t h a Mo l e c u l a r D y n a m i c s s c a n n i n g l a s e r
d e n s i t o m e t e r s y s t e m ( p r o v i d e d b y t h e T e x a s T e c h Un i v e r s i t y
B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e ) . A n a l y s i s o f S O D i s o z y m e s e x -
t r a c t e d f r o m c r u d e c h l o r o p l a s t p r e p a r a t i o n s o f l e a v e s o f
t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w a s a l s o p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e
w h e t h e r t h e t r a n s g e n e p r o d u c t w a s c o r r e c t l y t a r g e t e d t o
t o b a c c o c h l o r o p l a s t s . B r i e f l y , 1 g o f l e a f t i s s u e w a s g r o u n d
g e n t l y i n 1 0 - m l a l i q u o t s o f 2 0 m M He p e s , p H 7 /0 . 4 M
s o r b i t o l /2 m M Mg Cl 2 a n d t h e s l u r r y w a s f i l t e r e d t h r o u g h a
2 0 - , g m m e s h t o r e m o v e u n b r o k e n c e l l s . Ch l o r o p l a s t s w e r e
p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 x g a n d w a s h e d i n t h e s a m e
b u f f e r . Ex t r a c t s w e r e a n a l y z e d b y S O D a c t i v i t y g e l a s
d e s c r i b e d a b o v e . T w o i n d e p e n d e n t l y t r a n s f o r m e d p l a n t s t h a t
e x p r e s s e d t h e i n t r o d u c e d g e n e a t h i g h e s t l e v e l s w e r e s e l f -
p o l l i n a t e d , a n d t h e o f f s p r i n g o f t h e s e p l a n t s ( h e r e a f t e r r e -
f e r r e d t o a s t r a n s g e n i c S O D p l a n t s ) w e r e g r o w n i n a g r e e n -
h o u s e a n d u s e d f o r o u r a n a l y s e s .
A n a l y s i s o f P h o t o i n h i b i t i o n . N e t p h o t o s y n t h e t i c r a t e s w e r e
m e a s u r e d f o r t r a n s g e n i c S O D p l a n t s a n d u n t r a n s f o r m e d
p l a n t s ( Xa n t h i ) b y m e a s u r i n g 0 2 e v o l u t i o n f r o m 1 0 - c m 2 l e a f
d i s k s w i t h a g a s - p h a s e , 0 2 e l e c t r o d e s y s t e m ( Ha n s a t e c h
I n s t r u m e n t s , P e n t n e y , K i n g ' s L y n n , U. K . ) u n d e r s a t u r a t i n g
CO 2 . L e a f d i s k s w e r e s u b j e c t e d i n d e p e n d e n t l y t o e i t h e r
m o d e r a t e o r s e v e r e s t r e s s r e g i m e s . Co n t r o l l e a f d i s k s o f e a c h
g e n o t y p e w e r e m a i n t a i n e d a t 2 5 0 C a n d t h e l i g h t i n t e n s i t y o f
t h e s t r e s s t r e a t m e n t s f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t s . T o
e n s u r e t h a t m e a s u r e m e n t o f 0 2 e v o l u t i o n a c c u r a t e l y r e p r e -
s e n t e d p h o t o s y n t h e s i s , r a t e s o f 1 4 CO 2 f i x a t i o n w e r e a l s o
d e t e r m i n e d . S i n c e b o t h m e a s u r e m e n t s c o r r e l a t e d c l o s e l y i n
a l l c a s e s , o n l y t h e 0 2 e v o l u t i o n d a t a a r e p r e s e n t e d .
Mo d e r a t e s t r e s s t r e a t m e n t . L e a f d i s k s f r o m t r a n s g e n i c
S O D p l a n t s a n d Xa n t h i p l a n t s w e r e e q u i l i b r a t e d a t 5 0 0
g m o l
o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d 2 5 0 C f o r 1 h r , a f t e r w h i c h
p h o t o s y n t h e t i c r a t e s w e r e d e t e r m i n e d a t 4 7 0
i u m o l
o f q u a n t a
p e r m 2 p e r s a n d 2 5 T C. D i s k s w e r e t h e n c h i l l e d t o 1 0 T C a t 5 0 0
j . m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s o n a c o o l i n g b l o c k . L e a f d i s k s
w e r e r e m o v e d a t d e s i g n a t e d i n t e r v a l s a n d p h o t o s y n t h e t i c
r a t e s w e r e m e a s u r e d a t 4 7 0 p m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d
1 0 0 C.
S e v e r e s t r e s s t r e a t m e n t . L e a f d i s k s w e r e e q u i l i b r a t e d a t
1 5 0 0
j i m o l
o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d 2 5 0 C f o r 1 h r .
P h o t o s y n t h e t i c r a t e s w e r e d e t e r m i n e d a t 9 7 5
g m o l
o f q u a n t a
p e r m 2 p e r s a n d 2 5 T C. T h e d i s k s w e r e t h e n r a p i d l y c o o l e d t o
3 0 C a t 1 5 0 0
j &m o l
o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d k e p t u n d e r t h e s e
c o n d i t i o n s f o r 4 h r . A f t e r t h i s t r e a t m e n t , p h o t o s y n t h e t i c r a t e s
m e a s u r e d a t 9 7 5 , z m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d 3 Y C w e r e
<1
9 m o l
o f 0 2 p e r m 2 p e r s f o r a l l l e a f d i s k s . L e a f d i s k s w e r e
t h e n q u i c k l y w a r m e d t o 2 5 T C, a n d 0 2 e v o l u t i o n w a s m o n i -
t o r e d a t 9 7 5
g m o l
o f q u a n t a p e r m 2 p e r s c o n t i n u o u s l y u n t i l
s t e a d y - s t a t e p h o t o s y n t h e t i c r a t e s w e r e r e a c h e d ( w i t h i n 3 0
m i n f o r b o t h t r a n s g e n i c S O D a n d Xa n t h i l e a f d i s k s ) .
