P r o c . N a t i A c a d . S c i .

US A
V o l . 7 9 , p p . 5 5 0 - 5 5 4 , J a n u a r y 1 9 8 2
G e n e t i c s
G e n e t i c v a r i a t i o n i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s : P r o b l e m o f
e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c a l l e l e s
( e v o l u t i o n / p o p u l a t i o n g e n e t i c s / p o l y m o r p h i s m / p e p t i d e a n a l y s i s / c h a r g e - s t a t e m o d e l )
F R A N C I S C O J . A Y A L A
D e p a r t m e n t o f G e r e t i c s , Un i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , D a v i s , C a l i f o r n i a 9 5 6 1 6
C o n t r i b u t e d b y F r a n c i s c o J . A y a l a , S e p t e m b e r 2 8 , 1 9 8 1
A B S T R A C T E l e c t r o p h o r e t i c s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e a v -
e r a g e f r e q u e n c y o f h e t e r o z y g o u s l o c i p e r i n d i v i d u a l i s a b o u t 1 2 %
i n D r o s o p h i l a a n d o t h e r i n v e r t e b r a t e s a n d , a b o u t 6 % i n v e r t e -
b r a t e s . I t i s e s t i m a t e d t h a t o n l y a b o u t t w o - t h i r d s o f a l l a m i n o a c i d
s u b s t i t u t i o n s c h a n g e n e t e l e c t r i c c h a r g e ; h e n c e , a l a r g e f r a c t i o n
o f a l l g e n e t i c v a r i a t i o n m a y b e u n d e t e c t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s . P e p -
t i d e m a p p i n g o f 1 1 i n d e p e n d e n t a l l e l e s c o d i n g f o r a l c o h o l d e h y -
d r o g e n a s e i n D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r h a s u n c o v e r e d o n e c r y p t i c
v a r i a n t ; t h u s , t h e f r e q u e n c y o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i -
a t i o n i s a p p a r e n t l y l o w , a b o u t 9 % i n t h i s s a m p l e . N e v e r t h e l e s s ,
w i t h a s i m p l e m o d e l i t i s s h o w n t h a t t h i s d e g r e e o f c r y p t i c v a r i a t i o n ;
i f i t i s t y p i c a l o f o t h e r l o c i , w o u l d s u b s t a n t i a l l y c h a n g e o u r c u r r e n t
e s t i m a t e s o f g e n e t i c v a r i a t i o n : t h e a v e r a g e h e t e r o z y g o s i t y w o u l d
i n c r e a s e f r o m a b o u t 1 2 % t o a b o u t 2 5 % f o r i n v e r t e b r a t e s a n d f r o m
a b o u t 6 % t o 2 1 % f o r v e r t e b r a t e s .
A v a r i e t y o f t e c h n i q u e s - i n c l u d i n g s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s
a n d h e a t o r u r e a d e n a t u r a t i o n - h a v e b e e n u s e d b y v a r i o u s i n -
v e s t i g a t o r s t o d e t e c t e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i a t i o n . T h e s e
t e c h n i q u e s a p p e a r t o b e l e s s e f f e c t i v e t h a n p e p t i d e m a p p i n g f o r
d e t e c t i n g c r y p t i c v a r i a t i o n , b u t , l i k e p e p t i d e m a p p i n g , t h e y s u g -
g e s t t h a t s t a n d a r d e l e c t r o p h o r e s i s m a y d e t e c t m o s t o f t h e p r o t e i n
v a r i a t i o n p r e s e n t i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s .
T h e c h a r g e - s t a t e m o d e l o f p r o t e i n v a r i a t i o n p r o p o s e s t h a t t h e
" a l l e l e s " d e t e c t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s a r e e x t r e m e l y d i v e r s e c l a s s e s
c o n s i s t i n g o f m a n y e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c a l l e l e s . T h e a l c o h o l
d e h y d r o g e n a s e p e p t i d e - m a p p i n g r e s u l t s a r e i n c o n s i s t e n t w i t h t h e
c h a r g e - s t a t e m o d e l .
E l e c t r o p h o r e t i c t e c h n i q u e s h a v e u n c o v e r e d e n o r m o u s a m o u n t s
o f g e n e t i c v a r i a t i o n i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s : i n m o s t s e x u a l l y r e -
p r o d u c i n g o r g a n i s m s , a n i n d i v i d u a l i s h e t e r o z y g o u s a t 5 - 2 0 %
o f i t s l o c i ( 1 ) . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t e l e c t r o p h o r e s i s d e t e c t s
a l l e l i c v a r i a n t s o n l y w h e n t h e e n c o d e d p r o t e i n s d i f f e r i n n e t
e l e c t r i c c h a r g e a n d t h a t o n l y a b o u t 3 3 % o f a l l p o s s i b l e a m i n o
a c i d s u b s t i t u t i o n s . ( o r 2 5 % o f a l l s i n g l e - b a s e r e p l a c e m e n t s i n t h e
t r a n s l a t e d D N A ) c h a n g e t h e n e t e l e c t r i c c h a r g e o f a p r o t e i n ( 2 ) .
W h e t h e r o r n o t t h e s e c l a i m s a r e c o r r e c t , i t r e m a i n s a n o p e n
q u e s t i o n h o w m i u c h g e n e t i c v a r i a t i o n e x i s t s i n n a t u r a l p o p u l a -
t i o n s a b o v e t h e e s t i m a t e s o b t a i n e d b y e l e c t r o p h o r e s i s .
A n o t h e r o p e n i s s u e c o n c e r n s t h e p r o c e s s e s t h a t m a i n t a i n t h e
p e r v a s i v e g e n e t i c v a r i a t i o n a l r e a d y k n o w n . K i m u r a a n d O h t a
( 3 ) h a v e p r o p o s e d t h a t m o s t o f t h e p r o t e i n v a r i a t i o n o b s e r v e d
i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s i s a d a p t i v e l y n e u t r a l - t h e p o l y m o r -
p h i s m s r e p r e s e n t a t r a n s i t i o n a l p h a s e i n m o l e c u l a r e v o l u t i o n
g o i n g f r o m f i x a t i o n f o r o n e a l l e l e t o f i x a t i o n f o r a n o t h e r a d a p -
t i v e l y e q u i v a l e n t a l l e l e a s a c o n s e q u e n c e o f r a n d o m d r i f t . T h e
m o d e l p r e s e n t e d i n ( 3 ) a s s u m e s t h a t t h e n u m b e r o f p o s s i b l e
a l l e l e s i s e f f e c t i v e l y i n f i n i t e , a n a s s u m p t i o n t h a t i s n o t m e t b y
e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e t e c t e d v a r i a t i o n . A m o d i f i e d v e r s i o n o f
t h e n e u t r a l i s t h y p o t h e s i s i s t h e " c h a r g e - s t a t e m o d e l , " w h i c h
p o s t u l a t e s t h a t t h e r e i s a l i m i t e d n u m b e r o f d e t e c t a b l e a l l e l i c
s t a t e s , d i f f e r e n t i a t e d f r o m e a c h o t h e r b y o n e o r m o r e e l e c t r i c
c h a r g e s , a n d t h a t e a c h d e t e c t a b l e a l l e l i c c l a s s c o n s i s t s o f a l a r g e
n u m b e r o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y " c r y p t i c " a l l e l e s , a l l o f w h i c h c o d e
f o r p r o t e i n s w i t h i d e n t i c a l e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y b u t h a v e
d i f f e r e n t a m i n o a c i d s e q u e n c e s ( 2 , 4 - 8 ) . A c c o r d i n g t o t h e
c h a r g e - s t a t e m o d e l , n o a l l e l e w i t h i n a g i v e n e l e c t r o p h o r e t i c
c l a s s ( o r " e l e c t r o m o r p h " ) i s e x p e c t e d t o e x i s t i n h i g h f r e q u e n c y ,
b u t r a t h e r t h e r e s h o u l d b e m a n y a l l e l e s , e a c h i n l o w f r e q u e n c y .
