Chimie anorganic biomimetic

Cursul 5

Complec#i model pentru enzimele ce con&in zinc


Cu excep&ia fierului, zincul este probabil cel mai biorelevant metal tranzi&ional
n toate formele de via&. Corpul uman con&ine n medie 2-3 g de zinc. Pn n
prezent, au fost identificate sute de enzime cu zinc cu propriet&i diferite, de la
cre#tere efectiv (sintetaze, polimeraze, ligaze #i tranferaze) la degradare
(hidrolaze, inclusiv peptidaze, amidaze #i nucleaze). Peptidazele #i amidazele cu
zinc produc ruperea legturii amidice RC(O)NH(R) #i sunt probabil cele mai
importante enzime cu zinc datorit importan&ei lor farmacologice.

Chimia coordinativ a situsutilor active

Cea mai comun caracteristic structural a situsurilor active ale enzimelor cu
zinc este centrul tetraedric de zinc [{XYZ}Zn
II
-OH
n
] legat la protein prin trei
resturi de aminoacizi. Resturile de aminoacizi coordinate la zinc (X, Y #i Z) sunt
sau histidin (ligand neutru coordinat prin N), glutamat sau aspartat (liganzi
anionici coordina&i prin O) sau cistein (coordinat prin S, probabil ligand
anionic). A#a cum se va vedea n continuare, aproape toate combina&iile posibile
de trei dintre ace#ti liganzi se regsesc n enzimele cu zinc. n mod uzual, n
stare de repaus n cele mai multe enzime mononucleare a patra pozi&ie de
coordinare din situsul activ e ocupat de un ligand ap sau hidroxil. Cele mai
importante combina&ii gsite n situsurile active ale enzimelor mononucleare cu
zinc sunt prezentate n figura 1.

Fig. 1.

n timpul ciclului catalitic, situsul activ tetraedric sau pseudotetraedric al
enzimelor cu zinc este destul de flexibil. Astfel, pentru multe dintre acestea
geometria situsului activ se poate modifica u#or de la tetracoordinare la
pentacoordinare. n particular, modul de coordinare a anionului carboxilat se
poate schimba u#or de la monodentat la bidentat.
n afar de toate aceste enzime mononucleare cu zinc exist #i cteva enzime n
care situsul activ este polinuclear. n aceste cazuri, situsul activ con&ine doi sau
mai mul&i ioni de zinc lega&i prin pun&i de o molecul de ap sau de resturi de
cistein sau aspartat.

Geometria liganzilor

Un chimist din domeniul chimiei coordinative bioanorganice care ncearc s
modeleze aceste situsuri active folosind liganzi simpli #i complec#i de zinc cu
ace#tia se confrunt cu multe probleme. n primul rnd, flexibilitatea amintit
anterior este aproape imposibil de mimat n absen&a buzunarului proteic. Mai
mult, coordinarea aminoacizilor n#i#i la zinc nu se face numai prin intermediul
gruprilor func&ionale de pe catena lateral ci #i prin gruparrile amin #i
carboxilat terminale. Folosirea aminoacizilor proteja&i sau a oligoproteinelor nu
furnizeaz liganzi suficient de volumino#i pentru a preveni formarea
complec#ilor de tipul ML
2
sau a complec#ilor dinucleari cu pun&i hidroxo.
Pentru a dep#i aceste probleme gruprile func&ionale trebuie ata#ate la liganzi
chelatici sau macrociclici. n particular, liganzii tripodali au fost folosi&i cu
succes pentru complec#ii model de mai mult de 20 de ani. Cel mai important
avantaj al acestora este coordinarea lor facial care produce un centru
tetraedric de zinc #i o geometrie mai degrab rigid comparativ cu liganzii
macrociclici foarte flexibili. n final, pot fi fcute u#or modificri ale acestora n
vederea optimizrii mpiedicrilor sterice pentru a preveni formarea dimerilor.
Studii foarte recente raporteaz ob&inerea de liganzi crora li s-au ata#at un
numr mare de grupri func&ionale pentru a mima buzunarul enzimei. Aceste
grupri func&ionale permit formarea de legturi de hidrogen cu liganzii hidroxo
sau ap coordina&i la zinc, interac&ii similare gsite #i n enzime.
Liganzii tripodali pot fi clasifica&i n: (1) tridenta&i anionici; (2) tridenta&i neutri;
(3) tetradenta&i anionici #i (4) tetradenta&i neutri. Cteva exemple relevante sunt
prezentate n figura 2.

Fig. 2.

Enzime mononucleare cu zinc #i modele

Enzime ce conin trei resturi de histidin! coordinate la zinc
Metzincine
Cele mai multe metzincine con&in ionul de zinc (II) coordinat la trei resturi de
histidin. Pn n prezent, au fost caracterizate prin difrac&ie de raze X
urmtoarele familii de metzincine: astacine, seralisine, adamlisine,
leishmanolisine, familia metaloproteazelor (MMPs) #i snapalisine.
Adamlisinele degradeaz matricea extracelular, n particular colagenul. Acest
proces este implicat n distrugerea &esuturilor provocat de otrava reptilelor.
Astfel, enzimele sunt numite dup cel mai periculos #arpe din SUA, Crotalus
adamanteus.
MMPs se pot clasifica n: (1) colagenaze adevrate, care atac molecula de tip
triplu helix a colagenului ntr-un singur situs; (2) gelatinaze, care degradeaz
colagenul denaturat sau gelatina; #i (3) stromlisine care &intesc proteoglicanii. n
consecin&, acestea sunt esen&iale pentru multe procese n care &esutul urmeaz
s fie modificat sau rearanjat, cum ar fi embriogeneza sau vindecarea rnilor.
Poten&ialul lor proteolitic (sau absen&a acestuia) este, de asemenea, necesar
pentru generarea #i cre#terea tumorilor, metastaze, inflama&ii, artrite reumatoide
#i multe alte procese. Inhibitorii pentru MMPs au astfel un mare interes
farmacologic #i pn azi, multe structuri model #i inhibitori pentru colagenaze #i
gelatinaze con&in, de exemplu, o grupare func&ional de tip acid hidroxamic
coordinat la zinc (fig. 3).

Fig. 3
Cercetrile recente din acest domeniu au fost concentrate pe gsirea de noi
grupri care s se coordineze la zinc.

Anhidraza carbonic

Anhidraza carbonic (CA) a fost prima dintre enzimele cu zinc pentru care s-a
pus n eviden& prezen&a zincului. Este o enzim omniprezent, ceea ce
nseamn c se gse#te n plante, animale #i bacterii. Mul&i complec#i model ai
zincului sunt modele pentru proteaze #i anhidraza carbonic n acela#i timp.
Anhidraza carbonic catalizeaz conversia hidrolitic a dioxidului de carbon la
carbonat acid (schema 1) #i astfel enzima joac un rol fiziologic esen&ial n
respira&ie #i n echilibrul CO
2
/HCO
3
'. n mod normal, aceast reac&ie este foarte
lent. Totu#i, anhidrazele carbonice produc o transformare in vivo a dioxidului
de carbon de 10
7
ori mai rapid. Fr aceste enzime catalizatori ai reac&iei,
transportul CO
2
ntre &esuturile metabolizatoare #i plmni ar fi aproape
imposibil.

Schema 1
Deprotonarea ligandului ap #i formarea unui intermediar bicarbonat prin atacul
nucleofil al speciei [His
3
Zn
II
OH]
+
la CO
2
este acceptat ca etap intermediar n
mecanismul catalitic. Au fost propuse dou mecanisme distincte (schema 2) iar
intermediarii cheie pentru ambele sunt sus&inu&i de studiile pe compu#i model.
Studiile teoretice nclin spre utilizarea mecanismului Lindskog.

Schema 2
Anhidraza carbonic este folosit de corp pentru a produce umoarea apoas
(unul dintre fluidele din interiorul ochilor). Sulfonamidele sunt poten&iali
inhibitori ai anhidrazelor carbonice reducnd formarea umorii apoase pentru a
scdea presiunea intra-ocular cu 15-20%. Astfel ace#ti compu#i pot fi folosi&i
ca medicamente pentru a trata glaucomul.

Complec#i de zinc cu liganzi de tipul hidridotris(pirazol-1-il)borat (Tp)

Multe dintre modelele enzimelor mononucleare cu zinc folosesc liganzi tripodali
cu trei atomi donori de azot.
Similar cu compu#ii model pentru oxidazele #i oxigenazele mononucleare
dependente de fier, liganzii de tip hidridotris(pirazol-1-il)borat (Tp),
restric&iona&i steric sunt utiliza&i adesea pentru a mima liganzii histidinici
coordina&i la zinc prin cei trei donori pirazol-1-il. n particular, cercetrile
efectuate de Vahrenkamp #i Parkin au ajutat la n&elegerea #i elucidarea multor
mecanisme biocatalitice. Astfel, scopul multor studii pe compu#i model este de a
reproduce mecanismul anhidrazei carbonice cu modele func&inale. Primul model
mononuclear de tip zinc-hidroxo a fost ob&inut folosind liganzi volumino#i de tip
Tp
RR
, (R = t-Bu, Ph, Cum, R = H, Me, t-Bu). Sintezele se efectueaz prin
reac&ii de transmetalare sau prin reac&ii de substitu&ie (schema 3). Protonarea n
mediu acid, cu acizi cu anioni care nu se coordineaz permite formarea
aquacomplec#ilor.

Schema 3
Compu#ii de tip hidroxo reac&ioneaz similar cu CA, dup mecanismul descris
anterior (schema 1) pentru a forma bicarbonat din CO
2
. Dac reac&ia continu cu
un alt complex de tip hidroxo se ob&ine un compus binuclear cu ionul carbonat
n punte, [{ZnTp
Me,tBu
}
2
(-CO
3
)]. Compusul de tip hidroxo este, de asemenea,
un punct de start bun pentru a se ob&ine complec#i de tip tiolat, fenolat sau
alcoolat prin reac&ii de substitu&ie cu tioli, fenoli sau alcooli. Reac&iile
complec#ilor de tip hidroxo cu diver#i anioni conduc la halogeno sau carboxilato
complec#i. Cu dialchil carbonat se formeaz monoalchil carbonato complec#i
(fig. 4 a); ace#tia se pot ob&ine #i prin reac&ia alcoolato complec#ilor cu CO
2
.

Fig. 4
Al&i complec#i de tip hidroxo ([Zn(OH)(Tp
Cum,Me
)]) hidrolizeaz difosfa&ii,
sulfonatofosfa&ii, disulfona&ii #i unii esteri #i amide. n particular, hidroliza
amidelor arat c ace#ti compu#i model sunt modele structurale #i func&ionale
pentru MMPs. Prin urmare, ace#ti compu#i sunt folosi&i n studii asupra
posibilit&ii de coordinare a unor inhibitori ai proteazelor (fig. 4 b #i 5).

Fig. 5
Sinteza unor astfel de modele structurale pentru inhibitorii enzimelor porne#te,
de obicei, de la complec#i de tip hidroxo. Ace#tia se folosesc, de asemenea, n
studii asupra propriet&ilor coordinative ale altor molecule biorelevante cum sunt
aminoacizii, nucleozidele, nucleotidele. Sinteza compu#ilor de tip tiolat #i
carboxilat se poate realiza folosind ca reactan&i alchil complec#i
([Zn(R)(Tp
R,R
)]). Precursorii de tip alchil se ob&in din reac&ia dialchil zincului cu
K[Tp
R,R
] sau Tl[Tp
R,R
] sau prin transmetalare (schema 4).

Schema 4
Analogii de tip hidrur ai complec#ilor de zinc [Zn(H)(Tp
R,R
)] dep#esc n
reactivitate alchil complec#ii #i permit un acces mai u#or la complec#ii de tip
alcoolat [Zn(OR)(Tp
R,R
)] prin reac&ia cu alcoolii.

Complec#i de zinc cu liganzi neutri

n afar de compu#ii cu liganzi anionici de tipul Tp n literatur se gsesc #i
cteva exemple de liganzi neutri cu set donor N,N,N. Astfel de liganzi tripodali
cu atomi donori de azot, al cror numr este n cre#tere, sunt folosi&i s mimeze
centrii activi ai enzimelor ce con&in trei resturi histidinice coordinate la zinc. n
particular, tris(imidazolil)carbinoli, tris(imidazolil)alcani #i
tris(imidazolil)fosfine s-au dovedit a fi liganzi folositori pentru astfel de modele.
ns combina&iile tetraedrice caracterizate structural sunt rare #i, din pcate, #i
mai rare n cazul hidroxo sau aqua complec#ilor. Folosirea ligandului
tris(benzimidazolilmetil)amina (tba) a dus la ob&inerea unui complex model care
este aproape la fel de versatil ca modele cu liganzi de tip Tp (fig. 6). Acest
ligand se coordineaz la ionul de zinc prin patru atomi de azot, nucleele
benzenice formnd un buzunar de coordinare hidrofob #i crescnd mpiedicarea
steric. Substituen&ii volumino#i din pozi&ia unu a gruprii benzimidazolice
determin orientarea optim a atomilor donori spre centrul de zinc. Cea de a
cincea pozi&ie de coordinare poate fi ocupat de un ligand de tip tiolat sau
carboxilat. Au fost ob&inu&i #i complec#ii cu ap sau hidroxil.

fig. 6

Enzime ce conin dou! resturi de histidin! $i un ion carboxilat coordinai la
zinc

n multe enzime cu zinc centrul metalic este coordinat la dou resturi de
histidin #i unul de acid aspartic sau glutamic, ceea ce este similar cu
oxigenazele mononucleare ce con&in fier. S-a sugerat c aceast similaritate ar
putea fi cauzat de sursa comun din care au evoluat. n prezent, natura folose#te
cu precdere centrii de zinc n metaloenzime pentru hidroliza legturilor
peptidice. n concordan& cu mecanismul n general acceptat al peptidazelor cu
zinc (schema 5), ionul de zinc (II) are dou sarcini: (1) polarizeaz gruparea
carbonil a func&iunii amidice ce urmeaz a fi rupt; #i (2) sus&ine (determin)
deprotonarea moleculei de ap coordinate.

Schema 5
n termolizin, Glu 143 accept acest proton #i l transfer pr&ii care se
desprinde din peptid (mai precis, gruprii NH din peptid).
Peptidazele care atac partea terminal a unei peptide sunt numite
exopeptidaze. Se disting dou tipuri, amino- #i carbopeptidaze, n func&ie de
captul peptidei (cel care se termin cu gruparea NH
2
sau respectiv COOH) care
se va rupe.

Complec#i de zinc cu liganzi cu set donor N,N,O

nlocuirea unui grup donor de tip piridil cu unul de tip carboxilat n liganzii
tris(piridilmetil)amin (tpa) or tris(picolil)amin conduce la formarea ligandului
tripodal cu set donor N,N,O, bispicolilglicin (BPG) (fig. 2). Acest ligand
anionic se coordineaz la zinc prin trei atomi donori de azot #i unul de oxigen #i
este deci numai condi&ional potrivit pentru a mima motivul N,N,O al enzimelor
gluzincine sau aspzincine. Mai mult, mpiedicarea steric a acestui ligand este
mai mic dect a liganzilor de tip tris(benzimidazolilmetil)amin. Astfel, au fost
ob&inu&i complec#i ai zincului octaedrici sau pentacoordina&i cu liganzi de tip
alcoolat sau fosfat (fig. 7a). Amide derivate de la bispicolilglicin (de exemplu,
cu aminoacidul fenilalanin) sunt liganzi homochirali volumino#i #i pot forma
complec#i model de zinc cu ap coordinat (fig. 7b).