MV T r e a t m e n t . MV d a m a g e w a s a n a l y z e d a s d e s c r i b e d b y
B o w l e r e t a l . ( 8 ) w i t h m o d i f i c a t i o n s . L e a f d i s k s ( 1 . 5 c m 2 )
c o l l e c t e d f r o m t r a n s g e n i c S O D p l a n t s a n d u n t r a n s f o r m e d
Xa n t h i p l a n t s w e r e t r a n s f e r r e d t o 3 . 5 - c m P e t r i d i s h e s c o n '
t a i n i n g 3 m l o f MV s o l u t i o n s a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s .
S a m p l e s w e r e v a c u u m i n f i l t r a t e d f o r 5 m i n a n d i n c u b a t e d a t
2 1 0 C f o r 1 6 h r i n d a r k n e s s . L e a f d i s k s w e r e t h e n i l l u m i n a t e d
( 5 0 0 A m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s ) f o r 2 h r , t h e n i n c u b a t e d i n
d a r k n e s s a t 3 0 0 C f o r a n a d d i t i o n a l 1 6 h r .
Ce l l l e a k a g e a n a l y s i s . T h e c o n d u c t i v i t y o f t h e d e c a n t e d
MV s o l u t i o n w a s m e a s u r e d w i t h a n O r i o n m o d e l 1 2 0 c o n -
d u c t i v i t y m e t e r . T h e MV s o l u t i o n s w e r e r e c o v e r e d f r o m t h e
c o n d u c t i v i t y m e t e r c e l l a n d a u t o c l a v e d , w i t h t h e d a m a g e d
l e a f d i s k s , f o r 1 5 m i n t o r e l e a s e a l l s o l u t e s . T h e c o n d u c t i v i t y
o f t h e MV s o l u t i o n w a s a g a i n d e t e r m i n e d a n d t h e p e r c e n t a g e
o f e l e c t r o l y t e l e a k a g e a t t r i b u t a b l e t o MV t r e a t m e n t w a s
d e t e r m i n e d b y d i v i d i n g t h e c o n d u c t i v i t y v a l u e o f t h e t e s t
s a m p l e b y t h e c o n d u c t i v i t y o f t h e s a m p l e a f t e r a u t o c l a v i n g
( 1 0 0 % e l e c t r o l y t e l e a k a g e ) .
P h e o p h y t i n m e a s u r e m e n t s . P h e o p h y t i n i s a b r e a k d o w n
p r o d u c t o f c h l o r o p h y l l t h a t r e s u l t s f r o m t h e l o s s o f t h e Mg
m o i e t y . A f t e r MV t r e a t m e n t , p i g m e n t s w e r e e x t r a c t e d f r o m
l e a f d i s k s i n 8 0 % a c e t o n e a n d t h e p e r c e n t a g e o f c h l o r o p h y l l
c o n v e r t e d t o p h e o p h y t i n w a s d e t e r m i n e d b y a n i n c r e a s e i n
a b s o r b a n c e a t 5 5 3 n m r e l a t i v e t o a b s o r b a n c e a t 6 6 5 n m ( 8 , 1 9 ) .
R ES UL T S
A n a l y s i s o f S O D i s o f o r m s f r o m l e a v e s o f t w o t r a n s g e n i c S O D
p l a n t s t h a t a c c u m u l a t e d s i g n i f i c a n t a m o u n t s o f p e a c h l o r o -
p l a s t i c Cu /Zn S O D i s s h o w n i n F i g . 2 . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s
o f S O D a c t i v i t y g e l s i n d i c a t e d t h a t t r a n s g e n i c S O D p l a n t s
a c c u m u l a t e d t h e p e a S O D i s o f o r m t o l e v e l s = 2 - f o l d h i g h e r
t h a n t h a t o f e n d o g e n o u s c h l o r o p l a s t i c F e S O D o r Cu /Zn
S O D s i n u n t r a n s f o r m e d t o b a c c o p l a n t s . N o t a b l y , n a t i v e
Cu /Zn S O D i s o f o r m s w e r e n o t d e t e c t a b l e i n a n y t r a n s g e n i c
S O D p l a n t s t h a t e x p r e s s e d d e t e c t a b l e a m o u n t s o f p e a c h l o -
r o p l a s t i c Cu /Zn S O D , i n d i c a t i n g t h a t e x p r e s s i o n o f t h e
i n t r o d u c e d Cu /Zn S O D g e n e s o m e h o w i n t e r f e r e d w i t h t h e
a c t i v i t y o f n a t i v e t o b a c c o Cu /Zn S O D i s o f o r m s . P e a Cu /Zn
S O D w a s d e t e c t e d i n c h l o r o p l a s t s i s o l a t e d f r o m t r a n s g e n i c
p l a n t s ( F i g . 2 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h i s e n z y m e w a s i n c o r p o r a t e d
i n t o t o b a c c o c h l o r o p l a s t s .
