1

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure

Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB


ANALISA DNA


I. PENDAHULUAN
Analisis DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level
molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotipe (materi genetik) yang
dimiliki oleh organisme tertentu. Analisa pada level ini, jauh lebih akurat dibanding
dengan analisa fenotipe (morfometrik) karena ciri fenotipe merupakan hasil interaksi
antara genotipe dengan lingkungan. Dengan kata lain, interpretasi hasil analisa fenotipe
tidak persis mencerminkan genotipe yang dimiliki oleh organisme tertentu.
Aplikasi analisis DNA antara lain penentuan marker (penanda) dalam mengukur
hubungan kekerabatan antar kelompok ikan dalam populasi, baik yang di alam maupun di
lingkungan budidaya, studi taksonomi, genetika populasi, dan diagnosa penyakit.
Penggunaan marker pada level DNA memiliki beberapa kelebihan yaitu tidak dipengaruhi
oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan, lebih sensitif, hampir semua jaringan dapat
digunakan sebagai sumber material genetik dan dapat digunakan dalam jangka waktu yang
relatif lebih lama. Sedangkan kelemahannya adalah prosedur yang cukup rumit dan
mahalnya biaya analisa.
Prosedur analisa DNA diawali dengan mengekstraksi genom DNA dari sumber sel
yang diikuti dengan proses isolasi sekuen DNA tertentu. Seperti yang diutarakan oleh
Lewin (1994), bahwa langkah awal dalam menganalisa DNA adalah memecahkan genom
DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil.
Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari molekul-molekul
lain di dalam suatu jaringan yang dilarutkan. Karena secara alami, DNA adalah suatu
molekul primer yang keberadaannya selalu terkait denga RNA dan protein. Sedangkan
dalam menganalisa DNA yang diperlukan adalah DNA dalam bentuk murni (Stine, 1973).
Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA umumnya adalah menghancurkan sel
dan isolasi asam nukleat. Selanjutnya dilakukan penghancuran inti sel sehingga DNA akan
terlepas dan akan menyebabkan viskositas larutan meningkat sehingga molekul DNA
2

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

terlihat lebih nyata. Langkah kedua adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan
kontaminan seperti RNA dan protein.
Dalam ekstraksi DNA, jenis sumber sel yang digunakan ada beberapa macam
seperti hati, otot, sirip, darah dan sel hasil kultur. Sedangkan kondisi sumber sel meliputi
sumber sel segar, sumber sel terfiksasi dan sumber sel beku.

II. BAHAN DAN ALAT
Bahan

1. Jaringan ikan uji
7. Primer
2.
Cell lysis solution 8. Master mix PCR
3. Protein precipitation solution 9. Marker DNA
4. RNase 10. 1 x TBE
5. Proteinase K 11. Etidium bromida
6. Ion Exchange water/distilled water

Alat

1. Inkubator 5. Mesin PCR
2. Tabung mikro 6. Vortex
3.
Pipet mikro 7. Satu set elektroforesis
4. Sentrifuse 8. UV illuminator

III. PROSEDUR KERJA
3.1. PROSEDUR EKTRAKSI DNA
Penghancuran sel (Cell lysis)
1. Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan ekstraksi DNA diautoclave.
3

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

2. Sampel ikan ditimbang sebanyak 10 20 mg, lalu dimasukkan ke dalam tabung mikro
(1.5 ml).
3. Tambahkan 200 l Cell Lysis Solution dan 1.5 l Proteinase K solution ke dalam
tabung mikro.
4. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 55
0
C selama 3 24 jam.

Gambar 5. Inkubasi jaringan dengan Dry Thermo Unit
Eliminasi RNA
1. 1,5 l RNase (4 mg/ml) dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu diaduk dengan
membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali. Kemudian diinkubasi pada suhu 37
0
C
selama 30 60 menit.
2. Setelah inkubasi selesai, dinginkan sampel sampai mencapai kondisi suhu ruang.

Pengendapan Protein
1. 200 l Protein Precipitation Solution ke dalam larutan sampel lalu divortex pada
kecepatan tinggi selama 20 detik.
2. Inkubasi sampel on ice selama 10 - 15 menit.
3. Kemudian sampel disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit hingga
terbentuk endapan protein dan larutan yang mengandung DNA.
4

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB


Gambar 6. Sentrifuse
Pengendapan DNA
1. Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati ke dalam tabung
baru yang telah berisi 600 l Larutan Isopropanol 100%.
2. Tabung yang berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan membolak-balikkan
tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat untaian pita DNA yang berwarna putih.
3. Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit hingga terbentuk pelet DNA di dasar tabung.
4. Larutan supernatan dibuang.
5. 300 l Larutan Etanol 70% dingin, kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang
berisi pelet DNA. Lalu tabung dibolak-balik beberapa kali untuk membilas sisa-sisa
DNA yang berada di dinding tabung.
6. Tabung disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
7. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung dikeringkan diatas
kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 30 menit.
8. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 30-50 l
akuades steril (SDW) ke dalam tabung.
9. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20C) atau langsung digunakan
untuk proses selanjutnya.