I h e r e i n a d v a n c e a s i m p l e m o d e l i n o r d e r t o e x p l o r e t h e e f f e c t
o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i a n t s o n c u r r e n t e s t i m a t e s o f
g e n e t i c v a r i a t i o n . T h e n , I e x a m i n e t h e a v a i l a b l e e m p i r i c a l d a t a
a n d c o n c l u d e t h a t ( i ) c r y p t i c v a r i a t i o n s e e m s t o b e c o n s i d e r a b l y
l e s s e x t e n s i v e t h a n i t i s c l a i m e d b y t h e c a l c u l a t i o n s q u o t e d
a b o v e , b u t ( i i ) n e v e r t h e l e s s t h e r e s u l t i n g i n c r e a s e i n t h e e s t i -
m a t e s o f g e n e t i c v a r i a t i o n i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s i s n o t t r i v i a l .
F i n a l l y , I a r g u e t h a t t h e e x i s t i n g e v i d e n c e i s i n c o n s i s t e n t w i t h
t h e c h a r g e - s t a t e m o d e l .
T HE MO D E L
L e t x i r e p r e s e n t t h e f r e q u e n c i e s o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e t e c t -
a b l e a l l e l e s a t t h e k l o c u s ; X x i
= 1 . A s s u m i n g Ha r d y - W e i n b e r g
e q u i l i b r i u m , t h e v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s t h a t m e a s u r e e l e c -
t r o p h o r e t i c v a r i a t i o n a r e
f r e q u e n c y o f h o m o z y g o t e s : Ho m = E x
2
f r e q u e n c y o f h e t e r o z y g o t e s : He t = 1 - x
2
e f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s : n e = 1 / X x 1 2 .
F i r s t , I s h a l l a s s u m e t h a t e a c h e l e c t r o p h o r e t i c a l l e l e i s a c -
t u a l l y a c l a s s c o n s i s t i n g o f t w o a l l e l e s , w i t h f r e q u e n c i e s a a n d
b , c o d i n g f o r p r o t e i n s e q u e n c e s t h a t d i f f e r b y a t l e a s t o n e a m i n o
a c i d ; a + b = 1 . I s h a l l a l s o a s s u m e f o r s i m p l i c i t y t h a t t h e f r e -
q u e n c i e s o f t h e t w o a l l e l e s i n e a c h e l e c t r o p h o r e t i c c l a s s a r e t h e
s a m e f o r a l l e l e c t r o m o r p h s . T h e v a l u e s o f t h e p a r a m e t e r s t h a t
m e a s u r e t o t a l v a r i a t i o n , e l e c t r o p h o r e t i c a s w e l l a s c r y p t i c , a r e :
Ho m ' = ( a 2 + b 2 )
y x i 2
He t ' = 1 - ( a 2 + b 2 ) X x , 2
n =
1 / ( a 2
+
b 2 ) X x , 2
=
n e / ( a 2
+
b 2 ) .
T h e i n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n d u e t o c r y p t i c v a r i a n t s m a y
b e m e a s u r e d i n t w o w a y s . F i r s t , o n e m a y o b t a i n t h e d i f f e r e n c e
b e t w e e n t o t a l h e t e r o z y g o s i t y a n d e l e c t r o p h o r e t i c h e t e r o z y g o s i t y :
He t ' - He t = [ 1 - ( a 2 + b 2 ) ]
7 x i
.
[ 1 ]
A b b r e v i a t i o n : A D Ha s e , a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e .
5 5 0
T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -
m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C . 1 7 3 4 s o l e l y
t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 9 ( 1 9 8 2 ) 5 5 1
S e c o n d , o n e m a y o b t a i n t h e r a t i o o f t h e e f f e c t i v e n u m b e r s o f
a l l e l e s :
n e / n e =
[ n e l ( a 2
+
b 2 ) ] / n e
=
1 / ( a 2
+
b 2 ) . [ 2 ]
E q . 2 m e a s u r e s t h e i n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n b e t t e r t h a n
E q . 1 f o r t w o ( r e l a t e d ) r e a s o n s . T h e f i r s t r e a s o n i s t h a t E q . 2
r e f l e c t s m o r e a c c u r a t e l y t h e a c t u a l i n c r e a s e i n v a r i a t i o n . T h i s
c a n b e s h o w n w i t h a n e x a m p l e . C o n s i d e r t h e c h a n g e f r o m t w o
a l l e l e s , e a c h w i t h a f r e q u e n c y o f 0 . 5 , t o f o u r a l l e l e s , e a c h w i t h
a f r e q u e n c y o f 0 . 2 5 . T h e i n c r e a s e i n h e t e r o z y g o s i t y i s f r o m 0 . 5 0
t o 0 . 7 5 , a n d t h e d i f f e r e n c e i s He t ' - He t = 0 . 2 5 , o r a 5 0 % i n -
c r e a s e o v e r t h e o r i g i n a l v a l u e . B u t g o i n g - f r o m t w o a l l e l e s w i t h
e q u a l f r e q u e n c i e s t o f o u r a l l e l e s w i t h e q u a l f r e q u e n c i e s i s a d o u -
b l i n g o f t h e g e n e t i c v a r i a t i o n . T h i s i s r e f l e c t e d i n t h e r a t i o b e -
t w e e n t h e e f f e c t i v e n u m b e r s o f a l l e l e s : n e ' / e = 4 / 2 = 2 .
T h e s e c o n d r e a s o n i s t h a t t h e i n c r e a s e i n h e t e r o z y g o s i t y
a c h i e v e d b y a g i v e n a m o u n t o f c r y p t i c v a r i a t i o n i s a f u n c t i o n o f
t h e p r e e x i s t i n g a m o u n t o f g e n e t i c v a r i a t i o n . F o r a n y g i v e n a a n d
b , t h e d i f f e r e n c e He t ' - He t ( E q . 1 ) w i l l b e g r e a t e s t , n a m e l y
1 - ( a 2 + b 2 ) , w h e n a l o c u s h a s n o e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e t e c t a b l e
v a r i a t i o n
( E x i 2
= 1 ) , a n d t h e g r e a t e r t h e e l e c t r o p h o r e t i c v a r i -
a t i o n a t a l o c u s , t h e s m a l l e r t h e d i f f e r e n c e w i l l b e . T h i s b i a s i s
n o t p r e s e n t i n E q . 2 : t h e v a l u e o f n e ' / n e d e p e n d s o n l y o n t h e
f r e q u e n c y o f t h e c r y p t i c a l l e l e s .
T h e a s s u m p t i o n t h a t t h e r e a r e o n l y t w o c r y p t i c a l l e l e s i n e a c h
e l e c t r o p h o r e t i c c l a s s m a y b e a b a n d o n e d b y a s s u m i n g i n s t e a d
t h a t e a c h e l e c t r o m o r p h c o n s i s t s o f o n e a l l e l e w i t h f r e q u e n c y a
a n d m a n y o t h e r a l l e l e s , e a c h w i t h v e r y l o w f r e q u e n c y . T h i s
w o u l d o c c u r i f m a n y d i f f e r e n t a m i n o a c i d s e q u e n c e s e x i s t w i t h i n
e a c h e l e c t r o p h o r e t i c c l a s s , b u t [ a s i s t h e c a s e f o r a l c o h o l d e -
h y d r o g e n a s e ( A D H) i n D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ] o n e i s q u i t e
c o m m o n i n t h e p o p u l a t i o n . R e p r e s e n t t h e f r e q u e n c y o f t h e r a r e
c r y p t i c v a r i a n t s a s b . , s o t h a t E b T =
b ; a + b = 1 . T h e v a l u e s
o f t h e p a r a m e t e r s t h a t m e a s u r e t o t a l v a r i a t i o n a r e :
Ho m " = ( a 2 +
X b i 2 )
X x 1 2 a 2 X x , 2
He t " = 1 - ( a 2 + X b . 2 ) X x , 2 - a 2
: x i 2
n e =
1 / ( a 2
+
l b i 2 ) j X i 2 n e / a 2
He t " - He t = [ 1 - ( a 2 + l b j 2 ) ] E 2 x , 2 ( 1 - a 2 ) X x i 2
A s b e f o r e , t h e s m a l l e r t h e a m o u n t o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e -
t e c t a b l e v a r i a t i o n , t h e g r e a t e r t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o
h e t e r o z y g o s i t i e s . T h e m a x i m u m p o s s i b l e v a l u e o f t h i s d i f f e r e n c e
w i l l b e 1 - a 2 , w h e n t h e l o c u s i s m o n o m o r p h i c b y e l e c t r o p h o r e s i s .
O t h e r m o d e l s a r e p o s s i b l e . F o r e x a m p l e , i t m i g h t b e t h e c a s e
t h a t w i t h i n e a c h e l e c t r o p h o r e t i c c l a s s t h e r e a r e s e v e r a l - t o - m a n y
c r y p t i c a l l e l e s , a l l i n a b o u t e q u a l f r e q u e n c i e s . Ho w e v e r , t h e
A D H d a t a g i v e n b e l o w s u g g e s t t h a t t h e r e i s o n e c o m m o n a l l e l e
w i t h i n e a c h e l e c t r o p h o r e t i c c l a s s .
R E S UL T S
T h e a m o u n t o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i a t i o n a t a g i v e n
l o c u s c o u l d b e e s t i m a t e d b y o b t a i n i n g t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e
o f e a c h e l e c t r o p h o m o r p h f r o m a s u f f i c i e n t l y l a r g e n u m b e r o f
i n d i v i d u a l s . C l e a r l y , t h i s i s n o t p r e s e n t l y f e a s i b l e b e c a u s e t h e
r e q u i r e d i n v e s t m e n t o f t i m e a n d o t h e r r e s o u r c e s i s e n o r m o u s .
P e p t i d e m a p p i n g , o r " f i n g e r p r i n t i n g , " o f p r o t e i n d i g e s t s i s a l e s s
e x p e n s i v e m e t h o d , a l t h o u g h i t m a y n o t g i v e f u l l r e s o l u t i o n ( b e -
c a u s e s o m e a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s i n i n s o l u b l e p e p t i d e s o r i n
l a r g e o n e s m a y b e u n d e t e c t e d ) .
A D H ( a l c o h o l : N A D + o x i d o r e d u c t a s e , E C 1 . 1 . 1 . 1 ) f r o m D .
n w l a n o g a s t e r h a s b e e n e x a m i n e d i n o u r l a b o r a t o r y b y f i n g e r -
p r i n t i n g ( 9 , 1 0 ) . T w o e l e c t r o m o r p h s , A D HF ( o r , s i m p l y , F f o r
" f a s t " ) a n d A D Hs ( o r S f o r " s l o w " ) , o c c u r b o t h w i t h h i g h f r e -
q u e n c i e s i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s o f D . m e l a n o g a s t e r . S t r a i n s
w e r e m a d e h o m o z y g o u s b y d e s c e n t , s o t h a t e a c h s t r a i n w o u l d
c a r r y o n l y o n e a l l e l e s a m p l e d f r o m a n a t u r a l p o p u l a t i o n . A t o t a l
o f 1 1 s t r a i n s w e r e e x a m i n e d . S i x s t r a i n s c a r r i e d t h e F e l e c t r o -
m o r p h : f o u r w e r e d e r i v e d f r o m f l i e s c o l l e c t e d i n N a p a C o u n t y ,
C a l i f o r n i a ; o n e w a s d e r i v e d f r o m f l i e s i n R e d w o o d C i t y , C a l i -
f o r n i a ; a n d o n e w a s f r o m C e d a r R a p i d s , I o w a . T h e o t h e r f i v e
s t r a i n s c a r r i e d t h e S e l e c t r o m o r p h a n d w e r e a l l d e r i v e d f r o m
t h e N a p a C o u n t y p o p u l a t i o n . T r y p t i c d i g e s t s o f p u r i f i e d e n z y m e
f r o m e a c h s t r a i n w e r e f i n g e r p r i n t e d .
T h e t w o r e l e v a n t r e s u l t s a r e a s f o l l o w s ( 9 , 1 0 ) . F i r s t , t h e d i f -
f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o e l e c t r o m o r p h s i n v o l v e s i n a l l c a s e s t h e
s a m e s u b s t i t u t i o n , t h r e o n i n e i n A D HF t o l y s i n e i n A D Hs . T h i s
s u b s t i t u t i o n o c c u r s i n r e s i d u e 1 9 2 . ( T h e t o t a l s e q u e n c e c o n s i s t s
o f 2 5 4 r e s i d u e s ; s e e r e f . 1 1 ) . S e c o n d , o n l y 1 e l e c t r o p h o r e t i c a l l y
c r y p t i c s u b s t i t u t i o n h a s b e e n d e t e c t e d a m o n g t h e 1 1 a l l e l e p r o d -
u c t s : t h e 5 S s t r a i n s g i v e i d e n t i c a l p e p t i d e m a p s ; a m o n g t h e F
s t r a i n s , t h o s e f r o m R e d w o o d C i t y , f r o m C e d a r R a p i d s , a n d t h r e e
f r o m N a p a C o u n t y a r e i d e n t i c a l t o e a c h o t h e r b u t d i f f e r f r o m
t h e f o u r t h N a p a C o u n t y s t r a i n b y a t l e a s t o n e a m i n o a c i d
s u b s t i t u t i o n .
A s a m p l e o f 1 1 a l l e l e p r o d u c t s i s s m a l l . Mo r e o v e r , t h e r e m a y
b e m o r e v a r i a t i o n t h a n h a s b e e n d e t e c t e d b y p e p t i d e m a p p i n g
b e c a u s e t h e p e p t i d e m a p s c o n t a i n o n l y a b o u t 5 0 % o f t h e A D H
s e q u e n c e ; t h e o t h e r h a l f o f t h e m o l e c u l e i s i n s o l u b l e i n t h e b u f -
f e r s u s e d ( 1 2 ) . B e t h a t a s i t m a y , t h e f r e q u e n c y o f e l e c t r o p h o r e t i -
c a l l y c r y p t i c v a r i a n t s i n t h e s a m p l e i s 1 / 1 1 = 0 . 0 9 1 . T h i s i s t h e
o b s e r v e d v a l u e o f b i n t h e m o d e l p r o p o s e d a b o v e ; a = 0 . 9 0 9 .
T h e 9 5 % b i n o m i a l c o n f i d e n c e l i m i t s o f t h e s e e s t i m a t e s a r e b
= 0 . 0 0 2 3 - 0 . 4 0 4 5 a n d a = 0 . 5 9 5 5 - 0 . 9 9 7 7 .
T a b l e 1 s h o w s t h e i n c r e a s e i n t o t a l g e n e t i c v a r i a t i o n o b t a i n e d
w h e n t h e f r e q u e n c y o f c r y p t i c v a r i a n t s i s a s o b s e r v e d f o r A D H.
T h e t a b l e u s e s t h r e e v a l u e s o f a ( a n d b ) : t h e o b s e r v e d f r e q u e n c y
a n d e a c h o f t h e t w o c o n f i d e n c e b o u n d s . T h e c a l c u l a t i o n s a r e
m a d e u n d e r t h e t w o a s s u m p t i o n s c o n s i d e r e d a b o v e : ( i ) w h e n
e a c h e l e c t r o m o r p h c o n s i s t s o f o n l y t w o c r y p t i c a l l e l e s a n d ( i i )
w h e n t h e r e i s o n e c o m m o n c r y p t i c a l l e l e b u t m a n y r a r e o n e s .
I t c a n b e s e e n t h a t t h e r e s u l t s u n d e r t h e s e t w o a s s u m p t i o n s a r e
f a i r l y s i m i l a r w h e n e v e r t h e f r e q u e n c y , a , o f t h e c o m m o n a l l e l e
i s h i g h ( 0 . 9 0 o r g r e a t e r ) . I n g e n e r a l , t h e l o w e r t h e f r e q u e n c y
o f a , t h e g r e a t e r t h e i n c r e a s e i n v a r i a t i o n o b t a i n e d u n d e r t h e
s e c o n d a s s u m p t i o n .
T h e f r e q u e n c i e s o f t h e t w o e l e c t r o m o r p h s , A D HF a n d
A D Hs , i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s o f D . m e l a n o g a s t e r a r e a b o u t 0 . 7
a n d 0 . 3 . T h u s , f o r e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e t e c t a b l e v a r i a t i o n , He t
=
0 . 4 2 0 a n d n e
=
1 . 7 2 . I f w e u s e , a s t h e b e s t g u e s s , a = 0 . 9 1 ,
w e o b t a i n u n d e r a s s u m p t i o n ( i ) : He t ' = 0 . 5 1 6 , n e ' = 2 . 0 7 ; a n d
T a b l e 1 . T o t a l g e n e t i c v a r i a t i o n a s a f u n c t i o n o f t h e f r e q u e n c y a
o f t h e m o s t c o m m o n c r y p t i c a l l e l e *
T o t a l v a r i a t i o n I n c r e a s e i n v a r i a t i o n
a Ho m ' He t ' He t ' - He t
n ' J n ,
W i t h o n l y t w o a l l e l e s p e r e l e c t r o m o r p h :
0 . 9 9 7 7 0 . 9 9 5 Y x i x 2 1 - 0 . 9 9 5 2 x i x 2 0 . 0 0 5 X x i 2 1 . 0 0 5
0 . 9 0 9 1 0 . 8 3 5 X x , 2 1 - 0 . 8 3 5 X i 2 0 . 1 6 5 X x i 2 1 . 1 9 8
0 . 5 9 5 5 0 . 5 1 8 1 x i x 2 1 - 0 . 5 1 8 X x i 2 0 . 4 8 2 j X i 2 1 . 9 3 0
W i t h m a n y a l l e l e s p e r e l e c t r o m o r p h :
0 . 9 9 7 7 0 . 9 9 5 X x i 2 1 - 0 . 9 9 5 x i x 2 0 . 0 0 5 X x i 2 1 . 0 0 5
0 . 9 0 9 1 0 . 8 2 6 1 x i x 2 1 - 0 . 8 2 6 X x i 2 0 . 1 7 4 X - x i 2 1 . 2 1 0
0 . 5 9 5 5 0 . 3 5 4 x i 2 1 - 0 . 3 5 4 x i x 2 0 . 6 4 5 X x i 2 2 . 8 2 5
*
x i i s t h e a l l e l i c f r e q u e n c y a n d n e i s t h e e f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s f o r
e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e t e c t a b l e v a r i a n t s .
G e n e t i c s :
A y a l a
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 9 ( 1 9 8 2 )
u n d e r a s s u m p t i o n ( i i ) . He t " = 0 . 5 2 1 , n e 1 ,
= 2 . 0 9 . T h e t w o a s -
s u m p t i o n s y i e l d f a i r l y s i m i l a r e s t i m a t e s , b u t i n b o t h c a s e s t h e r e
i s a n o n t r i v i a l i n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n - a d i f f e r e n c e o f
a b o u t 0 . 1 0 i n h e t e r o z y g o s i t y a n d a 2 1 % i n c r e a s e i n t h e e f f e c t i v e
n u m b e r o f a l l e l e s .
E l e c t r o p h o r e t i c s t u d i e s o f 2 0 o r m o r e l o c i i n m a n y o r g a n i s m s
g i v e a v e r a g e h e t e r o z y g o s i t i e s p e r l o c u s o f a b o u t He t = 0 . 1 2
( n e
=
1 . 1 4 )
f o r
D r o s o p h i l a
a n d o t h e r
i n v e r t e b r a t e s ,
a n d He t
= 0 . 0 6 ( n e = 1 . 0 6 ) f o r v e r t e b r a t e s s u c h a s h u m a n s . I t i s n o t
p r e s e n t l y k n o w n w h a t t h e a m o u n t o f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c
v a r i a t i o n d e t e c t e d b y p e p t i d e m a p p i n g m i g h t b e f o r t h e v a r i o u s
l o c i . T h e r e s e e m s t o b e n o a p r i o r i r e a s o n w h y a m i n o a c i d s u b -
s t i t u t i o n s t h a t d o n o t e n t a i l e l e c t r i c c h a r g e c h a n g e s w o u l d b e
m o r e o r l e s s f r e q u e n t i n e l e c t r o p h o r e t i c a l l y p o l y m o r p h i c l o c i
t h a n i n e l e c t r o p h o r e t i c a l l y m o n o m o r p h i c l o c i . I n o r d e r t o g a i n
s o m e i n s i g h t a b o u t t h e e f f e c t s t h a t e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c
v a r i a t i o n m a y h a v e o n c u r r e n t . e s t i m a t e s o f g e n e t i c v a r i a t i o n ,
I s h a l l a s s u m e t h a t t h e f r e q u e n c y o f c r y p t i c a l l e l e s o b s e r v e d a t
t h e A d h l o c u s ( i . e . , a = 0 . 9 0 9 , b = 0 . 0 9 1 ) i s t y p i c a l f o r o t h e r
l o c i . T h e n , t h e e s t i m a t e s o f t o t a l g e n e t i c v a r i a t i o n w o u l d b e a s
f o l l o w s ( s e e T a b l e 1 ) : f o r D r o s o p h i l a a n d o t h e r i n v e r t e b r a t e s ,
n = 1 . 1 4 X 1 . 2 = 1 . 3 7 a n d He t ' = 0 . 2 7 ; f o r
v e r t e b r a t e s , n e I
= 1 . 2 7 a n d He t ' = 0 . 2 1 . T h u s , t h e e f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s
p e r l o c u s i s 2 0 % g r e a t e r ; t h e a v e r a g e h e t e r o z y g o s i t y b e c o m e s
m o r e t h a n d o u b l e f o r i n v e r t e b r a t e s a n d m o r e t h a n t r i p l e f o r
v e r t e b r a t e s . T h e i n c r e a s e i n h e t e r o z y g o s i t y i s , o f c o u r s e , l a r g e l y
d u e t o t h e c o n t r i b u t i o n o f c r y p t i c v a r i a t i o n i n e l e c t r o p h o r e t i -
c a l l y m o n o m o r p h i c o r n e a r - m o n o m o r p h i c l o c i , w h i c h c h a n g e
f r o m z e r o o r n e a r - z e r o t o 1 8 % h e t e r o z y g o s i t y w h e n t h e f r e -
q u e n c y o f c r y p t i c r a r e v a r i a n t s ( b ) i s 0 . 1 0 .
T h e c a l c u l a t i o n s j u s t m a d e s h o w t h a t , i f e l e c t r o p h o r e t i c a l l y
c r y p t i c v a r i a n t s o c c u r a t m o s t o r a l l l o c i , o u r c u r r e n t e s t i m a t e s
o f g e n e t i c v a r i a t i o n i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s m a y i n c r e a s e s u b -
s t a n t i a l l y . T h i s w o u l d o c c u r e v e n i f t h e c u m u l a t i v e f r e q u e n c y
o f t h e a d d i t i o n a l v a r i a n t s a t e a c h l o c u s i s r e l a t i v e l y l o w - f o r
e x a m p l e , o f t h e o r d e r o f 1 0 % a s a s s u m e d a b o v e .
D I S C US S I O N
A v a r i e t y o f t e c h n i q u e s h a v e b e e n a p p l i e d i n r e c e n t y e a r s ,
m o s t l y i n D r o s o p h i l a , i n o r d e r t o u n c o v e r v a r i a t i o n u n d e t e c t e d
b y e l e c t r o p h o r e s i s . T h e t e c h n i q u e s m o s t e x t e n s i v e l y u s e d a r e
s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s , h e a t d e n a t u r a t i o n , a n d u r e a
d e n a t u r a t i o n .
E l e c t r o p h o r e t i c s t u d i e s o f g e n e t i c v a r i a t i o n u s u a l l y u s e a s i n -
g l e s e t o f e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s i n t h e a s s a y o f a g i v e n e n -
z y m e . T h e m e t h o d o f s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s c o n s i s t s o f a p -
p l y i n g a v a r i e t y o f c o n d i t i o n s t o a g i v e n e n z y m e . T h e c o n d i t i o n s
m o s t o f t e n v a r i e d a r e g e l c o n c e n t r a t i o n a n d b u f f e r p H; t y p i c a l l y
f r o m 6 - 1 0 d i f f e r e n t s e t s o f c o n d i t i o n s a r e u s e d . E l e c t r o m o r p h s
t h a t h a v e i d e n t i c a l m o b i l i t y u n d e r a s e t o f c o n d i t i o n s m a y b e
d i s t i n g u i s h a b l e w h e n t h e c o n d i t i o n s a r e c h a n g e d .
T h e s p e c i e s m o s t e x t e n s i v e l y e x a m i n e d b y . s e q u e n t i a l e l e c -
t r o p h o r e s i s i s D r o s o p h i l a p s e u d o o b s c u r a . T a b l e 2 s u m m a r i z e s
s o m e o f t h e r e s u l t s o b t a i n e d ( s o m e d a t a h a v e n o t b e e n i n c l u d e d
b e c a u s e t h e s t a t i s t i c s u s e d i n t h e t a b l e c o u l d n o t b e c a l c u l a t e d ) .
T h e i n c r e a s e i n v a r i a t i o n d e t e c t e d r a n g e s f r o m z e r o , a t a n u m b e r
o f l o c i , t o 7 6 % a t t h e E s t - 5 l o c u s ( n e ' / n e = 1 . 7 6 ) . I n g e n e r a l ,
t h e m o r e h e t e r o z y g o u s a l o c u s , t h e g r e a t e r t h e i n c r e a s e i n v a r i -
a t i o n a p p e a r s t o b e . T h i s r u l e , h o w e v e r , h a s e x c e p t i o n s . F o r
e x a m p l e , a l t h o u g h A d h i n D . m e l a n o g a s t e r i s h i g h l y h e t e r o -
z y g o u s , n o a d d i t i o n a l v a r i a t i o n h a s b e e n d e t e c t e d b y s e q u e n t i a l
e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 7 ) . F o r t h e 1 3 l o c i s h o w n i n T a b l e 2 , t h e r e i s
a n a v e r a g e i n c r e a s e o f 1 2 % ( n e ' / n e = 1 . 1 2 ) i n t h e a m o u n t o f
v a r i a t i o n , w i t h h e t e r o z y g o s i t y , d e s i g n a t e d h e r e a f t e r s i m p l y a s
H. i n c r e a s i n g b y 0 . 0 4 . T h e a v e r a g e h e t e r o z y g o s i t y f o r t h e 1 3
l o c i i s g r e a t e r t h a n i t h a s b e e n o b s e r v e d i n s t u d i e s o f D . p s e u -
d o o b s c u r a t h a t i n c l u d e m a n y l o c i ( H 0 . 1 0 ) . T h u s , i f t h e i n -
c r e a s e i n v a r i a t i o n d e t e c t e d b y s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s i s
p r o p o r t i o n a l t o H, t h e n t h e o v e r a l l i n c r e a s e f o r r a n d o m s a m p l e s
o f e l e c t r o p h o r e t i c l o c i w o u l d b e e v e n l e s s t h a n t h e a v e r a g e s
g i v e n i n T a b l e 2 . B e t h a t a s i t m a y , t h e i n c r e a s e d e t e c t e d b y
s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s i s r e l a t i v e l y s m a l l .
E l e c t r o m o r p h s w i t h i d e n t i c a l e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y m a y
d i f f e r i n t h e r m o s t a b i l i t y . I f t h e d i f f e r e n c e s a r e s h o w n b y g e n e t i c
t e s t s t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e l o c u s i t s e l f , t h e y m a y r e f l e c t d i f -
f e r e n t a m i n o a c i d s e q u e n c e s i n t h e e n c o d e d p o l y p e p t i d e s . S a t -
i s f a c t o r y d a t a e x i s t f o r f o u r e n z y m e s i n a s i n g l e s p e c i e s , D . m e -
l a n o g a s t e r ( T a b l e 3 ) . A l l f o u r l o c i a r e h i g h l y p o l y m o r p h i c , b u t
t h e a d d i t i o n a l v a r i a t i o n d e t e c t e d r a n g e s f r o m n o n e ( a G p d h ) t o
5 4 % ( E s t - 6 ) . O n t h e a v e r a g e , H i n c r e a s e s f r o m 0 . 4 1 0 t o 0 . 4 8 5
a n d t h e e f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s i s 1 8 % g r e a t e r . T h e i n c r e a s e
i n v a r i a t i o n i s s o m e w h a t l a r g e r t h a n w i t h s e q u e n t i a l e l e c t r o -
p h o r e s i s , b u t t h i s s h o u l d b e t a k e n u n d e r a d v i c e , g i v e n t h a t t h e
s p e c i e s a n d t h e s e t o f l o c i a r e d i f f e r e n t i n t h e t w o s t u d i e s .