7 Z ;
V
1 S O DD
F e S O . . [ D
. Cu ! Zn S O D
C" u ' Zn I S O D
F I G . 2 . S a m p l e s ( 2 5
A . g )
o f t o t a l p r o t e i n f r o m l e a f e x t r a c t s f r o m
Cu /Zn S O D t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s , u n t r a n s f o r m e d t o b a c c o
p l a n t s ( Xa n t h i ) , a n d p e a p l a n t s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d i n n o n d e n a -
t u r i n g p o l y a c r y l a m i d e S O D a c t i v i t y g e l s . N a t i v e t o b a c c o i s o f o r m s
a r e i n d i c a t e d a t l e f t . Mn S O D i s l o c a t e d i n m i t o c h o n d r i a . F e S O D i s
f o u n d i n c h l o r o p l a s t s , a s i s t h e h i g h - m o b i l i t y Cu /Zn S O D i s o f o r m
( b o t t o m b a n d ) . T h e o t h e r ( s l o w e r ) Cu /Zn S O D i s o f o r m i s f o u n d i n
t h e c y t o s o l . P e a i s o f o r m s i n c l u d e ( f r o m t o p t o b o t t o m ) m i t o c h o n d r i a l
Mn S O D , c y t o s o l i c Cu /Zn S O D I , a n d c h l o r o p l a s t i c Cu /Zn S O D I I .
N o t e t h a t t h e n a t i v e t o b a c c o c h l o r o p l a s t i c Cu /Zn S O D i s o f o r m w a s
n o t d e t e c t a b l e i n t h e e x t r a c t s o f t r a n s g e n i c l e a v e s . Ch l o r o p l a s t s
i s o l a t e d f r o m t r a n s g e n i c S O D p l a n t s ( Ch l o r o . ) c o n t a i n b a n d s t h a t
c o r r e l a t e w i t h n a t i v e F e S O D a n d p e a Cu /Zn S O D I I .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0
( 1 9 9 3 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0 ( 1 9 9 3 ) 1 6 3 1
P h o t o s y n t h e t i c r a t e s d e t e r m i n e d b y 0 2 e v o l u t i o n f r o m l e a f
d i s k s o f Xa n t h i p l a n t s a n d t r a n s g e n i c S O D p l a n t s b e f o r e
p h o t o i n h i b i t o r y t r e a t m e n t s w e r e v i r t u a l l y i d e n t i c a l , a v e r a g -
i n g 3 5 A m o I o f 0 2 p e r m 2 p e r s ( F i g . 3 ) . Wh e n l e a f d i s k s o f
Xa n t h i p l a n t s w e r e e x p o s e d t o m o d e r a t e s t r e s s ( 1 0 0 C, 5 0 0
A m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s ) , t h e i r p h o t o s y n t h e t i c r a t e s
d e c r e a s e d b y - 9 5 % t o a m e a n o f 1 . 7 5 p m o l o f 0 2 p e r m 2 p e r
s . Ho w e v e r , u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s , p h o t o s y n t h e t i c r a t e s
o f t r a n s g e n i c S O D l e a f d i s k s w e r e r e d u c e d b y o n l y 7 5 %, t o
a m e a n o f 8 . 7 5 j t m o l o f 0 2 p e r m 2 p e r s . A l t h o u g h r e d u c e d
p h o t o s y n t h e s i s w a s o b s e r v e d i n l e a f d i s k s o f b o t h g e n o t y p e s
d u r i n g m o d e r a t e s t r e s s c o n d i t i o n s , l e a f d i s k s o f t r a n s g e n i c
S O D p l a n t s e x h i b i t e d h i g h e r p h o t o s y n t h e t i c c a p a c i t y t h a n
Xa n t h i l e a f d i s k s . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t n e t p h o t o s y n t h e t i c
r a t e s o f b o t h Xa n t h i a n d t r a n s g e n i c S O D l e a f d i s k s r a p i d l y
r e c o v e r e d a f t e r m o d e r a t e s t r e s s e x p o s u r e w h e n t h e y w e r e
w a r m e d t o 2 5 0 C a n d m a i n t a i n e d a t 5 0
t &m o l
o f q u a n t a p e r m 2
p e r s f o r 3 0 m i n ( F i g . 3 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t , u n d e r t h e s e
m o d e r a t e s t r e s s c o n d i t i o n s , l i t t l e i f a n y l o n g - t e r m o x i d a t i v e
d a m a g e h a d o c c u r r e d i n l e a f d i s k s o f e i t h e r g e n o t y p e .
S i n c e c o m p l e t e r e c o v e r y o f p h o t o s y n t h e s i s w a s o b s e r v e d
i n l e a f d i s k s o f b o t h Xa n t h i a n d t r a n s g e n i c S O D p l a n t s a f t e r
m o d e r a t e s t r e s s , i n c r e a s e d s t r e s s l e v e l s w e r e n e c e s s a r y t o
d e t e r m i n e w h e t h e r d i f f e r e n c e s e x i s t e d i n t h e i r c a p a c i t y t o
c o p e w i t h a n d t o r e c o v e r f r o m m o r e s e v e r e s t r e s s . A f t e r
e x p o s u r e t o 1 5 0 0 a m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d 3 Y C f o r 4
h r , p h o t o s y n t h e t i c r a t e s f o r b o t h Xa n t h i a n d t r a n s g e n i c S O D
l e a f d i s k s w e r e <1 Zm o l o f 0 2 p e r m 2 p e r s . Wh e n w a r m e d
t o 2 5 0 C a n d m e a s u r e d a t 9 7 5 u m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s ,
p h o t o s y n t h e s i s i n l e a f d i s k s f r o m Xa n t h i p l a n t s r e c o v e r e d ,
w i t h i n 3 0 m i n , t o a m e a n s t e a d y - s t a t e r a t e o f 1 2
J &m o I
o f 0 2
p e r m 2 p e r s ( F i g . 4 ) . T h u s , a f t e r s e v e r e s t r e s s , t h e p h o t o -
s y n t h e t i c c a p a c i t y o f Xa n t h i l e a f d i s k s w a s o n l y 3 6 % o f t h a t
m e a s u r e d b e f o r e s t r e s s t r e a t m e n t , i n d i c a t i n g t h a t s u b s t a n t i a l
o x i d a t i v e d a m a g e t h a t c o u l d n o t b e r a p i d l y r e v e r s e d h a d
o c c u r r e d . Un d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s , p h o t o s y n t h e t i c r a t e s o f
l e a f d i s k s f r o m t r a n s g e n i c S O D p l a n t s r e c o v e r e d t o a m e a n
s t e a d y - s t a t e r a t e o f 3 1 , A m o l o f 0 2 p e r m 2 p e r s . He n c e ,
t r a n s g e n i c S O D l e a f d i s k s r e t a i n e d p h o t o s y n t h e t i c c a p a c i t y
a f t e r s e v e r e s t r e s s t h a t w a s n e a r l y 9 0 %o o f t h a t b e f o r e s t r e s s
e x p o s u r e , i n d i c a t i n g t h a t l i t t l e o x i d a t i v e d a m a g e h a d o c -
c u r r e d . A l t h o u g h l e a f d i s k s o f b o t h Xa n t h i a n d t r a n s g e n i c
S O D p l a n t s e x h i b i t e d c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f p h o t o s y n t h e s i s
d u r i n g e x p o s u r e t o s e v e r e s t r e s s c o n d i t i o n s , m o s t o f t h i s
i n h i b i t i o n w a s r a p i d l y r e v e r s e d i n t r a n s g e n i c S O D l e a f d i s k s ,
4 0
G o
a
u 3 0
0 _ .
R
" 2 0
. 0
s 0
G o
i ; p
E4 v
_
s o
i
P i
4 0
3 0
2 0
1 0
0
0 1 0 2 0 3 0
R e c o v e r y ( Mi n u t e s a t 2 5 0 C)
F I G . 4 . N e t p h o t o s y n t h e t i c r a t e s w e r e m e a s u r e d f o r t r a n s g e n i c
S O D p l a n t s ( o ) a n d u n t r a n s f o r m e d Xa n t h i p l a n t s ( o ) a t 2 5 ( a f t e r
e x p o s u r e t o s e v e r e p h o t o i n h i b i t o r y s t r e s s ( 1 5 0 0 A m o l o f q u a n t a p e r
m 2 p e r s , 3 0 C f o r 4 h r ) . P h o t o s y n t h e t i c r a t e s f o r c o n t r o l l e a f d i s k s o f
e a c h g e n o t y p e m a i n t a i n e d a t 2 5 0 ( a n d 1 5 0 0
, m o l
o f q u a n t a p e r m 2
p e r s d i d n o t c h a n g e f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t . V a l u e s a r e
m e a n s S D ( n = 1 0 - 1 2 p l a n t s o f e a c h g e n o t y p e ) . * * * , P = 0 . 0 0 1 .
i n d i c a t i n g t h a t t h e y h a d s u f f e r e d s u b s t a n t i a l l y l e s s d a m a g e
t h a n Xa n t h i l e a f d i s k s . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t s i g -
n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t h e l e v e l s o f p h o t o i n h i b i t o r y s t r e s s c a n
b e a c h i e v e d i n l e a v e s o f t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s t h a t
o v e r e x p r e s s p e a c h l o r o p l a s t Cu /Zn S O D .
T o d i r e c t l y c o r r e l a t e t h e e n h a n c e d p h o t o s y n t h e t i c p e r f o r -
m a n c e o f t r a n s g e n i c S O D l e a v e s u n d e r c h i l l i n g a n d h i g h l i g h t
i n t e n s i t y w i t h i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o o x i d a t i v e s t r e s s , l e a f
d i s k s f r o m t r a n s g e n i c S O D a n d Xa n t h i p l a n t s w e r e t r e a t e d
w i t h MV , a c o n t a c t h e r b i c i d e t h a t c a u s e s m a s s i v e , l i g h t -
m e d i a t e d a c c u m u l a t i o n o f O i n p h o t o s y n t h e t i c t i s s u e s ( 2 0 )
( F i g . 5 ) . T h e e x t e n t o f c e l l u l a r d a m a g e w a s q u a n t i f i e d b y
s o l u t e l e a k a g e , w h i c h i s a m e a s u r e o f m e m b r a n e d i s r u p t i o n
( 8 ) . L e a f d i s k s o f Xa n t h i p l a n t s s h o w e d a d o s e - d e p e n d e n t
i n c r e a s e i n m e m b r a n e d a m a g e , r e a c h i n g n e a r l y c o m p l e t e
d i s r u p t i o n ( ' 9 0 %o o f m a x i m u m s o l u t e l e a k a g e ) a t 2 . 4 , u M MV .
T i s s u e s o f t r a n s g e n i c S O D p l a n t s s h o w e d s i g n i f i c a n t l y l e s s
d a m a g e a t 0 . 6 a n d 1 . 2 , u M MV t h a n Xa n t h i t i s s u e s . Ho w e v e r ,
a t 2 . 4 , u M MV t h e e x t e n t o f d a m a g e i n t r a n s g e n i c l e a f d i s k s
w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f c o n t r o l s a m p l e s .
T h e s e o b s e r v a t i o n s w e r e e x t e n d e d b y a n a l y s i s o f p h e o p h y t i n
p r o d u c t i o n i n MV - t r e a t e d l e a f d i s k s a s a m e a s u r e o f c h l o r o -
p h y l l d a m a g e ( F i g . 6 ) . Ch l o r o p h y l l d a m a g e i n t r a n s g e n i c S O D
l e a f d i s k s a t 1 . 2
I L M
MV w a s r e d u c e d b y a n a v e r a g e o f 4 0 %
c o m p a r e d w i t h Xa n t h i l e a f d i s k s , b u t a t 2 . 4 , u M MV , m u c h
l e s s d i f f e r e n c e w a s s e e n . T h e s e r e s u l t s c o n f i r m t h a t t r a n s -
g e n i c S O D p l a n t s e x h i b i t i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o MV -
9 0
) /B e d 1
I /
0 1 2
Ho u r s a t 5 0 0 n m o l q u a n t a m n 2 s l , 1 0 C
F I G . 3 . N e t p h o t o s y n t h e t i c r a t e s w e r e m e a s u r e d f o r t r a n s g e n i c
S O D p l a n t s ( o ) a n d u n t r a n s f o r m e d Xa n t h i p l a n t s ( a ) d u r i n g m o d e r a t e
p h o t o i n h i b i t o r y s t r e s s ( 5 0 0 A m o l o f q u a n t a p e r m 2 p e r s a n d 1 0 0 Q .
A f t e r s t r e s s t r e a t m e n t , l e a f d i s k s w e r e a l l o w e d t o r e c o v e r f o r 3 0 m i n
a t 2 5 0 C a n d 5 0
l z m o l
o f q u a n t a p e r m 2 p e r s . P h o t o s y n t h e t i c r a t e s f o r
c o n t r o l l e a f d i s k s o f e a c h g e n o t y p e m a i n t a i n e d a t 2 5 0 C a n d 5 0 0
A m o l
o f q u a n t a p e r m 2 p e r s d i d n o t c h a n g e
f o r t h e d u r a t i o n o f t h e
e x p e r i m e n t . V a l u e s a r e m e a n s S D ( n
= 1 0 - 1 2
p l a n t s
o f e a c h
g e n o t y p e ) . * * * , P = 0 . 0 0 1 .
Xa n t h i
8 0
Cu L /Zn ) S O D
- .
7 0
6 0
4 0 . ; 4
0
E
3 0
2 0
1 0
0 0 - 6 - 1 . 2 4
0 0 . 6 1 . 2 2 . 4
Me t h y l V i o l o g e n Co n c e n t r a t i o n i t i M)
F I G . 5 . A n a l y s i s o f c e l l u l a r d a m a g e i n MV - t r e a t e d l e a f d i s k s o f
t r a n s g e n i c S O D a n d u n t r a n s f o r m e d Xa n t h i p l a n t s b y m e a s u r e m e n t o f
p e r c e n t s o l u t e l e a k a g e i n t r e a t e d t i s s u e s c o m p a r e d w i t h a u t o c l a v e d
t i s s u e s . V a l u e s a r e m e a n s S D ( n = 9 p l a n t s o f e a c h g e n o t y p e ) . * * * ,
P = 0 . 0 0 1 .
P l a n t
B i o l o g y :
S e n
G u p t a
e t a l .
/ I
I
I
1 6 3 2 P l a n t B i o l o g y : S e n G u p t a e t a l .
2 5 Xi u t h i
1 1 1 /Zr 1 S t I D )
2 0
1 5
- 1 0
5
0
0 1 . 2 2 . 4
Me t h y l V i o l o g e r n Co n c e n t r a t i o n i M)
F I G . 6 . A n a l y s i s o f o x i d a t i v e d a m a g e i n MV - t r e a t e d l e a f d i s k s
f r o m t r a n s g e n i c S O D p l a n t s a n d Xa n t h i p l a n t s b y m e a s u r e m e n t o f t h e
c o n v e r s i o n o f c h l o r o p h y l l t o p h e o p h y t i n . V a l u e s a r e m e a n s S D ( n
= 5 p l a n t s o f e a c h g e n o t y p e ) . * * * , P = 0 . 0 0 1 ; * , P = 0 . 0 5 .
m e d i a t e d o x i d a t i v e d a m a g e , a l t h o u g h s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s
i n MV t o l e r a n c e b e t w e e n t r a n s g e n i c S O D p l a n t s a n d Xa n t h i
p l a n t s c o u l d b e d e t e c t e d o n l y o v e r a r e l a t i v e l y n a r r o w r a n g e
o f MV c o n c e n t r a t i o n s .
D I S CUS S I O N
T h e r e s u l t s p r e s e n t e d c l e a r l y i n d i c a t e t h a t o v e r e x p r e s s i o n o f
p e a c h l o r o p l a s t Cu /Zn S O D i n t o b a c c o l e a v e s c a n i m p r o v e
t h e i r p h o t o s y n t h e t i c p e r f o r m a n c e u n d e r m o d e r a t e s t r e s s a n d
m a i n t a i n p h o t o s y n t h e t i c c a p a c i t y a f t e r s e v e r e o x i d a t i v e
s t r e s s . We i n t e r p r e t t h e s e r e s u l t s t o i n d i c a t e t h a t , u n d e r
s t r e s s f u l c o n d i t i o n s , t r a n s g e n i c S O D t i s s u e s h a v e l o w e r
l e v e l s o f 2 t h a n c o n t r o l t i s s u e s , l e a d i n g t o h i g h e r n e t r a t e s
o f p h o t o s y n t h e s i s a n d r e d u c e d o x i d a t i v e d a m a g e . S i n c e i t i s
u n l i k e l y t h a t p e a Cu /Zn S O D i s i n h e r e n t l y s u p e r i o r t o
t o b a c c o c h l o r o p l a s t S O D i s o f o r m s , w e b e l i e v e t h a t t h e d i f -
f e r e n c e i n s t r e s s t o l e r a n c e i n t r a n s g e n i c S O D p l a n t s i s
d i r e c t l y r e l a t e d t o i n c r e a s e d l e v e l s o f a c t i v e S O D i n t h e i r
c h l o r o p l a s t s . T h e s e r e s u l t s d o n o t n e c e s s a r i l y i n d i c a t e t h a t
0 2
c a u s e s
c h l o r o p l a s t d a m a g e d i r e c t l y . R a t h e r , r a p i d
d i s m u -
t a t i o n o f 2 i n t r a n s g e n i c S O D p l a n t s c o u l d p r e v e n t i t s
r e a c t i o n w i t h H2 0 2 t o f o r m h i g h l y r e a c t i v e - O H ( 8 , 2 1 ) .
I n c r e a s e d l e v e l s o f S O D a n d o t h e r o x i d a t i v e s t r e s s r e s p o n s e
e n z y m e s h a v e b e e n c o r r e l a t e d w i t h r e d u c e d p h o t o i n h i b i t i o n
i n MV - r e s i s t a n t v a r i e t i e s o f Co n y z a b o n a r i e n s i s ( 9 ) a n d t h e
a d d i t i o n o f e x o g e n o u s S O D o r c a t a l a s e t o t h y l a k o i d s h a s a l s o
b e e n s h o w n t o r e d u c e p h o t o i n h i b i t i o n ( 2 2 ) . O u r r e s u l t s s h o w
t h a t d i r e c t m a n i p u l a t i o n o f S O D g e n e e x p r e s s i o n a l o n e c a n
e f f e c t t o l e r a n c e t o p h o t o i n h i b i t o r y s t r e s s .
S i n c e 2 c a n d i s m u t a t e w i t h o u t c a t a l y s i s a t a r e l a t i v e l y
h i g h r a t e , o n e m i g h t q u e s t i o n t h e n e e d f o r i n c r e a s e d S O D i n
p l a n t s . S p o n t a n e o u s d i s m u t a t i o n i s h i g h l y p H- d e p e n d e n t ,
s i n c e i t d e p e n d s o n p r o t o n a t i o n o f O 2 t o HO 2 - w i t h a p K a o f
4 . 8 ( 2 3 ) . T h u s , u n d e r t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s o f t h e s t r o m a o f
i l l u m i n a t e d c h l o r o p l a s t s , i t i s l i k e l y t h a t t h e r a t e o f u n c a t a -
l y z e d d i s m u t a t i o n o f 2 i s a t l e a s t 4 o r d e r s o f m a g n i t u d e
l o w e r t h a n t h e V m a x o f Cu /Zn S O D ( - 2 x 1 0 9 M- 1 s - 1 ) ( 2 4 )
a n d i s o f l i t t l e b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e .
T h e h i g h e r p h o t o s y n t h e t i c r a t e s f o r l e a f d i s k s f r o m t r a n s -
g e n i c S O D p l a n t s c o m p a r e d w i t h t h o s e f o r Xa n t h i p l a n t s
u n d e r m o d e r a t e l o w t e m p e r a t u r e s t r e s s ( F i g . 3 ) a r e i n t e r e s t -
i n g , s i n c e b o t h g e n o t y p e s s h o u l d d i f f e r o n l y i n t h e i r c a p a c i t y
t o s c a v e n g e t o x i c o x y g e n s p e c i e s . O t h e r g e n e t i c a l l y c o n -
t r o l l e d f a c t o r s t h a t c o u l d c a u s e d i f f e r e n c e s i n p h o t o s y n t h e t i c
p e r f o r m a n c e a t l o w t e m p e r a t u r e a r e p r e s u m a b l y t h e s a m e i n
b o t h g e n o t y p e s . T h e r e f o r e , t h e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e i m p l i -
c a t e t h e d i r e c t i n v o l v e m e n t o f o x i d a t i v e s t r e s s i n t h e r a p i d l y
r e v e r s i b l e r e d u c t i o n o f p h o t o s y n t h e s i s a t l o w t e m p e r a t u r e i n
t o b a c c o .
T r a n s g e n i c S O D p l a n t s a l s o e x h i b i t e d i n c r e a s e d r e s i s t a n c e
t o o x i d a t i v e d a m a g e c a u s e d b y e x p o s u r e t o l o w c o n c e n t r a -
t i o n s o f MV , b u t a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , t h i s p r o t e c t i v e
e f f e c t d i s a p p e a r e d . T e p p e r m a n a n d D u n s m u i r ( 2 5 ) w e r e
u n a b l e t o d e t e c t a n y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n r e s i s t a n c e t o
MV b e t w e e n t o b a c c o p l a n t s t h a t e x p r e s s e d h i g h l e v e l s ( 3 0 - t o
5 0 - f o l d a b o v e n o r m a l S O D l e v e l s ) o f p e t u n i a c h l o r o p l a s t
Cu /Zn S O D a n d c o n t r o l p l a n t s . A l t h o u g h t h e d i s c r e p a n c i e s
b e t w e e n o u r r e s u l t s a n d t h o s e o f t h i s p r e v i o u s s t u d y c a n b e
l a r g e l y e x p l a i n e d b y d i f f e r e n c e s i n a s s a y m e t h o d s , i t i s a l s o
p o s s i b l e t h a t m o d e r a t e i n c r e a s e s i n Cu /Zn S O D a c t i v i t y ( a s
i n o u r p l a n t s ) c a n p r o v i d e m o r e e f f e c t i v e p r o t e c t i o n f r o m MV
d a m a g e t h a n v e r y h i g h S O D l e v e l s . I n f a c t , El r o y - S t e i n e t a l .
( 2 6 ) h a v e r e p o r t e d t h a t m o d e r a t e i n c r e a s e s o f Cu /Zn S O D
p r o v i d e MV r e s i s t a n c e i n h u m a n a n d m o u s e c e l l s b u t l a r g e
i n c r e a s e s d o n o t . S i n c e Cu /Zn S O D s a r e s e n s i t i v e t o e n d -
p r o d u c t ( H2 0 2 ) i n h i b i t i o n , i t i s p o s s i b l e t h a t , w h e n c e l l s t h a t
e x p r e s s h i g h l e v e l s o f Cu /Zn S O D a r e t r e a t e d w i t h MV , t h e y
p r o d u c e a b u r s t o f H2 0 2 t h a t s i m p l y d e a c t i v a t e s t h e e n z y m e .
T h e b r e a k d o w n i n s t r e s s r e s i s t a n c e s e e n i n o u r t r a n s g e n i c
p l a n t s a t 2 . 4 , u M MV c o u l d i n d i c a t e t h a t t h e i n t r o d u c e d
Cu /Zn S O D i s d e a c t i v a t e d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . B o w l e r e t
a l . ( 8 ) h a v e r e p o r t e d s i g n i f i c a n t p r o t e c t i o n f r o m MV - i n d u c e d
o x i d a t i v e d a m a g e i n t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s t h a t o v e r e x -
p r e s s e d H2 0 2 - i n s e n s i t i v e , c h l o r o p l a s t - l o c a l i z e d Mn S O D .
P r e l i m i n a r y a n a l y s i s i n o u r l a b o r a t o r y i n d i c a t e s t h a t t o b a c c o
p l a n t s t h a t c o n t a i n a n a n a l o g o u s Mn S O D c o n s t r u c t a r e
s u b s t a n t i a l l y m o r e r e s i s t a n t t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f MV
t h a n t h e t r a n s g e n i c Cu /Zn S O D p l a n t s d e s c r i b e d h e r e
( A . S . G . , A . S . H. , a n d R . D . A . , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) .
F u r t h e r a n a l y s e s o f t r a n s g e n i c p l a n t s t h a t o v e r e x p r e s s
c h l o r o p l a s t S O D s w i l l u n d o u b t e d l y y i e l d f u n d a m e n t a l i n f o r -
m a t i o n a b o u t t h e e f f e c t s o f o x i d a t i v e s t r e s s o n c h l o r o p l a s t s ,
c e l l s , a n d w h o l e p l a n t s . A d d i t i o n a l m o d i f i c a t i o n s o f o t h e r
c o m p o n e n t s o f t h e a c t i v e - o x y g e n - s c a v e n g i n g s y s t e m o f
p l a n t s w i l l h e l p t o e l u c i d a t e t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e
p r o t e c t i v e m e c h a n i s m s . We r e m a i n h o p e f u l t h a t i n v e s t i g a -
t i o n s o f t h i s t y p e w i l l e v e n t u a l l y p r o v i d e s i g n i f i c a n t i m p r o v e -
m e n t s i n t h e t o l e r a n c e o f c u l t i v a t e d p l a n t s t o e n v i r o n m e n t a l
s t r e s s .
T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y T e x a s A d v a n c e d T e c h n o l o g y
P r o g r a m G r a n t 0 3 6 4 4 0 8 3 ( t o R . D . A . a n d A . S . H. ) a n d Un i t e d S t a t e s
D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e Co o p e r a t i v e A g r e e m e n t 5 8 - 7 MN 1 - 9 - 9 5 2
( t o R . D . A . a n d J . J . B . ) . A . S . G . w a s s u p p o r t e d b y a f e l l o w s h i p f r o m
t h e N a t i o n a l R e s e a r c h Co u n c i l .
1 . Ca d e n a s , E. ( 1 9 8 9 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 8 , 7 9 - 1 1 0 .
2 . B a n n i s t e r , J . V . , B a n n i s t e r , W. H. & R o t i l i o , G . ( 1 9 8 7 ) CR C
Cr i t . R e v . B i o c h e m . 2 2 , 1 1 1 - 1 8 0 .
3 . Ha l l i w e l l , B . ( 1 9 8 7 ) Ch e m . P h y s . L i p i d s 4 4 , 3 2 7 - 3 4 0 .
4 . B o w l e r , C. , V a n Mo n t a g u , M. & I n z 6 , D . ( 1 9 9 2 ) A n n u . R e v .
P l a n t P h y s i o l . 4 3 , 8 3 - 1 1 6 .
5 . R a b i n o w i t c h , H. D . & F r i d o v i c h , I . ( 1 9 8 3 ) P h y t o c h e m . P h o -
t o b i o l . 3 7 , 6 7 9 - 6 9 0 .
6 . D u k e , M. V . & S a l i n , M. L . ( 1 9 8 3 ) P h y t o c h e m i s t r y 2 2 , 2 3 6 9 -
2 3 7 3 .
7 . V a n Ca m p , W. , B o w l e r , C. , V i l l a r r o e l , R . E. , T s a n g , W. T . ,
V a n Mo n t a g u , M. & I n z e , D . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A
8 7 , 9 9 0 3 - 9 9 0 7 .
8 . B o w l e r , C. , S l o o t e n , L . , V a n d e n b r a n d e n , S . , D e R y k e , R . ,
B o t t e r m a n , J . , S y b e s m a , C. , V a n Mo n t a g u , M. & I n z 6 , D .
( 1 9 9 1 ) EMB O J . 1 0 , 1 7 2 3 - 1 7 3 2 .
9 . J a n s e n , M. A . K . , S h a a l t i e l , Y . , K a z z e s , D . , Ca n a a n i , O . ,
Ma l k i n , S . & G r e s s e l , J . ( 1 9 8 9 ) P l a n t P h y s i o l . 9 1 , 1 1 7 4 - 1 1 7 8 .
1 0 . R i c h t e r , M. , R u h l e , W. & Wi l d , A . ( 1 9 9 0 ) P h o t o s y n t h . R e s . 2 4 ,
2 3 7 - 2 4 3 .
1 1 . S o p o r y , S . K . , G r e e n b e r g , B . M. , Me h t a , R . A . , El d m a n ,
M. A . & Ma t t o o , K . ( 1 9 9 0 ) Z. N a t u r f o r s c h . 4 5 c , 4 1 2 - 4 1 7 .
1 2 . Ho d g s o n , R . A . J . & R a i s o n , J . K . ( 1 9 9 1 ) P l a n t a 1 8 3 , 2 2 2 - 2 2 8 .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0
( 1 9 9 3 )
P l a n t B i o l o g y : S e n G u p t a e t a l .
1 3 . Ho d g s o n , R . A . J . & R a i s o n , J . K . ( 1 9 9 1 ) P l a n t a 1 8 5 , 2 1 5 - 2 1 9 .
1 4 . S c i o l i , J . R . & Zi l i n s k a s , B . A . ( 1 9 8 8 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
US A 8 5 , 7 6 6 1 - 7 6 6 5 .
1 5 . I s i n , S . H. , B u r k e , J . J . & A l l e n , R . D . ( 1 9 9 0 ) P l a n t Mo l . B i o l .
1 5 , 7 8 9 - 7 9 1 .
1 6 . B e v a n , M. W. ( 1 9 8 4 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 , 8 7 1 1 - 8 7 2 1 .
1 7 . Ho r s c h , R . B . , F r y , J . E. , Ho f f m a n n , N . J . , Ei c h o l t z , D . ,
R o g e r s , S . G . & F r a l e y , R . T . ( 1 9 8 5 ) S c i e n c e 2 2 7 , 1 1 9 - 1 2 3 .
1 8 . B e a u c h a m p , C. 0 . & F r i d o v i c h , I . ( 1 9 7 1 ) A n a l . B i o c h e m . 4 4 ,
2 7 6 - 2 8 7 .
1 9 . B l i g h , E. G . &D y e r , W. J . ( 1 9 5 9 ) Ca n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 3 7 ,
9 1 1 - 9 1 7 .
2 0 . B a b b s , C. H. , P h a m , J . A . & Co o l b a u g h , R . C. ( 1 9 8 9 ) P l a n t
P h y s i o l . 9 0 , 1 2 6 7 - 1 2 7 0 .
P r o c . N a t i . A c a d . S c i . US A 9 0 ( 1 9 9 3 ) 1 6 3 3
2 1 . Ha l l i w e l l , B . ( 1 9 8 2 ) i n S u p e r o x i d e D i s m u t a s e , e d . O b e r l e y ,
L . W. ( CR C, B o c a R a t o n , F L ) , V o l . 1 , p p . 8 9 - 1 2 4 .
2 2 . Wi l d , A . , R i c h t e r , M. & R u b l e , W. ( 1 9 9 0 ) Cu r r . R e s . P h o t o -
s y n t h . 2 , 3 7 7 - 3 8 0 .
2 3 . Ha l l i w e l l , B . & G u t t e r i d g e , J . M. C. ( 1 9 8 5 ) F r e e R a d i c a l s i n
B i o l o g y a n d Me d i c i n e ( Cl a r e n d o n P r e s s , O x f o r d ) .
2 4 . G e t z o f f , E. D . , Ca b e l l i , D . E. , F i s h e r , C. L . , P a r g e , H. E. ,
V i e z o l i , M. S . , B a n c i , L . & Ha l l e w e l l , R . A . ( 1 9 9 2 ) N a t u r e
( L o n d o n ) 3 5 8 , 3 4 7 - 3 5 1 .
2 5 . T e p p e r m a n , J . M. & D u n s m u i r , P . ( 1 9 9 0 ) P l a n t Mo l . B i o l . 1 4 ,
5 0 1 - 5 1 1 .
2 6 . El r o y - S t e i n , O . , B e r n s t e i n , Y . &G r o n e r , Y . ( 1 9 8 6 ) EMB O J . 5 ,
6 1 5 - 6 2 2 .