Pemurnian DNA
1. Ambil 20 l sampel DNA dan masukkan ke dalam tabung mikro (0.6 ml)
2. Kemudian tambahkan 20 l larutan Phenol/Chloroform mix (1:1)
5

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

3. Larutan di vortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit sampai tebentuk 3
lapisan
4. Ambil lapisan atas (larutan DNA) dengan sangat hati-hati dan pindahkan ke tabung
yang baru.
5. Tambahkan 2 l NaOAC (3M pH 5.2) kedalam tabung mikro berisi DNA.
6. Tambahkan 60 l Etanol absolut dan campuran larutan divortex.
7. Kemudian di inkubasi di dalam freezer -80C selama 15 menit.

Gambar 7. Tiga lapisan yang terbentuk setelah inkubasi
8. Sentrifuse tabung pada kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit
9. Buang supernatant, kemudian cuci pellet DNA dengan 20 l Etanol 70%.
10. Sentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
10. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung dikeringkan diatas
kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 30 menit.
11. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 10 l akuades
steril (SDW) ke dalam tabung.
12. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20C) atau langsung digunakan
untuk proses selanjutnya.

3.2. PROSEDUR PENGUKURAN KONSENTRASI DNA DAN RNA
1. Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 80 kali dengan SDW (RNA dengan DEPC)
dengan volume akhir 100.
2. Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat penyimpanan lalu
dibilas dengan akuades.
3. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pelarut (SDW untuk DNA dan
DEPC untuk RNA), dengan memasukkan 80 l pelarut tersebut ke dalam kuvet.
Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam alat, lalu tekan tombol set ref, hasil
6

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

pembacaan akan menunjukkan nilai absorbansi 0.000. Dilanjutkan dengan
pengukuran konsentrasi DNA atau RNA.
4. Kuvet yang akan digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan akudes. Setelah itu
larutan asam nukleat yang akan diukur dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 80 l
dan kuvet ditempatkan di dalam alat.
5. Setelah tombol sample ditekan dan konsentrasi larutan sudah terbaca, kuvet
dikeluarkan dan dibilas dengan akuades.

Gambar 8. Gene Quant
3.3. PROSEDUR PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
a. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai dengan Taq Polymerase
yang digunakan :
Menggunakan ExTaq Polymerase
1. Pembuatan larutan premix yang terdiri dari :
Bahan Jumlah
10 x Buffer Ex Taq 1.00 l x jumlah sampel + 1
DNTP 1.00 l x jumlah sampel + 1
Primer
Forward
1.00 l x jumlah sampel + 1
Reverse
1.00 l x jumlah sampel + 1
Ex Taq 0.05 l x jumlah sampel + 1
7

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

SDW 4.95 l x jumlah sampel + 1

2. Larutan premix dibagi ke dalam masingmasing mikrotube sebanyak 9 l.
3. Masukkan masingmasing sampel DNA sebanyak 1 l sehingga volume akhir
tiap mikrotube adalah 10 l.

Menggunakan Pure Taq Ready-To-Go- PCR Beads
Tambahkan pada tube yang berisi PCR Beads masing-masing bahan berisi berikut
ini, hingga volume akhir setiap mikrotube adalah 25 l.
Sampel DNA
2 l
Primer Forward
2 l
Primer Reverse
2 l
SDW
19 l
Total Volume
25 l

Menggunakan My PCR KIT 1 (Vivantis)
1. Pembuatan premix
Bahan Jumlah
2 x Taq Master Mix 5.00 l x jumlah sampel + 1
MgCl2 0.50 l x jumlah sampel + 1
Primer
Forward
1.00 l x jumlah sampel + 1
Reverse
1.00 l x jumlah sampel + 1
SDW 1.5 l x jumlah sampel + 1
2. Larutan premix dibagi ke dalam masingmasing mikrotube sebanyak 9 l.
3. Masukkan masingmasing sampel DNA sebanyak 1 l sehingga volume akhir tiap
8

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

mikrotube adalah 10 l.
b. Masukkan masing-masing mikrotube ke dalam mesin PCR yang telah diprogram
sebagai berikut :
Proses
Suhu Lama Waktu Siklus
Denaturasi awal 94
0
C 3 menit 1
Siklus PCR :
Denaturasi
Annealing
Extension

94
0
C
59
0
C
72
0
C

30 detik
30 detik
30 detik


30
Final ekstension 72
0
C 3 menit 1

Note : Program PCR dapat berubah sesuai DNA yang akan dianalisa. Suhu
annealing disesuaikan dengan sekuen primer yang digunakan.