L o u k a s e t a l . ( 2 1 ) h a v e a s s a y e d b y u r e a d e n a t u r a t i o n e i g h t l o c i
i n D . s u b o b s c u r a . D i f f e r e n c e s i n s e n s i t i v i t y t o u r e a t r e a t m e n t
a p p e a r t o b e a s s o c i a t e d w i t h e a c h l o c u s u n d e r e x a m i n a t i o n
r a t h e r t h a n w i t h t h e g e n e t i c b a c k g r o u n d . T h e r e s u l t s a r e s u m -
T a b l e 2 . I n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n o b s e r v e d b y s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s i n U. S . p o p u l a t i o n s o f
D . p s e u d o o b s c u r a
S t a n d a r d
c o n d i t i o n s A l l c o n d i t i o n s I n c r e a s e i n v a r i a t i o n
L o c u s He t n e He t '
n t e He t ' - He t n ' e / n e R e f .
E s t - 5 0 . 6 4 5 2 . 8 0 . 7 9 8 4 . 9 0 . 1 5 3 1 . 7 6 ( 1 3 )
P t - 8 0 . 5 1 2 . 0 4 . 0 . 5 5 2 . 2 2 0 . 0 4 1 . 0 9 ( 1 4 )
A o * 0 . 4 9 9 2 . 0 0 . 5 8 4 2 . 4 0 . 0 8 5 1 . 2 0 ( 1 5 )
X d h 0 . 4 3 6 1 . 8 0 . 6 2 8 2 . 7 0 . 1 9 2 1 . 5 0 ( 1 5 )
O d h 0 . 0 8 2 1 . 0 9 0 . 0 9 8 1 . 1 1 0 . 0 1 6 1 . 0 2 ( 1 5 )
He x - 1 0 . 0 7 7 1 . 0 8 0 . 0 7 7 1 . 0 8 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 6 )
P t - 7 0 . 0 6 1 . 0 6 0 . 0 9 1 . 1 0 0 . 0 3 1 . 0 3 ( 1 4 )
P t - 6 0 . 0 4 1 . 0 4 0 . 0 4 1 . 0 4 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 4 )
Md h 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 5 )
He x - 2 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 6 )
He x - 6 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 6 )
He x - 7 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 6 )
a G p d h 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 3 )
A v e r a g e 0 . 1 8 1 1 . 3 8 0 . 2 2 1 1 . 6 5 0 . 0 4 0 1 . 1 2
*
L a b e l e d A d h - 6 i n t h e o r i g i n a l p a p e r .
5 5 2 G e n e t i c s :
A y a l a
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 9
( 1 9 8 2 )
5 5 3
T a b l e 3 . I n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n o b s e r v e d b y h e a t d e n a t u r a t i o n i n D . m e l a n o g a s t e r
E l e c t r o p h e s i s I n c r e a s e i n
E l e c t r o p h o r e s i s p l u s h e a t v a r i a t i o n
L o c u s He t n e He t ' n ' e He t ' - He t W e / n e R e f
E s t - 6 0 . 4 8 1 . 9 3 0 . 6 7 2 . 9 8 0 . 1 9 1 . 5 4 ( 1 8 )
A d h 0 . 4 8 1 . 9 4 0 . 5 0 2 . 0 0 0 . 0 2 1 . 0 3 ( 1 9 )
P g m 0 . 3 6 1 . 5 7 0 . 4 5 1 . 8 2 0 . 0 9 1 . 1 6 ( 2 0 )
a G p d h 0 . 3 2 1 . 4 7 0 . 3 2 1 . 4 7 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 9 )
A v e r a g e 0 . 4 1 0 1 . 7 3 0 . 4 8 5 2 . 0 6 0 . 0 7 5 1 . 1 8
m a r i z e d i n T a b l e 4 . T h e r e i s s o m e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e
a m o u n t o f e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a t i o n a n d t h e i n c r e a s e i n v a r i a t i o n
d e t e c t e d b y u r e a , a l t h o u g h P e p t - 1 i s a n o t a b l e e x c e p t i o n . T h e
a v e r a g e i n c r e a s e i n h e t e r o z y g o s i t y ( 0 . 0 7 7 ) i s a b o u t t h e s a m e a s
t h e a v e r a g e i n c r e a s e d e t e c t e d b y t h e r m o s t a b i l i t y i n D . m e l a n -
o g a s t e r , b u t t h e i n c r e a s e i n e f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s i s g r e a t e r
( 2 5 % v s . 1 8 % ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e v a r i a t i o n u n c o v -
e r e d b y u r e a d e n a t u r a t i o n m a y b e t h e s a m e a s t h a t u n c o v e r e d
b y t h e r m o s t a b i l i t y t e s t s ( 2 1 , 2 2 ) .
C o m p a r i s o n o f t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e v a r i o u s m e t h o d s t o
u n c o v e r e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i a t i o n i s h a n d i c a p p e d b y
t h e f a c t t h a t t h e a v a i l a b l e d a t a a r e f o r d i f f e r e n t s e t s o f l o c i i n
d i f f e r e n t o r g a n i s m s . Ho w e v e r , t h e A d h l o c u s o f D . m e l a n o g a s -
t e r h a s b e e n a s s a y e d b y s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s a n d h e a t
d e n a t u r a t i o n a n d b y p e p t i d e m a p p i n g . T h e r e s u l t s a r e c o m -
p a r e d i n T a b l e 5 . Us i n g s e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s , K r e i t m a n
( 1 7 ) f a i l e d t o d e t e c t a n y e l e c t r o p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i a n t s i n
a s a m p l e o f 9 6 a l l e l i c p r o d u c t s ( a l t h o u g h h e c o u l d d i f f e r e n t i a t e
s o m e v a r i a n t s f i r s t i d e n t i f i e d b y t h e r m o s t a b i l i t y ) . S a m p s e l l ( 1 9 )
e x a m i n e d b y h e a t d e n a t u r a t i o n 4 4 3 6 a l l e l i c p r o d u c t s a n d o b -
t a i n e d a s m a l l i n c r e a s e i n v a r i a t i o n . A l t h o u g h t h e a l l e l i c s a m p l e
s t u d i e d b y f i n g e r p r i n t i n g i s m u c h t o o s m a l l , t h i s t e c h n i q u e a p -
p e a r s t o h a v e c o n s i d e r a b l y g r e a t e r p o w e r f o r d e t e c t i n g e l e c t r o -
p h o r e t i c a l l y c r y p t i c v a r i a t i o n t h a n t h e t w o o t h e r t e c h n i q u e s .
Y e t , t h e v a r i o u s t e c h n i q u e s g i v e c o n s i s t e n t r e s u l t s i n t h e s e n s e
t h a t t h e y a l l i n d i c a t e t h a t c o n v e n t i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s m a y a c -
t u a l l y d e t e c t m o s t o f t h e p r o t e i n v a r i a t i o n p r e s e n t i n n a t u r a l
p o p u l a t i o n s ( s e e a l s o r e f . 2 3 ) . A l t h o u g h , a s p o i n t e d o u t , a n i n -
c r e a s e o f 2 0 % i n t h e e f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s i s n o t t r i v i a l ,
i t i s n o t l i k e l y t o h a v e d r a s t i c c o n s e q u e n c e s f o r m o s t e v o l u t i o n -
a r y c o n s i d e r a t i o n s .
T h e s e r e s u l t s a p p l y , o f c o u r s e , o n l y t o g e n e t i c v a r i a t i o n t h a t
y i e l d s d i f f e r e n c e s i n t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f p r o t e i n s . I n a d -
d i t i o n , v a r i a t i o n e x i s t s i n r e d u n d a n t t h i r d - c o d o n p o s i t i o n s a n d
i n t h e u n t r a n s l a t e d r e g i o n s o f t h e D N A . C o m p a r i s o n s b e t w e e n
s p e c i e s a n d b e t w e e n h o m o l o g o u s g e n e s w i t h i n t h e s a m e g e -
n o m e a r e p r o v i d i n g i n f o r m a t i o n a b o u t t h e r a t e s o f e v o l u t i o n o f
T a b l e 4 . I n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n o b s e r v e d b y u r e a
d e n a t u r a t i o n i n t w o G r e e k p o p u l a t i o n s o f D . s u b o b s c u r a *
E l e c t r o p h o r e s i s
E l e c t r o p h o r e s i s p l u s u r e a I n c r e a s e i n v a r i a t i o n
L o c u s He t n e He t ' n f e He t ' - He t W ' e / n e
X d h 0 . 6 1 2 . 5 6 0 . 7 7 4 . 4 4 0 . 1 6 1 . 7 3
E s t - 5 0 . 6 0 2 . 5 2 0 . 7 3 3 . 7 4 0 . 1 3 1 . 4 8
A o 0 . 5 9 2 . 4 1 0 . 6 9 3 . 1 9 0 . 1 0 1 . 3 2
P e p t - 1 0 . 4 8 1 . 9 5 0 . 4 8 1 . 9 5 0 . 0 0 1 . 0 0
L a p 0 . 4 7 1 . 9 0 0 . 6 2 2 . 6 7 0 . 1 5 1 . 4 1
O d h 0 . 1 2 1 . 1 4 0 . 1 2 1 . 1 4 0 . 0 0 1 . 0 0
Me 0 . 1 0 1 . 1 1 0 . 1 1 1 . 1 3 0 . 0 1 1 . 0 2
A c p h 0 . 0 6 1 . 0 6 0 . 1 3 1 . 1 5 0 . 0 7 1 . 0 8
A v e r a g e 0 . 3 7 9 1 . 8 3 0 . 4 5 6 2 . 4 2 0 . 0 7 7 1 . 2 5
*
F r o m r e f . 2 1 .
r e d u n d a n t v s . n o n r e d u n d a n t n u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n s , o f i n -
t r o n s v s . e x o n s , o f g e n e s v s . i n t e r g e n i c s e q u e n c e s , a n d s o o n .
I n o r d e r t o e s t i m a t e v a r i a t i o n i n n a t u r a l p o p u l a t i o n s , h o w e v e r ,
c o m p a r i s o n s m u s t b e m a d e b e t w e e n i n d i v i d u a l s ( o r b e t w e e n t h e
t w o g e n o m e s o f t h e s a m e i n d i v i d u a l ) . S l i g h t o m e t a l . ( 2 4 ) h a v e
s e q u e n c e d t h e A y g e n e i n t h e t w o c h r o m o s o m e s o f o n e h u m a n
i n d i v i d u a l . T h e t w o a l l e l e s d i f f e r i n a b o u t 2 % o f t h e 1 4 6 8 n u -
c l e o t i d e p a i r s s e q u e n c e d , b u t a l l o f t h e d i f f e r e n c e s o c c u r i n
u n t r a n s l a t e d s e g m e n t s o f t h e D N A . E v i d e n c e o b t a i n e d f r o m
D N A h y b r i d i z a t i o n s u g g e s t s t h a t h e t e r o z y g o s i t y a t 2 - 4 % o f t h e
n u c l e o t i d e p a i r s m a y b e t y p i c a l o f t h e w h o l e g e n o m e ( 2 5 , 2 6 ) .
T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t , a t t h e D N A l e v e l , i f t h e u n -
t r a n s l a t e d r e g i o n s o f g e n e s a r e t a k e n i n t o a c c o u n t , e v e r y i n d i -
v i d u a l i n s e x u a l l y r e p r o d u c i n g o r g a n i s m s i s l i k e l y t o b e h e t e r -
o z y g o u s a t e v e r y l o c u s .
T h e c h a r g e - s t a t e m o d e l o f g e n e t i c v a r i a t i o n p o s t u l a t e s t h a t
m o s t a l l e l e s a r e " c r y p t i c , " i . e . , u n d e t e c t a b l e b y e l e c t r o p h o r e s i s
( 2 , 5 - 8 ) . T h e t o t a l n u m b e r o f d i f f e r e n t a m i n o a c i d s e q u e n c e s
t h a t o n e w o u l d e x p e c t t o f i n d w i t h i n a g i v e n e l e c t r o m o r p h d e -
p e n d s , f i r s t o f a l l , o n t h e n u m b e r o f s i t e s t h a t a r e f r e e t o v a r y
w i t h o u t u n d e r m i n i n g t h e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n ,
b u t i n a n y c a s e i t s h o u l d b e l a r g e ( 2 7 ) . I f w e a s s u m e , f o r e x a m p l e ,
t h a t t h e n u m b e r o f s i t e s f r e e t o v a r y i n a p r o t e i n i s a b o u t 1 0 %
o f t h e t o t a l ( 2 8 ) , t h e r e w o u l d b e s o m e 2 5 s u c h s i t e s i n D . m e -
l a n o g a s t e r A D H. B e c a u s e o n l y a b o u t h a l f o f t h e m o l e c u l e i s
p r e s e n t i n t h e p e p t i d e s e x a m i n e d b y f i n g e r p r i n t i n g , i t m i g h t
b e a s s u m e d t h a t a b o u t 1 2 v a r i a b l e s i t e s w o u l d b e r e p r e s e n t e d
i n t h e p e p t i d e m a p s . I f e a c h s i t e c a n b e o c c u p i e d b y a n y o n e
o f t h e 2 0 a m i n o a c i d s , t h e n u m b e r o f p o s s i b l e d i f f e r e n t s e -
q u e n c e s w o u l d b e 2 0 1 2 , t w o - t h i r d s o f w h i c h w o u l d n o t y i e l d
c h a r g e d i f f e r e n c e s . E v e n t h o u g h o n l y 1 1 A D Hs h a v e b e e n s a m -
p l e d b y f i n g e r p r i n t i n g , t h e c h a r g e - s t a t e m o d e l p r e d i c t s t h a t
e a c h e l e c t r o p h o r e t i c c l a s s s h o u l d h a v e b e e n h e t e r o g e n e o u s ,
c o n s i s t i n g o f a v a r i e t y o f s e q u e n c e s . A s K i n g ( 2 7 ) h a s w r i t t e n :
" A p r e d i c t i o n c a n . . . b e m a d e : w h e n t h e t i m e a n d t e c h n i q u e s
a r e a v a i l a b l e , i t w i l l b e f o u n d t h a t t h e c o m m o n e r e l e c t r o p h o r e t i c
' a l l e l e s ' i n a l m o s t e v e r y p o l y m o r p h i c s y s t e m i n l a r g e p o p u l a t i o n s
w i l l b e s h o w n t o c o n s i s t o f a n u m b e r o f s e q u e n t i a l l y d i s t i n c t
i s o a l l e l e s . " T h e m o d e l a l s o p r e d i c t s t h a t t h e c h a r g e d i f f e r e n c e
b e t w e e n t h e F a n d S e l e c t r o m o r p h s w i l l i n v o l v e v a r i o u s a m i n o
a c i d s u b s t i t u t i o n s a t a v a r i e t y o f s i t e s .
T h e s e p r e d i c t i o n s a r e n o t b o r n e o u t b y t h e p r e s e n t r e s u l t s .
F i r s t , o n l y o n e c r y p t i c a l l e l e h a s b e e n f o u n d i n a s a m p l e o f 1 1
i n d e p e n d e n t A D Hs . S e c o n d , t h e c h a r g e d i f f e r e n c e b e t w e e n
t h e A D Hs a n d A D HF e l e c t r o m o r p h s i s i n e v e r y c a s e d u e t o t h e
T a b l e 5 . I n c r e a s e i n g e n e t i c v a r i a t i o n d e t e c t e d b y t h r e e d i f f e r e n t
m e t h o d s a t t h e A d h l o c u s o f D . m e l a n o g a s t e r
Me t h o d He t '
-
He t n ' e / n e R e f .
S e q u e n t i a l e l e c t r o p h o r e s i s 0 . 0 0 1 . 0 0 ( 1 7 )
He a t d e n a t u r a t i o n 0 . 0 2 1 . 0 3 ( 1 9 )
P e p t i d e m a p p i n g 0 . 1 0 1 . 2 0
G e n e t i c s :
A y a l a
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 9 ( 1 9 8 2 )
s u b s t i t u t i o n o f l y s i n e f o r t h r e o n i n e . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s o b -
s e r v a t i o n i s e n h a n c e d b y t h e f a c t t h a t t h e A D HF e l e c t r o m o r p h s
e x a m i n e d c o m e f r o m t h r e e d i f f e r e n t n a t u r a l p o p u l a t i o n s . A n d
t h e r e c a n b e l i t t l e d o u b t t h a t p e p t i d e m a p p i n g c a n d e t e c t a l l
a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s t h a t a l t e r t h e c h a r g e o f a s o l u b l e p e p -
t i d e . T h u s , t h e r e s u l t s o f t h e A D H f i n g e r p r i n t i n g t e s t - a s w e l l
a s t h o s e o f o t h e r t e s t s ( 8 , 2 3 ) - a r e i n c o n s i s t e n t w i t h t h e c h a r g e -
s t a t e m o d e l o f g e n e t i c v a r i a t i o n .
I a m i n d e b t e d t o J o h n H. G i l l e s p i e f o r r e v i e w i n g a n e a r l i e r v e r s i o n
o f t h i s m a n u s c r i p t a n d f o r a d v i c e . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y G r a n t
G M 2 2 2 2 1 f r o m n t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f He a l t h .
1 . A y a l a , F . J . & K i g e r , J . A . ( 1 9 8 0 ) Mo d e r n G e n e t i c s ( B e n j a m i n /
C u m m i n g s , Me n l o P a r k , C A ) , p . 6 6 2 .
2 . Ma r s h a l l , D . R . & B r o w n , A . H. D . ( 1 9 7 5 ) J . Mo l E v o l 6 ,
1 4 9 - 1 6 3 .
3 . K i m u r a , M. & O h t a , T . ( 1 9 7 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 9 , 4 6 7 - 4 6 9 .
4 . Ma y n a r d S m i t h , J . ( 1 9 7 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) N e w B i o l 2 3 7 , 3 1 .
5 . K i n g , J . L . ( 1 9 7 3 ) J . Mo l . E v o l 2 , 3 1 7 - 3 2 2 .
6 . O h t a , T . & K i m u r a , M. ( 1 9 7 3 ) G e n e t . R e s . 2 2 , 2 0 1 - 2 0 4 .
7 . W e h r h a h n , C . F . ( 1 9 7 5 ) G e n e t i c s 8 0 , 3 7 5 - 3 9 4 .
8 . B r o w n , A . H. D . , Ma r s h a l l , D . R . & W e i r , B . S . ( 1 9 8 1 ) i n G e -
n e t i c s S t u d i e s o f D r o s o p h i l a P o p u l a t i o n s , e d s . G i b s o n , J . B . &
O a k e s h o t t , J . G . ( A u s t r a l i a n N a t i o n a l Un i v . P r e s s , C a n b e r r a ) , p p .
1 5 - 4 3 .
9 . F l e t c h e r , T . S . , A y a l a , F . J . , T h a t c h e r , D . R . & C h a m b e r s , G . K .
( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . US A 7 5 , 5 6 0 9 - 5 6 1 2 .
1 0 . F l e t c h e r , T . S . ( 1 9 7 8 ) D i s s e r t a t i o n ( Un i v . o f C a l i f o r n i a , D a v i s ,
C A ) .
1 1 . T h a t c h e r , D . R . ( 1 9 8 0 ) B i o c h e m . J . 1 8 7 , 8 7 5 - 8 8 6 .
1 2 . S c h w a r t z , M. F . & J b r n v a l l , H. ( 1 9 7 6 ) E u r . J . B i o c h e m . 6 8 ,
1 5 9 - 1 6 8 .
1 3 . C o y n e , J . A . , F e l t o n , A . A . & L e w o n t i n , R . C . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l
A c a d . S c i . US A 7 5 , 5 0 9 0 - 5 0 9 3 .
1 4 . S i n g h , R . S . ( 1 9 7 9 ) G e n e t i c s 9 3 , 9 9 7 - 1 0 1 8 .
1 5 . C o y n e , J . A . & F e l t o n , A . A . ( 1 9 7 7 ) G e n e t i c s 8 7 , 2 8 5 - 3 0 4 .
1 6 . B e c k e n b a c h , A . T . & P r a k a s h , S . ( 1 9 7 7 ) G e n e t i c s 8 7 , 7 4 3 - 7 6 1 .
1 7 . K r e i t m a n , M. ( 1 9 8 0 ) G e n e t i c s 9 5 , 4 6 7 - 4 7 5 .
1 8 . C o c h r a n e , B . J . & R i c h m o n d , R . C . ( 1 9 7 9 ) G e n e t i c s 9 3 , 4 6 1 - 4 7 8 .
1 9 . S a m p s e l l , B . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m . G e n e t . 1 5 , 9 7 1 - 9 8 8 .
2 0 . T r i p p a , G . , L o v e r r e , A . & C a t a m o , A . ( 1 9 7 6 ) N a t u r e ( L o n d o n )
2 6 0 , 4 2 - 4 3 .
2 1 . L o u k a s , M. , V e r g i n i , Y . & K r i m b a s , C . B . ( 1 9 8 1 ) G e n e t i c s 9 7 ,
4 2 9 - 4 4 1 .
2 2 . S a t o h , C . & Mo h r e n w e i s e r , H. W . ( 1 9 7 9 ) A n n . Hu m . G e n e t . 4 2 ,
2 8 3 - 2 9 2 .
2 3 . R a m s h a w , J . A . M. , C o y n e , J . A . & L e w o n t i n , R . C . ( 1 9 7 9 ) G e -
n e t i c s 9 3 , 1 0 1 9 - 1 0 3 7 .
2 4 . S l i g h t o m , J . L . , B l e c h i , A . E . & S m i t h i e s , 0 . ( 1 9 8 0 ) C e l l 2 1 ,
6 2 7 - 6 3 8 .
2 5 . B r i t t e n , R . J . , C e t t a , A . & D a v i d s o n , E . H. ( 1 9 7 8 ) C e l l 1 5 ,
1 1 7 5 - 1 1 8 6 .
2 6 . G r u l a , J . W . , Ha l l , T . J . , l i u n t , J . A . , G u i g n i , T . D . , D a v i d s o n ,
E . H. & B r i t t e n , R . J . ( 1 9 8 2 ) E v o l u t i o n , i n p r e s s .
2 7 . K i n g , J . L . ( 1 9 7 4 ) G e n e t i c s 7 6 , 6 0 7 - 6 1 3 .
2 8 . F i t c h , W . M. & Ma r g o l i a s h , E . ( 1 9 7 0 ) E v o l B i o l 4 , 6 7 - 1 0 9 .
5 5 4 G e n e t i c s :
A y a l a