Fig. 7
nc o dat, ace#tia nu sunt liganzi anionici ci neutri cu patru atomi donori, trei
de azot #i un oxigen amidic. Geometria acestor compu#i este de bipiramid
trigonal distorsat.
Dac gruparea metilpiridil a ligandului bispicolilglicin este nlocuit cu
gruparea 2-hidroxibenzil, este nevoie de substituen&i volumino#i n pozi&ia cinci
a acestei grupri (2-hidroxibenzil) pentru a mpiedica formarea unor structuri
dimere sau oligomere.
Carrano #i Hammes au folosit grupri voluminoase ter&-butil n pozi&ia orto a
donorilor de tip fenolat ob&innd un ligand anionic tripodal cu set donor N,N,O
(3-ter&-butil-2-hidroxi-5-metilfenil)bis(3,5-dimetilpirazol-1-il)metan. Folosind
acest ligand s-au ob&inut c&iva complec#i tetraedrici ai zincului cu halogeni,
acetat sau liganzi de tip tiolat n a patra pozi&ie de coordinare (schemele 6 #i 7).

Schema 6

Schema 7
Cele mai multe sinteze ncep cu reac&ia dintre ligandul fenolic #i dimetilzinc
ob&inndu-se complexul tetraedric cu metil n a patra pozi&ie de coordinare care
este apoi folosit ca precursor pentru complec#ii de tip tiolat #i carboxilat.
Cu doi atomi donori de azot #i unul de oxigen, acest ligand este potrivit s
mimeze situsuri active ale gluzincinelor #i aspzincinelor, de#i ionul de zinc (II)
n aceste modele este coordinat la un donor de tip fenolat #i nu carboxilat.
Prin inser&ia unui derivat carbonilic, R
2
C=O, sau a dioxidului de carbon, CO
2
,
ntr-o legtur de tip borohidrur a complexului hidridobis(pirazol-1-il)borat
zinc, Parkin #i colaboratorii au ob&inut modele pentru gluzincine #i aspzincine
(schema 8).

Schema 8
Inser&ia R
2
C=O conduce la formarea unui atom de oxigen donor de tip eter n
timp ce inser&ia CO
2
duce la formarea de anhidrid mixt a acidului formic.
Astfel, ambele grupri donoare nu sunt cu adevrat modele pentru donorii de tip
carboxilat din situsurile active ale enzimelor.
Complec#ii alchil zinc ce con&in diver#i liganzi de tip bis(pirazol-1-il)acetato
(bpa
R,R
) ofer acces u#or la complec#ii model pentru peptidaze. Pn n prezent,
pornind de la combina&iile [Zn(bpa
R,R
)(CH
3
)] au fost ob&inute cteva combina&ii
cu liganzi clorur, carboxilat, tiolat #i hidroxamat. A#a cum s-a mai precizat,
tiola&ii, carboxila&ii #i hidroxama&ii sunt cele mai comune grupri ce se
coodineaz la zinc n inhibitorii zinc peptidazelor. Multe astfel de modele au
fost caracterizate structural (fig. 8).

Fig. 8
Studiile viitoare pe compu#i model trebuie s se axeze pe gsirea unor noi
grupri ce se pot coordina la zinc #i evaluarea triei legturilor formate
(Zngrupare donoare) pentru a se gsi poten&iali inhibitori ai peptidazelor.