Setelah proses PCR selesai mesin dimatikan dan hasil PCR disimpan di dalam
freezer -20
0
C untuk selanjutnya dapat dielektroforesis.

Gambar 9. Mesin PCR
PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI
Pemotongan mtDNA dengan enzim restriksi dilakukan dengan cara mencampurkan
bahan-bahan berikut :
9

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB


Buffer enzim
1 l
Enzim
1 l
Hasil PCR
2 l
SDW
6 l
Volume Akhir
10 l

Kemudian diinkubasi pada suhu 37
0
C selama 1- 3 jam. Hasil pemotongan dengan
enzim restriksi ini dapat langsung dilihat dengan elektroforesis.\
Contoh jenis jenis enzim dan situs pemotongannya.

No. Nama Sumber Situs Pemotongan
1 Hinf I Haemophilus influenza Rf G A N T C
C T N A G
2 Hae III Haemophilus aegyptius G G C C
C C G G
3 Alu I Arthrobacter luteus A G C T
T C G A
4 Mbo I Moraxella bovis sp. G A T C
C T A G
5 Cfr 13 I Citobacter freundii RFL 13 G G N C C
C C N G G
10

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

PROSEDUR ELEKTROFORESIS

Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose yang kepekatannya
disesuaikan dengan sample yang akan dicek, yaitu sebagai berikut :

No. Ukuran DNA Konsentrasi Gel
1 0.8 10 kb 0.7%
2 0.5 7 kb 0.9%
3 0.4 6 kb 1.2%
4. 0.2 4 kb 1.5%
5. 0.1 2 kb 2%

Cara pembuatan gel agarose :
1. Larutkan serbuk agarose dalam larutan 1 x Tris Borate EDTA (TBE) yang
mengandung Ethidium Bromide (30 l/1 liter TBE).
2. Panaskan dalam microwave selama 1.5 menit atau larutan sampai menjadi bening.
3. Larutan dibiarkan sampai hangat kemudian dituangkan ke dalam cetakan (Ganbar
10A) yang telah dilengkapi sisir/comb sebagai cetakan sumur/well elektroforesis.
4. Gel dibiarkan membeku, kemudian dimasukkan kedalam bak elektroforesis (Gambar
10B) yang telah berisi larutan buffer elektroforesis.

Prosedur Elektroforesis :
1. 3 l volume sampel yang akan di cek dicampur dengan 0.5 l loading buffer yang
mengandung bahan pemberat DNA dan pewarna (Bromophenol Blue).
2. Campuran dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis.
3. Bak elektroforesis ditutup dan lisrik dialirkan dengan tegangan 200 volt dan kuat arus
60 100 mA.
11

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

4. Setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif mencapai bagian dari
panjang gel, maka proses elektroforesis dapat dihentikan.
5. Gel diangkat dari bak elektroforesis dan dilepaskan dari cetakan untuk selanjutnya
diamati dengan menggunakan ultraviolet transluminator (Gambar 10C) dengan
panjang gelombang pendek (280 nm).
6. Contoh-contoh hasil elektroforesis dapat dilihat pada gambar 11, 12, dan 13.

Gambar 10. Seperangkat alat elektoforesis, A= Cetakan agarosa, 1= Sumur dan 2=
Cetakan sumur, B= Bak Elektroforesis, C= Ultraviolet Illuminator
1
2
A B
C
12

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB


Gambar 10. Hasil Elektroforesis DNA _Actin Ikan Zebra (M = Marker GeneRuler
TM

1kb DNA Ladder, No.1-5= Sampel ikan zebra, = DNA _Actin ukuran
200 bp)

Gambar 11. Hasil elektroforesis gen glikoprotein KHV (M = Marker 2-Log DNA
Ladder (0.1-10.o kb, = DNA _Actin ukuran 400 bp)
13

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB


Gambar 12. Hasil elektroforesis RAPD PCR ikan gurame (Osprhonemus gouramy)
14

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational Procedure
Departemen Budidaya Perairan 2011
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB